KR102067707B1 - 마클루라 푸베센스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물 - Google Patents

마클루라 푸베센스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 마클루라 푸베센스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화 및 뇌신경 보호효과가 있음이 밝혀지며, 이를 토대로 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens ) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다. 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은, 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.

Description

마클루라 푸베센스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물 {Composition for neuroprotection containing extract or fraction of Maclura pubescens as an effective component}
본 발명은 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중(腦卒中, stroke)은 뇌의 기능에 부분적 또는 전체적으로 급속한 장애가 발생하여 상당 기간 이상 지속되는 것으로, 뇌혈관의 병 이외에 다른 원인을 찾을 수 없는 경우를 말한다. 한의학에서는 뇌졸중을 ‘중풍(中風)’ 또는 ‘풍(風)’으로도 지칭하는데, 중풍은 뇌졸중에 포함되지 않는 질환도 포함하고 있어 일치하는 개념은 아니다. 뇌졸중은 뇌경색(허혈성 뇌졸중)과 뇌혈관의 파열로 인해 뇌 조직 내부로 혈액이 유출되어 발생하는 뇌출혈(출혈성 뇌졸중)을 모두 포함하는 용어이다.
뇌조직은 평상시 많은 양의 혈류를 공급받고 있으나, 다양한 원인으로 인하여 뇌혈관이 막히는 경우가 발생하여 뇌에 공급되는 혈액량이 감소하면 뇌조직이 기능을 제대로 하지 못하게 된다. 뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되면 뇌조직이 괴사되는데, 뇌조직이 괴사되어 회복 불가능한 상태에 이른 것을 뇌경색(cerebral infarction)이라고 한다. 뇌경색(cerebral infarction)에는 뇌혈전증과 뇌색전증이 있다. 혈전증(血栓症)은 혈관의 국소에서 혈액이 굳어져서 혈관을 막는 것을 말하며, 혈전이 생기면 그 혈관의 영역은 혈류가 두절되며, 다른 곳으로부터의 부혈행로에 의한 보상이 충분하지 않으면 그 부위의 뇌조직은 사멸된다. 색전증은 심장 속에 생긴 혈전이 혈류에 의하여 말초(末梢)로 운반되어 말초의 혈관이 막히는 것을 말하며, 색전에 의하여 혈관이 막히면 그 부분의 뇌조직은 사멸한다. 일반적으로 색전이 혈전에 비해 융해되기 쉽고, 혈류가 다시 흐르게 되는 경우가 많은 것으로 알려져 있다.
뇌의 퇴행성 질환(degenerative disease)에는 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 윌슨병(Wilson disease), 파킨슨병(Parkinson disease) 등이 있는데 공통적으로 미만성 뇌위축(diffuse brain atrophy)을 나타낸다. 대뇌피질을 침범하는 퇴행성 질환에는 알츠하이머병과 픽병 등이 있는데 주된 증상은 치매(dementia)이다.
치매는 그 자체가 하나의 질환을 의미하는 것은 아니고, 여러 가지 원인에 의한 뇌손상에 의해 기억력을 위시한 여러 인지기능의 장애가 생겨 예전 수준의 일상생활을 유지할 수 없는 상태를 의미하는 포괄적인 용어이다. 치매는 일단 정상적으로 성숙한 뇌가 후천적인 외상이나 질병 등 외인에 의하여 손상 또는 파괴되어 전반적으로 지능, 학습, 언어 등의 인지기능과 고등 정신기능이 떨어지는 복합적인 증상을 말한다. 치매의 원인 중 가장 흔한 것은 알츠하이머병(AD; Alzheimer's dementia)으로 약 50-60%를 차지하고, 그 다음으로는 혈관성 치매(VaD; Vascular dementia)가 20-30%를 차지하며, 나머지 10-30%는 기타 원인에 의한 치매이다. 혈관성 치매는 뇌경색 또는 뇌출혈 등의 뇌혈관질환으로 뇌혈관이 막히거나 좁아져 발생한다.
뇌의 퇴행성 질환에 적용하는 약제로는 타크린(Tacrine)과 같은 아세틸콜린 분해효소 억제제(acetylcholinesterase-inhibiting drugs), 활성산소에 의한 뇌 세포의 파괴를 억제하는 비타민 E, 셀레질린(selegiline)과 같은 항산화제 등이 있다. 그러나 지금까지 개발된 약제들은 효능이 충분하지 않으며 상당 수 부작용을 수반하는 것으로 알려져 있다.
또한, 위와 같은 퇴행성 질환까지는 아니더라도 기억력 및 집중력 감퇴를 호소하는 일반인이 늘고 있다. 따라서 부작용은 없거나 최소화하면서 뇌의 기능과 기억력을 개선시킬 수 있는 약물이 요구되고 있다.
뉴로글로빈(Neuroglobin, Ngb)은 neuron에서 발견된 globin의 subtype으로 신경세포내의 O2를 감지하고 결합하여 운반하는 기능을 가지고 있으며, 활성산소종(ROS)의 scavenge 에 관여한다. Ngb가 신경재생을 촉진시킴이 보고된 바 있으며, 신경분화의 매우 초기단계에서 발현되며 미토콘드리아 기능과 ATP 생성을 보존함으로써 신경재생을 촉진시킬 수 있음이 확인되었다. 또한, Ngb는 정상 생리조건에서 뇌조직에 산소 운반기능을 통하여 세포호홉에서 중요한 역할을 담당하지만 뇌손상 시에는 내인적인 신경보호작용을 나타내며 이에 대한 작용기전으로 G-protein coupled receptor의 신호 형질도입(signal transduction)에 관여하며, 미토콘드리아에서 cytochrome C의 전자 전달에 의해 세포자멸(apoptosis), 세포의 생존(cell survival)을 조절하는 것으로 알려져 있다. Ngb는 특히 뇌신경세포에 선택적으로 높게 발현되며 내인성 신경보호인자일 뿐 아니라 신경재생 촉진기능도 동시에 지니므로 알츠하이머나 뇌졸중에 대하여 보호적인 역할을 하는 것으로 보고되었다(Greenberg et al., 2008) (Yu et al., 2013B). 최근 E2(ER)-유도성 Ngb 증진효과가 보고되었다. 이러한 Ngb는 약물학적으로 조절이 가능한 표적이므로 약물을 통한 Ngb 신호 증진은 뇌보호 치료에 매우 효과적이고 유용할 것으로 기대된다(Jin et al., 2011).
한편, 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)는 뽕나무속(Maclura) 식물로서 본 발명에서 실험에 사용한 마클루라 푸베센스는 해외생물소재허브센터로부터 분양받은 것이다. 마클루라 푸베센스는 식물학적으로 가지는 담갈색이며 수령이 많아지면 회녹색으로 변하고, 황갈색의 무성한 긴 솜털이 있으며 타원형의 껍질눈을 가지고 있다. 꽃은 엽액에서 짝지어 개화하며 대략 1cm의 지름이고 황갈색 무성한 긴 솜털이 있다. 꽃이 기저부분에서 다육질의 꽃받침 조각이 유착되어있다. 수술대는 짧고 원뿔형의 암술이 있다. 열매는 익었을 때 주홍색이며 1.5-2cm의 지름을 가지는데(Z. K. Zhou and M. G. Gilbert, 2003), 약리활성에 관한 연구 보고는 없다.
이와 같은 속에 속하는 마클루라 코치넨시스(Maclura cochinchinensis (Lour.) Corner)의 경우 뽕나무속(Maclura) 뽕나무과(Moraceae) 식물로서 전 세계에 널리 분포한다. 중국에서는 마클루라 코친시네시스 추출물이 임질, 류머티즘, 황달, 간염, 옴(scabies), 타박상(bruising)등에 사용하는 전통 민간약으로 알려져 있다. 베트남에서는 마클루라 코친시네시스 잎의 추출물이 상처 치료에 민간약으로 사용되고 있으며(van Hien and Cherry, 1997), 대만에서는 간염 치료제로 사용된다는 보고가 있다(Lin and Kan, 1990). 마클루라 코친시네시스 뿌리에서 베타시토스테롤(beta-sitosterol), 시린가레놀(syringarenol), 잔톤(xanthone), 켐페롤(kaempferol), 바닐린(vanillin) 등이 분리되었다는 보고가 있다(Zhou Q et al., 2013). 마클루라 코친시네시스의 약물학적 활성은 항미생물 작용 (Fukai et al., 2003), 항진균 작용(Fukai et al., 2003), 항 간염 바이러스(Bunyapraphatsara et al., 2000), (Yoosook et al., 2000), 항암(Wang et al., 2010), 항염(Lin et al., 1999), 항궤양(Kobayashi et al., 1997), 항히스타민(Mokkhasmit et al., 1971), 항 알츠하이머 작용(Wang et al., 2013) 등이 보고된바 있다.
그러나 다양한 약리활성이 알려져 있고 민간요법으로 이용되고 있는 마클루라 코친시네시스와 달리 마클루라 푸베센스에 대해서는 어떠한 생리 활성도 보고된바가 없다.
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본 발명은 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호 효과가 있는 뇌신경 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)의 추출물 및 분획물에 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한 뇌신경 보호 효과가 있음을 밝히고, 이를 토대로 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
마클루라 푸베센스 추출물 및 분획물이 신경보호 효능을 나타낸다는 것은 본 발명에서 처음 발견된 것으로, 본 발명에서는 마클루라 푸베센스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해 신경보호효능을 나타낸다는 것을 증명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,
마클루라 푸베센스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민의 치료 및 예방; 뇌손상 보호; 뇌기능 개선; 뇌신경세포 보호 중 하나 이상을 위한 뇌신경 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는,
마클루라 푸베센스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민의 개선 및 예방; 뇌손상 보호; 뇌기능 개선; 뇌신경세포 보호 중 하나 이상을 위한 뇌신경 보호용 식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 마클루라 푸베센스 추출물은 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것이다.
상기 식품 조성물에서 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다. 또한, 상기 식품은 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서는 마클루라 푸베센스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화, 이를 통한 뇌신경 보호효과가 있음을 규명하였다. 본 발명은 이러한 결과를 토대로, 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다.
도 1은 Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 SKNSH 세포에서 마클루라 푸베센스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험한 결과로, 마클루라 푸베센스 추출물에 의한 Ngb 유전자 전사활성 증가를 보여주고 있다.
도 2는 Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 N2a 세포에서 마클루라 푸베센스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험한 결과로, 마클루라 푸베센스 추출물에 의한 Ngb 유전자 전사활성 증가를 보여주고 있다.
도 3은 Vehicle, 마클루라 푸베센스 추출물을 처리한 SKNSH 세포에서 Ngb 단백질 발현변화를 확인한 결과이다.
도 4는 bEnd.3 세포의 저산소배양조건에서의 마클루라 푸베센스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과이다.
도 5는 primary cortical neuron 세포의 저산소배양 조건에서의 마클루라 푸베센스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과이다.
도 6은 primary cortical neuron 세포의 저산소배양 조건에서의 마클루라 푸베센스 분획물의 신경보호효과를 확인한 결과이다.
도 7은 생쥐 뇌졸중모델에서 마클루라 푸베센스 추출물이 뇌졸중에 의한 뇌경색을 감소시키는지를 실험한 결과로, 중뇌동맥 45분 폐색, 24시간의 재관류 후에 뇌경색의 크기를 측정한 결과이다.
도 8은 마클루라 푸베센스 추출물이 우울증 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가한 결과로, (A)는 십자형 높은 미로 실험 결과이며, (B)는 개방장 시험 결과이며, (C)는 강제수영실험 결과이며, (D)는 rotarod 실험 결과이다.
본 발명에서는 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens)의 추출물 및 이의 분획물에 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한 뇌신경 보호 효과가 있음을 밝힌다. 또한, 본 발명에서는 이러한 결과를 토대로 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens )의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다.
마클루라 푸베센스 추출물 및 분획물
본 발명에서 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens) 추출물은, 바람직하게는 물, 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 유기용매를 사용하여 10~80℃에서 추출하여 얻을 수 있다. 더욱 바람직하게는 마클루라 푸베센스에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 추출물을 여과하는 단계; 여과물을 감압 농축하는 단계; 및 필요에 따라 농축물을 건조하는 단계를 포함하는 방법으로 얻을 수 있다. 또한 이렇게 얻어진 추출물로부터 분획물을 얻을 수 있다. 각각의 단계를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
1) 추출하는 단계
마클루라 푸베센스의 전체 부위에 추출용매를 가하여 추출한다. 이때 추출용매로는 물, 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 3의 저급 알코올 사용한다. 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용한다. 추출용매는 건조된 마클루라 푸베센스 분량의 1 내지 20배를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, 속실렛(soxhlet) 추출, 환류 추출, 초음파발생장치를 이용한 초음파 추출, 자동 추출기 등의 방법을 이용할 수 있다. 추출 온도는 바람직하게는 10~80℃이고, 더욱 바람직하게는 20℃~70℃이며, 가장 바람직하게는 30℃~60℃이다. 추출시간은 한정되지는 않으나, 초음파 추출의 경우 바람직하게는 50 ℃에서 2~4일간 추출하며, 자동 추출기를 사용할 경우에는 20±5 분간 추출한다. 자동 추출기로는, 예를 들어, ASE300 가속화 추출기(DIONEX Corporation) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 95% 이상의 메탄올을 사용하여 50℃에서 2~4일간 초음파 추출한다. 또 다른 바람직한 실시예로서, ASE300 가속화 추출기(DIONEX Corporation)를 사용할 경우 N2 가스를 사용하여 50 ℃, 1500 psi에서 20분간 추출한다.
2) 여과하는 단계
다공성(多孔性) 여과재를 사용하여 상기 단계에서 얻은 추출물을 여과한다. 여과는 고형분, 이물질 등을 걸러내기 위한 것으로 이러한 용도에 적합한 여과재라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 여과지, 유리여과기, 유리섬유, 면, 솜, 나일론, 다공성 금속, 금속섬유 등이 사용될 수 있다.
3) 감압 농축하는 단계
여과 후 오래방치하면 침전물이 생길 수 있으므로 바로 농축하는 것이 바람직하다. 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 회전증발기 등을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다. 완전히 감압 농축한 후 그대로 바이알 등에 넣고 감압 밀봉하거나 아래의 건조단계를 더 거친 후 밀봉, 보관할 수 있다.
4) 건조하는 단계
농축 후 필요에 따라 건조단계를 더 추가할 수 있다. 건조 방법은 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 동결건조하는 등의 방법을 이용할 수 있다.
5) 분획물을 얻는 단계
상기와 같이 얻어진 추출물을 메탄올에 녹이고 원심분리 후 상층액을 모아 상온의 250 mm×21.2 mm, 7 μm particle size column에서 고성능액체크로마토그래피를 실시하여 21개 분획을 얻었다. 또한, 얻어진 분획에 대하여 ACQUITY UPLC BEH C18 column을 실시해 10개의 활성을 가진 분획을 분석하였다.
유효성 확인
본 발명에서는, 유전자 리포터 평가시험(Neuroglobin 반응성 유전자 전사실험), 세포내 표적 단백질의 발현량 변화를 통한 신경보호 효과 평가, 저산소유발(Oxygen glucose deprivation, OGD)에서의 세포 독성 및 생존도를 통한 신경보호작용 평가, 중뇌동맥폐색 수술(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)을 통한 생체 허혈성 뇌졸중 모델에서의 신경보호 효과 평가, 추출물을 투여 받은 동물모델에서의 행동학적 신경 보호에 미치는 효과 평가 등을 실시하였다.
이러한 실험을 통해 본 발명에서는, 마클루라 푸베센스 추출물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화, 신경보호효과, Ngb의 발현양 증가를 통한 뇌보호 효과, 뇌경색크기 감소를 통한 뇌보호 효과, 우울, 불안 및 운동성에 대한 신경행동학적 증상 개선 효과가 있음을 밝혔다. 마클루라 푸베센스 추출물이 신경보호 효능을 나타낸다는 것이나 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 나타낸다는 것은 본 발명에서 처음 발견되고 증명된 것이다.
또한, 본 발명에서는 마클루라 푸베센스 추출물의 급성 독성 실험을 통해 안전성을 확인하였다.
이러한 실험결과를 토대로, 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은, 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 최근에는 신경세포에서 Ngb와 여성호르몬 수용체(ER)와의 신호연관성이 보고되고 있다. 에스트로겐 유도성 뉴로글로빈의 작용이 De Marinis 그룹에 의하여 신경세포에서 처음 보고된 이후(De Marinis, Ascenzi et al. 2010), 신경세포(SKNBE, NT2)에서 에스트로겐-estrogen receptor(ER)α 결합에 의한 Ngb의 발현 증가가 보고되었으며(Guglielmotto, Reineri et al. 2016), ERβ를 경유하는 p38 MAPK 신호매개에 의한 Ngb 유도증가가 밝혀졌다(De Marinis, Marino et al. 2011). 또한 ERβ의 작용기전으로서 미토콘드리아 호홉촉진 작용이 최근에 보고되고 있어(Ponnusamy, Tran et al. 2016), 미토콘드리아에서 Ngb와 ERβ의 상호작용에 대한 가능성이 매우 높을 것으로 예측된다. Bioinformatics 정보에 의하면 Ngb는 주로 뇌의 특정부위(locus coeruleus, occipital cortex, lobe amygdala), 경동맥, 심장근육세포에서 발현이 높을 것으로 평가되므로(Guglielmotto, Reineri et al. 2016), Ngb는 여성의 뇌, 심혈관질환 연구를 위하여 매우 직접적인 치료 타겟임을 확인할 수 있고, 특히 페경기 여성의 뇌 및 심혈관질환 연구에서 매우 효과적이고 민감한 타겟이 될 수 있다고 예측된다. 따라서 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은 여성, 특히 갱년기 여성의 뇌신경 보호에 특히 적합하게 이용될 수 있으며, 뇌신경과 관련한 갱년기 증상의 완화에도 이용될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 뇌신경 보호용 약학적 조성물은 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 마클루라 푸베센스 추출물을 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg 으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
식품 조성물
본 발명의 뇌신경 보호용 식품 조성물은 상기 마클루라 푸베센스(Maclura pubescens) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.
상기 식품 조성물은 총 중량 중에 상기 유효성분을 0.0001 내지 20 중량%로 포함한다.
상기 식품은 특히 건강기능식품을 포함한다. 본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 다양한 식품 또는 음료 등에 기능성 성분을 첨가한 형태의 식품 조성물이 될 수 있다. 상기 식품은, 예를 들어, 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 필수 성분으로 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품이나 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 다양한 성분을 추가로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 그리고 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 그리고 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 전체 중량 중 0 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 좋다.
이하 구체적인 실험예 및 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실험예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[ 실험예 ]
마클루라 푸베센스 추출물의 제조
추출용매로 메탄올 99.9%를 사용하였으며, 초음파 추출기(BRANSON사)를 사용하였다.
그늘에서 잘 말린 마클루라 푸베센스 시료의 전체 부위 200g에 대해 메탄올 1.5L를 사용하여 50 ℃에서 3 일간 추출하였다. {(초음파 분쇄 15 분, 장소 2 시간)×10 회/ 일} × 3 일.
추출 후 탈지 된 면봉 깔때기를 통해 고형 물질을 걸러 냈다. 여과 후 오래방치하면 침전물이 생기므로 바로 여액을 45℃에서 완전히 감압 농축하였다 감압 농축된 시료를 바이알에 밀봉하여 저온실 (-4 ℃)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
또한, 상기와 같이 얻어진 추출물을 메탄올에 녹이고 원심분리 후 상층액을 모아 상온의 250 mm×21.2 mm, 7 μm particle size column에서 고성능액체크로마토그래피를 실시하여 21개 분획을 얻었다. 이 분획물들을 실험에 사용하였다.
실험방법
1. 유전자 리포터 평가시험: Neuroglobin ( Ngb ) 반응성 유전자 전사실험
Ngb-luciferase assay를 위해서 Ngb gene을 과발현시키고 promoter plasmid를 통해 형질주입시킨 human neuroblastoma(신경아세포종) 세포주(SKNSH)와 mouse neuroblastoma 세포주(N2a)를 이용했다. Seeding할 때에 세포를 10% FBS DMEM 배지에서 배양하며, 2.5 × 104 cells/well의 농도로 96-well plate에 seeding 했다. 세포가 약 45-50% confluency에 도달했을 때 2% FBS DMEM 배지로 갈아주었다. Ngb-luciferase assay의 경우 세포가 약 80% confluency에 도달했을 때 약처리를 진행하며 negative control군으로서 0.1% Dimethyl Sulfoxide(DMSO)와 다양한 농도의 마클루라 푸베센스(DMSO에 용해된 stock solution)를 배지에 희석시킨 후 배양세포에 처리했다. 24시간 배양 후 세포 배양을 종료하고 Passive Lysis Buffer(Promega, USA)를 이용하여 수용성 세포추출물을 얻었다. 여기에 존재하는 luciferase의 활성도는 Luciferase Assay System(Promega; luciferase의 기질 및 반응 완충액 포함)과 Luminometer(ELISA reader, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 정량적으로 측정했다. 시험물질이 나타내는 유전자 활성도는 negative control(0.1% DMSO)이 나타내는 활성도를 100%로 정하여 그 상대적인 활성정도를 나타내어 최종 비교 평가했다.
2. 세포내 표적 단백질의 발현양 변화를 통한 신경보호 효과 평가
Human neuroblastoma cell(SKNSH)을 이용하여 추출물에 의한 세포내 표적단백질(Ngb)의 발현양을 확인하였다. Seeding할 때에 세포를 10% FBS DMEM 배지에서 배양하며, 5 × 105 cells/dish 농도로 60mm dish에 seeding 했다. 다음날, 세포가 약 40-50% confluency에 도달했을 때 2% FBS DMEM 배지로 갈아주었다. 세포가 약 70-80% confluency에 도달했을 때 약처리를 진행하며 negative control군으로서 0.1% Dimethyl Sulfoxide(DMSO)을 처리하고 10-5 g/ml 농도의 마클루라 푸베센스(DMSO에 용해된 stock solution)를 배지에 희석시킨 후 배양세포에 처리했다. 24시간 배양 후 세포 배양을 종료하고 한 번 세척을 해준 뒤, 1X Lysis Buffer(Promega, USA)를 이용하여 단백질을 분리하였다. 세포 용해물(lysate)에 프로테아제 저해제(protease inhibitor) 및 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitor)를 넣은 lysis buffer를 가해 단백질을 분리하고 추출한 단백질을 BCA 법으로 정량하여 동량의 단백질양을 12% SDS-PAGE gel 에 80V에서 2시간 전기영동하였다. 전기영동 후 25V에서 3시간 PVDF membrane에 transfer한 다음 탈지우유(skim milk)를 녹인 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 RT에서 1시간 blocking 하고 primary 및 secondary antibody와 반응시켜 ECL 용액으로 확인하였다. 이때 primary antibody는 Ngb(RD181043050, BIOVENDER)를 1:1000 비율로 희석하여 사용했다. 실험상의 오류에 의한 단백질 양의 차이를 보정하기 위해 β-actin을 사용하였다.
3. 저산소유발(Oxygen glucose deprivation, OGD )에서의 세포 독성 및 생존도를 통해 신경보호작용 평가
Mouse brain endothelial(bEnd.3) 세포주와 primary cortical neuron cell을 산소를 고갈시킨 anerobic chamber(PlasLabs)에 넣어 각각 4시간, 3시간 OGD를 실시했다. Mouse brain endothelial(bEnd.3) 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC,USA)으로부터 구입했다. OGD 유발용액은 NaCl(120mM), KCl(2mM), CaCl2(2.0mM), NaHCO3(26mM), MgSO4(1.19mM), KH2PO4(1.18mM)를 포함하며 glucose와 혈장이 포함되지 않았고 pH는 7.4를 유지했다. OGD용액에 vehicle(0.1% DMSO), 마클루라 푸베센스 추출물과 21개 분획물을 처리하였다. 세포배양 plate의 well을 1회 세척하고 약물을 처리한 OGD용액을 세포에 처리하였으며 90% 질소, 5% 수소와 5% 이산화탄소의 혼합가스를 30분 이상 통과시켜서 bubbling 용액 내에 산소를 완전히 제거하였다. 일정 시간 후 30mM의 glucose와 혈장이 포함된 DMEM을 처리하고 incubator로 옮겨 24시간동안 reperfusion하여 경시적 변화를 WST assay kit(Dojindo)와 LDH assay kit(Biovision)를 통해 확인했다. 24시간의 reperfusion 후 plate의 well에서 media를 취하여 WST assay를 수행, 450nm의 흡광도 측정값을 통해 세포 생존도를 평가하거나 LDH assay를 수행, 490nm와 600nm의 흡광도 측정값을 통해 세포 독성도를 평가하였다. 시험물질이 나타내는 세포독성 및 생존도는 vehicle(0.1% DMSO)이 나타내는 세포 생존도 및 독성도를 100%로 정하여 그 상대적인 활성도를 나타내어 최종 비교 평가하였다.
4. 중뇌동맥폐색 수술(Middle cerebral artery occlusion, MCAO )을 통한 생체 허혈성 뇌졸중모델에서의 신경보호 효과 평가
뇌혈관 폐색과 재관류에 의한 뇌조직의 산화적 손상에서의 신경보호효과를 평가하기 위해 mouse MCAO 수술을 실시하여 뇌졸중 모델을 구축했다. 10주령 female CD1 mouse의 정중경부를 절개하여 외경동맥(external carotid artery, ECA)을 노출시킨 후, 나일론 봉합사를 외경동맥을 통해 내경동맥(internal carotid artery, ICA)으로 삽입하여 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA)을 폐색시켰다. 45분 후 나일론 봉합사를 제거하여 혈류를 회복시켜 ischemia/reperfusion damage를 유발하여 일과성 국소허혈 모델이 제작되었음을 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) 염색을 통하여 확인했다.
실험동물을 vehicle(0.9% Nacl solution, saline) 그룹과 마클루라 푸베센스 (250 mg/kg) 추출물 그룹으로 나누었다. MCAO 수술이 진행되기 전 두 그룹의 약물투여를 3주 간 24시간 간격으로 경구투여 하였으며 MCAO 수술을 실시, 하루 뒤 쥐의 뇌조직을 얻어 뇌경색크기를 측정했다. 시험물질이 나타내는 뇌경색크기의 변화는 vehicle(0.9% Nacl solution, saline) 그룹이 나타내는 뇌경색크기를 기준으로 하여 상대적인 뇌경색크기 변화를 측정하여 최종 비교 평가하였다.
5. 추출물 투여에 따른 동물모델에서의 행동학적 신경 보호에 미치는 효과 연구
약물을 경구투여하여 우울증 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화를 평가하였다. 10주령 female CD1 mouse를 vehicle(0.9% Nacl solution, saline), 추출물(250 mg/kg) 투여군으로 나누었다. 두 그룹의 약물투여는 24시간 간격으로 3주 동안 경구투여로 진행했으며 3주 투여 후, 개방장 시험, 십자형 높은 미로, 강제수영실험, rotarod의 행동실험을 실시하였다. 행동실험이 진행되는 동안 녹화를 하여 실험 후, 동영상을 분석 및 평가하였고 시험물질이 나타내는 행동학적 변화는 vehicle(0.9% Nacl solution, saline) 투여군이 나타내는 행동학적 수치를 기준으로 하여 상대적인 행동학적 변화를 분석, 최종 비교 평가하였다.
6. 추출물의 단회 투여 급성 독성 실험을 통한 안전성 효과 평가
식물 추출물의 임상 적용 가능성을 높이기 위해 단회 투여 급성 독성실험을 수행하였다. 10주령 female CD1 mouse를 이용하였고 투여 24시간 전부터 절식시켰다. vehicle(1% CMC in saline), 추출물 500mg/ kg, 1000mg/ kg, 1500mg/ kg, 2000mg/ kg 용량을 단회 경구투여하여 체중변화, 행동 관찰 및 사망률을 측정하였다. 총 2주간 실험하였으며 투여 volume은 5μl/g 이내로 하였다.
결과
1. 마클루라 푸베센스 추출물의 Ngb 반응 유전자를 통한 N2a와 SKNSH 세포내 전사 활성 분석
Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 SKNSH와 N2a 세포에서 마클루라 푸베센스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험하였고 결과는 도 1 및 2와 같다. SKNSH 세포와 N2a 세포에서의 전사활성을 보았을 때, 마클루라 푸베센스 추출물 10-6 ~ 10-5 g/㎖의 농도에서 vehicle에 비해 Ngb 유전자의 전사 활성이 약 1.5 ~ 2 배 증가함을 확인하였다(도 1, 2). 이를 통해 마클루라 푸베센스 추출물이 Ngb 유전자의 전사 활성을 유도하는 것을 알 수 있었다. 본 실험결과를 통하여 유전자의 전사 작용 시 마클루라 푸베센스 추출물이 10-8 g/㎖의 농도 이상에서 농도 의존적으로 Ngb 전사 활성을 유도함을 알 수 있었으며, 추출물이 두 가지 세포종에 대해서 Vehicle(Veh)보다 높은 Ngb 전사 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
2. 마클루라 푸베센스 추출물의 SKNSH 세포내 Ngb 단백질 발현양에 따른 신경보호효과
Vehicle, 마클루라 푸베센스 추출물을 처리한 SKNSH 세포에서 Ngb 단백질 발현변화를 확인하였다. 결과는 도 3과 같다. 마클루라 푸베센스 추출물을 처리하였을 때, vehicle에 비해 약 2배 증가함을 확인하였다(도 3). 이러한 실험 결과를 통해 마클루라 푸베센스 추출물의 Ngb 단백질 발현량 증가를 확인 할 수 있었으며, 마클루라 푸베센스 추출물이 Ngb 단백질 발현을 유도시키는 것으로 확인되었다.
3. 마클루라 푸베센스 추출물과 분획물의 저산소유발 세포에 대한 신경보호효과
bEnd.3 세포, primary cortical neuron 세포에 마클루라 푸베센스 추출물과 분획물을 glucose가 포함되지 않은 배지에 희석하여 처리해준 직후 각각 4시간, 3시간 동안 저산소배양해주고 24시간 동안 재관류 처리하여 시험관 저산소증 모델에서의 신경보호효과를 확인하였다. 결과는 도 4, 5 및 6과 같다.
시험관 저산소증 모델에서의 마클루라 푸베센스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과, bEnd.3 세포에서의 신경보호효과를 보았을 때, 마클루라 푸베센스 추출물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-8 ~ 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 농도의존적으로 약 1.3 ~ 2배 증가시킴을 확인하였다(도 4).
Primary cortical neuron 세포에서의 신경보호효과를 보았을 때, 마클루라 푸베센스 추출물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 약 2배 이상 증가시킴을 확인하였다(도 5). 또한, 마클루라 푸베센스의 21개 분획물들을 저산소배양-유도 신경세포에 처리하였을 때 19개의 분획물들이 신경세포 독성을 유의하게 감소시켰다(도 6). 또, 정상 산소배양 조건에서도 10개 분획물들이 신경세포 독성을 감소시키는 신경보호작용을 하는 것을 확인 할 수 있었다. 본 실험 결과를 통해 마클루라 푸베센스 추출물과 분획물이 저산소배양 조건에서의 세포 생존도 증가에 효과가 있음을 확인 할 수 있었고, 신경보호효과가 우수한 것으로 평가되었다(도 4, 5, 6).
4. 마클루라 푸베센스의 뇌경색크기 감소를 통한 뇌보호 효과
마클루라 푸베센스 추출물이 뇌 보호 작용을 나타내는지 확인하기 위해 female CD1 mouse에 3주간 경구투여 하였다. 중뇌동맥 45분 폐색, 24시간의 재관류 후에 뇌경색의 크기를 측정하여 뇌보호 효과를 확인하였다. vehicle 그룹과 비교하여 마클루라 푸베센스 추출물 그룹은 뇌경색의 크기를 약 30%정도 감소시켰다(도 7). 이러한 실험결과를 통해 마클루라 푸베센스 추출물의 장기적인 약물투여가 뇌졸중유발상태에서 뇌경색 크기 감소를 통한 뇌보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
5. 마클루라 푸베센스 추출물에 의한 행동학적 신경보호효과
마클루라 푸베센스 추출물을 경구투여 하였을 때, 우울증 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가하였다. 10주령 female CD1 mouse에 마클루라 푸베센스 추출물을 3주간 경구투여한 뒤, 행동실험을 진행하였고, 추출물 투여에 대한 행동개선 효과를 확인하였다. 결과는 도 8과 같다. 실험결과, 마클루라 푸베센스 추출물 투여군이 vehicle 투여군과 비교하여 십자형 높은 미로 실험에서 개방된 공간으로 드나든 시간이 유의하게 늘어남을 확인할 수 있었고, 개방장 시험에서는 마클루라 푸베센스 추출물 투여군에서 vehicle 투여군에 비해 구석진 공간으로 가는 횟수가 유의하게 줄어들었으므로 불안성 개선효과를 확인할 수 있었다. 또한 강제수영실험에서는 마클루라 푸베센스 추출물 투여군이 vehicle 투여군에 비해 강한 움직임상태의 횟수가 유의하게 늘어났으므로 우울증 개선효과를 확인할 수 있었고, rotarod 실험에서는 떨어질 때까지의 시간이 vehicle 투여군에 비해 증가하였으므로 운동성의 개선을 확인하였다(도 8). 이러한 실험결과를 통해 마클루라 푸베센스 추출물은 우울증, 불안 및 운동성에 대한 신경행동학적 증상의 개선에 효과가 있음을 확인하였다.
6. 마클루라 푸베센스 추출물에 대한 단회 투여 급성 독성 안전성 효과
마클루라 푸베센스 추출물의 생체내 독성을 평가하기 위하여 단회 투여 급성 독성 실험을 수행하였다. female CD1 mouse를 네 그룹으로 나누어 vehicle (1% CMC saline), 마클루라 푸베센스 추출물 500 mg/kg, 1000 mg/kg, 1500 mg/kg, 2000 mg/kg 용량으로 경구 투여하였고 2주간 사망률, 체중 변화 및 행동을 관찰하였다. 결과는 아래 표 1과 같다. 투여 직후 동물의 움직임이 감소하였으나 24시간 이후 정상적인 행동을 보였으며 사료와 물 섭취도 정상적으로 관찰되었다. 총 2주간의 실험 기간 동안 사망률은 vehicle 군을 포함하여 모든 군에서 0%였으며 각 군 간의 체중 변화도 비슷한 수준으로 나타났다. 최대용량 2000 mg/kg 경구 투여 용량에도 급성독성이 나타나지 않았으므로 안전성이 높다고 평가된다.
[표 1] 마클루라 푸베센스 추출물에 의한 급성 독성 평가
Figure 112018059613546-pat00001

Claims (6)

  1. 마클루라 푸베센스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
    뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안 또는 신경과민의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 마클루라 푸베센스 추출물은 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것인 약학적 조성물.
  3. 마클루라 푸베센스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
    뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안 또는 신경과민의 개선 또는 예방; 뇌손상 보호; 뇌기능 개선; 뇌신경세포 보호 중 하나 이상을 위한 뇌신경 보호용 식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 마클루라 푸베센스 추출물은 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것인 식품 조성물.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 갖는 건강기능식품인 식품 조성물.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 식품은 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 갖는 식품 조성물.
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