KR101271593B1

KR101271593B1 - 마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항혈관신생효과를 갖는 조성물

Info

Publication number: KR101271593B1
Application number: KR1020110012707A
Authority: KR
Inventors: 김동희; 강경란; 황성우; 정성욱; 지용훈; 강재선; 김정애; 강유라
Original assignee: 대우제약 주식회사
Priority date: 2010-07-16
Filing date: 2011-02-14
Publication date: 2013-06-11
Also published as: EP2594268A4; CN103002892A; KR20120008429A; CA2803999C; US20130303600A1; EP2594268B1; US20130109745A1; WO2012008674A1; CA2803999A1; JP2013531032A; EP2594268A1; JP5728085B2; CN103002892B; US8940788B2

Abstract

본 발명은 마크로락틴 에이(macrolactin A), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A), 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)와 같은 마크로락틴류 화합물들을 유효성분으로 함유하는 항혈관신생효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.
본 발명이 제공하는 상기 마크로락틴류 화합물들은 생체내 실험에서 신생혈관형성을 강력히 억제하였으며, 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

Description

마크로락틴 에이 및 그 유도체를 유효성분으로 함유하는 항혈관신생효과를 갖는 조성물{Compositions for anti-angiogenesis containing macrolactin A and its derivatives}

본 발명은 항혈관 신생 작용이 있는 마크로락틴 에이(macrolactin A, 이하 MA라 칭함), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A, 이하 MMA라 칭함) 그리고 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A, 이하 SMA라 칭함)와 같은 마크로락틴류 화합물을 유효성분으로 함유하는 항혈관신생효과를 갖는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항혈관신생효과를 갖는 조성물을 이용하여, 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료를 목적으로 한 약학조성물을 제공할 수 있다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며, 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다(Folkman J et al., Int. Rev . Exp . Pathol ., 16 pp207-248, 1976)

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관 신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성된다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다. 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다.(D'Amato. RJ et al., Ophthalmology, 102(9), pp1261-1262, 1995; Arbiser JL, J. Am. Acad . Dermatol ., 34(3), pp486-497, 1996; O'Brien KD et al. Circulation, 93(4), pp672-682, 1996; Hanahan D et al., Cell, 86, pp353-364, 1996).

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이(metastasis) 되도록 한다(Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biological mechanism and Therapy(S. B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit. Rev . Oral . Biol . Med ., 6(3), pp230-247, 1995). 현재 임상에서 암 환자에게 사용하는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하는 주된 요인은 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 주요 원인이며, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하고 연골을 파괴시킨다. 즉, 염증을 유도하는 사이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하며, 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절 판누스를 형성한 후 쿠션 역할을 하는 연골을 파괴시킨다(Koch AE et al., Arthritis. Rheum ., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG et al., Braz J. Med . Biol . Rcs., 32(5), pp578-581, 1999; Koch AE, Atrhritis . Rheum ., 41(6), pp951-962, 1998).

해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다(Jeffrey MI et al., J. Clin . Invest ., 103, pp1231-1236, 1999). 그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 황반변성(macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다(Adamis AP et al., Angiogenesis, 3, pp9-14, 1999). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 실명하게 되는 질병이다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되기가 어렵고, 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한 달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수 밖에 없다(Folkman J, J. Invest . Dermatol ., 59, pp40-48, 1972).

혈관 신생 억제제를 이러한 각종 혈관신생 관련 질환의 치료에 적용할 수 있다. 이와 같은 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여해야하므로, 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 가장 이상적일 수 있다. 따라서 혈관신생 억제제로서 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되어지고 있다.

본 발명자들은 24환의 락톤링을 포함하고 있는 마크로라이드계 항생물질인 마크로락틴 에이를 비롯한 마크로락틴 유도체들의 약리활성에 대해 오랫동안 연구하여 왔다. 마크로락틴 화합물들은 분류되지 않은 해양 박테리아, 방선균 그리고 바실러스 균주에서 생산되었으며(Willam Fenical et al., J Am Chem Soc ., 111, pp7519-7524, 1989; Ik Dong Yoo et al., J Microbiol Biotechnol ., 7, pp429-434, 1997; Gabriella Molinari et al., Antimicrob Agents Chemother ., 50, pp1701-1709, 2006), 지금까지 23 종류가 구조적으로 확인되었다. 마크로락틴류 화합물의 약리활성에 대한 종래 연구는 다음과 같다.

1989년에 처음으로 분리된 MA는 murine melanoma cancer cell과 Herpes simplex virus 증식을 억제하고 HIV에 의해 손상된 T-림프아세포를 보호한다(Willam Fenical et al., J Am Chem Soc ., 111, pp7519-7524, 1989). 또한, 스쿠알렌합성효소(squalene synthase)를 억제하며(Sung Won Choi et al., Can J Microbiol ., 49, pp663-668, 2003), 글루타메이트(glutamate)에 손상된 뇌세포를 보호하고(Ik Dong Yoo et al., J Microbiol Biotechnol ., 7, pp429-434, 1997), 슈퍼박테리아를 비롯한 여러 병원성균에 대해서도 항균활성을 나타낸다(Gabriella Molinari et al., Antimicrob Agents Chemother ., 50, pp1701-1709, 2006). 이 외에도, 본 연구자등은 MA 및 그 유도체들이 지방다당질(lipopolysaccharide, LPS)로 유발된 염증매개인자의 생성을 저해하는 것을 확인하여 특허를 출원한바 있다(PCT출원번호 : PCT/KR2010/003239).

본 연구자등은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 케이제이에스-투(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P, 이하 “BP2”라 칭함)균주 발효액 또는 배양액으로부터 주생성물인 MA, MMA, SMA가 생산되는 것을 확인하였고 구조를 규명하였다. 상기 세 종류의 마크로락틴 화합물이외에도 마크로락틴 비(macrolactin B), 마크로락틴 씨(macrolactin C), 마크로락틴 디(macrolactin D), 마크로락틴 이(macrolactin E), 마크로락틴 에프(macrolactin F), 마크로락틴 지(macrolactin G), 마크로락틴 에이치(macrolactin H), 마크로락틴 아이(macrolactin I), 마크로락틴 제이(macrolactin J), 마크로락틴 케이(macrolactin K), 마크로락틴 엘(macrolactin L), 마크로락틴 엠(macrolactin M), 마크로락틴 엔(macrolactin N), 이소마크로락티닉 엑시드(isomacrolactinic acid) 그리고 마크로락티닉 엑시드(macrolactinic acid)로 추정되는 화합물을 상기 균 발효액 또는 배양액 조추출물로부터 생산되는 것을 엘씨/매스(LC/Mass)로 확인하였다(대한민국 특허등록번호 : 10-0895908). 하지만, 본 연구자등은 마크로락틴 오(macrolactin O), 마크로락틴 피(macrolactin P), 마크로락틴 큐(macrolactin Q), 마크로락틴 알(macrolactin R),마크로락틴 에스(macrolactin S)는 BP2 균에서 생산되는 것을 확인하지는 못하였다.

마크로락틴류 화합물들은 상기와 같은 다양한 구조만큼 다양한 약리활성을 갖고 있다. 하지만, 마크로락틴류 화합물들의 혈관신생억제에 대한 연구는 현재까지 전혀 보고된 바가 없다. 이에, 본 연구자등은 여러 종류의 마크로락틴류 화합물들을 포함하고 있는 BP2 균의 발효액 또는 배양액으로부터 생성된 조추출물을 엠피엘씨(middle pressure liquid chromatography, MPLC)를 사용하여 분획하였고, 각 분획물을 대상으로 혈관신생억제활성을 조사하였다. 그 결과, 마크로락틴류 화합물들을 포함하는 분획에서 혈관신생을 억제하였으며, 특히 MA, MMA, SMA를 포함하고 있는 분획은 신생혈관형성을 강력히 억제하였다. 이에, 본 연구자등은 상기 세 종류의 마크로락틴 화합물을 포함하는 엠피엘씨 분획으로부터 각 물질을 고순도로 정제하였으며(PCT출원번호 : PCT/KR2010/003239), 정제된 세 종류의 마크로락틴 화합물 각각의 혈관신생억제 활성을 조사하게 되었다.

본 발명자들은 MA, MMA 그리고 SMA가 혈관신생을 강력히 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 따라서, 본 발명은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료 목적으로 상기 마크로락틴류 화합물들을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공하는 데에 그 목적이 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1 ~ 화학식 3으로 표시되는 화합물들을 유효성분으로 함유하는 혈관신생억제용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 화학식 1 ~ 화학식 3으로 표시되는 화합물 중 어느 하나를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

화학식 1

화학식 2

화학식 3

상기 혈관신생으로 인한 질환으로는 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반변성, 당뇨성 망막변증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이 등이 알려져 있다

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 화합물들은 본 발명자들에 의해 이미 출원된 특허(PCT/KR2010/003239)에 기재된 방법으로 얻을 수 있다.

즉, 화학식 1, 화학식 2 그리고 화학식 3에 해당하는 화합물인 MA, MMA, SMA를 얻기 위해서는 본 발명자들에 의해 분리된 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 KJS-2(Bacillus polyfermenticus KJS-2, KCCM10769P)균주를 사용하여 PCT/KR2010/003239에 기재된 방법대로 발효, 추출, 분리 정제 과정을 거쳐 수득한다.

상기와 같은 방법으로 수득한 본 발명의 화합물들은 생체내 실험인 닭의 융모요막 모델에서 혈관내피성장인자(VEGF, vascular endothelial growth factor), 종양괴사인자-알파(TNF-α, tumor necrosis factor-α) 그리고 인터루킨-8(IL-8, interleukin-8)과 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관형성과 혈관신생으로 초래하는 암 전이를 강력히 억제함으로써, 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로서 본 발명의 화합물들이 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명이 제공하는 MA, MMA 그리고 SMA는 생체내 실험인 닭의 융모요막 모델에서 신생혈관형성을 강력히 억제함으로써 이를 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 혈관신생으로 초래된 질환의 치료 및 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

1.도 1a는 VEGF로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 보여주는 것으로 실시예에 의한 융모요막의 입체현미경 사진이다.
2. 도 1b는 VEGF로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 그래프로 나타낸 것이다.
3. 도 2a는 TNF-a로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 보여주는 것으로 실시예에 의한 융모요막의 입체현미경 사진이다.
4. 도 2b는 TNF-a로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 그래프로 나타낸 것이다.
5. 도 3a는 IL-8으로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 보여주는 것으로 실시예에 의한 융모요막의 입체현미경 사진이다.
6. 도 3b는 IL-8으로 유도된 신생혈관형성에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 그래프로 나타낸 것이다.
7. 도 4a는 5% FBS로 유도된 섬유육종세포의 전이에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 보여주는 사진이다.
8. 도 4b는 5% FBS로 유도된 섬유육종세포의 전이에 대하여 본 발명에 따른 화합물의 억제효과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 MA, MMA, SMA를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

여기서, 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막변증, 증식성 유리체 망막변증, 미성숙 망막변증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

이하 본 발명에 따른, 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 설명하도록 한다.

상기 약학조성물은 BP2를 비롯한 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 균의 배양액 혹은 발효액으로부터 생성된 마크로락틴류 화합물들인 MA, MMA, SMA 중 하나 이상 또는 각각의 물질을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다.

또한, 본 발명의 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼륨 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 MA, MMA, SMA 중 하나 이상 또는 각각의 물질을 유효성분으로 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제, 점안제, 점이제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용한다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 젤액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수젤액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제, 점안제, 점이제가 포함된다. 비수성용제와 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 점안제, 점이제 같은 경우에는 인산, 구연산, 주석산, 말산, 호박산 등 완충제와 염산, 황상, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등 산도조절제를 사용할 수 있다.

MA, MMA, SMA 중 하나 이상 또는 각각의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.01 내지 100 ㎎/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, MA, MMA, SMA 중 하나 이상 또는 각각의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명의 구성을 하기 실험 및 실시예를 들어 더욱 상세히 설명하지만 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.

실험재료 및 시약

유정란은 백자토종닭(청송, 한국)에서 구입하여 사용하였다. 2-피리딘카르복스알데히드(2-carboxaldehyde)와 2-아세틸퓨란(2-acetylfuran) 및 코티존 아세테이트(cortisone acetate)는 알드리치사(Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서, 혈관내피성장인자(VEGF)와 인터루킨-8(IL-8)은 알앤디사(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)에서 종양괴사인자-알파(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)는 인비트로겐사(Invitrogen Life Tech.)에서, 와트만 필터 디스크(whatman filter disc)는 와트만사(Whatman, UK)에서, batimastat는 Tocris사(Ballwin, MO, USA)로부터 구입하였다.

<제조예1> 실험물질 생산 및 분리정제

실험물질인 MA, MMA 그리고 SMA는 본 발명자들에 의해 이미 출원된 특허(PCT/KR2010/003239)에 기재된 방법대로 수득하였다.

<실시예1> CAM 분석을 통한 혈관신생 억제효과

생체내 시험상(in vivo)에서 마크로락틴류 화합물들의 항혈관신생효과를 확인하기 위하여, 융모요막(chorioallantoic membrane, CAM) 분석을 실시하였다(Nguyen M et al., Microvascular Res ., 47, pp31-40, 1994). 각 그룹(group) 당 6±1 개의 유정란을 사용하였다.

닭의 유정란을 온도 37℃, 상대습도 55%를 유지해주면서 배양시켜 10일째에 기낭(air sac) 부위에 피하주사침(hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫고, 창(window)을 낼 유정란의 평평한 부위에 두 번째 구멍을 뚫었다.

첫 번째 구멍인 기낭 부위의 구멍을 통해 공기를 빼냄으로써, 융모요막(CAM)이 유정란의 껍질로부터 분리되게 하여 이 부위를 회전연마기(griding wheel, Multipro 395JA, Dremel, Mexico)로 절단하여 창을 만들었다.

다음으로, 와트만 필터 디스크(whatman filter disc #1, whatman사, USA)에 코르티존 아세테이트(cortisone acetate) 3 ㎎/㎖을 처리하여 건조시킨 후 혈관내피성장인자(VEGF) 혹은 종양괴사인자-알파(TNF-α) 혹은 인터루킨-8(IL-8)을 10 ㎕씩을 filter disc에 처리한다(20 ng/CAM).

이미 만들어 놓은 창을 통해 필터 디스크를 혈관위에 얹고, MA 또는 MMA 혹은 SMA 화합물을 디메틸술폭사이드(DMSO)로 녹여 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 각 농도별로 처리하였다.

약물처리 3일 뒤, 필터 디스크가 얹힌 CAM 부분을 떼어내어 인산완충용액을 이용하여 씻어준 후, 입체현미경(Leica, Wetzlar, Germany)과 Image-Pro Plus software(Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다.

모든 data는 평균(Mean) ± 평균표준오차(standard error of mean)로 표시하였고, 통계분석은 GraphPad Prism 4 소프트웨어(GraphPad Software, San Die해, CA, USA)를 사용하여 일원변량분석(one-way ANOVA)으로 분석하고, 각 군 간의 차이에 대한 다중비교(multiple comparison)는 NK(Newman-Keuls)의 방법을 이용하였다. P값이 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의한 것으로 평가하였다.

상기의 실험 결과는 도1, 도2 그리고 도 3에 나타내었다.

도 1, 도 2, 도 3은 각 실험군에서 신생혈관을 관찰한 사진 및 각 실험군의 혈관 가지 개수 측정결과를 나타내는 그래프이다.

도 1a와 도1b를 참조하면, PBS만을 처리한 실험군(PBS)과, 혈관내피성장인자만을 처리한 실험군(VEGF alone), 혈관내피성장인자와 마크로락틴 화합물 각각을 농도별로 처리한 실험군을 나타낸 사진에서 MA, MMA 그리고 SMA가 혈관내피성장인자(VEGF)에 의한 신생혈관의 형성을 억제하였다. 특히, SMA는 농도 의존적으로 신생혈관형성을 강력히 억제하였다.

도 2a와 도2b를 참조하면, PBS만을 처리한 실험군(PBS)과, 종양괴사인자-알파를 처리한 실험군(TNF-α alone), 종양괴사인자-알파와 마크로락틴 화합물 각각을 농도별로 처리한 실험군을 나타낸 사진에서 MA와 SMA가 종양괴사인자-알파(TNF-α)에 의한 신생혈관의 형성을 억제하였다. 특히, SMA는 20 ㎍/CAM으로 처리된 군에서는 대조군과 비슷한 혈관 가지 개수로 신생혈관형성을 강력히 억제하였다.

도 3a와 도3b를 참조하면, PBS만을 처리한 실험군(PBS)과, 인터루킨-8을 처리한 실험군(IL-8 alone), 인터루킨-8과 마크로락틴 화합물 각각을 농도별로 처리한 실험군을 나타낸 사진에서 MA와 SMA가 인터루킨-8(IL-8)에 의한 신생혈관의 형성을 강력히 억제하였다. 특히, SMA는 20 ㎍/CAM으로 처리된 군에서는 대조군과 비슷한 혈관 가지 개수로 신생혈관형성을 강력히 억제하였다.

이와 같이, 본원 발명에 따른 마크로락틴화합물의 처리로 혈관내피성장인자 또는 종양괴사인자-알파 또는 인터루킨-8과 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 의한 신생혈관형성의 증가가 현저하게 감소되는 것을 알 수 있다.

<실시예2> 암 전이 억제능 실험

- 세포배양

HT-1080 인간 섬유 육종세포는 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin/streptomycin(PS)가 함유된 DMEM 배지로 37°C, 5% CO2 조건 하에서 배양하여, 세포가 배양 flask에 80% 이상 자라면 1 : 3 의 비율로 계대하여 본 실험에 사용하였다.

-암 전이 억제능 실험

생체외 시험상(in vitro)에서 마크로락틴 화합물의 암전이 억제 효능을 확인하기 위해 8 mm의 pore 크기를 가지는 폴리카보네이트 필터가 부착된 24-well transwell을 이용하여 섬유 육종 세포의 침윤성 실험을 수행하였다. 먼저 필터의 아래쪽면을 콜라겐 Type I (0.5 mg/ml)을 이용하여 코팅을 하고, 다시 필터의 위쪽면을 Matrigel (1.5 mg/ml)로 코팅을 하였다. 코팅을 끝낸 후. insert의 아래쪽 부분은 5% FBS가 포함된 배지로 채우고, 위쪽부분에는 serum-free 배지에 인간 섬유 육종 세포 HT-1080을 세포 배양기에서 18시간 동안 배양하였다. 필터의 아랫면으로 침윤되어져 나온 인간 섬유 육종 세포를 메탄올을 이용하여 고정시킨 후, Hematoxylin과 Eosin으로 염색하였다. 침윤되어져 나온 세포를 현미경으로 관찰하고, 각 필터에서 불규칙적으로 세 부분을 선택하여 촬영한 후, 세포 수를 측정하였다 (Kim, M. S. et al., Cancer Res ., 63, p5454-5461, 2003; Park, B. C. et al., Eur . J. Pharm., 567, pp193-197, 2007).

상기의 실험의 결과는 도4에 나타내었다.

도 4a와 도4b를 참조하면, 마크로락틴 화합물의 암전이 억제 효능을 비교하기 위해 대조군으로 암 전이에 필수적인 단백분해효소(matrix metalloproteinases, 이하 MMP라 칭함) 억제제인 batimastat를 사용하였다. 5% FBS로 유도된 섬유 육종 세포의 침윤이 증가되었고, MMP 억제제인 batimastat 5 농도를 처리한 대조군에서 유의하게 억제 되었다. MA와 SMA는 5% FBS로 침윤이 유도된 섬유 육종 세포에 농도 의존적으로 세포 전이를 억제하였다. 특히, SMA 1 은 전이 억제능이 유의성 있게 나타났으며, SMA 5 에서는 batimastat와 비슷한 수준까지 억제시키는 우수한 암전이 억제효과를 나타내었다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

Claims

마크로락틴 에이(macrolactin A), 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A) 및 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A) 중에서 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제효과를 갖는 약학조성물.
제1항에 있어서, 마크로락틴 에이(macrolactin A)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제효과를 갖는 약학조성물
제1항에 있어서, 7-O-말로닐 마크로락틴 에이(7-O-malonyl macrolactin A)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제효과를 갖는 약학조성물.
제1항에 있어서, 7-O-숙시닐 마크로락틴 에이(7-O-succinyl macrolactin A)를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제효과를 갖는 약학조성물.
제 1항 내지 제4항중 어느 한 항에 있어서, 혈관신생에 기인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 폐혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막변증, 안과염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골 손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 혈관신생억제효과를 갖는 약학조성물.