KR100825120B1

KR100825120B1 - 잎새버섯 추출물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR100825120B1
Application number: KR1020060138241A
Authority: KR
Inventors: 김정애; 이종숙; 이재성
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2006-12-29
Filing date: 2006-12-29
Publication date: 2008-04-25

Abstract

본 발명에 따르면, 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물이 제공된다.

이와 같은 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 의하면, 융모요막 모델 및 세포주에서 신생혈관형성 억제 및 암세포 생장 억제 효과가 탁월한 것으로 나타났으며, 이에 따라, 본 발명의 약학조성물은 암질환 및 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

잎새 버섯, 혈관신생, Grifola frodosa, 암, 약학조성물

Description

잎새버섯 추출물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising Grifola frodosa extract for treating or preventing angiogenesis-related disease and cancer disease}

도 1은 각 실험군에서 신생혈관을 관찰한 사진 및 각 실험군의 혈관 가지 개수 측정 결과를 나타내는 그래프,

도 2a는 대조군(control)으로 잎새버섯 추출물을 처리하지 않은 HUVEC 세포의 신생혈관을 나타낸 사진,

도 2b는 1㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 신생혈관을 나타낸 사진,

도 2c는 5㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 신생혈관을 나타낸 사진,

도 2d는 10㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 신생혈관을 나타낸 사진,

도 2e는 50㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 신생혈관을 나타낸 사진,

도 2f는 100㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 신생혈관을 나 타낸 사진,

도 3a는 대조군으로 잎새버섯 추출물을 처리하지 않은 HUVEC 세포의 암세포 침투능을 나타낸 사진,

도 3b는 5㎍/㎖ 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 암세포 침투능을 나타낸 사진,

도 3c는 10㎍/㎖ 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 암세포 침투능을 나타낸 사진,

도 3d는 50㎍/㎖ 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 암세포 침투능을 나타낸 사진,

도 3e는 100㎍/㎖ 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포의 암세포 침투능을 나타낸 사진이다.

본 발명은 잎새버섯 추출물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생 (embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다 (Folkman J et al., Int. Rev . Exp . Pathol ., 16, pp207-248, 1976).

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다. 혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 병리학적 상태에서 나타나는 혈관신생에 관련된 질환으로는 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 및 심혈관 질환인 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증이 있고, 혈관신생에 의한 안과 질환으로는 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등이 있다. 관절염과 같은 만성 염증성 질환, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 피부과 질환, 알츠하이머 및 비만도 혈관신생과 관련이 있으며, 암의 성장과 전이는 반드시 혈관신생에 의존한다 (D'Amato RJ et al., Ophthalmology , 102(9), pp1261-1262, 1995 ; Arbiser　 JL, J. Am . Acad . Dermatol ., 34(3), pp486-497, 1996 ; O'Brien KD et al. Circulation , 93(4), pp672-682, 1996 ; Hanahan D et al., Cell , 86, pp353-364, 1996).

특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종 양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이(metastasis) 되도록 한다 (Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ, Crit . Rev . Oral . Biol . Med ., 6(3), pp230-247, 1995). 암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

염증성 질환의 대표적인 질환인 관절염은 자가면역 이상이 원인이지만, 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 즉, 염증을 유도하는 사이토카인의 도움으로 활액세포와 혈관내피세포가 활액강에서 증식을 하여 혈관신생이 진행되면서 연골부에 발생하는 결합조직층인 관절 판누스를 형성하여 쿠션 역할을 하는 연골이 파괴된다 (Koch AE et al., Arthritis. Rheum ., 29, pp471-479, 1986; Stupack DG et al., Braz J. Med . Biol . Rcs., 32(5), pp578-581, 1999; Koch AE, Atrhritis . Rheum ., 41(6), pp951-962, 1998).

해마다 전 세계적으로 수백만 명이 실명하게 되는 많은 안과질환도 혈관신생이 원인이 되고 있다 (Jeffrey MI et al., J. Clin . Invest ., 103, pp1231-1236, 1999). 그 대표적인 예로 노인에게 일어나는 퇴화반 (macular degeneration), 당뇨병성 망막증 (diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장과 신생혈관에 의한 각막 질환과 같은 질병은 혈관신생이 원인이 되는 질병들이다 (Adamis AP et al., Angiogenesis , 3, pp9-14, 1999). 그 중 당뇨병성 망막증은 당뇨병의 합병증으로 망막에 있는 모세혈관이 초자체를 침습하여 결국 눈이 멀게 되는 질병이다.

붉은 반점과 인설의 피부가 특징인 건선도 피부에 생기는 만성의 증식성 질환인데 치유되지 않으며 고통과 기형을 수반한다. 정상인 경우 각질세포가 한달에 한번 증식하는데 비해 건선 환자는 적어도 일주일에 한번 증식한다. 이런 빠른 증식을 하기 위해서는 많은 혈액이 공급되어야 하므로 혈관신생이 활발히 일어날 수밖에 없다 (Folkman J, J. Invest . Dermatol ., 59, pp40-48, 1972).

혈관 신생 억제제를 이러한 각종 혈관신생 관련 질환의 치료제로 적용할 수 있으므로, 최근에 혈관신생을 억제시켜서 상기 질환들을 치료하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 이와 같은 혈관신생 억제제는 보통 환자에게 장기적으로 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이어야 가장 이상적인 치료제로 사용할 수 있다. 따라서 혈관신생 억제제로서 독성이 미비한 약제의 개발이 요구되어지고 있다.

한편, 버섯은 담자균과 자낭균 중 자실체를 형성하는 고등 균류로서 풍부한 영양소를 골고루 함유하고 있고 독특한 향기와 맛을 가지는 동시에 식용 및 약용으로 널리 이용되어 최근 각광받고 있는 기능성 식품 중의 하나이다. 이러한 버섯은 당질, 단백질, 비타민 및 무기질 등의 영양소가 풍부할 뿐만 아니라, 자실체 및 균사체의 추출물이 체질개선이나 각종 병의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 밝혀져 건강식품이나 의약품으로서의 용도가 크게 증가하고 있다.

이 중 잎새버섯(Grifola frondosa(Dicks. ex Fr.) S.F.Gray)은 민주름목 구멍장이버섯과(Polyporaceae)에 속하는 버섯으로서 가을에 졸참나무, 물푸레나무의 뿌리 근처에 사물 기생하여 다발로 발생하는 백색 목재부후균으로, 한국, 동아시아, 유럽, 북미 등에 분포되어 있다. 이러한 잎새버섯은 뭉툭한 대에서 무수한 가지꼴로 갈라지며 그 위에 다소 두껍고 구두칼형의 작은 갓을 형성한다. 갓의 크기는 2-5cm이고 두께는 2-4mm이며, 전체의 크기는 15-30cm이다. 표면은 초기에 흑색이나 후에 옅은 흑갈색으로 되고 그 위에 불완전한 둥근 무늬가 있으며, 조직은 부드럽고 백색을 띤다. 대의 기부(基部)는 굵고 바로 윗부분에서 여러 개의 분지로 갈라져 산호모양을 이루며 조직은 단단하며 충실하나 잘 부서진다. 이러한 잎새버섯은 식용 담자균류의 일종으로 향과 맛이 좋아서 일본에서는 송이버섯과 더불어 고급버섯으로 취급되고 있다. 이러한 잎새버섯에 대한 연구는 현재 균사체를 위주로 한 연구가 일부 진행되고 있을 뿐이다. 더구나 잎새버섯의 혈관 신생 또는 암의 예방 또는 치료 효과에 대한 연구는 아직까지 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자들은 본 발명의 잎새버섯 추출물이 우수한 혈관신생억제 및 암세포 성장 억제 효과를 가짐을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 잎새버섯 추출물을 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

여기서, 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환, 피부노화 및 암의 침윤과 전이로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 암질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

여기서, 암질환은 폐암, 비소세포성폐암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중 추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

이하, 본 발명의 일실시예에 따른 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 설명하도록 한다.

상기 약학조성물은 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다. 본 발명의 일실시예에서는 잎새버섯 자실체 추출물을 이용하며, 잎새버섯 추출물은 C1 내지 C4의 알코올이나 물을 이용하여 추출할 수 있다.

또한, 본 발명의 암질환 및 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 암질환 및 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 잎새버섯 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 잎새버섯 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　 또한 그 잎새버섯 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다.　 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투 여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular)주사에 의해 투여될 수 있다.

특히, 본 발명에 따른 잎새버섯 추출물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 없으며, 본 발명의 잎새버섯 추출물을 랫트에 경구투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD50)이 적어도 잎새버섯 추출물 10g/㎏이상인 안전한 물질로 판명되어 그 안정성이 확보되어 있다.

이하, 본 발명을 제형예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 제형예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제형예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 실험재료 및 시약, 기기 분석

유정란은 백자토종닭 농장 (경북 청송)에서 구입하여 사용하였으며, 인간 제대정맥 내피세포(Human umbilical vein endothelial cell; HUVEC)는 Clonetics(San Diego, CA)에서 구입하였다.

2-피리딘카르복스알데히드 (2-carboxaldehyde)와 2-아세틸퓨란(2-acetylfuran) 및 코티존 아세테이트 (cortisone acetate)는 알드리치사 (Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 섬유아세포증식인자 (FGF, fibroblast growth factor)는 인비트로젠 (Invitrogen, USA)에서 구입하였으며, 혈관내피성장인자 (VEGF, vascular endothelial growth factor)는 알앤디 (R&D systems, Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였으며, 와트만 필터 디스크 (whatman filter disc)는 와트만사(Whatman, UK)로부터 구입하였다.

또한, 건조된 잎새버섯 자실체는 일본 동경 지바현 시장에서 구입하였다.

참고예 2. 세포 배양

HUVEC 세포는 0.2%의 젤라틴(gelatin)이 코팅된 플라스크에서 배양되었다. 이 HUVEC 세포는 EBM-2(Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics, San Diego, CA) 배지에서 배양하였다. 이러한 EBM-2 배지는 우태아혈청(FBS), 하이드로코르티손 (hydrocortisone), hFGF-B(Human Basic Fibroblast Growth Factor), 혈관내피성장인자 (VEGF, vascular endothelial growth factor), R3-IGF-1(human recombinant insulin-like growth factor), 아스코르브산(ascorbic acid), hEGF(human epidermal growth factor), GA-1000 및 헤파린(heparin)을 포함한다. 본 발명의 실험예에서는 1번째 계대와 6번째 계대 사이의 HUVEC 세포를 사용하였다.

한편, 사람의 암 세포주로 HT-29 대장암세포, SNU-638 위암세포, Hep3B 간암세포 등은 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. 세포를 10 % 우태아혈청 (fetal bovine serum, GIBCO), 200 IU/㎖ 페니실린, 200 g/㎖ 스트렙토마이신, 1 mM 소듐 피루베이트 (sodium pyruvate) 를 포함하는 RPMI-1640 (HT-29 alc SNU- 638), DMEM (Hep3B) 배지조건, 37 ℃의 온도, 5 % CO₂/ 95 % 공기 조건의 가습 배양기에서 배양하였다. 이때, 배양 배지는 하루걸러 한번씩 교체하여 주었다. 컨플루언트 (confluent)하게 성장시킨 후, 0.25% 트립신-EDTA 용액으로 트립신 (trypsin) 처리하여 2차 배양 (subculture)하였다.

참고예 3. 잎새버섯 추출물 제조

잎새버섯 추출물을 얻기 위하여, 일본 동경의 지바현 시장에서 구입한 건조된 잎새버섯 자실체를 잘게 분쇄한 다음, 각각 물과 메탄올을 용매로 이용하여 추출하였다.

먼저, 메탄올을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정을 설명하면, 분쇄된 잎새버섯 시료에 20중량배량의 메탄올을 가한 다음, 40℃로 조절된 항온 수조에서 12시간 동안 3회에 걸쳐 반복하여 추출하였다. 이 추출액을 여과한 다음, 회전식 농축기(rotary evaporator, EYELA Co., Japan)를 이용하여 용매를 제거하였다. 다음으로, 용매가 제거된 시료를 증류수로 용해하고 동결건조하여 잎새버섯 추출물을 얻었다.

물을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정은 상기 메탄올을 용매로 하여 잎새버섯 추출물을 얻는 과정과, 사용되는 용매만 제외하고 동일하므로, 반복적인 설명은 생략하도록 한다.

실험예 1. 잎새버섯 및 잎새버섯 추출물의 성분 분석

잎새버섯의 일반 성분 분석은 공인분석화학회(AOAC)에 등재된 시험법에 준하여 실시하였다. 수분은 105℃ 건조법, 조단백질은 micro-Kjeldahl 법, 조지방은 Soxhlet법, 조회분은 550℃ 직접 회분법을 사용하여 측정하였으며, 조섬유는 0.13M H₂SO₄, 0.23M KOH로 분해한 후 건조 및 회화시켜 정량하였다.

또한, 메탄올 및 물을 이용하여 추출된 잎새버섯 추출물의 수율 값은 추출액 일정량을 취하여 동결건조한 다음 건물 중량을 구하고, 추출액 조제에 사용한 원료 건물량에 대한 백분율로 계산하였다.

상기의 잎새버섯 및 잎새버섯 추출물의 성분 분석 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

	잎새버섯	잎새버섯 추출물(메탄올)	잎새버섯 추출물(물)
수분	8.59±0.69	6.91±0.43	9.14±0.40
조단백질	32.55±3.24	10.13±0.53	44.66±0.26
조지방	1.10±0.64	1.63±0.20	0.74±0.33
조회분	7.04±0.12	11.98±0.85	12.49±0.79
조섬유	13.80±0.18	0.22±0.05	0.20±0.04
탄수화물	36.90±0.21	69.13±0.12	32.77±0.12
수율	-	28.7%	49.2%

표 1을 참조하면, 잎새버섯 자실체의 일반성분은 수분 8.59%, 단백질 32.55%, 지방 1.10%, 회분은 7.04%, 섬유 13.80%로 나타났다.

또한, 잎새버섯 자실체를 메탄올 및 물을 용매로 이용하여 추출한 후, 추출물에 대한 일반 성분을 분석한 결과, 전반적으로 비슷한 함량이 나타났으나, 단백질 함량이 메탄올을 이용한 추출물보다 물을 이용한 추출물이 4배 이상 많았다.

잎새버섯을 각각 메탄올 및 물을 이용하여 추출 및 동결건조한 후 각 추출용매별로 측정한 수율은, 물을 이용한 잎새버섯 추출물이 49.2%로 메탄올을 이용한 잎새버섯 추출물 28.7%보다 훨씬 많았다.

이에 따라, 물을 이용한 잎새버섯 추출물을 이용하여 하기의 실험예 2 내지 6의 실험을 수행하였다.

실험예 2. 닭의 융모요막 분석 ( CAM assay )을 통한 잎새버섯 추출물의 혈관 신생억제효과

잎새버섯 추출물의 생체내 시험상 (in vivo)에서 항혈관신생효과를 확인하기 위하여, CAM (CAM, chorioallantoic membrane) 분석을 실시하였다 (Nguyen M et al., Microvascular Res ., 47, pp31-40, 1994). 닭의 유정란을 온도 37 ℃, 상대습도 55%를 유지해주면서 배양시켜 10일째에 기낭 (air sac) 부위에 피하주사침 (hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫고, 창 (window)을 낼 유정란의 평평한 부위에 두 번째 구멍을 뚫었다.

첫 번째 구멍인 기낭 부위의 구멍을 통해 공기를 빼냄으로써, 융모요막 (CAM, chorioallantoic membrane)이 유정란의 껍질로부터 분리가 되게 하여 이 부위를 회전연마기 (grinding wheel, Multipro 395JA, Dremel, Mexico)로 절단하여 창을 만들었다. 다음으로, 와트만 필터 디스크 (whatman filter disk #1, whatman사, USA)에 코티존 아세테이트(cortisone acetate) 3 ㎎/㎖을 처리하여 건조시킨 후 섬유아세포증식인자(FGF)는 15 ng/CAM의 농도로, 혈관내피성장인자 (VEGF)는 20 ng/CAM의 농도로 적셔두었다.

만들어 둔 창을 통해 필터 디스크를 혈관 위에 얹고, 본 발명의 참고예 3의 잎새버섯 추출물을 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 10 ㎍ 농도로 처리하였다. 약물처리 3일 뒤, 필터 디스크가 얹힌 CAM 부분을 떼어내어 인산완충용액을 이용하여 씻어준 후, 입체현미경 (Stemi SV6 stereomicroscope, Carl Zeiss, Germany)과 Image-Pro Plus software (Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다

상기의 자료 분석 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1은 각 실험군에서 신생혈관을 관찰한 사진 및 각 실험군의 혈관 가지 개수 측정 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1을 참조하면, PBS만을 처리한 실험군(PBS)과, 혈관내피성장인자만을 처리한 실험군(VEGF alone), 혈관내피성장인자와 잎새버섯 추출물을 동시에 처리한 실험군(VEGF+GF)을 나타낸 사진에서, 잎새버섯 추출물은 혈관내피성장인자에 의한 신생혈관의 형성을 방해하는 것으로 나타난다.

이와 같이, 잎새버섯 추출물의 처리로 혈관내피성장인자와 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관 형성의 증가가 현저하게 감소될 수 있는 것을 알 수 있다.

실험예 3. HUVEC 세포에서 잎새버섯 추출물의 혈관형성억제효과

HUVEC 세포에서 잎새버섯 추출물이 혈관형성에 미치는 효과를 알아보기 위하여 96-웰 플레이트에 HUVEC 세포를 배양시켰다. 여기서 96-웰 플레이트(96-well plate)의 각 웰에 40㎕의 Matrigel(BD biosciences, Bedford, MA)을 코팅한 다음, 96-웰 플레이트를 37℃에서 30분 동안 보관한 후 사용하였다.

HUVEC 세포는 2%의 우태아혈청을 포함하는 EBM-2(Endothelial Cell Basal Medium-2, Clonetics, San Diego, CA) 배지에 혼탁시켰다. 이러한 HUVEC 세포는 상기 matrigel이 코팅된 각 웰에 1×10⁴개의 세포가 주입되도록 하였다. 그 다음으로, 각각 다른 농도의 잎새버섯 추출물을 각 웰에 첨가하고 7시간 동안 보관하였다. 이렇게 처리된 HUVEC 세포는 역상현미경과 연결된 CCD카메라로 촬영하였고, 그 사진을 도 2a 내지 도 2f에 나타내었다.

도 2a는 대조군(control)으로 잎새버섯 추출물을 처리하지 않은 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2b는 1㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2c는 5㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2d는 10㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이며, 도 2e는 50㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진, 도 2f는 100㎍/㎖의 잎새버섯 추출물을 처리한 HUVEC 세포를 나타낸 사진이다.

먼저, 도 2a를 참조하면, 대조군(control)에서 많은 혈관이 신생된 것을 관찰할 수 있다. 여기서, 잎새버섯 추출물의 농도를 높일수록 신생되는 혈관의 수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이에 따라, 잎새버섯 추출물이 HUVEC 세포의 혈관 신생을 억제한다는 것을 확인할 수 있다.

실험예 4. 잎새버섯 추출물의 HUVEC 세포 이주( migration ) 및 침윤( invasion)억제효과

잎새버섯 추출물의 혈관내피세포 이주 억제 효과를 알아보기 위하여, in vitro상에서 HUVEC세포를 이용하여 실험하였다(Mi-Sung Kim et al., Cancer Research, 63, 5454-5461, 2003 Sang-Oh Yoon et al., The journal of Biological chemistry, 276, 20085-20092, 2001; Sonia Zorzet et al., The journal of pharmacology and experimental therapeutics, 295, 927-933, 2000). 여기서 사용된 배양 플레이트는 다수의 8mm 크기의 구멍(pore)을 갖는 폴리카보네이트 (polycarbonate) 필터를 포함하는 24웰 플레이트(Corning Costar, Cambridge, MA)를 사용하였다. 이 폴리카보네이트 필터의 하면을 0.5㎎/㎖ 농도의 제1형 콜라겐(type Ⅰ collagen) 20㎖로 코팅하였으며, 그 상면은 1.5㎎/㎖ 농도의 Matrigel(BD biosciences, Bedford, MA) 20㎖로 코팅하였다. 여기서, 폴리카보네이트 필터의 하부 영역은 상기한 EBM-2 배지로 채웠으며, HUVEC 세포는 폴리카보네이트 필터의 상부에 접종하였다. 이렇게 접종된 HUVEC 세포를 37℃에서 18시간동안 배양한 다음 폴리카보네이트 필터의 하면에 침투된 세포를 메탄올(methanol)로 고정(fix)하고, 헤마톡시린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색하였다. 그 결과는 도 3a 내지 도 3e에 나타내었다.

도 3a 내지 도 3e는 잎새버섯 추출물의 혈관내피세포 이주 및 침윤 억제 효과를 확인하기 위하여 폴리카보네이트 필터의 하면을 200배율로 관찰한 현미경 사진으로, 각각 대조군, 5㎍/㎖ 잎새버섯 추출물 처리군, 10㎍/㎖ 잎새버섯 추출물 처리군, 50㎍/㎖ 잎새버섯 추출물 처리군 및 100㎍/㎖ 잎새버섯 추출물 처리군의 혈관내피세포 침투능을 나타낸 사진이다.

여기서, 잎새버섯 추출물을 처리한 경우 대조군에 비해 폴리카보네이트 필터의 하면에 침투한 HUVEC세포가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 잎새버섯 추출물이 HUVEC세포의 이주 및 침윤을 농도의존적으로 감소시킨다는 것을 알 수 있었다.

실험예 5. 잎새버섯 추출물의 암세포독성 실험

세포 생존률을 측정하기 위하여 참고예 2의 각 세포를 4 내지 5일 배양하여 24웰 플레이트에 5×10⁴ 세포/웰의 밀도로 분주하였고, 각 웰의 배지 용량은 1 ㎖로 맞추었다. 그 후 잎새버섯 추출물을 각각 0.1, 0.5, 1, 5 mg/㎖농도로 처리(시료처리군)하여 48시간동안 배양한 후, 100㎕의 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide ; 5 g MTT/ℓin H₂O)를 첨가한 후 4시간 더 세포를 배양하였다. 여기서, 대조군으로 잎새버섯 추출물을 첨가하지 않은 세포를 시료처리군과 동일한 방법으로 배양하였다.

그 후, 각각의 세포가 포함된 웰에 디메틸술폭사이드(DMSO) 200㎕를 첨가하고 환원된 MTT 결정을 용해하기 위하여 피펫으로 혼합하였다. 상대적인 세포 생존률을 540㎚ 필터를 가진 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Menlo Park, CA)로 스캐닝하여 측정하였다. 세포생존 저해효과는 다음의 수학식 1에 의해 계산하였으며, 그 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

세포생존 저해율(%) = {(대조군의 흡광도-시료처리군의 흡광도)/대조군의 흡광도}×100

추출용매	잎새버섯추출물투여량(㎎/㎖)	Hep3B세포생존 저해율(%)	SNU-638세포생존 저해율(%)	HT-29세포생존 저해율(%)
메탄올	0.1	9.27±0.95	-	17.19±3.64
메탄올	0.5	18.77±2.85	-	21.57±2.26
메탄올	1.0	33.97±1.70	25.16±1.57	22.87±6.69
메탄올	5.0	45.37±2.57	48.25±4.23	23.63±4.1
물	0.1	34.22±3.02	10.26±6.15	16.79±4.46
물	0.5	53.07±1.84	19.99±3.89	24.18±3.61
물	1.0	62.57±2.18	34.99±9.39	47.74±9.33
물	5.0	74.5±1.32	52.34±5.42	68.33±0.66

표 2에 나타난 바와 같이, 잎새버섯 추출물은 메탄올 추출물보다 암세포생존저해 효과가 더욱 큰 것으로 나타났으며, 잎새버섯 추출물의 여러 종류 사람 암세포에 대한 독성은 농도의존적으로 나타났다.

실험예 6. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 5 마리씩의 동물에 실시예 1에 따라 조제된 잎새버섯 추출물을 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/㎏, 5g/㎏ 및 10g/㎏의 용량으로 1회 단회 경구투여하였다. 상기 추출물의 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 잎새버섯 추출물을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 잎새버섯 추출물은 랫트에서 10g/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중간치사량(LD50)은 본 발명의 잎새버섯 추출물 10g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명의 잎새버섯 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다. 하기 제제예에 이용된 잎새버섯 추출물은 상기 참고예 3에서 물을 용매로 이용하여 얻은 잎새버섯 물추출물이 이용되었다.

제제예 1. 산제의 제조

잎새버섯 물추출물 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

잎새버섯 물추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

잎새버섯 물추출물 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 주사제의 제조

잎새버섯 물추출물 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5. 액제의 제조

잎새버섯 물추출물 100 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 의하면, 잎새버섯 추출물이 융모요막 모델에서 신생혈관형성을 억제하고, 혈관내피세포에서 HUVEC 세포의 혈관 형성 및 이주를 억제하는 것을 확인하였으며, 상기와 같은 잎새버섯 추출물이 암세포 성장을 억제하기 때문에 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환 및 암질환의 예방 및 치료용 약학 조성물로서 이용될 수 있다.

Claims

분쇄된 잎새버섯에 물을 가한 후, 40℃로 조절된 항온 수조에서 12시간 동안 반복 추출하여 얻어진 잎새버섯 추출물을 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 1항에 있어서, 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환 및 피부노화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
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