KR20060012393A - 감자 더뎅이병을 억제하는 신규한 바실러스 균주, 상기균주가 생산하는 항생물질 및 이를 함유하는 미생물제제 - Google Patents

감자 더뎅이병을 억제하는 신규한 바실러스 균주, 상기균주가 생산하는 항생물질 및 이를 함유하는 미생물제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP), 상기 균주가 생산하는 항생물질 및 그 제조방법, 그리고 상기 균주 또는 그로부터 제조된 항생물질을 함유하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)는 감자 더뎅이병균의 생육을 억제하는 뛰어난 효과가 있고, 또한 상기 균주로부터 생산된 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)는 감자 더뎅이병균 뿐만 아니라 다른 식물병원성 진균도 억제하는 탁월한 효과가 있음이 확인되었다.
따라서 본 발명은 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 또는 그로부터 생산된 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 또는 이투린 에이(iturin A)를 이용하여 감자 더뎅이병균을 포함한 다양한 식물병원성 진균에 대해 우수한 방제효과를 나타내는 뛰어난 미생물 제제를 제공할 수 있으므로, 생물농약산업상 매우 유용한 발명이다.
감자 더뎅이병, 식물병원성 진균, 항생물질, 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua), 생물농약

Description

감자 더뎅이병을 억제하는 신규한 바실러스 균주, 상기 균주가 생산하는 항생물질 및 이를 함유하는 미생물제제{Novel Bacillus sp. strain against Streptomyces scabiei, active compounds from the microorganism and biocontrol agent comprising the same}
도 1은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)로부터 항생물질의 생산조건을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질의 pH(a) 및 열안정성(b)을 확인한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)의 배양여액으로부터 항생물질을 분리하기 위해 분취용 역상 실리카겔 에이치피엘씨(preparative silicagel RP-18 HPLC) 및 바이오어세이(bioassay)한 결과이다.
도 4는 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 1H-NMR 데이터이다.
도 5는 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 13C-NMR 데이터이다.
도 6은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생 물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 HMBC 데이터이다.
도 7은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 HMQC 데이터이다.
도 8은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 질량분석 데이터이다.
도 9는 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 이투린 에이(iturin A)의 1H-NMR 데이터이다.
도 10은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 이투린 에이(iturin A)의 질량분석 데이터이다.
도 11은 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질이 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)의 형태에 미치는 영향을 주사 전자 현미경(scanning electron microscopy)으로 확인한 결과로, 여기에서 a는 상기 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)의 정상 균사체와 포자를, b는 본 발명의 항생물질 이투린 에이(iturin A)로 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 처리한 경우를, 그리고 c는 본 발명의 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)로 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 처리한 경우의 결과를 나타낸다.
도 12는 토양에서 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)의 감자 더뎅이병 방제효과를 확인한 결과로, 여기에서 a는 무처리 감자, b는 스트렙토마이 세스 스카비(Streptomyces scabiei)로 감염시킨 감자, 그리고 c는 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)와 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 동시에 처리한 감자를 나타낸다.
본 발명은 감자 더뎅이병을 억제하는 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP), 상기 균주가 생산하는 항생물질 및 그 제조방법, 그리고 상기 균주 또는 그로부터 생산된 항생물질을 함유하는 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 비롯한 각종 식물병원성 진균에 대해 생육억제 활성이 뛰어난 항생물질을 생산하는 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주, 상기 균주가 생산하는 항생물질 및 그 제조방법, 그리고 상기 균주 또는 그 항생물질을 함유하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제에 관한 것이다.
감자는 세계에서 재배되고 있는 여러 식량작물 중 8위의 생산량을 차지하며 인류의 식량문제를 해결하는데 대단히 중요한 역할을 하고 있는 작물로, 증산면에 있어서 다른 어느 작물보다도 커다란 가치를 가지고 있다.
그러나 오늘날 병해충에 의한 농작물의 피해가 갈수록 심화되고 있는 바, 특히 감자의 경우 무름병(Erwinia cartovora), 풋마름병(Ralstonuia solanacearum), 더뎅이병(Streptomyces spp.) 등이 상품가치를 저하시키는 주된 질병으로 알려져 있다. 이 중 감자 더뎅이병은 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 의해 발생되는 병으로, 중성이나 약알카리성인 토양에서 상대적으로 건조한 해에 많이 발생하며, 괴경이나 뿌리 등의 겉표면에 흠을 남김으로써 상품가치를 저하시키는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 더뎅이병이 심한 경우에는 발병 부위를 벗겨 내야 하기 때문에 수량 면에서의 손실 또한 매우 크다고 볼 수 있다.
더뎅이병은 전세계의 감자 재배지역에서 발생하며, 특히 감자의 연작지에서 심한 것으로 알려져 있다. 더욱이 최근 국내에서는 품종에 따라 차이가 있기는 하지만 평균 30-40%, 심한 경우에는 60-70%의 세균병 이병율이 나타나 건전 종서 생산 및 농가소득에 커다란 피해를 주고 있는 실정이다.
따라서 이를 방제하기 위한 수단으로 종래에는 주로 유기합성농약을 사용하였으나, 1990년 초에 이러한 합성농약이 하천이나 지하수를 오염시키고, 토양에 잔류하여 생태계의 균형을 파괴하며, 최종 소비자인 사람이나 가축이 먹는 농산물에 잔류되어 심각한 부작용을 일으킨다는 사실이 드러남에 따라, 최근에는 이러한 부작용의 위험이 없는 천연소재로부터 새로운 생물농약을 개발하려는 노력이 계속되고 있다.
이와 관련하여 현재 감자 더뎅이병에 대한 항생물질을 생산하는 신규한 균주 및 유기합성 농약사용으로 인한 생태계 균형의 파괴를 감소시킬 수 있는 생물농약은 아직까지 개발되지 않은 상태에 있다.
따라서 본 발명은 감자 더뎅이병을 억제하는 신규한 균주, 상기 균주가 생산 하는 항생물질 및 그 제조방법의 제공을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 감자 더뎅이병을 포함한 식물곰팡이병을 억제하는 신규 미생물제제의 제공을 그 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 감자 더뎅이 병원균(Streptomyces scabiei)에 대해 생육억제 활성이 뛰어난 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주를 제공한다.
상기의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)로부터 생산되며 더뎅이 병원균(Streptomyces scabiei)을 비롯한 식물병원성 진균에 대해 뛰어난 생육억제 활성을 나타내는 항생물질, 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A), 그리고 상기 항생물질의 제조방법을 제공한다.
또한 상기의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주 또는 그로부터 생산된 항생물질을 유효성분으로 하는 신규의 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제를 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다.
더뎅이병 발생지역이 적은 제주도 감자 재배지역에서 분리한 미생물로부터 감자 더뎅이병을 억제하는 생물방제균을 분리하기 위하여 스트렙토마이세스 스카비 (Streptomyces scabiei)를 대상 시험균주로 하여 길항능력을 조사하였다. 이 중 길 항 활성이 뛰어난 선화(sunhua)를 본 발명 균주로 선발하여 동정한 결과, 원형의 콜로니, 포자 염색 양성, 그람 염색 양성 등의 균학적 특성을 나타내어 바실러스 속 균주임이 판명되었다. 이에 상기 바실러스 균주를 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)로 명명하고, 이를 2004년 6월 8일 KCTC(Korean Collection for Type Culture)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10668BP를 부여받았다.
상기 바실러스 선화(Bacillu sp. sunhua) 균주를 배양하여 얻은 배양여액으로 마이크로코커스 류터스(Micrococcus luteus), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae), 바실러스 세레우스(Bacilus cereus), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis), 이 콜라이(Escherichia coli), 슈도모나스 에어러지노사(Pseudomonas aeriginosa), 세라티아 마르시엔스(Serratia marcescens), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 대한 저해활성을 조사해 본 결과, 특히 감자 더뎅이병의 병원균인 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 대해서 탁월한 활성을 나타내었다.
또한, 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 의해 발생되는 감자 더뎅이병은 중성이나 약알칼리성인 토양에서 상대적으로 건조한 해에 많이 발생하는데, 본 발명에서 제공하는 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질은 중성이나 약알칼리성에서 활성이 매우 안정적이며 열에 대해서도 안정성이 있다.
바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주가 생산하는 활성물질을 분리하기 위해, 상기 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주를 지와이엠 배지(GYM agar: Glucose 4g, Yeast extract 4g, Malt extrat 10g, Calcium carbonate 2g, pH 7.2)에서 종배양한 후 다시 동일한 지와이엠 배지(GYM agar)에서 37℃, 150rpm, 1일간 진탕배양하고, 그로부터 얻은 배양여액을 4℃, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 얻은 다음, 상기 상등액을 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 유기용매 추출하고, 그 추출액을 20% 또는 30% 물을 함유하는 메탄올을 이용하여 역상 실리카겔 칼럼크로마토그라피(silicagel RP-18 chromatography)한 후, 최종적으로 분취용 역상 실리카겔 에이치피엘씨(preparative silicagel RP-18 HPLC) 하였다.
또한 상기 결과 얻어진 최종 정제물질의 구조분석을 위해 1차 엔엠알과 2차 엔엠알(1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC) 및 질량분석을 수행한 결과, 본 발명 균주 바실러스 선화 균주가 생산하는 항생물질은 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)임이 확인되었다.
바실러스 선화(Bacillu sp. sunhua)가 생산하는 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)의 항균활성 범위를 조사한 결과, 감자의 더뎅이병균인 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 대해 매우 강한 항균활성을 나타내었으며, 그 외에 과수의 세균성 궤양병을 일으키는 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae syringe pv. syringae), 감자 썩음병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 점무늬 낙엽병을 일으키는 알터나리아 말리로티(Alternaria maliloti), 감귤 푸른 곰팡이병을 일으키는 페니실리움 디지 타툼(Penicillium digitatum) 등의 각종 식물 병원균에 대해서도 생육억제 효과를 나타냄을 확인하였다. 그 중에서도 특히, 감자 썩음병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)에 대해 강한 항균활성을 나타내어, 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillu sp. sunhua)가 생산하는 항생물질이 특히 감자병원성 미생물에 특이한 항균범위를 가짐을 알 수 있었다.
마지막으로, 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주를 실제 미생물 제제로 사용시 더뎅이병 억제효과가 어느 정도인지를 확인하기 위하여 포트 어세이(pot assay)를 실시한 결과, 40% 이상의 더뎅이병 저해효과가 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실험 및 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시 예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 바실러스 선화( Bacillus sp. sunhua) 균주의 분리·동정 및 항생물질의 생산
[제1단계: 바실러스 선화( Bacillus sp. sunhua) 균주의 분리·동정]
제주도 감자 재배지역에서 더뎅이 발생율이 적은 토양을 선택하여 분리한 균주들과 케시티시(KCTC), 케이에이시시(KACC) 균주를 포함한 총 205개 균주를 지와이엠 아가(GYM agar; Glucose 4g, Yeast extract 4g, Malt extrat 10g, Calcium carbonate 2g, pH 7.2)배지에 도말하여 30℃에서 1일간 배양하였다. 이들을 감자 더뎅이병 원인균인 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)가 포함된 피디 에이 배지(PDA 배지)에 toothpick하여 clear zone을 형성하는 균주를 선택하여 표 1과 같이 분리하였다.
Figure 112004034764215-PAT00001
상기 표 1에서 가장 강한 저해작용을 나타낸 선화(sunhua) 균주를 본 발명 균주로 선택하고, Identification kit(API 50CHB, France)를 사용하여 동정한 결과, 하기 표 2와 같은 형태학적 특성을 나타내어 바실러스 속 균주임이 판명되었다. 이에 상기 선화(sunhua) 균주를 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주로 명명하고, 2004년 6월 8일 KCTC(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 10668BP를 부여받았다.
본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)의 형태학적 특성
항목 특성
모양(shape) 원형(rod)
세포 크기(cell size) 1.4㎛ × 2.3㎛
운동성(motility) 있음(motile)
플라겔라(flagella) 양성
포자 염색(spore stain) 양성
그람 염색(gram stain) 양성
[제2단계: 항생물질 생산]
본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)로부터 항생물질을 생산하기 위한 최적조건을 알아보기 위하여, 티에스비(TSB; Triptic soy broth), 지와이엠 배지(GYM 배지; Glucose 4g, Yeast extract 4g, Malt extrat 10g, Calcium carbonate 2g, pH 7.2), 피디비 배지(PDB 배지; potato와 glucose가 infusion), 엘비 배지(LB 배지; Tripton 1g, Sodium chloride 1g, Yeast extract 0.05g), 와이엠 배지(YM 배지; Glucose 1.5g, Yeast extract 0.5g, KCl 0.02g)를 사용하여 실험한 결과, 지와이엠 배지(GYM 배지)에서 항생물질이 가장 많이 생산되었다.
이에 따라, 지와이엠 배지(GYM 배지)에서 종배양(seed culture)한 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)를 동일한 배지에 접종하여 37℃, 150rpm에서 3일간 진탕배양하면서 12시간 마다 항균활성(antibiotic activity)을 조사한 결과, 도 1에서와 같이 24시간 배양하였을 때 항생물질이 가장 많이 생산됨을 확인하였다.
실시예 2: 항생물질의 열 안정성 및 pH 안정성
상기 실시예 1에서 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산한 항생물질을 pH1 ~ 14로 조정하고 4℃에서 24시간 전처리 한 후 pH 7.0 으로 중화하여 잔존활성을 paper disc방법으로 측정한 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이 산성 pH조건에서는 불안하나 알칼리성 조건에서는 매우 안정함을 확인하였다.
또한 40℃, 60℃, 80℃, 100℃에서 각 30분간, 그리고 121℃에서 15분간 열처리한 후 paper disc방법으로 활성을 조사한 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이 80℃, 30분 열처리에도 50% 이상의 활성을 유지하여, 본 발명의 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질이 알칼리성 조건 뿐만 아니라 열에도 비교적 안정한 성질이 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 바실러스 선화( Bacillus sp. sunhua)의 배양여액에서 활성물질의 분리
더뎅이병 생물 방제균 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)로부터 항생물질을 정제하기 위하여, 먼저 지와이엠 배지(GYM 배지; Glucose 4g, Yeast extract 4g, Malt extrat 10g, Calcium carbonate 2g, pH 7.2)에서 종배양한 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주를 다시 동일한 배지에서 37℃, 150rpm에서 1일간 진탕배양한 다음, 상기 배양액 15L를 4℃, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 얻었다.
상기 상등액을 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 추출한 다음, 그 결과 얻어진 유기용매 추출액을 역상 실리카겔 칼럼크로마토그라피(silicagel RP-18 chromatography) 하였다. 이 때, 실리카겔은 머크(Merck) 사 제품의 실리카겔(silica gel ; 40~63 mesh)을 사용하였으며, 각각 50%, 40%, 30%, 20%, 10%의 물을 함유하는 메탄올(aqeueous methanol)을 이용하여 단계적으로 용출하였다. 그 결과, 20% 물을 함유하는 메탄올(aqueous mathanol) 분획 및 30% 물을 함유하는 메탄올(aqeueous methanol) 분획에서 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 저해하는 활성이 가장 강하게 나타났다.
따라서 최종적으로, 상기 20% 물을 함유하는 메탄올(aqueous mathanol) 분획 및 30% 물을 함유하는 메탄올(aqeueous methanol) 분획을 각각 분취용 역상 실리카겔 에이치피엘씨(preparative silicagel RP-18 HPLC)를 통해 분리하였다. 이 때 칼럼(column)은 심메트리 씨 에이틴 칼럼(SymmetryprepTM C18 column)을 사용하였으며, 60% 물을 함유하는 아세토나이트릴(aqueous acetonitril)을 이동상으로 하여 알아이 검출기(RI detector)로 검출하였다. 그 다음 상기 에이치피엘씨(HPLC)를 거친 분획을 8mm 여지 disc에 각각 흡착시킨 후, 이를 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 도말한 고체배지에 올려놓고 배양하여, disc주위의 억제환의 형성 유무로 저해활성을 확인하였다.
그 결과, 20% 물을 함유하는 메탄올에서는 5번 분획에서(도 3a 참조), 30% 물을 함유하는 메탄올에서는 14번 분획에서 가장 강한 활성이 나타남을 확인할 수 있었다(도 3b 참조).
실시예 4: 감자 더뎅이병을 저해하는 최종 정제물질의 구조분석
감자 더뎅이병을 저해하는 최종 정제물질의 구조분석을 위해서, 상기 실시예 3에서의 5번 분획(20% 물을 함유하는 메타올에서 분리) 및 14번 분획(30% 물을 함유하는 메탄올에서 분리)에 대해 1차 엔엠알과 2차 엔엠알(1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC) 및 질량분석을 수행하였다. 이 때, 1H-NMR은 Bruker Avance DPX 600 MHZ NMR spectrometer 로, 13C-NMR은 Bruker Avance DPX 300 MHZ NMR spectrometer 로 측정하였으며, 용매는 모두 D-methanol을 사용하였다. 또한 질량분석(mass)은 JMS-AX 505 WA spectrometer로 측정하였다.
그 결과 측정된, 30% 물을 함유한 메탄올에서 분리된 14번 분획의 엔엠알 데이터를 하기 표 3에 나타내었고, 1H-NMR 데이터, 13C-NMR 데이터, HMBC 데이터, HMQC 데이터 및 질량분석 데이터를 각각 도 4, 도 5, 도 6, 도 7 및 도 8에 표시하였다. 또한, 20% 물을 함유한 메탄올에서 분리된 5번 분획의 1H-NMR 데이터 및 질량분석 데이터를 각각 도 9 및 도 10에 나타내었다.
바실러스 선화(Bacillus sp. shnhua) 균주로부터 생산된 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A)의 NMR 데이터
원자 δC δH(J, Hz)
1 166.5
2 116.4 5.44(m)
3 143.7 6.54(t, 11.5)
4 129.0 7.12(dd, 11.5, 14.8)
5 141.0 6.07(m)
6 41.8 2.31(m)
7 71.1 4.15(m)
8 136.0 5.66(dd, 5.8, 15.1)
9 124.5 6.47(dd, 11.1, 15.1)
10 130.0 6.02(m)
11 127.0 5.44(m)
12 35.0 2.22(m) 2.38(m)
13 67.3 3.75(m)
14 42.7 1.50(m)
15 68.0 4.20(m)
16 133.6 5.46(m)
17 129.9 6.07(m)
18 130.3 5.97(dd, 10.5, 15.0)
19 133.6 5.56(m)
20 32.0 1.99(m) 2.10(m)
21 24.2 1.40(m)
22 34.2 1.42(m) 1.56(m)
23 71.0 4.90(m)
24 18.7 1.15(d, 6.3)
상기 표 3 및 도 4 내지 도 8의 1차 엔엠알과 2차 엔엠알(1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HMQC) 및 질량분석 데이터들을 종합한 결과, 30% 물을 함유한 메탄올에서 나온 14번 분획은 분자식 C24H34O5, 분자량 425의 마크로락틴 에이(macrolactin A)와 일치함을 확인할 수 있었고, 도 9 및 도 10의 1H-NMR 데이터 및 질량분석 데이터를 종합한 결과, 20% 물을 함유한 메탄올에서 나온 5번 분획은 분자량 1043의 이투린 에이(iturin A)와 일치함을 확인할 수 있었다.
상기와 같이 확인된 바실러스 선화(Bacillus sp. shnhua) 균주의 스트렙토마 이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 대한 항생물질들, 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)의 구조를 각각 하기 화학식 1 및 화학식 2에 표시하였다.
Figure 112004034764215-PAT00002
.....(Ⅰ)
Figure 112004034764215-PAT00003
...(Ⅱ)
실시예 5: 주사 전자 현미경(Scanning Electron Microscope)에 의한 억제 기작 관찰
바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질이 감자 더뎅이병의 병원균(Streptomyces scabiei)의 형태에 미치는 영향을 주사 전자 현미경으로 관찰하였다. 이를 위해 지와이엠(GYM) 평판배지에 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 도말하고 상기 실시예 4에서 분리 정제된 물질 이투린 에이(iturin A) 및 마크로락틴 에이(macrolactin A)를 처리한 후, 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)의 균체부위를 1cm 크기로 잘라 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 항생물질을 처리하지 않은 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)는 균사와 포자를 뚜렷하게 형성하였다(a). 그러나 이투린 에이(iturin A)를 처리한 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)는 포자는 형성되지 않고 균사만 자라는 모습을 보였으며(b), 마크로락틴 에이(macrolactin A)를 처리한 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)는포자 형성이 되지 않았을 뿐만 아니라 균사가 파괴되어 세포내 물질이 누출되는 현상을 나타내었다(c).
실시예 6: 바실러스 선화( Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질의 항균 스펙트럼
본 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질은 감자더뎅이병을 강하게 길항하는 효과를 나타내는 것으로 조사되었지만 다른 식물병원성 진균에 대한 방제력을 검증하기 위하여 항균활성 범위를 조사하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4의 결과로부터, 본 발명 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)의 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)가 감자 더뎅이병균 뿐만 아니라 과수의 세균성 궤양병을 일으키는 슈도모나스 시린지(Pseudomonas syringae syringe pv. syringae), 감자 썩음병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 점무늬 낙엽병을 일으키는 알터나리아 말리로티 (Alternaria maliloti), 감귤 푸른 곰팡이병을 일으키는 페니실리움 디지타툼(Penicillium digitatum) 등의 각종 식물 병원균에 대해서도 생육억제 활성을 가짐을 알 수 있었다. 흥미롭게도 상기 항생물질들은 감자의 썩음병을 일으키는 푸사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum)에 처리하였을 때 특히 강한 항균활성을 나타내었다. 또한, 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)의 항생물질들은 식물생육을 촉진시켜주는 라이조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti) 와 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens)에는 아무런 영향을 주지 않았다.
따라서 생물 방제균 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)가 생산하는 항생물질은 토양의 유용 미생물에는 영향을 주지 않으면서 식물병원성 진균에만 항균활성을 나타내고, 그 중에서도 특히 감자병원성 미생물에 특이한 항균범위를 가짐을 확인할 수 있었다.
바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주가 생산하는 항생물질의 항균 스펙트럼
시험 균주 저해 범위(Inhibition zone)(diameter)
마크로락틴 에이 이투린 에이
스트렙토마이세스 스카비 (Streptomyces scabiei) 22 22
라이조비움 멜리로티 (Rhizobium meliloti) - -
슈도모나스 플루오레슨스 (Psuedomonas fluorescens) - -
슈도모나스 시린지 (Pseudomonas syringae pv. syringae) 14 13
푸사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum) 20 20
알터나리아 말리로티 (Alternaria maliloti) 17 16
페니실리움 디지타툼 (Penicillium digitatum) */- */-
실시예 7: 바실러스 선화( Bacillus sp. sunhua)의 생물방제력 측정
선발된 길항균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)가 실제 토양 내에서도 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)에 대해 그 길항능력을 발휘하여 감자 더뎅이병을 억제할 수 있는지 조사하였다.
이를 위해, 28℃ 항온실에서 감자 싹 길이가 12.5cm정도 자란 일정한 크기의 비슷한 종묘만 골라 상토가 담긴 포트에 옮긴 후, 25℃에서 아무것도 처리하지 않은 것(a), 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)를 처리하지 않고 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)만 처리한 것(b), 그리고 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)와 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 동시에 처리한 것(c)으로 분류하여 3달 동안 키웠다.
그 결과 도 12에 나타낸 바와 같이, 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)만 처리한 감자(b)에 비해 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)와 스트렙토마이세스 스카비(Streptomyces scabiei)를 동시에 처리한 감자(c)에서 더뎅이병 감염율이 40% 정도 억제됨을 알 수 있었으며, 병징 또한 더 확대되지도 않음을 확인할 수 있었다.
이상 상기 실시예를 통하여 명백히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명이 제공하는 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP)는 감자 더뎅이 병균의 생육을 억제하는 뛰어난 효과가 있고, 또한 상기 균주로부터 생산된 항생물질은 감자 더뎅이병균을 비롯한 각종 식물병원성 진균을 억제하는 탁월한 효과가 있어서, 본 발명은 신규한 균주 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 또는 그로부터 생산된 항생물질을 이용하여 감자 더뎅이병균을 포함한 식물병원성 진균에 대해 우수한 방제효과를 나타내는 뛰어난 미생물 제제를 제공할 수 있으므로, 생물농약산업상 매우 유용한 발명이다.

Claims (5)

  1. 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 포함한 식물병원성 진균에 대해 뛰어난 생육억제 활성을 갖는 항생물질을 생산하는 바실러스 선화(Bacillus sp. sunhua) 균주 (KCTC 10668BP).
  2. 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주로부터 생산되며, 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 포함한 식물병원성 진균에 대해 뛰어난 생육억제 활성을 갖는 하기 구조(Ⅰ)의 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A).
    Figure 112004034764215-PAT00004
    .......(Ⅰ)
  3. 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주로부터 생산되며, 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 포함한 식물병원성 진균에 대해 뛰어난 생육억제 활성을 갖는 하기 구조(Ⅱ)의 항생물질 이투린 에이(iturin A).
    Figure 112004034764215-PAT00005
    ....(Ⅱ)
  4. 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주를 지와이엠 배지(GYM agar: Glucose 4g, Yeast extract 4g, Malt extrat 10g, Calcium carbonate 2g, pH 7.2)에서 종배양한 후 다시 동일한 지와이엠 배지(GYM agar)에서 37℃, 150rpm, 1일간 진탕배양하고, 그로부터 얻은 배양여액을 4℃, 8000rpm에서 30분간 원심분리하여 상등액을 얻고, 상기 상등액을 에틸아세테이트(ethyl acetate)로 유기용매 추출하고, 그 추출액을 20% 또는 30% 물을 함유하는 메탄올을 이용하여 역상 실리카겔 칼럼크로마토그라피(silicagel RP-18 chromatography)한 다음, 분취용 역상 실리카겔 에이치피엘씨(preparative silicagel RP-18 HPLC)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 포함한 식물병원성 진균에 대한 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 및 이투린 에이(iturin A)의 제조방법.
  5. 제1항의 바실러스 선화 (Bacillus sp. sunhua)(KCTC 10668BP) 균주 또는 제2항의 항생물질 마크로락틴 에이(macrolactin A) 또는 제3항의 항생물질 이투린 에이(iturin A)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 감자 더뎅이병균(Streptomyces scabiei)을 포함한 식물병원성 진균 방제용 미생물제제.
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