KR20140065184A

KR20140065184A - 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20140065184A
Application number: KR1020120132416A
Authority: KR
Inventors: 이동석; 이경선; 이형선; 류덕선; 김선희; 권지혜; 석동희
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-11-21
Filing date: 2012-11-21
Publication date: 2014-05-29

Abstract

본 발명은 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물은 세포독성이 없고, 항 세포사멸 인자인 bcl-2, caspase-3, caspase-8 및 caspase-9를 억제하며 세포사멸을 유도한다고 알려져 있는 시토크롬C의 발현을 촉진 또는 증가시켜 간암세포의 세포사멸을 유도하는 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 간암의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 간암을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating liver cancer comprising ethyl acetate fraction from Orostachys japonicus}

본 발명은 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

간세포 암(HCC, hepatocellular carcinoma)은 모든 간암 케이스의 약 83%를 차지하는 고전이성 암이고, 전세계적으로 암 사망의 3번째로 꼽히는 원인이다(Parkin et al., 2002, A Cancer Journal for Clinicians 55, 74-108). HCC는 종종 혈관에 대한 조기 침입뿐만 아니라, 간내(intrahepatic) 전이 및 이후의 간외(extrahepatic) 전이를 보인다(Ozaki et al., 2000, Cancer Research 60, 6519-6525). 암 전이, 즉 원발성 종양으로부터 멀리 떨어진 부위로의 전파 및 상기 부위에서의 후속적인 생장은 다양한 암에서 사망을 포함하는 나쁜 임상 예후의 주된 원인이다(Weiss 1990, Advances in Cancer Research 54, 159-211). 재발 및 전이는 HCC에서의 치료 실패 및 높은 사망률의 주된 원인이다(Mazzanti et al., 2008, Molecular Aspects of Medicine 29, 130-143). 암 세포의 전이는, 세포와 세포외 매트릭스(ECM) 간의 변경된 유착 및 결함 있는 세포-세포 상호작용을 포함하는 다양한 세포생리학적 변화를 수반하는 다단계적 과정이고, 전이는 매트릭스 메탈로프로테이나아제(MMP)의 과발현을 수반한다. 상기 효소들의 활성화는 종양 세포에 의한 ECM의 분해를 가능케 하여, 맥관 구조에 대한 상기 종양 세포의 접근, 표적 장기에 대한 이동 및 침입, 그리고 종양 전이의 발생을 야기한다 (Itoh and Nagase 2002, Essays in Biochemistry 38: 21-36). MMP 와 마찬가지로, 미토겐-활성화 단백질 키나아제 (MAPK) 수퍼패밀리의 구성원은 증가된 분산성/운동성, 침입, 증식, 생존 및 형태형성과 연관되어 있다 (Trusolino and Comoglio 2002, Nature Reviews Cancer 2, 289-300). 주요 포유류 MAPK에는 ERK1/2 (extracellular signal-regulated kinases 1 및 2), JNK/SAPK (c-Jun N-terminal kinase/stressactivated protein kinase), 및 p38 MAPK가 포함되며, 상기 MAPK들은 MMP 발현, 그리고 이동 및 침입의 조절에서 중심적인 역할을 한다 (Kwon et al., 2009, The Journal of Nutritional Biochemistry 20, 663-676).

또한, 최근에는 기존의 화학적 치료제의 부작용이 대두되어 민간에서 사용되는 천연물에서 항암 효과가 있는 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

이에 따라, 본 발명자들은 상기와 같은 화학적 치료제의 부작용에 대한 우려가 없으면서도 간암 세포를 효과적으로 억제할 수 있는 활성을 가진 식물소재를 도출하기 위해 다양한 식물을 대상으로 하여 연구를 수행하였다.

한국등록특허 제10-0614222호 한국공개특허 제10-2011-0019262호

이에 본 발명자들은 와송 추출물, 보다 구체적으로 와송의 에틸아세테이트 분획물이 간암의 예방 및 치료에 우수한 활성을 갖는다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 와송(Orostachys japonicas)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 개선 및 예방용 건강기능성 식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 와송(Orostachys japonicas)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 에틸아세테이트 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 에틸아세테이트를 첨가하여 수득한 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 와송의 에틸아세테이트 분획물은 상기 조성물에 10~200ug/ml의 양으로 포함되어 있을 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸의 주요 경로중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 세포사멸 최종 실행인자인 활성화형 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9을 증가시키는 기작을 통하여 간암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 HepG2 세포에서 시토크롬C의 발현을 촉진 또는 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 분획물은 JNK 또는 ERK1/2의 인산화를 촉진 또는 증가시키는 활성이 있을 수 있다.

나아가 본 발명은 와송(Orostachys japonicas)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 간암의 개선 및 예방용 건강기능성 식품을 제공한다.

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물은 세포독성이 없고, 항 세포사멸 인자인 bcl-2, caspase-3, caspase-8 및 caspase-9를 억제하며 세포사멸을 유도한다고 알려져 있는 시토크롬C의 발현을 촉진 또는 증가시켜 간암세포의 세포사멸을 유도하는 활성을 가지고 있어, 본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 간암의 치료 및 예방에 유용한 치료제 및 간암을 개선할 수 있는 기능성 식품의 제조에 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도처리에 따른 세포증식 억제효과를 MTS assay를 이용하여 나타낸 그래프이다.
도 2A는 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물 농도처리에 따른 세포사멸 유발 정도를 확인하기 위하여 DAPI 염색한 결과이다.
도 2B는 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물 농도처리에 따른 세포사멸 유발된 세포들의 정량적 비교를 위하여 유세포분석을 한 결과이다.
도 2C는 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물 농도처리에 따른 DNA 단편을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 세포사멸 관련 단백질에 미치는 영향을 분석하기 위하여 와송 에틸아세테이트 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리하여 bcl-2, Bax, 시토크롬C, caspase-3, caspase-8, caspase-9 및 GAPDH의 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리하여 p-JNK, p-ERK1/2 및 p-p38의 발현 정도를 웨스턴블롯 기법으로 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물이 세포사멸에 미치는 영향을 분석하기 위하여 HepG2 세포에 25 μM의 JNK 억제제인 SP600125를 30분간 전처리하고, 와송 에탄올 분획물 100 μl/ml를 1시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물이 세포사멸에 미치는 영향을 분석하기 위하여 HepG2 세포에 20 μM의 JNK 억제제인 Z-VAD-FMK를 30분간 전처리하고, 와송 에탄올 분획물 100 μl/ml를 48시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과이다.

본 발명은 와송(Orostachys japonicas)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 및 치료용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

와송(Orostachys japonicas)은 돌나물과의 다년생 초본 식물로서, 오랫동안 간염, 폐렴, 지혈, 습진, 화상, 부종의 치료를 위한 치료제로 사용해 왔으며, 약리 작용으로는 혈관 수축작용, 호흡 흥분 작용, 장관의 긴장도 증강 작용, 혈압강화, 이뇨 작용 및 해열 작용이 있다고 알려져 있다.

한편 본 발명자들은 이러한 와송을 이용한 간암 치료제를 개발하기 위해 연구하던 중, 와송의 에틸아세테이트 분획물이 항 세포사멸 인자인 bcl-2, caspase-3, caspase-8 및 caspase-9를 억제하며 세포사멸을 유도한다고 알려져 있는 시토크롬C의 발현을 촉진 또는 증가시켜 간암세포의 세포사멸을 유도하는 활성을 가지고 있다는 사실을 확인함으로써, 와송의 에틸아세테이트 분획물을 간암의 예방 및 치료용 조성물로 사용할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

이러한 사실을 입증하기 위해 본 발명자들은 본 발명의 일실시예를 통해 다음과 같은 실험을 수행하였는데, 즉, 와송의 에틸아세테이트 분획물 처리에 의한 핵의 형태적 변화를 관찰하기 위하여 HepG2 세포에 본 발명의 와송 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리하여 DAPI 염색을 한 결과, 와송 에틸아세테이트 분획물의 처리 농도가 증가할수록 세포사멸이 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축의 정도가 매우 증가됨을 알 수 있었다(도 2 A 참조).

또한, 다른 일실시예에 의하면, 와송 에틸아세테이트 분획물의 처리에 의하여 세포사멸이 유발되는지를 알아보기 위하여 유세포 분석 및 DNA 단편 분석을 한 결과, 와송 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로 세포사멸이 일어남을 알 수 있었다(도 2B 및 도 2C 참조).

또한, 다른 일실시예에 의하면, 미토콘드리아 경로를 포함한 세포사멸 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 조절인자로 알려진 bcl-2 family에 속하는 유전자들이 와송 에틸아세테이트 분획물 처리에 의하여 어떠한 변화가 나타나는지를 알아보기 위하여 와송 에틸아세테이트 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리한 후 웨스턴 블롯팅을 한 결과 항 세포사멸 인자인 bcl-2, caspase-3, caspase-8 및 caspase-9는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 감소하였고, 세포사멸을 유도한다고 알려져 있는 시토크롬C는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 3 참조).

뿐만 아니라 본 발명자들은 HepG2 세포에 본 발명의 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리한 경우 MAP kinase의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 p-JNK, p-ERK1/2 및 p-p38을 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과 p-p38은 검출되지 않았고 p-JNK 및 p-ERK1/2는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 4 참조).

나아가 HepG2 세포에 JNK 억제제인 SP600125와 Z-VAD-FMK를 전처리하고 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리하여 웨스턴 브롯팅을 수행한 결과, 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리하였을 때 p-JNK가 검출되었고(도 5 참조), 항 세포사멸 인자인 caspase-3, caspase-8 및 caspase-9가 감소됨을 확인할 수 있었다(도 6 참조).

이러한 결과를 바탕으로 본 발명자들은 본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물이 간암세포의 세포사멸을 억제하여 간암 세포에 대한 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 와송(Orostachys japonicus)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 와송(Orostachys japonicus)의 에틸아세테이트 분획물은 용매로서 에틸아세테이트를 사용하여 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있는데, 본 발명에 따른 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 당업계에 공지된 방법, 예를 들면, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법 중 어느 하나를 선택하여 사용할 수 있다.

또한, 목적하는 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 수행할 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.

바람직하게 본 발명의 간암에 대한 항암 활성을 가지는 와송 추출물은 유기용매로서 에틸아세테이트를 사용하는 추출방법을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 와송의 에틸아세테이트 분획물은 용매추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 공정을 수행할 수 있고, 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제하는 과정을 수행할 수 있다.

따라서 본 발명에 있어서 와송의 에틸아세테이트 분획물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획물 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물을 제조하는 방법을 구체적으로 살펴보면 다음과 같다.

본 발명의 와송 유래 에틸아세테이트 분획물은 (a) 건조된 와송(Orostachys japonicus) 분말을 에탄올을 이용하여 추출하는 단계; (b) 에탄올 추출물을 헥산과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 헥산 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계; (c) 상기 (b) 단계를 통해 수득한 물 분획물에 디클로로메탄과 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 디클로로메탄 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계; 및 (d) 상기 (c)단계를 통해 수득한 물 분획물에 에틸아세테이트와 물이 혼합된 혼합용매를 가하여 에틸아세테이트 분획물과 물 분획물로 분획하는 단계를 통하여 제조될 수 있다.

이러한 각종 유기용매를 이용하여 추출물을 분획화하는 과정은 추출물(또는 분획물)이 가지고 있는 약리효과를 최대로 나타내는 분획물(fraction)을 찾아내게 하는 바, 필요 없는 물질을 분획화 과정을 통해 제거하여, 특정 효과를 나타내는 활성물질만이 최대로 농축된 추출물 상태를 만들 수 있게 한다. 이러한 분획화 과정을 통해 천연식물의 추출물은 약학적 조성물 및 건강기능식품의 소재로서의 활용도를 높일 수 있게 된다.

따라서 본 발명은 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 간암에 대한 항암 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 본 발명의 조성물은 간암의 예방 및 치료를 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 와송의 에틸아세테이트 분획물을 10~200ug/ml로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 간암의 예방 및 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 와송의 에틸아세테이트 분획물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 간암을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.

본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물의 약학적으로 유효한 양은 0.5~100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5~5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 간암 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.

또한, 상기에서 약학적으로 허용되는 이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 간암의 예방 및 치료용 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 본 발명의 간암의 예방 및 치료용 조성물은 간암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.

따라서 본 발명은 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 간암의 예방 및 치료용 약제를 제공할 수 있다.

뿐만 아니라 본 발명에 따른 간암에 대한 항암 활성을 가지는 와송의 에틸아세테이트 분획물은 세포에 대해 독성을 유발시키지 않는 특징이 있고(도 1 참조), 또한 천연물인 와송을 사용함을 특징으로 하고 있어, 체내의 독성 및 부작용 염려 없이 안심하고 사용할 수 있다.

따라서 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 포함하는 상기 조성물은 간암의 예방 및 개선을 목적으로 하는 식품에 첨가할 수 있으므로, 상기 본 발명의 조성물은 간암 증상의 예방 및 개선을 위한 식품용 조성물로도 사용할 수 있다.

그러므로 본 발명의 조성물은 간암 증상의 예방 및 개선에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 기능성 식품 또는 음료로 용이하게 활용할 수 있다.

본원에서 상기 식품이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미로서, 식품, 식품 첨가제, 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 것을 말한다.

본원발명에 따른 항암 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본원발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영,유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 빵류, 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 캔디류, 쵸코렛류, 껌류, 아이스크림류, 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임식품(각종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실 음료, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.

또한, 상기 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체내조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미하며, 구체적으로는 건강 기능성 식품일 수 있다. 상기 기능성 식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본원발명에서 상기 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하며 기능성 음료를 포함한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 본 발명에 따른 상기 간암의 예방 또는 개선용 조성물을 포함하는 것 외에 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

나아가 상기 기술한 것 이외에 본원발명의 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있으며, 상기 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본원발명의 간암의 개선 및 예방용 조성물을 함유하는 식품에 있어서, 상기 본 발명에 따른 조성물의 양은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 90중량%로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 0.1중량% 내지 40중량%로 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100ml를 기준으로 0.001g 내지 2g, 바람직하게는 0.01g 내지 0.1g의 비율로 포함할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있으므로 상기 범위에 한정되는 것은 아니다.

그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 와송의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품을 제공할 수 있으며, 상기 식품의 형태는 이에 제한되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태일 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

<1-1> 시약

DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 소태아혈청 및 항생제는 Hyclone (Logan, UT)에서 구입하였고, bcl-2, bax, 시토크롬 c, 카파아제-3, 카파아제-8, 카파아제-9, 포스포-ERK1/2, ERK1/2, 포시포-p38, p38, 포스포-JNK, JNK 및 GAPDH에 대한 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였으며, 페르옥시다아제 결합 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하였다.

<1-2> 세포배양

사람 간암세포인 HepG2 (HB-8065)는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하여 10% FBS와 100 IU/mL 페니실린이 보충된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지에서 배양하였다. 상기 세포는 37℃, 95% CO₂/air 환경 하에서 배양하였다.

통계

모든 실험결과는 평균± 표준편차로 표기하였고, 그 결과들의 통계 분석하기 위하여 one-way ANOVA(SystatInc.,Evaston,IL,USA)를 수행하였다. p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

< 실시예 2>

와송의 용매 분획물 제조

밀양 거북이 와송을 식품용 및 의약용으로 사용하기 위하여 추출 용매는 약전 에탄올을 사용하였다. 자연 건조시킨 와송을 40메쉬(40mesh)이하로 잘게 분쇄하고 분말화 시킨 후, 95% 에탄올에 3시간 동안 침지하는 과정을 3회 반복하여 추출하였다. 그 여액을 증류 농축장치(rotary evaporator)를 이용해 40℃에서 농축하여 에탄올 추출물을 제조하였고, 이후 상기 농축 에탄올 추출물을 계통분획법에 따라 용매분획을 실시하였다.

먼저 상기 추출된 와송 에탄올 추출물에 물과 헥산이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 헥산 분획과 물 분획으로 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 디클로로메탄과 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 디클로로메탄 분획과 물 분획으로 다시 분리하였으며, 이렇게 얻어진 물 분획에 에틸아세테이트와 물이 1:1의 비율로 혼합된 혼합용매를 처리하여 에틸아세테이트 분획과 물 분획으로 분리하였다. 이후 분획이 완료된 각 와송의 용매 추출 분획물들은 rotary evaporator를 이용하여 건조시킨 후 하기 실험에 사용하였다.

< 실시예 3>

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 MTS 법에 의한 세포독성 검사

상기 실시예 2에서 수득한 용매 분획물들 중 와송의 에틸아세테이트 분획물을 대상으로 처리농도에 따른 사람 간암세포인 HepG2 세포에 대한 증식 억제 효과를 MTS[3-(4,5-dimethlylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxy-methoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt]분석을 이용하여 조사하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 각 웰당 2.5 × 10 cells/well를 100μL의 양으로 12시간 배양한 후, 와송의 에틸아세테이트 분획물을 각각 다른 농도(0, 25, 50, 75, 100, 200ug/ml)로 세포에 처리한 다음, 20㎕ Cell Titer 96 에이퀴어스 원 솔루션(Aqueous One Solution)용액을 처리하고 490㎚파장을 이용해 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 와송의 에틸아세테이트 분획물을 HepG2 세포에 농도별로 처리한 결과, 모든 농도에서 24시간 48시간 배양하였을 때 모두 높은 생존율을 보이는 것으로 나타남에 따라 세포독성이 거의 없는 것을 알 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 4>

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 DAPI 염색에 의한 세포핵의 형태 관찰

와송 에틸아세테이트 분획물 처리에 의한 세포사멸 유발 확인을 위한 핵의 형태적 변화 관찰을 위하여 본 발명의 발명자들은 준비된 HepG2 세포들을 모은 다음 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde) 용액과 PBS를 1:9의 비율로 섞은 fixing solution으로 세포를 상온에서 10분 동안 고정하고 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Sigma)용액을 이용하여 암조건, 상온에서 15분간 염색시킨 후, PBS 및 증류수로 DAPI 용액을 세척한 다음 무수알코올을 이용하여 탈수과정을 거친 슬라이드글라스 위에 마운팅 솔루션(mounting solution)을 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 사람 간암 HepG2 세포의 핵 형태 변화를 관찰하였다.

그 결과, HepG2 세포에서 와송 에틸아세테이트 분획물의 처리 농도가 증가할수록 세포사멸이 일어난 세포에서 전형적으로 관찰되는 염색질 응축의 정도가 매우 증가됨을 알 수 있었다(도 2 A 참조).

< 실시예 5>

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 유세포분석에 의한 세포빈도 측정

본 발명의 와송 에틸아세테이트 분획물의 처리에 의하여 세포사멸이 유발된 세포들의 정량적 비교를 위하여 준비된 사람 간암 HepG2 세포들을 트립신과 재부유한 100μl의 바인딩 버퍼, 10μl Annexin V-FITC 및 5μl 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)를 이용하여 고정 및 염색을 하고 실온인 암실에서 30분 동안 반응을 시킨 다음 유세포기 분석을 하였다.

그 결과, 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리하지 않았을 때 세포 사멸 정도는 0.56% 였고, 와송 에틸아세테이트 분획물을 50 ug/ml 처리하였을 때 세포사멸 정도가 25.54%, 와송 에틸아세테이트 분획물을 100 ug/ml 처리하였을 때 세포사멸 정도가 45.17%로 나타나 와송 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로 세포사멸이 일어남을 알 수 있었다(도 2B 참조).

< 실시예 6>

DNA 단편 분석

특정 세포에 세포사멸이 유발되었을 때 관찰될 수 있는 DNA 단편의 분석을 위하여 와송 에틸아세테이트 분획물이 처리된 배지에서 48시간 동안 배양된 세포를 모아 라이시스 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)를 4℃에서 10분간 처리한 다음, 그 상층액에 proteinase K(Sigma)를 0.5mg/ml의 농도로 처리한 다음 65℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 페놀: 클로로폼: 이소아밀알코올 혼합 용액(25:24:1, Sigma)을 첨가하고 원심 분리하여 얻어진 상층 액에 적정량의 에탄올과 3M 아세트산 나트륨을 첨가한 다음 -20℃에서 밤새 반응시켰다. 분리된 DNA 펠렛에 RNase A가 적당량 들어있는 TE 버퍼를 첨가하여 녹이고 젤로딩다이(gel laoding dye)를 혼합한 후 2% 아가로스 젤을 이용하여 1시간 동안 50V로 전기영동하여 에티디움 브로마이드(EtBr, Sigma)로 염색하고 UV하에서 관찰하였다.

그 결과, HepG2 세포에 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리한 군에서는 세포사멸이 일어난 세포들에서 볼 수 있는 전형적인 DNA laddering 현상을 관찰할 수 있었으며, 이는 와송 에틸아세테이트 분획물 농도 의존적으로 증가하였음을 관찰할 수 있었다(도 2C 참조).

< 실시예 7>

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 세포사멸 관련 단백질에 미치는 영향 분석

미토콘드리아 경로를 포함한 세포사멸 유발 조절에 있어서 가장 대표적인 조절인자로 알려진 bcl-2 family에 속하는 유전자들이 와송 에틸아세테이트 분획물 처리에 의하여 어떠한 변화가 나타나는지를 조사하기 위하여, 준비된 사람 간암 HepG2 세포를 모은 다음 적당량의 라이시스 버퍼(10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.5% Triton X-100)를 4℃에서 10분간 반응시킨 후 상층액을 분리하고 단백질 농도를 Bio-Rad 단백질 정량 시약을 이용하여 정량하였다. 동량의 Laemmli sample 버퍼(Bio-Rad)를 섞어서 샘플을 만들어 SDS-폴리아크릴아마이드 젤을 PVDF멤브레인으로 일렉트로블로팅에 의해 전이시킨 후, 12차 항체를 처리하고 PBS로 세척하여 ECL 용액을 적용시킨 다음 암하에서 X-ray 필름에 감광시켜 특정단백질의 양을 분석하였다.

와송 에틸아세테이트 분획물을 시간과 양을 달리하여 처리한 결과, Bax와 GAPDH는 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리하지 않았을 때와 차이가 없었으나, 항 세포사멸 인자인 bcl-2, caspase-3, caspase-8 및 caspase-9는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 감소하였고, 세포사멸을 유도한다고 알려져 있는 시토크롬C는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 3 참조).

< 실시예 8>

MAPK는 세포의 증식, 분화 그리고 세포의 생존과 세포사멸을 포함하는 다양한 생물학적 기능을 조절한다고 알려져 있다. 사람 간암 HepG2 세포에 본 발명의 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리한 경우 MAP kinase의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 p-JNK, p-ERK1/2 및 p-p38을 이용하여 웨스턴블롯팅을 수행하였다.

그 결과, p-p38은 검출되지 않았고 p-JNK 및 p-ERK1/2는 와송 에틸아세테이트 분획물의 농도시간의존적으로 증가함을 알 수 있었다(도 4 참조).

< 실시예 9>

본 발명에 따른 와송 에틸아세테이트 분획물의 세포사멸에 미치는 영향 분석

본 발명의 와송 에틸아세테이트 분획물이 세포사멸에 미치는 영향을 분석하기 위하여 사람 간암 HepG2 세포에 25 μM의 JNK 억제제인 SP600125를 30분간 전처리하고, 와송 에틸아세테이트 분획물 100 μl/ml를 1시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과, 와송 에틸아세테이트 분획물을 처리하였을 때 p-JNK가 검출됨을 알 수 있었다(도 5 참조).

또한, HepG2 세포에 또 다른 JNK 억제제인 Z-VAD-FMK를 20 μM를 30분간 전처리하고, 와송 에틸아세테이트 분획물 100 μl/ml를 48시간동안 처리하여 웨스턴블롯팅을 수행한 결과, 항 세포사멸 인자인 caspase-3, caspase-8 및 caspase-9가 와송 에틸아세테이트 분획물 처리하였을 때 감소함을 알 수 있었다(도 6 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

와송(Orostachys japonicas)의 에틸아세테이트 분획물을 유효성분으로 함유하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 에틸아세테이트 분획물은 와송 분말에 에탄올을 첨가하여 수득한 에탄올 추출물에 에틸아세테이트를 다시 첨가하여 수득한 추출물인 것을 특징으로 하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
와송의 에틸아세테이트 분획물은 상기 조성물에 10~200ug/ml의 양으로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 분획물은 bcl-2 패밀리 단백질의 발현 감소를 통해 세포사멸 경로 중 하나인 미토콘드리아 경로를 제어하며, 카스파제-3, 카스파제-8, 카스파제-9의 활성 촉진을 통해 간암세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 분획물은 HepG2 세포에서 시토크롬C의 발현을 촉진 또는 증가시키는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 분획물은 JNK 또는 ERK1/2의 인산화를 촉진 또는 증가시키는 활성이 있는 것을 특징으로 하는 간암의 예방 및 치료용 조성물.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 간암의 개선 및 예방용 건강기능성 식품.