KR102070721B1

KR102070721B1 - 짚신나물로부터 분리된 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102070721B1
Application number: KR1020180084708A
Authority: KR
Inventors: 우미희; 최재수; 민병선
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2018-07-20
Filing date: 2018-07-20
Publication date: 2020-01-29

Abstract

본 발명은 짚신나물로부터 분리된 화학식 1의 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 상기 화합물은 암 세포인 HeLa, HL-60 및 MCF-7 세포에 대한 세포사멸 효과가 우수하여, 암 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

짚신나물로부터 분리된 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 {A pharmaceutical composition comprising compounds isolated from Agrimonia pilosa for preventing or treating cancer}

본 발명은 짚신나물로부터 분리된 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

신체를 구성하는 가장 작은 단위인 세포(cell)는 정상 조건의 경우, 세포 자체의 조절 기능에 의해 분열 및 성장하고, 수명이 다하거나 손상되면 스스로 사멸하여 전반적인 수의 균형을 유지한다. 그러나 여러 가지 원인에 의해 세포 자체의 조절 기능에 문제가 생기면 정상적으로 사멸해야 할 비정상 세포들이 과다 증식하게 되며, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴(덩어리)를 형성하고 기존의 구조를 파괴하거나 변형시키는데, 이러한 상태를 암(cancer)으로 정의할 수 있다.

암의 종류는 처음 암 세포가 발생한 조직 및 장기에 따라 분류하기도 하고, 암세포의 모양과 발생기원에 따라 분류하기도 한다. 흔히 폐암, 위암, 대장암, 자궁경부암 등은 종양이 처음 생긴 장기를 기준으로 일컫는다. 또한 발생기원 측면에서는 크게 결체조직성 종양, 상피성 종양, 선암 등으로 구분되기도 한다. 우리나라의 경우 가장 많이 발생한 암은 갑상선암으로 나타났고, 이어서 위암, 대장암, 폐암의 순으로 발병률이 높다.

암이 발병되어 진행이 계속될 경우, 수술 등의 외과적 치료법과 함께 항암물질 투여에 의한 화학적 치료법이나 방사선치료 등을 병행하여 집중적으로 치료하지만, 다른 질환의 치료에 비해 환자의 상태에 따라 치료방법이 다양하고 복잡하며, 대부분 조기 암환자나 특정 암환자에만 국한된 치료방법이고, 조혈이나 면역기능 억제 등의 부작용도 나타나, 암으로 인한 사망은 지속적으로 증가하고 있는 추세이다.

최근 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 기능이 식품이나 식물체도 가지고 있다는 것이 보고되고 있어, 천연물로부터 생리기능을 가진 물질을 탐색하는 연구가 전 세계적으로 활발히 진행되고 있다(Lee, S. E. et al., J Medicinal Crop Sci., 12, 73-78, 2004). 특히, 천연물에 존재하는 화합물은 그 수가 많을 뿐 아니라 현재까지 알려진 유기합성 기술로는 만들어 내기 어려운 화합물, 예컨대 광학이성질체 등을 포함하는 경우가 많다. 즉, 상기와 같은 경향을 반영한 암 치료를 위한 새로운 접근 방법으로서, 물성과 화학적 구조가 다양하고 독성이 비교적 낮은 천연물 또는 천연물 유래 화합물로부터 부작용이 적고 효능이 뛰어난 항암제의 개발이 필요하다.

짚신나물(Agrimonia pilosa)은 다년생 숙근초로 장미과에 속하며 한국, 중국, 일본 등에서 서식한다. 우리나라의 경우에는 야산의 길가, 들판 등에 흔히 자라며, 선학초, 용아, 용아초, 황아초, 황용초, 지선초 등으로 부르기도 한다. 전통적으로 민간요법, 녹즙 등으로 널리 이용되어 왔고, 폐암, 간암, 식도암, 종양, 통증제거, 지형, 지사, 토혈, 혈토, 자궁출혈, 열기 등의 약용으로 널리 이용되어 왔다. 그 성분으로는 아그리모닌(agrimonin), 아그리모노라이드(agrimonolide), 탄닌(tannin), 스테롤(sterol), 유기산, 사포닌 등이 포함되어 있는 것으로 알려져 있다(정보섭 등, 향약대사전, 영림사, 636-637, 1998; Jung, M. et al., Molecules, 12(9), 2130-2139, 2007; Miyamoto, K. et al., Jpn. J. Pharmacol., 43(2), 187-195, 1987; Jung, C. H. et al., Immunol. Invest., 39(2), 159-170, 2010; Shin, W. J. et al., Microbiol. Immunol., 54(1), 11-19, 2010).

짚신나물 유래 화합물의 암 예방 또는 치료용 조성물과 관련된 종래기술로서, 한국공개특허 제10-2018-0015795호에는 짚신나물 분획추출물 및 이를 포함하는 알도오스 환원 효소를 억제용 조성물에 대해 개시되었으며, 선행논문 [최순자, 경원대학교 박사학위 논문, 2008] 및 [민경진 등, Journal of food hygiene and safety, 23(2), 149-156, 2008]에는 짚신나물 추출물의 항암 효과가 개시된 바 있다. 그러나, 본 발명의 화학식 1로 표시되는 짚신나물 유래 화합물이 암에 대한 치료 효과가 있음을 확인한 이전 보고는 아직 없다.

한국공개특허 제10-2018-0015795호, 짚신나물 분획추출물 및 이를 포함하는 알도오스 환원 효소를 억제용 조성물, 2018년 02월 14일, 공개.

민경진 등, 선학초 추출물의 항산화 및 항암활성, Journal of food hygiene and safety, 23(2), 149-156, 2008. 정보섭 등, 향약대사전, 영림사, 636-637, 1998. 최순자, 선학초(짚신나물)에 의한 in vitro와 in vivo에서의 암세포사멸 기전 탐색 경원대학교 박사학위 논문, 2008. Jung, C. H. et al., Inhibitory effect of Agrimonia pilosa Ledeb. on inflammation by suppression of iNOS and ROS production, Immunol. Invest., 39(2), 159-170, 2010. Jung, M. et al., Acetylcholinesterase inhibition by flavonoids from Agrimonia pilosa, Molecules, 12(9), 2130-2139, 2007. Lee, S. E. et al., Inhibitory activity on angiotensin converting enzyme (ACE) of Korean medical herbs, J Medicinal Crop Sci., 12, 73-78, 2004. Miyamoto, K. et al., Antitumor effect of agrimoniin, a tannin of Agrimonia pilosa Ledeb., on transplantable rodent tumors, Jpn. J. Pharmacol., 43(2), 187-195, 1987. Shin, W. J. et al., Broad-spectrum antiviral effect of Agrimonia pilosa extract on influenza viruses, Microbiol. Immunol., 54(1), 11-19, 2010.

본 발명의 목적은 짚신나물로부터 분리된 화합물을 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 1β,2α,19α-트리히드록시-3-옥소우르스-12-엔-28-오익산(화합물 1), 토멘틱산(화합물 2) 및 코로솔산(화합물 3)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성하는 것도 가능하며 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있고, 짚신나물을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물로부터 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수도 있다. 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 이용할 수 있다.

또한, 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography), 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피(sephadex LH-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 중에서 선택될 수 있다.

상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종, 혈액암, 결장암, 비소세포성폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 소장암, 직장암, 자궁내막암, 질암, 고환암, 식도암, 담도암, 임파선암, 담낭암, 내분비선암, 부신암, 림프종, 다발성 골수종, 흉선종, 중피종, 신장암, 뇌암, 중추신경계종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하게는 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종 및 혈액암으로 이루어진 군에서 선택된다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.

또한, 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아라비아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 안정화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 개시된 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여시간, 투여경로, 약물의 흡수, 분포 및 배설률, 사용되는 다른 약물의 종류 및 처방자의 판단 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.001㎎/㎏/일 내지 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 짚신나물 유래 화합물의 분리>

건조된 짚신나물(A. pilosa) 지상부 5.8㎏을 80% 에탄올(3회×4ℓ)로 실온에서 추출하고, 상기 과정에서 얻은 에탄올 추출액을 감압 농축하여 2.5㎏의 에탄올 추출물을 얻었다. 이후, 상기 에탄올 추출물을 1.5ℓ의 물에 현탁하고, 디클로로메탄(1ℓ×7회), 에틸아세테이트(1ℓ×7회) 및 n-부탄올(1ℓ×5회)을 순차적으로 분획하여 디클로로메탄 분획물(800.1g), 에틸아세테이트 분획물(163.9g) 및 n-부탄올 분획물(500.5g)과 마지막으로 물 분획물을 얻었다.

상기 분획물 중 디클로로메탄 분획물을 n-헥산:에틸아세테이트:메탄올(100:0:0 → 100:100:100)의 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여, 15개의 소분획물(A~O)을 얻었다.

상기 소분획물 중 C(3.1g)를 n-헥산:에틸아세테이트(4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2)의 용출 조건으로 오픈 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여, 7개의 소분획물(C1~C7)을 얻었다. 또한, 상기 소분획물 중 C3(340.3㎎)을 메탄올:물(6:1)의 용출 조건으로 RP-C18 컬럼 크로마토그래피하여 화합물 1(10.3㎎, 1β,2α,19α-trihydroxy-3-oxours-12-en-28-oic acid, 1β,2α,19α-트리히드록시-3-옥소우르스-12-엔-28-오익산) 및 화합물 2(6.5㎎, tormentic acid, 토멘틱산)를 얻었으며, 상기 소분획물 중 C6(412.1㎎)을 아세토니트릴:물(4:1)을 용매로 사용하여 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 실시함으로서 화합물 3(28.5㎎, corosolic acid, 코로솔산)을 얻었다.

<실시예 2. 항암 활성 확인>

항암 활성을 확인하기 위해, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 진행하였으며, 이때 사용한 암 세포주는 HeLa(adenocarcinoma cell), HL-60(human leukemia) 및 MCF-7(human breast adenocarcinoma cell)이다. 상기 암 세포주는 10%(v/v) FBS 및 100units/㎖ 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였다. 상기 암 세포가 접종된 100-π 배양 접시에 70-80%로 세포가 채워지면 Trypsin-EDTA를 사용하여 배양 접시에서 세포를 분리하였다.

암 세포(HeLa: 1×10⁵cells/mL, HL-60: 2×10⁵cells/mL, MCF-7: 1×10⁵cells/mL)가 함유된 배양액 100㎕를 96웰 플레이트에 접종하여, 24시간 동안 배양하였다. 이후, 농도에 따른 화합물을 100㎕씩 각각 처리하여 45시간을 추가 배양한 다음, 각 웰에 20㎕씩 MTT(5㎎/㎖) 용액을 처리하고 2시간 동안 반응하였다. 반응이 끝나면 플레이트를 1500rpm으로 5분 동안 원심분리하고 배양액을 제거한 다음, 플레이트에 100㎕의 DMSO를 더하여 생성된 포마잔 결정을 용해하였다. 이후, 570㎚에서 흡광도를 측정하여 암 세포에 대한 세포 사멸 효과를 확인하고 이를 표 1에 나타내었다.

조건	IC₅₀(μM)
조건	HeLa	HL-60	MCF-7
화합물 1	16.1	45.5	34.2
화합물 2	33.3	>50	>50
화합물 3	14.7	>50	42.7
양성대조군 (아드리아마이신)	3.1	15.6	6.3

상기 표 1을 살펴보면, 본 발명의 화합물 1 내지 3은 암 세포에 대한 세포 사멸 효과가 있는 것으로 확인되었다. 특히, 화합물 1의 경우 모든 암 세포(HeLa, HL-60 및 MCF-7 세포)에 대해 광범위한 세포 사멸 효과가 나타났으며, 다른 화합물과 비교시, in vivo 항암 활성에서도 우수한 효과를 보여주었다.

< 제제예 1. 정제의 제조>

본 발명 실시예 1의 짚신나물 유래 화합물 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2. 캡슐제의 제조>

본 발명 실시예 1의 짚신나물 유래 화합물 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 3. 주사제의 제조>

본 발명 실시예 1의 짚신나물 유래 화합물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

Claims

하기 화학식 1의 1β,2α,19α-트리히드록시-3-옥소우르스-12-엔-28-오익산(화합물 1)을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 암은 폐암, 간암, 위암, 대장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 갑상선암, 흑색종, 혈액암, 결장암, 비소세포성폐암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 소장암, 직장암, 자궁내막암, 질암, 고환암, 식도암, 담도암, 임파선암, 담낭암, 내분비선암, 부신암, 림프종, 다발성 골수종, 흉선종, 중피종, 신장암, 뇌암, 중추신경계종양, 뇌간신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 투여형으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.