TWI558406B - 兔尾草於促進骨生成或提供神經保護之用途 - Google Patents

Description

兔尾草於促進骨生成或提供神經保護之用途

本發明關於一種使用植物產品促進骨生成或提供神經保護的方法。特別是，本發明使用兔尾草屬(Uraria)促進骨生成或提供神經保護。

骨是身體骨架的結構材料，並且用於保持必需的骨量和結構。骨含有鈣離子(Ca2+)並在維持血液中鈣量扮演重要角色。為此，骨的生長是在骨重建循環的成骨細胞和破骨細胞的活性間的代謝平衡。當骨吸收和骨形成之間的平衡被破壞，成骨細胞替換的骨組織量不配合破骨細胞吸收的骨組織量，因而導致骨質疏鬆症，一種引起骨密度或骨量失去的常見疾病。成骨細胞是骨形成細胞，其源自骨髓間質幹細胞(MSCs)。成骨細胞在創造和維持骨骼架構上扮演非常重要的角色。骨形成涉及一系列複雜的事件，包括成骨細胞的增殖和分化，最終導致細胞外基質的礦化。在成骨細胞發育的各階段，特定的基因被順序表現或再表現，例如，組蛋白4(histone 4)是一個增殖標記，鹼性磷酸酶(alkaline phosphate；ALP)為分化標記與骨鈣素(osteocalcin)為礦化標記。在人類健康方面，骨形成在嬰兒和兒童的骨骼正常生長，在更年期婦女預防骨量損失，以及骨折患者的癒合和重塑是一個重要的臨床關注點。為了防止骨損失與和增加骨形成，需要營養和藥物製劑。因此，成骨細胞初代細胞(osteoblast primary cell)培養的體外模型已被廣 泛地用於尋找誘導成骨細胞分化、基質礦化以及形成新骨的新藥物。有許多影響成骨細胞表型在細胞培養物中的表現的參數。

骨疾病，如骨質疏鬆症，常見於中年或老年婦女。用於骨質疏鬆症的治療劑實例包括，但不限於，雙膦酸鹽產品(亞倫膦酸鹽(alendronate)、依替膦酸鹽(etidronate))、荷爾蒙產品(雷洛昔芬(raloxifene))、維生素D產品、降鈣素(calcitonin)產品與鈣產品。然而，雙膦酸鹽產品具有低吸收率與令人困擾的投藥問題，並可能誘發食道炎。荷爾蒙產品需要終生投藥並具有潛在的副作用，如乳癌，子宮癌，膽結石與血栓症。維生素D產品價格昂貴且不是很有效。降鈣素產品也有成本高與難以投藥的問題。鈣產品具有較低的副作用，但僅限於預防而不是治療。因此，仍有需要新的骨質疏鬆症療法。

植物藥療法已被認為是各種疾病的可行的替代療法。美國第5478549號專利涉及一種用於口服誘導與促進鈣吸收進入哺乳動物骨組織的方法，其包含投藥有效劑量的黃酮糖苷配基糖苷(flavonol aglycone glucoside)結合營養鈣。美國第6340703號專利提供一種治療及預防骨質疏鬆症的方法，包括給予需要這種治療的受試者有效量的異黃酮芒柄花素(isoflavone formononetin)，視需要給予一或多種醫藥上可接受的佐劑、載劑及/或賦形劑。美國第7122214號專利使用Rhizoma Drynariae萃取物(RDE)作為骨質疏鬆治療劑。美國第7350914號專利提供一種醫藥或藥物製劑，包括大豆(Glycine max)，毛喉鞘蕊(Coleus forskohlii)，茶樹(Camellia sinensis)，大蒜(Allium sativum)，催眠睡茄(Withania somnifera)，白花蛇舌草(Boerhavia diffusa)，和薑黃(Curcuma longa)的植物混合物，或者萃取自彼等植物的活性成份混合物。美國第8153167號專利提供一種衍生自6種植物材料的組合物：(i)淫羊藿(Herba epimedii)、(ii)補骨脂(Fructus Psoraleae)、(iii)生地黃(Radix Rehmanniae preparatae)(熟地黃)、(iv)杜仲(Cortex Eucommiae)、 (v)蛇床子(Fructus Cnidii)、(vi)黃芪(Radix Astragali)的組合物；該組合物用於治療與成骨細胞和/或破骨細胞有關的病況，如骨質疏鬆症和有關骨量或絕經的病況、肥胖、葡萄糖不耐症及糖尿病。對骨形成具可能功效的其他傳統中草藥的先前研究包括葛根(Puerariae radix)(Wang,X.,Wu,J.,Chiba,H.,Yamada,K.,& Ishimi,Y.(2005).Puerariae radix prevents bone loss in castrated male mice.Metabolism,54,1536-1541.)、骨碎補(Drynariae rhizome)(Jeong,J.C.,Lee,J.W.,Yoon,C.H.,Lee,Y.C.,Chung,K.H.,Kim,M.G.,& Kim,C.H.(2005).Stimulative effects of Drynariae Rhizoma extracts on the proliferation and differentiation of osteoblastic MC3T3-E1 cells.Journal of Ethnopharmacology,96,489-495.)以及淫羊藿(Epimedium pubescens)(Hsieh,T.P.,Sheu,S.Y.,Sun,J.S.,Chen,M.H.,& Liu,M.H.(2010).Icariin isolated from Epimedium pubescens regulates osteoblasts anabolism through BMP-2,SMAD4,and Cbfa1 expression.Phytomedicine,17,414-423)。

兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.Ex DC.(Fabaceae))是一種傳統可食用植物藥，廣泛分佈在整個印度、泰國、印度尼西亞、中國南部和台灣。已有報導指出可有效地抑制壓力性潰瘍。兔尾草屬顯示一氧化氮的清除與活體外抗氧化作用(Luo,C.,Liu,A.M.,Xing,W.Q.,Shi,G.,Cao,Y.,Pang,J.X.,& Qiu,Y.C.(2011).Antioxidant effect of flavonoids from Uraria crinita.Zhongguo Shiyan Fangjixue Zazhi,17,198-201.)。其治療畏寒、腫脹、胃痛與潰瘍的用途可能是由於其抗發炎活性。在台灣，人們以水煮並如人參茶般飲用其味道、香味、甜味，並止渴；因此它也一直被稱為“台灣人參”。此外，它的根在傳統中藥中用於飲食補充治療小兒骨骼發育不良、以及運動相關的骨扭曲、扭傷與拉傷(Machida,K.,Sakamoto,S.,& Kikuchi,M.(2009).Two new neolignan glycosides from leaves of Osmanthus heterophyllus.Journal of Natural Medicines,63,227-231)。

然而，沒有報導顯示兔尾草與骨骼疾病有關。

本發明提供一種促進骨生成的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。

本發明亦提供一種治療和/或預防骨疾病的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。

本發明進一步提供一種提供神經保護的方法，該方法包括由藥有效量的兔尾草屬其部分或其萃取物至個體。

圖1顯示兔尾草(Uraria crinite；UC)的乙醇萃取物與分配部分(partition fraction)在HOb細胞中的ALP活性。HOb細胞接種於96孔盤中。24小時後，棄去舊培養基，並於成骨細胞分化培養基中以受測萃取物處理細胞(100微克/毫升)72小時。使用對硝基苯基磷酸二鈉基質(p-nitrophenyl phosphate disodium substrate)評估ALP活性。數據以平均值±標準差(n=3)顯示。相較於對照組組(n=3)，* P<0.05和** P<0.01。

圖2顯示兔尾草(UC)乙醇萃取物與分配部分(partition fraction)在HOb細胞中的礦化(mineralization)活性。HOb細胞鋪於24孔盤中，三天後棄去舊培養基，並以受測萃取物(100微克/毫升)於礦化培養基中處理細胞(含有抗壞血酸(50微克/毫升)與β-甘油磷酸(10毫莫耳)的成骨細胞分化培養基)12天。在實驗結束時，將培養物以75%的乙醇固定，且礦化結節(mineralized nodule)形成用茜素紅-S(Alizarin Red-S)染色進行評估。以10%氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)溶液沖提結合的染色物，並使用微量滴定板讀數器(microtiter plate reader)定量。數據以平 均值±標準差(n=3)顯示。相較於對照組組(n=3)，* P<0.05和** P<0.01。

圖3顯示從兔尾草分離的成分的化學結構的示意圖。

圖4顯示出芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷(apigenin 6-C-(β-D-apiofuranosyl(1→2)-α-D-xylopyranoside)(3)的HMBC相關性(H→C)。

圖5顯示分離自兔尾草屬的化合物於HOb細胞中的細胞存活率。HOb細胞接種於96孔盤。24小時後，棄去舊培養基，並以受測化合物(100μM)在成骨細胞分化培養基中處理細胞72小時。使用MTT分析(MTT assay)評估測定細胞活性。數據以平均值±標準差(n=3)顯示。相較於對照組組(n=3)，* P<0.05和** P<0.01。

圖6顯示分離自兔尾草的化合物於HOb細胞中的ALP活性。HOb細胞接種於96孔盤。24小時後，棄去舊培養基，並以受測化合物(100μM)在成骨細胞分化培養基中處理細胞72小時。使用對硝基苯基磷酸二鈉基質(p-nitrophenyl phosphate disodium substrate)評估ALP活性。數據以平均值±標準差(n=3)顯示。相較於對照組組(n=3)，* P<0.05和** P<0.01。

圖7顯示分離自兔尾草的化合物於HOb細胞中的礦化(mineralization)活性。HOb細胞鋪於24孔盤中，三天後棄去舊培養基，並以受測萃取物(100微克/毫升)於礦化培養基中處理細胞(含有抗壞血酸(50微克/毫升)與β-甘油磷酸(10毫莫耳)的成骨細胞分化培養基)12天。在實驗結束時，將培養物以75%的乙醇固定，且礦化結節(mineralized nodule)形成用茜素紅-S(Alizarin Red-S)染色進行評估。以10%氯化十六烷基吡啶(cetylpyridinium chloride)溶液沖提結合的染色物，並使用微量滴定板讀數器(microtiter plate reader)定量。數據以平均值±標準差(n=3)顯示。相較於對照組組(n=3)，* P<0.05和** P<0.01。

本發明驚訝地發現兔尾草屬或其萃取物增加骨生成且可刺激骨骼生長及修復，並提供神經保護的效果。

除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員的通常理解相同的含義。雖然任何方法和類似或等同於本文描述的材料可用於實施或測試本發明，較佳的方法和材料被描述。用於本發明的目的，下列用語定義如下。

如本文使用者，用語“一”和“一個”是指該冠詞的語法對象的一個或多於一個(即，至少一個)。

如本文使用者，在申請專利範為中的用語“或”係指“和(及)/或”，除非明確指明僅為或者，或除非該或者是互斥的。

如本文使用者，用語“促進”、”增進”或”改進”是指活性、反應、病況、疾病、或其他生物參數的增進。

如本文使用者，用語“個體”包括活的生物，例如人，猴子，牛，綿羊，馬，豬，牛，山羊，狗，貓，小鼠，大鼠，培養的細胞與轉基因物種。在一較佳具體實施例，個體為人。

如本文使用者，用語“投藥”(或施用)包括給藥途徑，允許本發明的兔尾草屬執行其預期功能。

如本文使用者，用語“治療”是指減輕疾病或病症的影響的方法。治療也可以指減少疾病或病症本身的原因的方法。治療也可以是從天然水平的任何降低，並且可為但不限於疾病，病症，或疾病或病症的症狀完全消除。

如本文使用者，用語“預防”是指抑制或減輕與骨質疏鬆症相關的症狀。

如本文使用者，用語“有效量”是指有效治療和/或預防骨質疏鬆症 或提供神經保護作用的兔尾草屬的量。

如本文使用者，用語“成骨細胞”或“成骨(骨生成)”是指自未分化的幹細胞和成骨細胞系增殖為成骨細胞和骨組織(例如，新骨基質的合成與積存)。成骨也指祖細胞(progenitor)或前體細胞(precursor cell)分化或轉分化為骨細胞(即，成骨細胞)。祖細胞或前體細胞可以是多能幹細胞，包括，例如，間質幹細胞。祖細胞或前體細胞可為預定形成骨細胞系的細胞(例如，預成骨細胞(pre-osteoblast cells))或未預定形成成骨細胞系的細胞(例如，前脂肪細胞或成肌細胞(myoblast))。

如本文使用者，用語“骨疾病”是指與骨組織損失有關的疾病，如骨質疏鬆症。

促進骨生成及治療和/或預防骨質疏鬆症之方法

在一方面，本發明提供一種促進骨生成的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。本發明也提供一種兔尾草屬或其部分或其萃取物用於製造促進骨生成的藥劑的用途。

在另一方面，本發明提供一種增加骨量的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。本發明也提供一種兔尾草屬或其部分或其萃取物用於製造增加骨量的藥劑的用途。

在另一方面，本發明提供一種提高或增強骨生長速率的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。本發明也提供一種兔尾草屬或其部分或其萃取物用於製造提高或增強骨生長速率的藥劑的用途。

在又一方面，本發明提供一種治療和/或預防骨疾病的方法，該方法包括投藥有效量的兔尾草屬或其部分或其萃取物至個體。本發明也提供一種兔尾草屬或其部分或其萃取物用於製造治療和/或預防骨疾病的藥劑的用途。

在體外或在體內，可以使用本領域中已知的任何方法來檢測骨生 成的誘導；例如，藉由檢測成骨細胞特異性蛋白質的表現，檢測骨特異性轉錄因子的表現，及檢測骨密度的改變。成骨細胞特異性蛋白質包括，例如，鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase；ALP)，I型膠原蛋白，骨鈣素(osteocalcin)，和造骨蛋白(osteoponin)(Olsen et al.,Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.16：191(2000))。在一些具體實施例，鹼性磷酸酶的表現被檢測作為骨生成的指標。骨特異性轉錄因子包括，例如，Cbfa1/Runx2，GSC，D1x1，D1x5，Msx1，Cart1，Hoxa1，Hoxa2，Hoxa3，Hoxb1，rae28，Twist，AP-2，MF1，Pax1，Pax3，Pax9，TBX3，TBX4，TBX5和Brachyury(Olsen et al,2000,supra)。

本發明的方法可用於治療骨疾病。可根據本發明，藉由增加骨質量或骨生長進行治療骨疾病，包括但不限於，骨質疏鬆症，關節炎，骨關節炎，牙周病，牙槽骨質流失，截骨術骨質流失，兒童特發性骨質流失，曲率脊柱及高度的損失。根據本發明可治療破壞性骨疾病，包括但不限於，骨質疏鬆症，骨關節炎和溶骨性病變，例如那些由腫瘤疾病，放療，或化療引起的病變。

骨疾病可由特徵為低骨質量，骨缺損，或軟骨缺損的情況所引起。用語“骨量(骨質量)”是指每單位體積的骨量。特點是低骨量的病況是其中骨量水平低於特定年齡的正常水平，如“Assessment of Fracture Risk and Its Application to Screening for Postmenopausal Osteoporosis," Report of a World Health Organization Study Group,World Health Organization Technical Series 843(1994)”中所定義。骨缺損是骨形成對骨吸收的比例失衡，如此，如未修飾，個體會呈現低於期待的骨骼，或個體的骨骼會比預期的較不完整。骨缺損也可由骨折、從手術介入或從牙齒或牙周疾病而導致。骨癒合包括，但不限於，修復骨缺損，如發生於，例如，封閉、開放和未癒合性骨折。軟骨缺損為損傷的軟骨，比預期少的軟骨，或較預期不完整的軟骨。

包括特徵為低骨質量的病況是，但不限於，原發性和繼發性骨質疏鬆症，牙周病，牙槽骨質流失，截骨術骨流失，兒童期特發性骨質流失。特徵為低骨質量的病況還包括，但不限於，骨質疏鬆症的長期併發症如脊柱彎曲，高度的損失和假體手術。

骨質疏鬆症或多孔骨是一種疾病，特徵是每單位體積的骨質量淨流失。此種骨質量流失及所導致的骨折的後果是骨架的破壞，以提供身體足夠的結構支撐，低骨量和骨組織的結構退化導致骨脆性和增加髖關節、脊椎和手腕的骨折。發生骨質流失沒有症狀。骨質疏鬆症包括“繼發性骨質疏鬆症”，如糖皮質激素誘導的骨質疏鬆症(glucocorticoid-induced osteoporosis)，甲狀腺功能亢進引起的骨質疏鬆症，固定化導致的骨質疏鬆症，肝素誘發的骨質疏鬆症或免疫抑制誘發的骨質疏鬆症。在患有骨質疏鬆症的病患，骨頭會變得脆弱使得突然緊張可引起骨折或引起脊椎塌陷。目前大多數的骨質疏鬆症治療停止持續的骨質流失，但無法增強骨形成且因此骨的質量仍然很差，但不會變得更糟。

在一具體實施例，任何本發明的上述方法包括投藥骨生成促進劑的額外步驟。任何本發明的上述用途中的藥劑另包括骨生成促進劑。較佳地，所述額外活性劑係選自雙膦酸鹽(bisphosphonates)。較佳的雙膦酸鹽包括但不限於，替魯膦酸(tiludronic acid)，阿崙膦酸(alendronic acid)，唑來膦酸(zoledronic acid)，伊班膦酸(ibandronic acid)，利塞膦酸(risedronic acid)，依替膦酸(etidronic acid)，克羅膦酸(clodronic acid)，和帕米膦酸(pamidronic acid)以及它們的藥學上可接受的鹽。本領域技術人員將會知道，這些化合物通常以其離子形式表示，例如，替魯膦酸鹽(tiludronate)，阿崙膦酸鹽(alendronate)，唑來膦酸鹽(zoledronate)，伊班膦酸鹽(ibandronate)，利塞膦酸鹽(risedronate)，依替膦酸(etidronate)，克羅膦酸鹽(clodronate)和帕米膦酸鹽(pamidronate)。特別較佳的雙膦酸鹽包 括阿崙膦酸鹽與利塞膦酸鹽。

提供神經保護的方法

在另一方面，本發明提供了用於提供神經保護的方法，該方法包括由藥有效量的兔尾草屬其部分或其萃取物至個體。本發明也提供一種兔尾草屬或其部分或其萃取物用於製造提供神經保護的藥劑的用途。

神經保護是指用於急性疾病(如中風或腦部或神經系統損傷/創傷，缺氧，脊髓損傷或週圍神經損傷)後防止神經系統中腦/神經元損傷或退化或防止慢性神經退化疾病(如帕金森氏病，阿茲海默氏病，多發性硬化症)結果的機制和策略。神經保護的目的是中樞神經系統損傷後減少神經元功能障礙/死亡，並嘗試維持大腦細胞相互作用的最大可能的完整性，從而產生未受干擾的神經功能。藉由提供神經保護，兔尾草屬或其部分或其萃取物可用於治療神經損傷(如中風，尤其是缺血性中風，腦損傷，缺氧，脊髓損傷或週圍神經損傷)，以及治療或預防神經退化疾病。

用於本發明方法或用途的兔尾草屬或其部分或其萃取物

兔尾草屬(Uraria)為豆科，蝶形花科中開花植物的一個屬。它屬於蝶形花亞科(Faboideae)。在一具體實施例，兔尾草屬是選自下列群組：兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)，圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)，Uraria acaulis Schindl，Uraria acuminata Kurz，Uraria balansae Schindl.，Uraria barbata Lace，Uraria campanulata(Benth.)Gagnep.，Uraria candida Backer，Uraria clarkei Gagnep.，Uraria cochinchinensis Schindl.，Uraria cordifolia Wall.，Uraria crinita(L.)DC.，Uraria cylindracea Benth.，Uraria fujianensis Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria gossweileri Baker f.，Uraria kurzii Schindl.，Uraria lacei Craib，Uraria lagopodoides(L.)DC.，Uraria lagopus DC.，Uraria longibracteata Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria pierrei Schindl.，Uraria poilanei Phon，Uraria prunellifolia Baker，Uraria rotundata Craib，Uraria rufescens(DC.)Schindl.及Uraria sinensis(Hemsl.)Franch。較佳地，兔尾草屬為兔尾草，大葉兔尾草，羽葉兔尾草或圓葉兔尾草。更佳地，兔尾草屬為兔尾草。較佳地，兔尾草屬萃取物為兔尾草，大葉兔尾草，羽葉兔尾草或圓葉兔尾草的萃取物。

整個兔尾草屬植物或兔尾草屬植物的所有部分可以在本發明中使用。在一具體實施例，兔尾草屬植物的根部被用在本發明。

在一具體實施例，兔尾草屬的萃取物可用於本發明。較佳地，兔尾草，大葉兔尾草，羽葉兔尾草或圓葉兔尾草用於得到萃取物。較佳地，該兔尾草屬為兔尾草。更佳地，兔尾草用於獲得該萃取物。較佳地，所述萃取物是整個兔尾草屬植物的有機溶劑萃取物，較佳的萃取物是兔尾草屬根的有機溶劑萃取物。較佳地，所述萃取物是甲醇萃取物，乙醇萃取物，丙醇萃取物，丁醇萃取物或己烷萃取物。更佳地，所述萃取物是乙醇萃取物。根據本發明的一具體實施例，有機溶劑萃取物可進一步用己烷，乙酸乙酯和丁醇的分配(partition)，得到己烷萃取物，乙酸乙酯萃取物和丁醇萃取物。因此，本發明提供了一種兔尾草屬萃取物，它是由以下步驟產生：以乙醇萃取兔尾草屬得到乙醇萃取物，並以乙酸乙酯或丁醇萃取乙醇萃取物得到得到乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。乙酸乙酯萃取物可進一步劃分，得到9個部分。這些部分的第3部分進一步用Sephadex LH-20管柱色層分析(chromatograph)分離和純化，並以甲醇/水萃取得到17個部分。將所得部分進一步以色層分析分離。因此，可得到一種新的化合物，芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷。據此，本發明提供一種兔尾草屬萃取物， 其是藉由萃取兔尾草屬得到乙醇萃取物，並以乙酸乙酯或丁醇萃取乙醇萃取物以得到乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。

任何本領域已知的萃取技術可用於製備本發明的萃取物。所得到的萃取物可進一步以色層分析進一步劃分。較佳的色層分析是採用溶劑沖提的液相色層分析。較佳地，所述液相色層分析是高效液相色層分析(HPLC)或逆相HPLC。

分離自兔尾草屬或其部分或其萃取物的新化合物

本發明提供一種從兔尾草屬或其部分或其萃取物中分離的下列新化合物：

芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷(apigenin 6-C-(β-D-apiofuranosyl(1→2)-α-D-xylopyranoside)。

因此，本發明提供一種式(I)化合物，

其中R₁是呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖基(apiofuranosyl-α-L-arabinopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-葡萄糖吡喃基(apiofuranosyl-β-D-glucopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃半乳糖基(apiofuranosyl-β-D-galactopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃木糖基 (apiofuranosyl-β-D-xylopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃阿拉伯糖基(apiofuranosyl-β-D-arabinopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃核糖基(apiofuranosyl-β-D-ribopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃來蘇糖基(apiofuranosyl-β-D-lyxopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃核酮糖基(apiofuranosyl-β-D-ribulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃木酮糖(apiofuranosyl-β-D-xylulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-阿洛吡喃糖基(apiofuranosyl-β-D-allopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃阿卓糖基(apiofuranosyl-β-D-altropyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃甘露糖基(apiofuranosyl-β-D-mannopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃古洛糖基(apiofuranosyl-β-D-gulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃艾杜糖基(apiofuranosyl-β-D-idopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃塔洛糖基(apiofuranosyl-β-D-talopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃葡萄糖基(apiofuranosyl-α-L-glucopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃半乳糖基(apiofuranosyl-α-L-galactopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃木糖基(apiofuranosyl-α-L-xylopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-阿拉伯吡喃糖基(apiofuranosyl-α-L-arabinopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃核糖基(apiofuranosyl-α-L-ribopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃來蘇糖基(apiofuranosyl-α-L-lyxopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃核酮糖基(apiofuranosyl-α-L-ribulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃木酮糖基(apiofuranosyl-α-L-xylulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-阿洛吡喃糖基(apiofuranosyl-α-L-allopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃阿卓糖基(apiofuranosyl-α-L-altropyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃甘露糖基(apiofuranosyl-α-L-mannopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃古洛糖基(apiofuranosyl-α-L-gulopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-α-L-艾杜吡喃糖基(apiofuranosyl-α-L-idopyranosyl)或呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃塔洛糖基(apiofuranosyl-α-L-talopyranosyl)。

較佳地，R₁是呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖基，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃阿拉伯糖基，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃葡萄糖基，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃半乳糖基，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃木糖基或呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃阿拉伯糖基。更佳地，R₁是呋喃芹菜糖基-α-L-吡喃阿拉伯糖基。

具通式(I)中R₁的不同糖基團的化合物可根據本領域中已知的方法(Org.Biomol.Chem.,2010,8,4451-4462)，從芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃阿拉伯糖苷修飾而得。連接R1的各種糖基至芹菜素(4',5,7-三羥基黃酮)的合成方案如下所示：

兔尾草屬，其部分或其萃取物可與藥學上可接受的載劑，賦形劑，稀釋劑和/或鹽一起調配為用於給藥的醫藥組合物或藥物。

藥學上可接受的載劑，稀釋劑，賦形劑和/或鹽是指載劑，稀釋劑，賦形劑和/或鹽必須與製劑中的其他成分相容，不會不利地影響兔尾草屬其部分或其萃取物的治療益處，並且不會使其接受者受害。

用於實施本發明的兔尾草屬，其部分或其萃取物或其醫藥組合物的投藥可為全身性及/或局部(例如，在骨折，截骨術或矯形手術的部位)遞送化合物的任何方法。這些方法包括口服途徑，非經腸途徑，十二指腸內途徑等。

在局部應用中，兔尾草屬，其部分或其萃取物或其醫藥組合物施用於骨折，截骨術或移植物的位置，例如，藉由注射合適溶劑(例如，油性溶劑如花生油)中的兔尾草屬，其部分或其萃取物於骨折部位或者骨癒合部位，或在開放手術的情況下，藉由局部應用，例如合適載劑(例如骨蠟，去礦化骨末，聚合的骨水泥，骨密封劑，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸-聚乙醇酸等)中的例如骨蠟，脫鈣骨粉末，聚合的骨水泥，骨密封劑，聚乳酸，聚乙醇酸，聚乳酸，聚乙醇酸等其部分或其萃取物。或者，局部應用可藉施用在溶液載劑中的兔尾草屬，其部分或其萃取物的溶液或分散液於表面或將其併入骨外科中常規使用的固體或半固體植入物，如滌綸網片(Dacron-mesh)，凝膠泡沫和基爾骨(kiel bone)，或假體(proctheses)。

對於局部施用，兔尾草屬，其部分或其萃取物或其醫藥組合物可調配製成含有活性成分懸浮或溶解於一種或多種載劑的合適軟膏劑。用於本發明的兔尾草屬，其部分或其萃取物的局部給藥的載劑包括，但不限於，礦物油，液體凡士林，白凡士林，丙二醇，聚氧乙烯，聚氧丙烯化合物，乳化蠟，糖，如乳糖和水。或者，所述醫藥組合物可以配製成含有懸浮或溶解於一種或多種藥學上可接受的載劑的兔尾草屬，其部分或其萃取物的乳劑或乳膏。合適的載劑包括，但不限於，礦物油，山梨醇單硬脂酸酯，聚山梨醇酯60，鯨蠟酯蠟，鯨蠟硬脂醇，2-辛基十二烷醇，苯甲醇和水。

根據具體的擬處理情況，病症或疾病，額外治療劑可以與兔尾草屬，其部分或其萃取物一起給藥。這些額外的治療劑與含有兔尾草屬， 其部分或其萃取物的組合物，可以任何順序依次給藥，作為多劑量療程的一部分(連續或間歇給藥)。或者，那些藥劑可為單一劑型的一部分，與兔尾草屬，其部分或其萃取物一起混和於單一組合物(同時給藥)。

對於口服給藥，用於本發明的醫藥組合物可為溶液，懸浮液，錠劑，丸劑，膠囊劑，散劑，顆粒劑，半固體，緩釋製劑，酏劑，氣霧劑等型式。錠劑含有各種賦形劑如檸檬酸鈉，碳酸鈣和磷酸鈣與各種崩解劑如澱粉，較佳為馬鈴薯或木薯澱粉和某些複合矽酸鹽，以及結合劑如聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖，明膠和阿拉伯膠。另外，潤滑劑如硬脂酸鎂，十二烷基硫酸鈉和滑石對於壓錠目的常常是非常有用的。類似的固體組合物也用作軟和硬填充明膠膠囊的填充劑，在這方面較佳的材料也包括乳糖或牛乳糖以及高分子量聚乙二醇。當水性懸浮液和/或酏劑用於口服給藥時，本發明的兔尾草屬，其部分或其萃取物可結合各種甜味劑，調味劑，著色劑，乳化劑和/或懸浮劑，以及稀釋劑，例如如水，乙醇，丙二醇，甘油及其各種類似組合。

製劑的選擇取決於多種因素，例如藥物給藥模式(例如，於口服給藥，製劑為錠劑，丸劑或膠囊的形式是較佳的)與藥物物質的生物可利用率。

本文所用的術語“非經腸”是指給藥方式，包括靜脈內，肌內，腹膜內，胸骨內，皮下，髓內和關節內注射和輸注。用於非經腸注射的醫藥組合物可包含藥學上可接受的無菌水或非水性溶液，分散液，懸浮液或乳液，以及使用前重新配製成無菌注射溶液或分散液的無菌粉末。水溶液特別適用於靜脈內，肌內，皮下和腹膜內注射的目的。在這方面，所用的無菌水介質都是由本領域技術人員的標準技術容易獲得的。合適的水性和非水性載劑，稀釋劑，溶劑或賦形劑的實例包括水，乙醇，多元醇(如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，羧甲基纖維素及 其合適的混合物，植物油(如橄欖油)，以及可注射的有機酯如油酸乙酯。適當的流動性可以被保持，例如，藉由使用包衣材料如卵磷脂，藉由在分散液的情況下維持所要求的粒徑，以及藉由使用表面活性劑。

用於本發明的醫藥組合物也可包含佐劑，例如，但不限於，防腐劑，潤濕劑，乳化劑和分散劑。防止微生物作用可藉由包含各種抗菌劑和抗真菌劑來確保，例如對羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸等。它也可以包括等滲劑，例如糖，氯化鈉等。可注射藥物形式的延長吸收可藉由包含延遲吸收的物質如單硬脂酸鋁和明膠來實現。

緩慢輸注給藥對於鞘內或硬膜外途徑特別有用。用於遞送化合物的許多可植入或經調節的速率的體內可安裝幫浦是本領域已知的。參見，例如，美國第4619652號專利。

懸浮液，除活性化合物之外，可包含懸浮劑，例如，乙氧基化異硬脂醇，聚氧乙烯山梨醇和脫水山梨醇酯，微晶纖維素，偏氫氧化鋁，膨潤土，瓊脂，和黃蓍膠(tragacanth)，以及它們的混合物。

為了經皮(如局部)給藥，製備稀釋無菌水溶液或部分水性溶液(通常在約0.1%至5%的濃度)，類似於上述非經腸溶液。

用於本發明的醫藥組合物還可藉由鼻氣霧劑或吸入給藥。此種組合物可根據藥物製劑領域中的公知技術製備，並且可製備為鹽水溶液，採用苯甲醇或其它台適的防腐劑，吸收促進劑以提高生物可利用率，碳氟化合物，和/或其它常規增溶劑或分散劑。

用於直腸或陰道給藥的組合物較佳為栓劑，可以藉由混合本發明兔尾草屬，其部分或其萃取物與合適的無刺激性賦形劑或載劑，如可可脂，聚乙二醇或栓劑蠟(在室溫下是固體而在體溫下為液體，因此在直腸或陰道腔中溶化並釋放藥物)，來製備。

其它藥學上可接受的載劑包括，但不限於，無毒性的固體，半固體或液體填充劑，稀釋劑，包膠材料或任何類型的製劑助劑，包括但 不限於，離子交換劑，氧化鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，緩衝物質如磷酸鹽，甘胺酸，山梨酸，山梨酸鉀，飽和植物脂肪酸，水，鹽或電解質的偏甘油酯混合物，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，氫氫磷酸鹽，氯化鈉，鋅鹽，膠體二氧化矽，三矽酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，基於纖維素的物質，聚乙二醇，羧甲基纖維素鈉，聚丙烯酸酯，蠟，聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂。

固體藥用賦形劑包括，但不限於，澱粉，纖維素，滑石，葡萄糖，乳糖，蔗糖，明膠，麥芽，大米，麵粉，白堊，矽膠，硬脂酸鎂，硬脂酸鈉，甘油單硬脂酸酯，氯化鈉，脫脂奶粉等。液體和半固體賦形劑可以選自甘油，丙二醇，水，乙醇和各種油進行選擇，包括那些石油，動物，植物或合成來源，例如，花生油，大豆油，礦物油，芝麻油等。較佳的液體載劑，特別是用於可注射溶液，包括水，鹽水，葡萄糖水溶液和乙二醇。

製備含一定量活性成分的各種醫藥組合物的方法是已知的，或根據本揭露，對那些本領域技藝人士將是顯而易見。其它合適的藥物賦形劑及其製劑係描述於Remington's Pharmaceutical Sciences,edited by E.W.Martin,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)。

用於本發明的醫藥組合物含有1%-100%(按重量計)的兔尾草屬，其部分或其萃取物，較佳為10%-100%，10%-95%或20%-95%(按重量計)。在任何情況下，待給藥的組合物或製劑將根據本發明的有效量的治療，被治療的受試者的狀況，病症或疾病，決定所含有兔尾草屬，其部分或其萃取物的量。

本領域的普通技術人員將會理解，醫藥上有效量的兔尾草屬，其部分或其萃取物可以憑經驗確定，並可以純的形式(當這樣的形式存在)，以藥學上可接受的鹽，酯或前藥的形式使用。該藥劑可以施用於患者作為與一種或多種藥學上可接受的賦形劑組合的醫藥組合物。將 會理解的是，當施用於，例如，人類患者，本發明的藥劑或組合物的總每日用法將在可靠的醫學判斷範圍內由主治醫師決定。具體的治療有效劑量對於任何特定患者，將取決於多種因素：要達到的細胞反應類型和程度，使用的具體藥劑或組合物的活性，使用的具體試劑或組合物，年齡，體重，一般健康狀況，患者的性別和飲食，給藥時間，給藥途徑和藥劑的排泄速率，治療的持續時間，組合使用或同時使用的特定藥劑的藥物，以及在醫學領域中已知的類似因素。

投劑也可以安排在患者中特定的方式，以提供在血液中的藥物的預定濃度，如由接受的技術和常規的技術來確定。

或者，兔尾草屬，其部分或其萃取物可用食品級載劑，賦形劑，稀釋劑和/或鹽作為健康食品或膳食補充劑。上述載劑的賦形劑，稀釋劑和/或鹽可以在本發明的健康食品或膳食補充劑中使用。健康食品或膳食補充劑可以各種形式存在，包括但不限於錠劑，膠囊，膠囊形錠劑，粉劑，飲料，包括奶昔，固體食品，包括點心棒等。

對相關領域的普通技術人員而言，其它合適的修改和調整將是顯而易見的，以本文所述的方法和應用可以在不脫離本發明或其任何實施方案的精神和範圍。提供下列實施例以說明但不限制本發明。

實施例

材料與方法

植物材料

兔尾草(Uraria crinite)的根是從名間鄉農協會，台灣南投縣收集，並由郭昭麟先生，中國藥學暨中藥資源學系，中國醫藥大學，台中，台灣鑑定。一標本(M-343)貯存於台北醫學大學生藥學研究所，台灣。

試劑和化學品

DMSO(二甲亞碸)，噻唑藍四氮唑溴化物(MTT)，曲拉通X-100(Triton X-100)，對硝基苯基磷酸二鈉基質，茜素紅-S(Alizarin Red-S)， 西吡氯銨一水合物(cetylpyridinium chloride monohydrate)，抗壞血酸，β-甘油磷酸二鈉鹽水合物購自Sigma-Aldrich公司(Sigma,St.Louis,Missouri,USA)。磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)和胰蛋白酶購自Gibco(Gibco Canada Inc.,Burlington,Ont.,Canada)。成骨細胞的旋光度以JASCO P-1020數位旋光儀(JASCO P-1020 digital polarimeter)測定。紫外線光譜用Hitachi U-2800 U-2800紫外/可見分光光度計(Hitachi U-2800 UV/vis spectrometer)測定。1D-和2D-核磁共振(NMR)光譜以Bruker AM-500光譜儀使用二甲亞碸-d6，MOH-d4，和D₂O溶液測定。HRESI-MS和ESI-MS分析以購自Cell Applications(Cell Applications,Inc.,San Diego,CA,USA)的VG Platform Electrospray ESI/MS測定。所有用於本研究的化學品和試劑為高等級的商業產品。其他材料包括BCA(二辛可寧酸；bicinchoninic acid)蛋白質測定試劑盒(Thermo Scientific,Rockford,IL,USA)及4-硝基苯基磷酸二鈉鹽六水合物(4-nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate)(Alfa Aesar,Ward Hill,Massachusetts,USA)。

一般實驗方法

旋光度以JASCO P-1020數位旋光儀測定。紫外線光譜用Hitachi U-2800 U-2800紫外/可見分光光度計測定。1D-和2D-核磁共振(NMR)光譜以Bruker AM-500光譜儀使用二甲亞碸-d6，MOH-d4，和D₂O溶液測定。HRESI-MS和ESI-MS以VG Platform Electrospray ESI/MS進行分析。

粗萃取物的製備與純化

新鮮的兔尾草根(14.7公斤)用含水乙醇(95%v/v，共120升公升)萃取3次。過濾後，將濾液蒸發並在真空下乾燥。乾燥後的萃取物(601.4克)懸浮於H₂O，並依次以正己烷，乙酸乙酯(EtOAc)和正丁醇(n-BuOH)劃分，分別得到78.4，32.0，和133.9克的萃取物。在EtOAc和正丁醇萃取物具有最大的基質礦化活性(matrix mineralization activities)(圖2)。將 EtOAc萃取物經葡聚醣凝膠Sephadex LH-20管柱以95%的乙醇沖提，得到9個部分(UCE-1至UCE-9)。UCE-3部分以Sephadex LH-20管柱層析進一步分離，並以MeOH/H₂O(40~100%)沖提，得到17個部分(UCE-3-1至UCE-3-17)。UCE-3-7部分以MCI CHP-20管柱層析用H₂O-MeOH梯度沖提，得到14個次部分(UCE-3-7-1至UCE-3-7-14)。化合物2(98.1毫克)UCE-3-7-4部分經MeOH/H₂O再結晶後得到。UCE-4部分用Sephadex LH-20管柱層析進一步分離，並以MeOH/H₂O(50至100%)沖提，得到17個部分(UCE-4-1至UCE-4-17)。UCE-4-3及UCE-4-10部分經MCI CHP-20管柱，並用MeOH/H₂O(30至100%)沖提，分別得到8個(UCE-4-3-1~UCE-4-3-8)和11個次部分(UCE-4-10-1至UCE-4-10-11)。化合物11(12.0毫克)從UCE-4-3-2部分經HPLC於半製備C-18逆向管柱，以10% MeOH作為沖提溶劑系統純化後獲得。化合物4(6.9毫克)從UCE-4-10-2部分經HPLC於半製備C-18逆向管柱，以25% MeCN作為沖提溶劑系統純化後獲得。UCE-5部分用MCI CHP-20管柱層析，以H₂O-MeOH梯度沖提，得到24個次部分(UCE-5-1至UCE-5-24)。UCE-5-15和UCE-5-16部分經葡聚醣凝膠Sephadex LH-20管柱，以MeOH/H₂O(60%)沖提，分別得到6個(UCE-5-15-1至UCE-5-15-6)和10個次部分(UCE-5-16-1至UCE-5-16-10)。化合物3(12.2毫克)和化合物1(184.5毫克)從UCE-5-15-1和UCE-5-16-9部分經HPLC於半製備C-18逆向管柱，以55% MeOH作為沖提溶劑系統純化後獲得。正-丁醇萃取物經Diaion HP-20管柱，以H₂O-MeOH梯度沖提，得到6個次組分(UCB-1至UCB-6)。UCB-3，UCB-4及UCB-5部分通過各自的Sephadex LH-20管柱，以95%EtOH沖提進一步分離，分別得到6個(UCB-3-1至UCB-3-6)，9個(UCB-4-1至UCB-4-9)和6個(UCB-5-1至UCB-5-6)部分。UCB-3-3和UCB-5-2部分經MCI CHP-20管柱層析，以H₂O-MeOH梯度沖提分離，分別得到6個(UCB-3-3-1~UCB-3-3-6)和8個(UCB-5-2-1至 UCB-5-2-8)次部分。化合物7(38.3毫克)和化合物8(15.3毫克)從UCB-3-3-2部分得到。化合物5(58.6毫克)和化合物6(7.6毫克)從UCB-3-3-3和UCB-5-2-1部分以各自的HPLC於半製備C-18逆向管柱，以20% MeOH作為沖提溶劑系統純化後獲得。UCB-4-3和UCB-4-4部分經MCI CHP-20管柱，並以MeOH/H₂O(分別為60~100%和20~100%)分離純化，分別得到4個(UCB-4-3-1到UCB-4-3-4)和9個(UCB-4-4-1至UCB-4-4-9)次部分。化合物9(38.5毫克)從UCB-4-3-3部分經HPLC於半製備C-18逆向管柱，以20% MeOH作為沖提溶劑系統純化後獲得。化合物10(13.5毫克)從UCB-4-4-3部分經HPLC於半製備C-18逆向管柱，以40% MeOH作為沖提溶劑系統純化後獲得。

化合物3的酸水解

將1毫克的化合物3以加熱塊在80℃下以6N HCl水解6-8小時。將混合物冷卻，並蒸發以除去酸，然後再分析前，再懸浮於milli-Q水中，並通過Millipore-GX尼龍膜。化合物3和多醣水解物的單糖以高效陰離子交換層析(HPAEC)系統(Dionex,Sunnyvale,CA)和陰離子交換管柱(Carbopac PA-10,4.6 x 250mm)分離。單糖的分析使用等度18mM氫氧化鈉溶液在環境溫度下進行。

芹菜素6-C-(β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷(3)：黃色固體；[α]22D+21(c 0.5,MeOH)；UV(MeOH)λmax(log ε)：272(4.36),329(4.35)nm；1H-NMR(DMSO-d6,500MHz)and 13C-NMR(DMSO-d6,125MHz)，參表1；HRESI-MS m/z 535.1459[M+H]+(C25H27O13,535.1452計算值)。

細胞培養

人類成骨細胞(HOB)是來源於63歲的白人女性的正常股骨並得自Cell Applications(San Diego,CA,USA)的原代細胞。HOb細胞生長於成骨細胞生長培養基(Osteoblast Growth Medium)，並維持於37℃，5%CO₂的濕潤 環境。培養基每隔一天更換。為維持指數生長，細胞每7天傳代培養。Hob細胞用於細胞存活，分化和礦化測定。

細胞存活檢測

兔尾草萃取物及其部分的細胞存活是使用MTT檢測來測定。HOb細胞以每孔盤4×10³個細胞的密度接種於96孔盤中。接種24小時後，棄去舊培養基，並以受測萃取物或化合物處理細胞。經過72小時的培養後，棄去舊培養基並加入MTT試劑到每個孔中並培養4小時。然後棄去培養基，並加入100μl的DMSO到所有孔中，並充分混合以溶解深藍色結晶。用ELISA讀數器(ELISA reader)記錄在600nm處的吸光度。

鹼性磷酸酶(ALP)檢測

兔尾草萃取物及其部分的鹼性磷酸酶(ALP)活性以磷酸對硝基苯酯(p-nitrophenyl phosphate)作為基質測定。HOb細胞以每孔盤4×10³個細胞的密度接種於96孔盤中。接種24小時後，棄去舊培養基，並以受測萃取物或化合物處理在成骨細胞分化培養基(Osteoblast Differentiation Medium)中的細胞。經過72小時的培養，棄去培養基，將細胞用冷PBS沖洗兩次，並用裂解緩衝液(PBS，含0.1%的Triton X-100)裂解細胞。在上清液中的細胞蛋白質濃度，在37℃下以BCA(二辛可寧酸)蛋白試劑處理1小時後測定，加入1M NaOH停止反應並測定560nm的吸光度。此外，上清液中的鹼性磷酸酶在37℃下，於0.1M的NaHCO3-Na2CO3緩衝液(pH 10，含有0.1%Triton X-100，2mM的MgSO₄及6mM磷酸對硝基苯酯)中1小時後測定活性。加入1M NaOH停止反應並測定在405nm處的吸光度。每個值被正常化為蛋白質濃度。

礦化基質形成分析(Mineralized Matrix Formation Assay)

兔尾草萃取物及其部分的礦化活性是由鈣的茜素紅-S染色測定。HOb細胞以每孔盤7×10⁴個細胞的密度接種於96孔盤中。接種3天後，棄去舊培養基，並以受測萃取物或化合物處理在含有抗壞血酸(50微克 /毫升)和β-甘油磷酸(10mM)的礦化培養基(Osteoblast Differentiation Medium)中的細胞12天。在實驗結束時，將培養物固定在75%的乙醇，及鈣沉積在室溫下用茜素紅-S溶液(40mM，pH值4.2)染色15分鐘。以於10mM磷酸鈉(pH 7.0)中的10%(w/v)氯化十六烷基吡啶溶液沖提結合的染色，並用ELISA讀數器在550nm處進行定量。

統計分析

學生t檢驗(Student’s t test)用於測定各實驗組的值之間的統計學顯著差異。數據以平均值±標準差表示及P值<0.05為統計學上顯著差異。

實例1 兔尾草於Hob細胞促進成骨細胞分化和基質礦化(matrix mineralization)

兔尾草(UC)根部的95%乙醇(EtOH)萃取物使用生物級的方法進行萃取及層析。95%的乙醇粗萃取物懸浮於H₂O並以正己烷，乙酸乙酯和正丁醇依序劃分，得到4個部分。粗萃取物在Hob細胞的細胞增殖採用MTT法進行評估。結果顯示沒有任何的粗萃取物被發現導致顯著的細胞毒性或HOb細胞在100微克/毫升或以下濃度的增殖(數據未示出)。ALP活性是主要的成骨細胞分化的標記。藉由測定HOb細胞的ALP活性檢測萃取物對成骨細胞分化的效果。在Hob細胞處理72小時後，結果顯示100微克/毫升的95%的乙醇粗萃取物及水性部分分別呈現增加106.51±0.44及119.36±5.64%的ALP活性(圖1)。此外，藉由測定在HOb細胞的骨結節形成測試萃取物對成骨細胞礦化的影響。在第12天對礦化結節進行組織化學茜素紅染色。結果顯示，在100微克/毫升的95%的乙醇粗萃取物，乙酸乙酯部分和正丁醇部分分別呈現增加130.45±1.51，123.11±3.28，和146.73±2.85%的礦化活性(圖2)。

實例2 從兔尾草生物引導分離和鑑定活性化合物

該活性乙酸乙酯和正丁醇部分被導入各種管柱層析和高效液相層析純化，並產生新的化合物(3)，以及10個已知化合物，2',4',5,7-四羥 基異黃烷酮(dalbergioidin)(1)(Durango,Quinones,Torres,Rosero,Gil & Echeverri,2002)，水楊酸(2)(Scott,1972)，牡荊素(vitexin)(4)(Krafczyk & Glomb,2008)，色胺酸(tryptophan)(5)((Lee & Phillips,1992))，麥芽酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(maltol-3-O-β-D-glucopyranoside)(6)(Ono,Masuoka,Tanaka,Ito & Nohara,2001)，腺核苷(adenosine)(7)(Moyroud & Strazewski,1999)，spatholosineside A(8)(Yin,Liu,Wang,Tu,Liang & Zhao,2008)，byzantionoside B(9)(Matsunami,Otsuka & Takeda,2010)，(7R,8R)-threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-sinapyl ether7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷((7R,8R)-threo-guaiacylglycerol-8-O-4'-sinapyl ether 7-O-β-D-glucopyranoside)(10)(Machida,Sakamoto & Kikuchi,2009)和胸腺嘧啶(thymine)(11)(Pouchert,1993)(圖3)。這些已知的化合物藉由與文獻中對應的數據或與真實樣品比較其光譜數據而鑑定(UV,¹H-NMR,¹³C-NMR,ESI-MS)。

新的化合物3為黃色粉末。3的分子式由其正面HRESI-MS M/Z：535.1459[M+H]⁺(計算為C₂₅H₂₇O₁₃ ⁺，535.1452)被確定為C₂₅H₂₆O₁₃，這與它的核磁共振(NMR)資料一致(表1)。紫外光譜顯示在λ max 272和329nm的吸收帶，且NMR光譜顯示δ_H 6.75(1H,s,H-3)與δ_C 102.8(C-3)，163.5(C-2)與181.8(C-4)的信號，這表示黃酮基團的存在。在A₂X₂偶合系統中，在δ_H 6.91(2H,d,J=8.8Hz,H-3',H-5')與7.92(2H,d,J=8.8Hz,H-2',H-6')的信號，以及NMR光譜中δ_C 116.0(C-3',C-5''')與128.5(C-2',C-6''')信號的存在建議3中有單取代的芳香部分(環B)。在異核多鍵相關(Heteronuclear Multiple Bond Correlation；HMBC)光譜，由於分別與C-6，Ç-7，C-9的長鏈偶和一個芳香信號，δ_H 6.51(1H,s,H-8)被指定在H-8。這些資料顯示3具有5,7,4-三羥基黃酮(芹菜素)的骨架(5,7,4'-trihydroxyflavone(apigenin)skeleton)(圖4)。NMR光譜也顯示二個糖信號δ_H 2.52至5.25與δ_C 64.5至109.1。3的酸水解後，將水層通過HPLC分離，並與標準品比較，僅得到一個糖苷：芹菜糖(apiose)。其它糖的存在下藉NMR， HSQC，COSY和HMBC光譜確定。上述證據指出，3是經木糖與芹菜糖(apiose)基團取代的芹菜素(apigenin)。芹菜素與木糖的6-C-糖基化在較木犀草素(leutolin)的場域(field)(δ_C 100.1)低約8ppm而被確認，以及C-1”信號在NMR分析中在靠近δ_C 72.1處出現(Dubois,Zoll,Bouillant & Chopin,1982)。D-木糖苷的α-構型和D-芹菜糖苷(D-apioside)的β-構型可以藉由異構質子(anomeric proton)H-1"與H-1'''的偶合常數推導出。β-D-呋喃芹菜糖苷(β-D-apiofuranoside)和α-D-吡喃木糖苷(α-D-xylopyranoside)連接的位置(C-1'''→C-2")藉HMBC相關(HMBC correlation)在位於δ_C 198.1的C-1'''與位於δ_H 4.27(1H,brs)的H-2"而被確認(圖4)。基於上述資料，3的結構被確定為芹菜素6-C-(β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷。

實例3 分離自兔尾草的化合物對HOb細胞的存活

HOb細胞以分離自兔尾草的化合物培養72小時，及採用MTT法檢測細胞存活。結果顯示只有化合物(5)在100μM以80.43±1.11%的值些微抑制細胞存活。其結果如圖5所示。

實例4 分離自兔尾草的化合物對HOb細胞的ALP活性

為了研究分離自兔尾草的化合物對成骨細胞分化的影響，測定HOb細胞的鹼性磷酸酶(ALP)活性。植物成份，大豆苷元(daidzein)，作為陽性對照組。在這些化合物中，4個化合物，dalbergioidin(1)，芹菜素6-C-(β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷(3)，腺核苷(7)和byzantionoside B(9)，被發現在HOb細胞中，於100μM時ALP活性分別顯著增加114.10±4.41，109.68±2.20，108.70±4.14和114.81±0.18%(圖6)。

實例5 分離自兔尾草的化合物對HOb細胞的礦化

茜素紅染色，廣泛用於檢測鈣在細胞中的存在，用於研究分離自兔尾草的化合物在培養12天的HOb細胞對骨礦化的效果(在受測化合物，抗壞血酸及β-甘油磷酸的存在下進行)。結果顯示新化合物3，dalbergioidin(1)，腺核苷(7)與byzantionoside B(9)在100μM顯著增加HOb細胞中礦化骨結節的形成，數據分別為150.10±0.80%，107.09±2.80%，125.21±3.75%及129.21±6.13%(圖7)。這些結果顯示 新化合物3呈現人類成骨細胞的最有效的礦化活性。

實例6 兔尾草萃取物的神經保護

NGF(神經生長因子)誘導PC12細胞分化檢測被用於神經損傷試驗模型，及6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine)被用來誘導神經損傷。如前所述而製備的兔尾草根萃取物被用於檢測。頃發現乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物具有優異的神經保護作用。經6-羥基多巴胺損傷的PC12細胞的細胞存活率自0.55%增加到62.88 +/- 1.10%(以乙酸乙酯萃取物處理的細胞)及61.54 +/- 1.48%(正丁醇萃取物處理的細胞)。

Claims (16)

1. 一種兔尾草屬的根或其萃取物用於製造促進骨生成的藥劑的用途；其中該兔尾草屬係選自下列組成之群：兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)，圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)，Uraria acaulis Schindl，Uraria acuminata Kurz，Uraria balansae Schindl.，Uraria barbata Lace，Uraria campanulata(Benth.)Gagnep.，Uraria candida Backer，Uraria clarkei Gagnep.，Uraria cochinchinensis Schindl.，Uraria cordifolia Wall.，Uraria crinita(L.)DC.，Uraria cylindracea Benth.，Uraria fujianensis Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria gossweileri Baker f.，Uraria kurzii Schindl.，Uraria lacei Craib，Uraria lagopodoides(L.)DC.，Uraria lagopus DC.，Uraria longibracteata Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria pierrei Schindl.，Uraria poilanei Phon，Uraria prunellifolia Baker，Uraria rotundata Craib，Uraria rufescens(DC.)Schindl.及Uraria sinensis(Hemsl.)Franch；及其中該兔尾草屬萃取物為乙醇萃取物或乙醇萃取物的乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
2. 如請求項1之用途，其中該兔尾草屬為兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)或圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)。
3. 如請求項1之用途，其中該兔尾草屬根之萃取物係由下列步驟製得：以乙醇萃取兔尾草屬得到乙醇萃取物，並以乙酸乙酯或丁醇 萃取該乙醇萃取物得到乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
4. 如請求項1之用途，其中該乙酸乙酯萃取物含有芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷。
5. 一種兔尾草屬的根或其萃取物用於製造治療和/或預防骨疾病的藥劑的用途；其中該兔尾草屬係選自下列組成之群：兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)，圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)，Uraria acaulis Schindl，Uraria acuminata Kurz，Uraria balansae Schindl.，Uraria barbata Lace，Uraria campanulata(Benth.)Gagnep.，Uraria candida Backer，Uraria clarkei Gagnep.，Uraria cochinchinensis Schindl.，Uraria cordifolia Wall.，Uraria crinita(L.)DC.，Uraria cylindracea Benth.，Uraria fujianensis Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria gossweileri Baker f.，Uraria kurzii Schindl.，Uraria lacei Craib，Uraria lagopodoides(L.)DC.，Uraria lagopus DC.，Uraria longibracteata Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria pierrei Schindl.，Uraria poilanei Phon，Uraria prunellifolia Baker，Uraria rotundata Craib，Uraria rufescens(DC.)Schindl.及Uraria sinensis(Hemsl.)Franch；及其中該兔尾草屬萃取物為乙醇萃取物或乙醇萃取物的乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
6. 如請求項5之用途，其中該兔尾草屬為兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)或圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)。
7. 如請求項5之用途，其中該兔尾草屬根之萃取物係由下列步驟製 得：以乙醇萃取兔尾草屬得到乙醇萃取物，並以乙酸乙酯或丁醇萃取該乙醇萃取物得到乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
8. 如請求項5之用途，其中該乙酸乙酯萃取物含有芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷。
9. 如請求項5之用途，其中該骨疾病為骨質疏鬆症，關節炎，骨關節炎，牙周病，牙槽骨質流失，截骨術骨質流失，兒童特發性骨質流失，曲率脊柱，高度的損失，骨關節炎或溶骨性病變。
10. 一種兔尾草屬的根或其萃取物用於製造提供神經保護的藥劑的用途，其中該兔尾草屬係選自下列組成之群：兔尾草(Uraria crinita(L.)Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)，圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)，Uraria acaulis Schindl,Uraria acuminata Kurz，Uraria balansae Schindl.，Uraria barbata Lace，Uraria campanulata(Benth.)Gagnep.，Uraria candida Backer，Uraria clarkei Gagnep.，Uraria cochinchinensis Schindl.，Uraria cordifolia Wall.，Uraria crinita(L.)DC.，Uraria cylindracea Benth.，Uraria fujianensis Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria gossweileri Baker f.，Uraria kurzii Schindl.，Uraria lacei Craib，Uraria lagopodoides(L.)DC.，Uraria lagopus DC.，Uraria longibracteata Y.C.Yang & P.H.Huang，Uraria pierrei Schindl.，Uraria poilanei Phon，Uraria prunellifolia Baker，Uraria rotundata Craib，Uraria rufescens(DC.)Schindl.及Uraria sinensis(Hemsl.)Franch；及其中該兔尾草屬萃取物為乙醇萃取物或乙醇萃取物的乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
11. 如請求項10之用途，其中該兔尾草屬為兔尾草(Uraria crinita(L.) Desv.ex DC.)，大葉兔尾草(Uraria lagopodioides(L.)Desv.ex DC.)，羽葉兔尾草(Uraria picta(Jacq.)Desv.ex DC.)或圓葉兔尾草(Uraria neglecta Prain)。
12. 如請求項10之用途，其中該兔尾草屬根之萃取物係由下列步驟製得：以乙醇萃取兔尾草屬得到乙醇萃取物，並以乙酸乙酯或丁醇萃取該乙醇萃取物得到乙酸乙酯萃取物或丁醇萃取物。
13. 如請求項10之用途，其中該乙酸乙酯萃取物含有芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷。
14. 如請求項10之用途，其中該神經保護為中風或腦部或神經系統損傷/創傷，缺氧，脊髓損傷，週圍神經損傷，帕金森氏病，阿茲海默氏病或多發性硬化症。
15. 一種式(I)化合物， 其中R₁是呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃木糖基(apiofuranosyl-β-D-xylopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃阿拉伯糖基(apiofuranosyl-β-D-arabinopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃核糖基(apiofuranosyl-β-D-ribopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃來蘇糖基(apiofuranosyl-β-D-lyxopyranosyl)，呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃核酮糖基(apiofuranosyl-β-D-ribulopyranosyl)或呋喃芹菜糖基-β-D-吡喃木酮糖(apiofuranosyl-β-D-xylulopyranosyl)。
16. 如請求項15之化合物，其為具下式的芹菜素6-C-β-D-呋喃芹菜糖基(1→2)-α-D-吡喃木糖苷：