KR102177036B1 - 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물 - Google Patents

붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102177036B1
KR102177036B1 KR1020150114594A KR20150114594A KR102177036B1 KR 102177036 B1 KR102177036 B1 KR 102177036B1 KR 1020150114594 A KR1020150114594 A KR 1020150114594A KR 20150114594 A KR20150114594 A KR 20150114594A KR 102177036 B1 KR102177036 B1 KR 102177036B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
muscle
red sea
sea squirt
peptide
Prior art date
Application number
KR1020150114594A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170019993A (ko
Inventor
변희국
이정권
Original Assignee
강릉원주대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 강릉원주대학교산학협력단 filed Critical 강릉원주대학교산학협력단
Priority to KR1020150114594A priority Critical patent/KR102177036B1/ko
Publication of KR20170019993A publication Critical patent/KR20170019993A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102177036B1 publication Critical patent/KR102177036B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 억제 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

Description

붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물{Composition for preventing or treating Alzheimer's disease induced by halocynthia aurantium muscle hydrolysates}
본 발명은 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물에 관한 것이다.
알츠하이머병(AD)은 신경세포 손상으로 인해 기억력, 인지력, 추론력, 판단력 및 지남력의 상실을 특징으로 하는 노화와 밀접한 관련이 있는 퇴행성 뇌질환이다. 알츠하이머병의 병리학적 특징으로 뇌의 인지활동과 관련된 영역에서 신경섬유다발의 세포내 축적과, Aβ 단백질이 주요성분으로 구성된 노인반점(senile plaque)의 세포외 침착을 나타낸다. 39-43개의 아미노산으로 구성된 Aβ 단백질은 신경세포 독성을 나타내는 것이 공지되어 있다. 다수의 보고에 의하면 Aβ는 알츠하이머병의 병리적 특징이며, 병의 발생의 주요원인으로 인식되고 있다. Aβ 펩티드는 아밀로이드 전구체 단백질(Amyloid precursor protein, 이하, APP라 함)의 가수분해에 의해 생성되며, 39-43개의 아미노산으로 이루어진 다수의 Aβ가 알려져 있다. APP가 먼저 BACE에 의해 아밀로이드 전구체 단백질(APP)의 N-말단에서 절단 된 후 감마-세크레타아제에 의해 C-말단에서 절단되는 경로에 의해 Aβ가 생성된다.
따라서, BACE, Asp 또는 메맙신(Memapsin)으로도 명명되고 있는 베타-세크레타아제 효소((a) Tang, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000, 97, 1456. (b) Hussain, I. et al., Mol. CellNeurosci.1999, 14, 419. (c) Yan, R. et al., Nature1999, 402, 533. (d). Sinha, S, et al., Nature1999, 402, 537. (e) Vassar, R.et al., Science1999, 286, 735.)의 활성을 억제하는 저해제는 알츠하이머 질환의 예방 및 근본적인 발병원인이나 증상을 치료할 수 있는 약물로 사용가능하므로, 현재 수많은 제약회사에서 새로운 저해제를 개발하기 위하여 노력하고 있다.
본 발명에서는 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물을 제공한다.
본 발명은 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 억제 또는 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 억제 또는 예방에 효과적이다.
도 1은 붉은멍게 근육의 구성 아미노산 조성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 붉은멍게 근육 가수분해물로부터 베타-시크리타아제 저해 펩타이드 분리정제 과정을 나타내는 그래프로, (A) 세파덱스 G-25 컬럼 크로마토그래피를 이용한 분리정제, (B,C) HPLC를 이용한 분리정제 과정을 나타낸다.
도 3은 붉은멍게 근육 유래의 가수분해산물 분획성분을 대상으로 MS/MS 분석 결과를 도시한 그래프이다.
본 발명은 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer'sdisease)의 억제 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 펩타이드는 상기 붉은멍게 근육을 이루는 단백질을 단백질 가수분해효소로 처리한 가수분해 산물일 수 있다.
상기 조성물은 베타-시크레타제(β-secretase) 억제 활성을 가질 수 있다.
상기 붉은멍게 근육에서 유래된 펩타이드를 함유하는 유효 성분은 0.001 내지 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 붉은멍게 근육에서 유래된 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
서열번호1: LVKVEA
또한, 조성물의 아미노산 중 N-말단에 류신(Leucine)이 결합될 수 있다.
실시예
1. 붉은멍게 근육의 아미노산 조성
붉은 멍게 근육의 아미노산 조성 분석 결과를 도 1에 나타내었다. 붉은 멍게의 주요아미노산은 Gly(13.0%), Glu(13.22%) 및 Asp(11.1%)로 나타났다.
2. 붉은멍게 근육 유래의 효소적 단백질 가수분해물 제조
붉은멍게 근육의 단백질 및 콜라겐을 이용하기 위하여 단백질 가수분해 효소를 이용하여 가수분해를 실시 한 후 가수분해도를 측정하였다. 단백질 가수분해 효소는 Alcalase, α-chymotrypsin, Neutrase, papain, pepsin 및 trypsin을 사용하였다. 어류의 근육1.0g를 100ml의 buffer에 넣고 pH와 온도를 각 효소의 최적 조건에 맞추어 1시간 반응시킨 후 효소대 기질을 1:100 비율로 효소를 넣어 준 후 12시간 반응 시켰다. 가수분해 효소별 조건은 표1에 나타내었다. 12시간 반응 후 원심분리하여 상등액을 수거하고, 수거된 상등액은 동결건조하여 β-secretase 활성 측정에 사용하였다. 각 가수분해물의 가수분해도를 측정한 결과, chymotrypsin 가수분해물의 가수분해도가 52.62%로 가장 우수하였다(표2).
Enzyme Buffer pH Temperature (℃)
Alcalase 50mM sodium phosphate 7.0 50
αchymotrypsin 50mM sodium phosphate 8.0 37
Neutrase 50mM sodium phosphate 8.0 50
Papain 50mM sodium phosphate 6.0 37
Pepsin 20mM glycineHCl 2.0 37
Trypsin 50mM sodium phosphate 8.0 37
Degree of hydrolysis (%)
Alcalase 37.19
Chymotrypsin 52.62
Neutrase 40.81
Papain 24.01
Pepsin 25.95
Trypsin 48.42
3. 붉은멍게 근육 가수분해물의 β-secretase 저해활성
β-secretase inhibitory activity assay를 이용하여 각 가수분해물 중 β-secretase 저해 활성이 높은 펩타이드가 다량 함유되어 있는 효소 가수분해물을 선정한다. β-secretase inhibitory activity은 β-secretase assay kit에서 제시한 방법을 변형하여 측정한다. 즉, 70μl buffer (50mM sodium acetate, pH 4.5), 10μl β-secretase (1.0 Unit/ml), 10μl substrate (10mM MCA-[ASN670, LEU671]-AMYLOID BETA/A4 PRECURSOR PROTEIN 77, 50mM sodium acetate buffer, pH 4.5)를 10μl의 시료액과 혼합 후 25℃에서 60분간 암조건에서 반응시킨다. 형광 reader(Bio-Rad)는 excitation 360nm로 하고, emission 405nm로 하여 측정한다. 저해율 공식은 다음과 같다.
Inhibition (%) = [1-{(S-S0)/(C-C0)}]×100
C :　(Enzyme + buffer + substrate) 반응 20분 후
C0:(Enzyme+buffer+substrate)반응 직전 (zero time)
S : (Enzyme + sample + substrate) 반응 20분 후
S0:(Enzyme+sample+substrate)반응 직전 (zero time)
붉은멍게 근육의 각 가수분해물의 β-secretase 저해활성은 IC50값으로 측정하여 표3에 나타내었다. 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성은 Alcalase 가수분해물의 IC50값이 1.23mg/ml로 다른 가수분해물에 비해 높게 나타났다(표 3).
IC50 value (mg/ml)
Alcalase 1.23
Chymotrypsin 1.76
Neutrase 1.43
Papain 1.60
Pepsin 2.50
Trypsin 8.09
4. β-secretase 저해 펩타이드의 분리정제
붉은멍게 근육 가수분해물 중에서 β-secretase 저해활성이 가장 우수한 Alcalase 가수분해물로부터 β-secretase 저해 펩타이드를 분리정제하였다. Alcalase 분해된 붉은멍게 근육 가수분해물을 100mg/ml 농도로 탈이온수에 녹인 후 Sephadex G-25를 충진시킨 column(2.5 × 75cm)에 주입하였다. 분리용매는 탈이온수를 이용하여 1.5ml/min 유속으로 분리하였으며, 흡광도 215nm에서 결과를 측정하여 각 획분으로 분리하였다. 분리결과, 4개의 획분(F1~F4)을 얻었으며, 4개의 분획물 중에서 β-secretase 저해 활성은 획분 F3의 IC50값이 987μg/ml으로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해 활성이 가장 높은 획분 F3는 ODS column (5μm, 10 × 250mm, YMC, lnc. Japan)를 사용하여 Agilent 1000 HPLC에서 분리정제 하였다, 분리용매는 acetonitrile (0.1% trichloroacetic acid)를 40분간 0%에서 20%로 농도구배를 하여 2.0ml/min의 유속으로 분리하였다. 분리결과는 흡광도 215nm에서 측정하여 그래프로 나타냈다. 분리 결과는 3개의 획분(F1~F3)으로 분리되었다. 각 획분의 β-secretase 저해활성은 획분 F1의 IC50 값이 115.1μg/ml로 가장 높게 나타났다. β-secretase 저해활성이 가장 높은 획분 F1는 다시 HPLC에서 분석용 column (particle size 5 μm; 4.6×250 mm)를 사용하여 유속 0.5ml/min의 조건으로 분리하였다. 분리결과는 흡광도 215nm에서 측정하여 그래프로 나타냈었다. 재 분리정제 결과, F1-1 획분의 단일 펩타이드로 분리되었다.
5. β-secretase 저해 펩타이드의 분자량 및 아미노산 서열
아미노산 서열 분석은 순차적으로 nano Ultra Performance Liquid Chromatography(nanoUPLC, Waters Corporation, Milford, MA) 와 연결된 nano-전자분부(ESI) 사극 자(quadrupole) 이온 비행 시간차 분석기(TOF) 질량분석기(Q-TOF Premier, Waters Corporation, Manchester, UK)에 의하여 분석이 이루어졌다. 모든 분석은 양이온 모드로 분석하였다. 이때 scan은 0.6초 간격으로, MS spectra는 m/z 100에서 m/z 1,600의 범위에서 분석하였다. 이때 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온 중, 가장 높은 강도를 보이는 3개를 선택하여 이온 비행 시간차 분석기를 통해 m/z 50 에서 m/z 1,990 범위에서 1.2초 동안 MS/MS spectra를 받았다. 데이터 수집은 초당 이온 검출 강도 20 이상인 이온을 선택하여 분석한다. 분석한 결과 (도3), 붉은멍게 근육 가수분해물로부터 분리된 활성 펩타이디는 Leu-Val-Lys-Val-Glu-Ala (657.8Da)의 6개의 아미노산 잔기를 가지고 있으며, β-secretase 저해 활성 펩타이드의 IC50값은 159.25 μM이였다.

Claims (6)

  1. 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드를 유효 성분으로 함유하는 알츠하이머 질병(Alzheimer's disease)의 억제 또는 예방용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 펩타이드는 상기 붉은멍게 근육을 이루는 단백질을 단백질 가수분해효소로 처리한 가수분해 산물인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 조성물은 베타-시크레타제(β-secretase) 억제 활성을 갖는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드는 0.001 내지 10.0 ㎎/㎖의 농도로 포함되는 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 붉은멍게 근육 유래의 단백질을 가수분해하여 얻어지는 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 서열번호 1의 아미노산 중 N-말단에 류신(Leucine)이 결합된 것인 조성물.
KR1020150114594A 2015-08-13 2015-08-13 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물 KR102177036B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150114594A KR102177036B1 (ko) 2015-08-13 2015-08-13 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150114594A KR102177036B1 (ko) 2015-08-13 2015-08-13 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170019993A KR20170019993A (ko) 2017-02-22
KR102177036B1 true KR102177036B1 (ko) 2020-11-10

Family

ID=58314899

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150114594A KR102177036B1 (ko) 2015-08-13 2015-08-13 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102177036B1 (ko)

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101164020B1 (ko) * 2006-09-29 2012-07-18 한국과학기술연구원 손바닥선인장 추출물을 함유하는 약학 조성물
KR101230650B1 (ko) * 2010-09-29 2013-02-06 강릉원주대학교산학협력단 홍어 껍질 유래의 알츠하이머 질병의 억제 또는 예방을 위한 조성물
KR101297339B1 (ko) * 2011-09-14 2013-08-16 재단법인 강릉과학산업진흥원 어류 껍질 유래의 펩타이드를 함유하는 항알츠하이머 활성의 약학 조성물 및 건강기능식품

Also Published As

Publication number Publication date
KR20170019993A (ko) 2017-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Power et al. Selective enrichment of bioactive properties during ultrafiltration of a tryptic digest of β-lactoglobulin
Jiang et al. Contribution of specific amino acid and secondary structure to the antioxidant property of corn gluten proteins
Hernández-Ledesma et al. Preparation of ovine and caprine β-lactoglobulin hydrolysates with ACE-inhibitory activity. Identification of active peptides from caprine β-lactoglobulin hydrolysed with thermolysin
KR101174299B1 (ko) 카세인 가수분해물, 그 제조법 및 그 용도
Nedjar-Arroume et al. Isolation and characterization of four antibacterial peptides from bovine hemoglobin
Tashima et al. Peptidomics of three Bothrops snake venoms: insights into the molecular diversification of proteomes and peptidomes
Zekiri et al. Purification and characterization of tyrosinase from walnut leaves (Juglans regia)
Valente et al. Bothrops insularis venomics: a proteomic analysis supported by transcriptomic-generated sequence data
Di Bernardini et al. Isolation, purification and characterization of antioxidant peptidic fractions from a bovine liver sarcoplasmic protein thermolysin hydrolyzate
KR101771867B1 (ko) 디펩티딜 펩티다아제 ⅳ (dppⅳ) 저해 펩티드 화합물, 그것을 함유하는 조성물, 및 그 제조 방법
US9486491B2 (en) Collagen peptide composition production method, DPP-4 inhibitor, and antihyperglycemic agent
US8815806B2 (en) Yellow pea seed protein-derived peptides
Demon et al. Proteome-wide substrate analysis indicates substrate exclusion as a mechanism to generate caspase-7 versus caspase-3 specificity
Amici et al. Peroxynitrite-induced oxidation and its effects on isolated proteasomal systems
Krichen et al. Identification and molecular docking of novel ACE inhibitory peptides from protein hydrolysates of shrimp waste
Munawar et al. Isolation and characterization of Bradykinin potentiating peptides from Agkistrodon bilineatus venom
Pujiastuti et al. Screening of angiotensin-I converting enzyme inhibitory peptides derived from soft-shelled turtle yolk using two orthogonal bioassay-guided fractionations
Wiezel et al. Insights into the structure, function and stability of bordonein-L, the first L-amino acid oxidase from Crotalus durissus terrificus snake venom
EP1359157A1 (en) Metallo-proteinase inhibitory agent
Lu et al. Dual‐enzyme hydrolysis for preparation of ACE‐inhibitory peptides from sesame seed protein: optimization, separation, and identification
Schulz et al. A prolyl endopeptidase from Flammulina velutipes for the possible degradation of celiac disease provoking toxic peptides in cereal proteins
Huang et al. Extraction, identification and anti-photoaging activity evaluation of collagen peptides from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) skin
Lee et al. Neuroprotective effect of β-secretase inhibitory peptide from pacific hake (Merluccius productus) fish protein hydrolysate
KR102177036B1 (ko) 붉은멍게 근육 가수분해물 유래의 항알츠하이머성 펩타이드 조성물
WO2015088477A1 (en) Peptide substrates recognizable by type e botulinum neurotoxin

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant