WO2018062819A1 - 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease, and more particularly, to a pharmaceutical composition and a method for preparing the same, which can prevent or treat liver disease using a fermentation product of Wasong.
  • the liver is an organ that plays an important role in defending the body from toxic substances from the outside and in metabolizing ex vivo substances, that is, converts various nutrients ingested into the form necessary for living bodies, and is required for life support such as albumin.
  • Various substances are synthesized and biotransformation is performed in a state where biological foreign matters (xenobiotics) are easily excreted in vitro. Since ex vivo substances, once in vivo, pass through the liver, the liver is at higher risk of exposure to many toxic substances besides nutrients and is more likely to be damaged than other organs. It is an organ that has excellent liver regeneration ability, and is fully recovered from slight damage.
  • hepatic fibrosis can lead to lethal cirrhosis, which can develop into liver cancer.
  • hepatic disease is not a pain or subjective symptoms in the early stages, it is found only in the late stages can not be treated in a timely manner, accordingly, is a disease with high mortality. As such, despite the seriousness of liver disease, there is no effective liver disease treatment yet.
  • liver disease caused by hepatitis virus antiviral drugs are used, but the side effects are serious. Recently, in the case of liver disease caused by toxic substances that are increasing due to alcohol and environmental pollution, effective treatment is still rare. Accordingly, there is an urgent need for the development of drugs that can treat and prevent liver damage while maintaining the structure and function of liver tissue.
  • Orostachys japonicus is a perennial herbaceous plant with a dicotyledonous rosewood snails, also known as a rock brush, and has been recorded for its anticancer effect, antipyretic, geothermal, eczema, and burns.
  • breast cancer, pancreatic cancer, bone marrow cancer, esophageal cancer, uterine cancer, lymph gland cancer, gastric cancer, colon cancer, high blood pressure, hypotension, blood circulation, diabetes, stroke, arthritis, hand paw, constipation, vomiting, and various adult diseases are known to be effective.
  • Ingredients present in the vortex include triterpenoids and ⁇ -cysterols such as Friedelin, Epifriedlanol, Glutinone and Glutinol.
  • sterols such as -sterol) and campesterol, fatty acid esters, flavonoids such as camperol and quercetin, and 4-hydroxy Aromatic acids such as benzoic acid (4-hydroxybenzoic acid), 3,4-dehydroxybenzoic acid (3,4-dehydroxybenzoic acid), and gallic acid (gallic acid), and the like, and recently, Research on the treatment of diseases is actively progressing.
  • Wosong contains more than 90-95% of water, and it is necessary to take it in excess in order to expect the known effects.However, in case of patients whose digestive function is so poor that it is difficult to pass even a proper amount of meal, it is actually impossible. Therefore, it will be necessary to study how to increase the effective ingredient of wasong and increase the convenience of taking.
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition that can effectively prevent or treat liver disease using the fermentation of Whasong.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing a composition for preventing or treating liver disease, which increases the effective ingredient of vortex in a simple and easy process, and increases the convenience of taking.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating liver disease, which comprises a fermentation product of Orostachys japonicus as an active ingredient.
  • the method for producing the fermented product of Waksong is as follows.
  • the vortex may be prepared and dried at a temperature of 30 to 50 ° C. for 24 to 72 hours, and then pulverized as necessary.
  • a solvent may be added to the dry ground product of the vortex to obtain a vortex suspension.
  • the kind of the solvent is not particularly limited, but it is preferable to use distilled water to carry out the fermentation process later.
  • the addition amount of the solvent is not particularly limited, but a solvent may be added so that the dry pulverized crushed powder in the suspension may be included in 5-20w / v%, 5-15w / v% or 5-10w / v%. .
  • the turmeric suspension may be fermented using a culture medium of an enzyme or fermentation strain, but preferably, fermentation using a fermentation strain culture medium may maximize the antioxidant or anti-inflammatory effect by increasing the active ingredient of the turmeric. More preferably, the fermentation may be carried out using an enzyme first, followed by fermentation using a fermentation strain culture medium.
  • the enzyme used in fermentation of the Warsong may be one or more selected from the group consisting of cellulase, hemicellulase and amyloglucosidase, and preferably cellulase,
  • An enzyme in which hemicellulase and amyloglucosidase is mixed in a weight ratio of 0.5 to 1.5: 0.5 to 1.5: 0.5 to 1.5 can be used.
  • the cellulase is 1,4- (1,3: 1,4) - ⁇ -D-glucan 4-glucano-hydrolase (1,4- (1,3: 1,4) - ⁇ -D-Glucan 4-glucano-hydrolase), preferably Novozyme's Cellulclast, but is not limited thereto.
  • HTec2 manufactured by Novozyme, but is not limited thereto.
  • the primary fermentation product may be obtained by adding the enzyme to the suspension of the turmeric and fermenting for 12 to 48 hours, 12 to 36 hours, or 24 to 36 hours.
  • the addition amount of the enzyme is not particularly limited, but may be added in an amount of 5-20% by volume, 5-15% by volume, or 5-10% by volume, based on the total volume of the turmeric suspension.
  • the secondary fermentation product may be obtained by fermenting the secondary fermentation broth using a culture solution of the fermentation strain.
  • Lactobacillus hilgardii Leukonostoc mesenteroides ( Leuconostoc) mesenteroides ), Pediococcus acidilactici) and a saccharide as MY process but to use one or more strains selected from the group consisting of three Levy jiae (Saccharomyces cerevisiae), preferably acids Pocono stock mesen teroyi des (Leuconostoc mesenteroides) and Phedi O CD rakti in Lactococcus time ( Pediococcus acidilactici ) one or more strains can be used, and more preferably, Pediococcus acidilactici ( pediococcus acidilactici ) can be used to increase the active ingredient of the pine fruit can increase the therapeutic effect of liver disease.
  • Levy jiae Sacharomyces cerevisiae
  • Phedi O CD rakti in Lac
  • the culture solution of the fermentation strain in the present invention may further include a juice medium or vegetable juice medium to improve the activity of the fermentation strain.
  • the type of juice medium is not particularly limited, but may be obtained from, for example, fruits such as citrus fruits, grapes, apples, mangoes, oranges, pineapples, bokbunja, strawberries, peaches, blueberries or pomegranates, but is not limited thereto. Instead, it may be a puree of fruit.
  • the kind of the vegetable juice is not particularly limited, but for example, juices such as carrots, tomatoes, cabbage, etc. may be mentioned, but are not limited thereto, and may be puree of vegetables.
  • the juices and medicinal juices can be obtained by grinding and grinding fruits or vegetables with a mixer or the like, and further juice them as necessary.
  • Such juice and vegetable juice may be suitably concentrated, and the concentrate may be used as it is, or diluted with distilled water or the like to an appropriate concentration.
  • the fruit juice and vegetable juice mentioned above may be used individually, or may be used in combination according to the objective.
  • puree of fruit or vegetable can be obtained by performing an enzymatic process under ultra-high pressure (for example, 100 MPa), and contains abundant plant fiber.
  • the enzyme used for this enzyme treatment can be suitably selected according to the kind of fruit or vegetable.
  • the culture medium in the present invention may include a fermentation strain in the amount of 10 6 ⁇ 10 9 cells / ml, 10 6 ⁇ 10 8 cells / ml or 10 6 ⁇ 10 7 cells / ml.
  • the fermentation strain may be obtained by adding a culture solution of the fermentation strain to the suspension of the Warsong and incubated for 3 to 10 days at 30 to 40 ° C.
  • the addition amount of the culture solution is not particularly limited, but may be preferably added in an amount of 0.05 to 0.5% by weight, 0.05 to 2% by weight, or 0.05 to 0.1% by weight based on the total weight of the suspension.
  • the secondary fermentation product may be freeze-dried as necessary.
  • the conditions for performing the freeze drying are not particularly limited, but for example, may be performed at -60 to 30 °C for 6 to 50 hours, preferably 1 to 3 hours at -40 to -20 °C,- It may be performed for 1 to 3 hours at 20 to 10 ° C, 3 to 5 hours at -5 to 0 ° C, 1 to 3 hours at 10 to 20 ° C, and 1 to 3 hours at 20 to 30 ° C.
  • the formulation of the fermentation of the Wasong is not particularly limited, and may be, for example, a liquid fermentation or a solid fermentation of the Wasong.
  • Formulation of the fermentation product of the vortex may be selected in various ways depending on the preference of the patient to be administered or the purpose of use of the composition.
  • the fermentation product of Wahsong obtained as described above effectively inhibits the production of iNOS, COX-2 and TNF-a and its gene expression by inhibiting the transcriptional action of NF- ⁇ B and AP-1 in the nucleus of liver cells. This can prevent or treat liver damage due to antioxidant and anti-inflammatory responses.
  • Liver diseases to be prevented or treated in the present invention may be selected from the group consisting of autoimmune liver disease, drug-induced liver disease, alcoholic liver disease, infectious liver disease and congenital metabolic liver disease, preferably infectious liver May be a disease.
  • lipopolysaccharide (Lipopolysaccharide, LPS) stimulates the production of pro-inflammatory substances, acute liver damage occurs, resulting in fatty liver, weight ratio of liver tissue to weight increases.
  • LPS lipopolysaccharide
  • compositions of the present invention can most preferably be used for the prevention or treatment of acute liver injury mediated by lipopolysaccharide or fatty liver resulting therefrom.
  • the content of the fermentation product of the wasong in the pharmaceutical composition is not particularly limited, but may preferably be included in an amount of 0.1 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • prophylaxis may be used without limitation as long as the action of blocking the liver disease or inhibiting or delaying the liver disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment may include without limitation any action that improves or benefits liver disease using the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise a suitable carrier, excipient or diluent according to conventional methods.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate , Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, methylhydroxy benzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like, may be used, but is not limited thereto.
  • compositions according to the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral preparations, suppositories, or sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • when formulated, it may be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations may include at least one excipient such as starch, calcium carbonate, It can be prepared by mixing sucrose, lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc can also be used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solvents, emulsions, and syrups.In addition to the commonly used simple diluents, water and liquid paraffin, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • Routes of administration of the pharmaceutical compositions according to the invention are not limited to these, but are oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, Sublingual or rectal. Oral or parenteral release is preferred.
  • parenteral includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intra-articular, intramuscular, intrasternal, intradural, intralesional and intracranial injection or infusion techniques.
  • the pharmaceutical compositions of the invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.
  • the pharmaceutical compositions of the present invention vary depending on a number of factors, including the activity, age, weight, general health, sex, formulation, time of administration, route of administration, rate of release, drug combination and severity of the particular disease to be prevented or treated, of the specific compound employed.
  • the dosage of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the patient's condition, weight, degree of disease, drug form, route of administration and duration, and 0.0001 to 50 mg / kg or It may be administered at 0.001 to 50 mg / kg. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention may be formulated as pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.
  • the present invention relates to a food composition for preventing or ameliorating liver disease, which comprises a fermented product of vortex as an active ingredient.
  • the food composition of the present invention may be prepared in the form of various foods, for example, beverages, gums, teas, vitamin complexes, powders, granules, tablets, capsules, sweets, rice cakes, breads and the like. Since the food composition of the present invention is composed of plant extracts having little toxicity and no side effects, it can be used with confidence even for long-term use for prophylactic purposes.
  • the amount may be added at a ratio of 0.1 to 50% of the total weight.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as fructose, sucrose and the like, and common sugars such as polysaccharides, dextrins and cyclodextrins, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • the flavourant include natural flavourants (tautin, stevia extract (for example, rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.), synthetic flavors (saccharin, aspartame, etc.).
  • compositions of the present invention include various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners. , pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like.
  • the proportion of such additives may be selected in the range of 0.1 to about 50 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the Warsong fermentation product of the present invention can effectively inhibit the production of iNOS, COX-2 and TNF-a and its gene expression by inhibiting the transcriptional action of NF- ⁇ B and AP-1 in the nucleus of liver cells.
  • the same antioxidant and anti-inflammatory response can effectively prevent or treat liver damage.
  • Figure 1 shows the UPLC component analysis results for the Warsong fermentation of Examples 1 to 5 in Evaluation Example 4.
  • Figure 2 is a graph showing the change in body weight with each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 5.
  • Figure 3 is a graph showing the change in weight ratio of liver tissue to weight of the mouse according to each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 5.
  • Figure 4 is a graph showing the results of measuring the change in serum ALT level according to each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 6.
  • Figure 5 is a graph showing the results of measuring the change in serum AST level according to each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 6.
  • Figure 6 (a) and (b) is a graph showing the change in ROS levels in serum and liver tissue according to each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 7.
  • FIG. 7 is a graph showing the change of AP-1 expression amount according to each treatment in the mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 8 is a graph showing the change of NF- ⁇ B p65 expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 8 is a graph showing the change of NF- ⁇ B p65 expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • Figure 9 is a graph showing the change in the amount of COX-2 expression according to each treatment in a mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 10 is a graph showing the change in iNOS expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury caused by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 10 is a graph showing the change in iNOS expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury caused by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 11 is a graph showing the change of TNF- ⁇ expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 11 is a graph showing the change of TNF- ⁇ expression level according to each treatment in the mouse model of acute liver injury by LPS in Evaluation Example 8.
  • FIG. 12 (a) to 12 (e) show photographs of the liver tissues observed after each treatment with an optical microscope in the mouse model of acute liver injury caused by LPS in Evaluation Example 9.
  • FIG. 12 (a) to 12 (e) show photographs of the liver tissues observed after each treatment with an optical microscope in the mouse model of acute liver injury caused by LPS in Evaluation Example 9.
  • Osongsta (Orostachydis Herba) was purchased from the right herbal (Seoul, Korea).
  • the enzyme used for the first fermentation was a 1: 1: 1 mixture of Cellulclast (Novozymes, Denmark), HTec2 (Novozymes, Denmark) and amyloglucosidase provided by the Korea Research Institute of Chemical Technology.
  • strain suspension was prepared by adding the juice medium so that the concentration of the strain was 10 7-10 8 cells / ml.
  • all reagents used for culturing microorganisms were Difco (Difco Laborator, Detroit, MI. USA).
  • Juice medium was added to the strain culture so that the concentration of the strain was 10 7 ⁇ 10 8 cells / ml.
  • Escherichia coli (serotype O55: B5, L2880) derived LPS, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH), 2,2'-azinobis-3-ethyl- Benzothiazoline-6-sulfonic acid (2,2'-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS) was purchased from Sigma aldrich (MO, USA). Nitrocellulose membranes were purchased from Amersham GE Healthcare (Little.
  • phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), nuclear factor-kappa B (NF- ⁇ Bp65), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase -2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF- ⁇ ), histones, ⁇ -actin and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), and Activator protein-1 (AP- 1) was purchased from Cell sinaling (CA, USA).
  • Protease inhibitor mixtures, DMSO and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) are available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. It was purchased from (Osaka. Japan).
  • each of the dry vortex powder was weighed and placed in five containers, and then 45 ml of sterile distilled water was added and suspended to have a solid content of 10 w / v%.
  • the previously prepared complex enzyme solution was added to the vessel containing each suspension in an amount of 0.5 ml and fermented overnight.
  • Example 2 Lactobacillus hilgardii
  • Example 3 Leuconostoc mesenteroides
  • Example 4 ⁇ Pediococcus acidilactici
  • Example 5 Saccharomyces cerevisiae
  • the fermentation product was diluted 100-fold and then analyzed for DPPH radical scavenging activity. Specifically, electron donating ability was measured by DPPH free radical scavenging method.
  • DPPH is a free radical, and the solution is deep violet, which, when combined with the antioxidant in the sample, neutralizes (reduces) and the solution becomes transparent. DPPH is therefore used to determine the amount of antioxidant (radical scavenging) substance contained in a sample.
  • Radical scavenging ability (%) ⁇ (OD control -OD sample ) / OD control ⁇ X100
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Example 4
  • Example 5 DPPH radical scavenging activity (%) 97.54 ⁇ 0.18 40.68 ⁇ 1.24 *** 26.43 ⁇ 1.05 *** 94.96 ⁇ 0.21 29.12 ⁇ 1.62 *** *** means p ⁇ 0.001.
  • Examples 1 to 5 all exhibited high DPPH radical scavenging ability, in particular, Examples 1 and 3 showed very high DPPH radical scavenging ability, and Example 2 was the next highest DPPH radical. Scavenging ability. As such, it can be seen that all the fermented products of Wahsong according to the present invention have excellent antioxidant capacity.
  • the fermentation product was diluted 100-fold and analyzed for ABTS radical scavenging ability. Specifically, 7 mm ABTS and 2.45 mm potassium persulfate were dissolved in distilled water and then stored by shading for 12 hours. The reaction solution was calibrated with an absorbance of 0.70 ⁇ 0.02 using ethanol at 415 nm. Thereafter, 5 ⁇ l of the fermented product samples of Examples 1 to 5 were added to 95 ⁇ l of ABTS, followed by reaction for 15 minutes, and then the absorbance was measured at 415 nm. Absorbance was calculated and calculated by the formula (b), the results are shown in Table 4 below.
  • Radical scavenging ability (%) ⁇ (OD control -OD sample ) / OD control ⁇ ⁇ 100
  • Example 1 Example 2
  • Example 3 Example 4
  • Example 5 ABTS radical scavenging activity (%) 79.50 ⁇ 2.43 40.20 ⁇ 0.18 *** 33.83 ⁇ 1.76 83.12 ⁇ 2.59 *** 43.12 ⁇ 0.69 *** *** means p ⁇ 0.001.
  • Examples 1 to 5 all showed high ABTS radical scavenging ability, and in particular, Example 4 showed very high ABTS radical scavenging ability, and Example 1 showed the next highest ABTS radical scavenging ability. Seemed. As such, it can be seen that all the fermented products of Wahsong according to the present invention have excellent antioxidant capacity.
  • the daily oral administration group was divided into 5 groups and 6 animals were assigned to each group.
  • Samples were orally administered for 8 doses for 8 days, and on day 9 of the experiment, LPS 20 mg / kg was intraperitoneally injected and fasted for 24 hours, followed by anesthesia with ethyl ether, blood was collected from the heart, and immediately centrifuged. Serum was separated using a separator. After that, saline (0.9% NaCl, pH 7.4) was perfused and livers were collected and weighed for long periods, and then stored rapidly at -80 ° C until analysis.
  • the weight ratio of liver tissue to weight in the control group can be seen to increase significantly compared to the normal group, but decreased in the administration group administered the fermented products of Examples 1, 3 and 4 You can see the tendency to do it. In particular, when the fermentation product of Example 4 is administered can be seen that significantly reduced compared to the control.
  • the pharmaceutical composition of the present invention suppresses the production of fatty liver due to acute liver injury by LPS and helps to restore liver function.
  • ALT aminotransferase
  • AST aminotransferase activity in serum were measured by colorimetric determination at 505 nm with a UV spectrophotometer using a reagent kit prepared by Reitman-Frankel method, and the international unit per liter of serum (IU / L) The results are shown in FIGS. 4 and 5, respectively.
  • AST aspartate aminotransferase, aspartate aminotransferase, GOT, glutamic oxalacetic transaminase
  • ALT alanine aminotransferase, alanine aminotransferase, GPT, glutamic pyruvate transaminase
  • AST and ALT are enzymes present in liver cells, which are mainly released into the blood when hepatocytes are damaged, thereby increasing blood levels.
  • control group was significantly increased ALT due to the destruction of hepatocytes compared to the normal group, but in the administration group administered the fermentations of Examples 1, 3 and 4, the ALT was reduced compared to the control group In particular, when the fermentations of Examples 3 and 4 were administered, it can be seen that the ALT significantly decreased than the control group.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be seen to restore the liver damage induced by LPS, it can be expected to exhibit an excellent effect on liver diseases such as acute, chronic liver damage, fatty liver.
  • Serum was collected by centrifuging blood at 4,000 rpm for 10 minutes in the mouse heart of the normal group, control group and administration group of Evaluation Example 5, and liver tissue was ground using 1 mm EDTA-50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4). It was. After measuring 25 mM DCFH-DA in order to measure ROS in serum and liver tissue, the calculated value measured for 30 minutes using 530 nm emission wavelength and 485 nm excitation wavelength every 10 minutes from 0 minutes using a fluorescence photometer. Calculated. The results are shown in Figures 6 (a) and (b), respectively.
  • ROS which is a biomarker of oxidative stress
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is administered, both ROS are decreased in serum and liver tissues, and especially in liver tissues. It can be seen that there is an improvement effect of.
  • the pharmaceutical composition of the present invention inhibits the formation of inflammatory precursors by regulating signaling of NF- ⁇ B and AP-1.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can confirm a significant effect on the antioxidant and anti-inflammatory in LPS-induced acute liver cell damage.
  • the fermented products (Examples 3 and 4) that proceeded up to the second fermentation have a more excellent effect than the primary fermented products (Example 1), and particularly, during the second fermentation, Pediococcus esididilacti.
  • the fermentation product (Example 4) using the Pediococcus acidilactici strain has the most excellent effect.

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Abstract

본 발명은 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 와송의 발효물을 이용하여 간 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 와송의 발효물을 이용하여 간 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물과 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
간은 외부로부터 들어온 독성물질로부터 전신을 방어하고 생체 외 물질의 대사를 담당하는 중요한 기능을 담당하는 장기로서, 즉, 섭취한 각종 영양소를 생체에 필요한 형태로 전환시키고, 알부민 등과 같은 생명유지에 필요한 각종 물질을 합성하며, 생체 이물질(xenobiotics)을 체외로 배설하기 쉬운 상태로 전환 (biotransformation)시키기도 하는 등 매우 다양한 기능 수행한다. 생체 내로 들어온 생체 외 물질은 일단 간을 통과하기 때문에, 간은 영양소 외에도 많은 독성물질에 노출될 위험이 높고 다른 장기보다 손상될 가능성이 높다. 간 재생능력이 우수한 장기로 약간의 손상에는 충분히 회복된다. 그러나 과도한 스트레스, 흡연, 환경오염에 의한 화학물질에의 노출, 음주 및 바이러스 감염, 담즙 분비 정지 등에 의해 지속적 손상을 받게 되면, 기능이 저하될 뿐만 아니라 간 조직의 일부가 완전히 파괴되고 손상 부분은 정상으로 회복하지 못하는 결과를 초래한다. 결국 간 섬유화를 거쳐 치명적인 간 경화를 일으킬 수 있고, 간 경화는 간 암으로 발전할 수 있다. 또한, 간 질환은 초기 단계에서는 통증이나 자각증세가 나타나지 않고, 말기에 이르러서야 발견되기 때문에 적절한 시기에 치료가 불가능하고, 그에 따라 사망률도 높은 질환이다. 이처럼, 간 질환의 심각성에도 불구하고 아직까지 효과적인 간 질환 치료제가 없는 실정이다.
간염 바이러스에 의한 간 질환의 경우에는 항바이러스 약물이 사용되고 있으나, 그 부작용이 심각하다는 문제점이 있다. 최근에는 알코올 및 환경오염으로 늘어나고 있는 독성 물질에 의한 간 질환의 경우 아직까지 효과적인 치료방법이 드물다. 이에, 간 조직의 구조 및 기능을 유지하면서 간 손상을 치료 및 예방할 수 있는 약물의 개발이 절실히 필요한 실정이다.
한편, 와송(瓦松, Orostachys japonicus)은 일명 바위솔로 불리는 쌍떡잎식물 장미목 돌나물과의 다년생 초본식물로, 한방 고서에 항암효과, 해열, 지열, 습진, 화상 등에 특효가 있다고 기록되어 있다. 특히 유방암, 췌장암, 골수암, 식도암, 자궁암, 임파선암, 위암, 대장암, 고혈압, 저혈압, 혈액순환, 당뇨병, 중풍, 관절염, 손 발 저림, 변비, 구토, 각종 성인병 등에 특효가 있다고 알려져 있다.
와송에 존재하는 성분으로는 프리델린(friedelin), 에피프리델라놀(epifriedlanol), 글루티논(glutinone) 및 글루티놀(glutinol)과 같은 트리터페노이드 류(triterpenoid)와 β-시스테롤(β-sisterol)과 캄페스테롤(campesterol) 등의 스테롤(sterol) 계열의 물질, 지방산 에스터 류(fatty acid ester), 캄페롤(kamperol)과 퀘르세틴(quercetin)과 같은 플라보노이드(flavonoid) 류, 4-하이드록시벤조산(4-hydroxybenzoic acid)과 3,4-디하이드록시벤조산(3,4-dehydroxybenzoic acid), 갈릭산(gallic acid) 등의 방향족 산(aromatic acid) 등이 있으며, 최근에는 상기 와송을 이용한 다양한 질환의 치료에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
와송에는 수분이 90~95%이상 함유되어, 기존에 알려진 효능을 기대하려면 과량으로 복용해야 하나, 실제로 소화기능이 매우 저하되어 적정량의 식사조차 넘기기 힘들어하는 환자들에게는 와송을 과량으로 복용하는 것이 사실상 불가능하다. 이에 따라 와송의 유효성분을 증대시키며 복용의 편리성을 높일 수 있는 방법에 대한 연구가 필요할 것이다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술 상 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 일 목적은 와송의 발효물을 이용하여 간 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 약학 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 간단하고 용이한 공정으로 와송의 유효성분은 증대시키며, 복용의 편리성을 높인 간 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 와송(Orostachys japonicus)의 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 와송의 발효물을 제조하는 방법은 다음과 같다.
우선, 와송을 준비하여 30~50℃의 온도 하에서 24 내지 72시간 동안 건조시킨 뒤, 필요에 따라서는 분쇄할 수 있다.
상기 와송의 건조 분쇄물에 용매를 첨가하여 와송 현탁액을 얻을 수 있다. 여기서, 상기 용매의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 증류수를 사용하는 것이 추후 발효 공정을 수행하기에 바람직하다. 또한, 상기 용매의 첨가량 역시 특별히 제한하지는 않으나, 현탁액 내 와송의 건조 분쇄물이 5~20w/v%, 5~15w/v% 또는 5~10w/v%로 포함될 수 있도록 용매를 첨가할 수 있다.
본 발명에서는 상기 와송 현탁액을 효소 또는 발효 균주의 배양액을 이용하여 발효시킬 수 있으나, 바람직하게는 발효 균주 배양액을 이용하여 발효시키는 것이 와송의 유효 성분을 증대시켜 항산화 또는 항염증 효과를 극대화시킬 수 있으며, 보다 바람직하게는 1차로 효소를 이용하여 발효시킨 뒤, 2차로 발효 균주 배양액을 사용하여 발효시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 와송의 발효 시 사용하는 효소로는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 아밀로글루코시다제가 0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5의 중량비로 혼합된 효소를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 셀룰라아제(cellulase)는 1,4-(1,3:1,4)-β-D-글루칸 4-글루카노-하이드로레이즈로(1,4-(1,3:1,4)-β-D-Glucan 4-glucano-hydrolase)일 수 있고, 바람직하게는 Novozyme사의 Cellulclast를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 상기 헤미셀룰라아제로는 Novozyme사의 HTec2를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 와송의 현탁액에 상기 효소를 첨가한 뒤 12~48시간, 12~36시간, 또는 24~36시간 동안 발효시켜 1차 발효물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 효소의 첨가량은 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 와송의 현탁액의 총 부피에 대하여 5~20부피%, 5~15부피% 또는 5~10부피%의 양으로 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 1차 발효물이 얻어지면, 발효 균주의 배양액을 사용하여 2차로 발효시켜 2차 발효물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 발효 균주로는 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 및 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 중 1종 이상의 균주를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)을 사용하는 것이 와송의 유효성분을 증대시켜 간 질환의 치료 효과를 높일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 발효 균주의 배양액은 과즙 배지 또는 야채즙 배지를 추가로 더 포함하여 발효 균주의 활성을 향상시킬 수 있다. 여기서 상기 과즙 배지의 종류를 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 감귤, 포도, 사과, 망고, 오렌지, 파인애플, 복분자, 딸기, 복숭아, 블루베리 또는 석류 등의 과일로부터 얻은 것일 수 있지만, 이들로 한정되지 않고, 과일의 퓨레(puree)일 수도 있다. 또한, 상기 야채즙의 종류는 특별히 제한하지 않으나, 예를 들면, 당근, 토마토, 양배추 등의 즙액을 들 수 있지만 이들로 한정되지 않고, 야채의 퓨레일 수도 있다.
상기 과즙 및 약채즙은 과일 또는 야채를 믹서 등으로 연마 분쇄하여, 필요에 따라서 더욱 착즙함으로써 얻을 수 있다. 이러한 과즙 및 야채즙은 적당히 농축되어도 바람직하고, 농축액은 그대로여도, 증류수 등으로 적당한 농도로 희석하여 사용하여도 바람직하다.
상술한 과즙 및 야채즙은, 각각이 단독으로 사용되어도, 목적에 따라 조합하여 사용하여도 좋다. 또한, 과일 또는 야채의 퓨레는, 초고압하(예를 들면, 100MPa)에서 효소 처리를 하는 것에 의해 얻을 수 있고, 식물섬유를 풍부하게 포함하고 있다. 이 효소 처리에 사용되는 효소는, 과일 또는 야채의 종류에 따라 적당히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 배양액은 발효 균주를 106~109cells/ml, 106~108cells/ml 또는 106~107cells/ml의 양으로 포함할 수 있다.
본 발명에서는 상기 와송의 현탁액에 발효 균주의 배양액을 첨가한 뒤 30~40℃에서 3~10일 동안 정치 배양시켜 발효물을 얻을 수 있다.
단, 상기 배양액의 첨가량을 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 현탁액 총 중량에 대하여 0.05~0.5중량%, 0.05~2중량%, 또는 0.05~0.1중량%의 양으로 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 2차 발효물이 얻어지면, 필요에 따라서는 상기 2차 발효물을 동결 건조시킬 수 있다. 여기서, 상기 동결 건조의 수행 조건을 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, -60 내지 30℃에서 6~50시간 동안 수행될 수 있고, 바람직하게는 -40~-20℃에서 1~3시간, -20~-10℃에서 1~3시간, -5~0℃에서 3~5시간, 10~20℃에서 1~3시간, 및 20~30℃에서 1~3시간 동안 수행할 수 있다.
본 발명에서 상기 와송의 발효물의 제형은 특별히 제한하지 않으며, 예를 들어 와송의 액상 발효물이거나 혹은 고상 발효물일 수 있다. 상기 와송의 발효물의 제형은 조성물의 투여될 환자의 기호나 혹은 사용 목적 등에 따라 다양히 조절되어 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기와 같이 얻어진 와송의 발효물은 간 세포의 핵 내에서 NF-κB와 AP-1의 전사 작용을 억제함으로써, iNOS, COX-2 및 TNF-a의 생성과 그 유전자 발현을 효과적으로 저해하여 항산화 및 항염증 반응에 의에 간 손상을 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 예방 또는 치료의 대상이 되는 간 질환으로는 자가면역성 간 질환, 약물 유인성 간 질환, 알코올성 간 질환, 감염성 간 질환 및 선천성 대사성 간 질환으로 이루어진 군에서 선택될 수 있고, 바람직하게는 감염성 간 질환일 수 있다.
한편, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide, LPS)는 염증유발물질의 생성을 자극하여 급성 간 손상이 발생하는데, 이로 인하여 지방간이 생기고, 체중에 대한 간 조직의 무게비가 증가하게 된다. 인체에서 간은 지방이 차지하는 비율이 5% 정도인데, 이보다 많은 지방이 축척된 상태를 지방간이라고 한다. 지방간은 더욱 심해질 경우 간염, 간경변으로 변하였다가 간암에 이르기까지 한다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 가장 바람직하게는 리포폴리사카라이드에 의해 매개된 급성 간 손상 혹은 그로부터 기인한 지방간의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 약학 조성물에서 상기 와송의 발효물의 함량은 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 50중량%의 양으로 포함될 수 있다.
본 발명에서 "예방"이란, 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 간 질환을 차단하거나, 간 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서, "치료"는 본 발명의 약학 조성물을 이용하여 간 질환이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50mg/kg 또는 0.001 내지 50mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.
본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 와송의 발효물을 유효 성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물에서 상기 와송의 발효물에 관한 것은 본 발명의 약학 조성물에 관한 개시 사항을 모순되지 않는 한 참조할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 과자, 떡, 빵 등의 형태로 제조될 수 있다. 본 발명의 식품 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없는 식물추출물로 구성된 것이므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물에 포함될 때 그 양은 전체 중량의 0.1 내지 50%의 비율로 첨가할 수 있다.
여기서, 상기 식품 조성물이 음료 형태로 제조되는 경우 지시된 비율로 상기 식품 조성물을 함유하는 것 외에 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 즉, 천연 탄수화물로서 포도당 등의 모노사카라이드, 과당 등의 디사카라이드, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜 등을 포함할 수 있다. 상기 향미제로서는 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등) 등을 들 수 있다.
그 외 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.1 내지 약 50 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명의 와송 발효물은 간 세포의 핵 내에서 NF-κB와 AP-1의 전사 작용을 억제함으로써, iNOS, COX-2 및 TNF-a의 생성과 그 유전자 발현을 효과적으로 저해할 수 있고, 이와 같은 항산화 및 항염증 반응에 의에 간 손상을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
도 1은 평가예 4에서 실시예 1 내지 5의 와송 발효물에 대하여 UPLC 성분 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 평가예 5에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 체중의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 평가예 5에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 마우스 체중 대비 간 조직의 무게비의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 4는 평가예 6에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 혈청 내 ALT 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5는 평가예 6에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 혈청 내 AST 수준의 변화를 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 6의 (a) 및 (b)는 평가예 7에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 혈청 및 간 조직 내 ROS 수준의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 평가예 8에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 AP-1 발현량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 8은 평가예 8에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 NF-κB p65 발현량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 9는 평가예 8에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 COX-2 발현량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 평가예 8에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 iNOS 발현량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 11은 평가예 8에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리에 따른 TNF-α 발현량의 변화를 그래프로 나타낸 것이다.
도 12의 (a) 내지 (e)는 평가예 9에서 LPS에 의한 급성 간 손상 마우스 모델에 있어서 각 처리 후 간 조직을 광학 현미경으로 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시형태들을 설명한다. 그러나 본 발명의 실시형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실시형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
[ 준비예 1] 재료의 준비
1. 약재의 준비
와송 (Orostachydis Herba)을 바른한약 (서울, 한국)에서 구입하였다.
2. 효소의 준비
1차 발효 시 사용할 효소로는 한국 화학연구원 융합화학연구팀에서 제공한 Cellulclast(Novozymes, Denmark), HTec2(Novozymes, Denmark), 아밀로글루코시다제의 1:1:1 혼합액을 사용하였다.
3. 발효 균주 배양액의 준비
2차 발효 시 사용할 배양액으로는 Lactobacillus hilgardii , Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici 및 Saccharomyces cerevisiae의 총 4종의 발효 균주 각각을 액상 발효한 뒤, 과즙 배지를 첨가하여 균주의 농도가 107~108 cells/㎖가 되도록 하여 균주 현탁액을 준비하였다. 단, 미생물의 배양에 사용된 시약은 모두 Difco (Difco Laborator, Detroit, MI. USA) 제품을 사용하였다. 균주 배양액에 과즙 배지를 첨가하여 균주의 농도가 107~108 cells/㎖가 되도록 하였다.
4. 기타 시약 및 재료의 준비
Escherichia coli (serotype O55:B5, L2880) 유래 LPS, 1,1-디페닐-2-피크릴하이드라질 (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH), 2,2’-아지노비스-3-에틸-벤조티아졸린-6-설폰산 (2,2’-azinobis-3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)은 Sigma aldrich (MO, USA)에서 구입하였다. 니트로셀룰로오스 막은 Amersham GE Healthcare (Little. Chalfont, UK)에서 구입하였고, 페닐메틸설포닐 플로라이드(Phenylmethylsulfonyl fluoride, PMSF), nuclear factor-kappa B (NF-κBp65), inducible nitric oxide synthase (iNOS), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumor necrosis factor alpha (TNF-α), 히스톤, β-액틴과 2차 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였으며, Activator protein-1 (AP-1)은 Cell sinaling (CA, USA)에서 구입하였다. 프로테아제 억제제 혼합물, DMSO 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka. Japan)에서 구입하였다. 또한, 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 (2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate, DCFH-DA)와 디하이드로로다민 123 (Dihydrorhodamine 123)은 Molecular Probes (Eugene, OR, U.S.A.)에서 ECL 웨스턴 블럿 탐지 시약은 GE Healthcare로부터 구입하여 사용하였다. 단백질 정량을 위한 BCA 단백질 어세이 키트는 Thermo Scientific (Rockford, IL, USA)에서 구입하였다.
[ 실시예 1 내지 5] 와송의 액상 발효물의 제조
1. 와송의 건조 및 분쇄
구입한 와송을 수세한 뒤, 건조기 (HDG-222, HyunDaeEnetech, HwaSung, Korea)를 이용하여 40℃에서 3일간 저온 건조한 후, 초미립자분쇄기 (Jet Mill, Ducksan, SiHeung, Korea)를 이용하여 미세 분말로 세분하였다.
2. 1차 발효
건조 와송 분말을 5g씩 칭량하여 5개의 용기에 넣은 뒤, 45 ㎖의 멸균 증류수를 첨가하여 고형분이 10w/v%가 되도록 현탁하였다. 각 현탁액이 포함된 용기에 미리 준비한 복합효소액을 0.5 ㎖의 양으로 첨가하고 하룻밤 동안 발효시켰다.
3. 2차 발효
1차 발효물이 포함된 각 용기에 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 균주 배양액을 0.5㎖씩 접종한 뒤 30℃ 에 맞추어진 항온배양기 (제이오텍, 대전, Korea)와 진탕배양기 (Shaking Incubator, Jeio Tech, DaeJeon Korea)에서 정치 배양하였다. 발효 동안 샘플을 간헐적으로 흔들어 주었다.
구분 1차 발효 2차 발효
실시예 1 ○ -
실시예 2 ○ Lactobacillus hilgardii
실시예 3 ○ Leuconostoc mesenteroides
실시예 4 ○ Pediococcus acidilactici
실시예 5 ○ Saccharomyces cerevisiae
[ 실시예 6 내지 10] 와송의 고상 발효물의 제조
상기 실시예 1 내지 5와 동일한 방법으로 5종의 액상 발효물을 제조한 뒤, 동결건조기 (LYOPH-PRIDE 20R, 일신바이오베이스, 한국)를 이용하여 상기 액상 발효물을 -30℃에서 120분, -15℃에서 120분, 0℃에서 240분, 15℃에서 120분, 30℃에서 120분의 조건으로 동결건조 하였다.
[ 평가예 1] pH 분석
상기 실시예 2 내지 5에서 발효물의 발효가 잘 진행되었는지 평가하기 위하여 pH를 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 단, pH 측정은 Waterproof 사의 pH Shear type을 사용하였다.
구분 pH
발효 기간(일)
1 2 3
실시예 2 7.11 6.44 6.35
실시예 3 7.03 7.04 7.75
실시예 4 3.95 4.35 4.75
실시예 5 7.24 6.65 6.84
상기 표 2에서 보는 바와 같이, 발효 시간이 경과할수록 pH가 변화하는 것을 볼 수 있다. 실시예 2 및 5의 경우 발효 시 사용한 균주가 산을 생성하는 균주이어서 시간이 경과할수록 발효물의 pH가 감소하는 것을 볼 수 있고, 반면 실시예 3 및 4의 경우 pH가 증가되는 것을 볼 수 있다.
[ 평가예 2] DPPH (1,1- diphenyl -2- picrylhydrazyl ) 라디칼 소거능
상기 실시예 1 내지 5에서 얻어진 발효물의 항산화 능력을 평가하기 위하여, 발효물을 100배 희석한 뒤 DPPH 라디칼 소거능(radical scavenging activity)을 분석하였다. 구체적으로, 전자공여능 (electron donating ability)은 DPPH 프리 라디칼 소거법으로 측정하였다. DPPH는 프리 라디칼 (free radical)이며, 용액은 보라색(deep violet)을 띠는데, 이는 시료 중에 있는 항산화 물질과 결합하여 중화 (환원)가 되면 용액은 투명하게 변한다. 따라서 DPPH는 시료 중에 포함된 항산화 (라디칼 소거능) 물질의 양을 측정하는데 사용된다.
상기 실시예 1 내지 5의 발효물 시료 100 μl를, 60 μl DPPH용액을 에탄올에 용해시킨 용액 100 μl에 넣고 혼합한 후, 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 사용하여 540 ㎚에서 흡광도를 사용하여 측정한 후, 전자공여능은 식(a)에 의해 계산하여 산출하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.
[식 (a)]
라디칼 소거능(%) = {(ODcontrol - ODsample)/ODcontrol}X100
ODcontrol: 시료가 들어가지 않은 경우(대조군) 흡광도
ODsample: 시료가 들어간 경우 흡광도
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
DPPH 라디칼 소거능(%) 97.54±0.18 40.68±1.24*** 26.43±1.05*** 94.96±0.21 29.12±1.62***
***는 p < 0.001을 의미한다.
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 5 모두 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타냈고, 그 중에서도 특히 실시예 1과 3이 매우 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 실시예 2가 그 다음으로 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. 이처럼, 본 발명에 따른 와송의 발효물은 모두 우수한 항산화 능력을 갖는 것을 알 수 있다.
[ 평가예 3] ABTS (2,2'- azinobis -3-ethyl- benzothiazoline -6- sulfonic acid) 라디칼 소거능
상기 실시예 1 내지 5에서 얻어진 발효물의 항산화 능력을 평가하기 위하여, 발효물을 100배 희석한 뒤 ABTS 라디칼 소거능을 분석하였다. 구체적으로 7 ㎜ ABTS와 2.45 ㎜ 과황화칼륨(Potassium persulfate)을 증류수에 녹인 다음 12시간동안 차광시켜 보관하였다. 이 반응액을 415 ㎚에서 에탄올을 이용하여 흡광도 0.70±0.02로 보정하였다. 그 후, ABTS 95μl에 실시예 1 내지 5의 발효물 시료 5μl을 첨가하여 15분 반응 시킨 후, 415 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 식(b)에 의해 계산하여 산출하였으며, 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
[식(b)]
라디칼 소거능(%) = {(ODcontrol - ODsample)/ODcontrol}×100
ODcontrol: 시료가 들어가지 않은 경우(대조군) 흡광도
ODsample: 시료가 들어간 경우 흡광도
구분 실시예 1 실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5
ABTS 라디칼 소거능(%) 79.50±2.43 40.20±0.18*** 33.83±1.76 83.12±2.59*** 43.12±0.69***
***는 p < 0.001을 의미한다.
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 5 모두 높은 ABTS 라디칼 소거능을 나타냈고, 그 중에서도 특히 실시예 4가 매우 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였으며, 실시예 1이 그 다음으로 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였다. 이처럼, 본 발명에 따른 와송의 발효물은 모두 우수한 항산화 능력을 갖는 것을 알 수 있다.
[ 평가예 4] 성분 분석
실시예 1 내지 5에서 얻어진 발효물 1ml에 함유된 성분을 분석하기 위하여, Waters사의 ESI 소스의 질량분석기가 결합된 UPLC를 사용하여 분석하였다. 성분의 분리를 위하여 ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1×150.0 ㎜, 1.7 ㎛) 칼럼을 사용하였으며, 이동상은 하기 표 5에 나타낸 조건으로 0.1% 포름산이 함유된 물과 아세토나이트릴을 사용하여 기울기 용매 조건으로 흘려주었다. 칼럼은 40℃를 유지하였으며, 유속은 분당 0.18 ㎖/min 및 주입량은 3.0 ㎕로 하였다. 또한 정량분석을 위하여 ACQUITY TQD MS를 사용하여 양이온과 음이온 모드에서 검출하였다. MS 검출을 위해 capillary voltage (3.3 kV), extract voltage (3 V), interface temperature (120℃), RF lens (0.3 V), desolvation temperature (300℃), desolvation gas (600 L/h), cone gas (50 L/h) 및 collision gas (0.14 ㎖/min) 등에 대한 조건을 설정하여 다중 반응 검지법(multiple reaction monitoring, MRM) 모드를 적용하여 정량을 실시하였다. 실시예 1 내지 5의 발효물 1 ㎖에 함유된 성분을 분석하여 그 결과를 하기 표 6 및 도 1에 나타내었다. 발효 와송은 퀘르세틴(quercetin)과 캠퍼롤(kaempferol)의 함량을 분석하여 나타내었으며 tr은 검출은 되지만 정량값이 의미가 없는 것을 의미한다.
시간(분) 이동상
A%(0.1% formic acid) B%(Acetonitrile)
10 90 10
30 40 60
40 30 70
45 30 70
50 90 10
구분 루틴 이소퀘르시트린 캠퍼롤-3-O-루티노사이드 퀘르시트린 퀘르세틴 캠퍼롤
실시예 1 No peak No peak No peak No peak 5.38723 9.94246
실시예 2 No peak No peak No peak No peak No peak No peak
실시예 3 No peak No peak No peak No peak No peak No peak
실시예 4 No peak No peak No peak No peak No peak No peak
실시예 5 No peak No peak No peak No peak No peak No peak
상기 표 6 및 도 1에서 보는 바와 같이, 실시예 1 내지 5에서 얻어진 와송의 액상의 발효물 내 루틴(rutin), 이소퀘르시트린(isoquercitrin), 캠퍼롤-3-0-루티노사이드(kaempferol-3-O-rutinoside), 퀘르시트린(quercitrin), 퀘르세틴(quercetin) 및 캠퍼롤(kaempferol)의 성분을 분석한 결과, 실시예 1의 발효물 에서 퀘르세틴의 함량이 5.38로 나타났고, 캠퍼롤의 함량이 9.94로 나타난 것을 볼 수 있다.
[ 평가예 5] LPS(Lipopolysaccharide)에 의한 급성 간 손상 개선 효과
ICR 마우스 (6주령, 수컷)에 아무런 처치를 하지 않은 정상군, LPS를 처치한 대조군, 상기 대조군에 실시예 1, 3 및 4에서 얻어진 발효물을 200 ㎎/㎏의 용량을 1일 1회 8일간 경구 투여한 투여군 이렇게 총 5그룹으로 분류하였으며, 각 군에 6마리씩 배정하였다.
8일 동안 시료를 각 용량에 맞게 경구투여 하였으며, 실험 9일째, LPS 20 ㎎/㎏를 복강주사하고 24시간 절식 후, 에틸 에테르(ethyl ether)로 흡입마취하여, 심장에서 혈액을 채취하였고 즉시 원심분리기를 이용해 혈청을 분리하였다. 그 후에, 식염수 (0.9% NaCl, pH 7.4)를 관류하여 간을 채취해 장기 무게를 잰 후, 분석 전까지 빠르게 -80℃에서 보관하였다.
적응기간을 제외한 식이 급여기간 8일 동안 체중의 변화 및 식이 효율을 측정하여 그 결과를 하기 표 7 및 도 2에 나타내었다. 또한, 마우스의 체중에 대한 간 조직의 무게비를 측정하여 그 결과는 도 3에 나타내었다.
구분 초기 몸무게(g) 최종 몸무게(g) 몸무게 증가량(g) FER(%)
정상군 33.02 ± 0.54 35.56 ± 0.77 2.54 ± 0.33 0.16 ± 0.02
대조군 32.52 ± 0.37 34.50 ± 0.41 1.99 ± 0.14 0.14 ± 0.01
실시예 1 32.62 ± 0.38 34.53 ± 0.51 1.92 ± 0.28 0.12 ± 0.02
실시예 3 32.18 ± 0.50 33.83 ± 0.68 1.65 ± 0.28 0.10 ± 0.02
실시예 4 32.08 ± 0.50 33.65 ± 0.46 1.57 ± 0.20 0.10 ± 0.01
상기 표 7 및 도 2에서 보는 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 정상군, 대조군 및 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 투여군 모두에서 체중이 일정하게 증가하는 것을 볼 수 있다.
또한, 도 3에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 몸무게에 대한 간 조직의 무게비가 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하는 것을 볼 수 있으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 투여군의 경우 감소하는 경향을 볼 수 있다. 특히 실시예 4의 발효물을 투여한 경우 대조군에 비하여 유의성 있게 감소한 것을 볼 수 있다.
따라서, 본 발명의 약학 조성물은 LPS에 의한 급성 간 손상으로 기인한 지방간의 생성을 억제하고 간 기능의 회복에 도움을 주는 것을 알 수 있다.
[평가예 6] 혈청의 ALT 및 AST 측정
상기 평가예 5의 정상군, 대조군 및 투여군의 마우스 심장에서 채취한 혈액을 원심분리기에 4,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 중 ALT (alanine aminotransferase) 및 AST (aspartate aminotransferase) 활성도는 Reitman-Frankel법에 의해 제조된 시약 키트를 사용하여 505 ㎚에서 UV spectrophotometer로 비색정량하여 측정하였고, 혈청 리터 당 국제 유닛 (IU/L)으로 측정하여 그 결과를 각각 도 4 및 5에 나타내었다.
AST (aspartate aminotransferase, 아스파르테이트 아미노전이요소, GOT, glutamic oxalacetic transaminase)와 ALT (alanine aminotransferase, 알라닌 아미노전이요소, GPT, glutamic pyruvate transaminase)는 간 기능 관련 효소로서 간 세포내의 미토콘드리아에 존재하며 간세포의 파괴에 의해 혈액 내로 유출되는 효소에 해당한다. 즉, AST 및 ALT는 간 세포 내에 존재하는 효소들로 주로 간세포가 손상을 받는 경우에 혈중으로 방출되어 혈중 수치가 증가하게 된다.
도 4에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 정상군에 비하여 간세포의 파괴로 인하여 ALT가 유의성 있게 증가하였으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 투여군의 경우 대조군에 비하여 ALT가 감소한 것을 볼 수 있고, 특히 실시예 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 ALT가 대조군 보다 유의성 있게 감소한 것을 볼 수 있다.
도 5에서 보는 바와 같이, 대조군의 경우 정상군에 비하여 AST가 유의성 있게 증가하였으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 투여군의 경우 대조군에 비하여 AST가 감소한 것을 볼 수 있고, 특히 실시예 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 AST가 대조군 보다 유의성 있게 감소한 것을 볼 수 있다.
이렇듯, 본 발명의 약학 조성물은 LPS에 의해 유도된 간 손상을 회복시키는 것을 볼 수 있는 바, 급성, 만성 간손상, 지방간 등의 간 질환에 우수한 효과를 나타낼 것을 기대할 수 있다.
[ 평가예 7] 활성 산소종(ROS)의 측정
상기 평가예 5의 정상군, 대조군 및 투여군의 마우스 심장에서 채혈한 혈액을 4,000 rpm 10분 원심 분리하여 혈청을 얻었고, 간 조직은 1 ㎜ EDTA-50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 7.4)를 이용하여 분쇄하였다. 혈청과 간 조직 내의 ROS를 측정하기 위하여 25 mM DCFH-DA를 혼합한 후, 형광 광도계를 이용하여 0분부터 매 10분씩 530 ㎚ 방출 파장과 485 ㎚ 여기 파장을 이용하여 30분간 측정한 산출 값을 계산하였다. 그 결과는 각각 도 6의 (a) 및 (b)로 나타내었다.
도 6의 (a) 및 (b)에서 보는 바와 같이, 산화적 스트레스의 바이오 마커인 ROS가 정상군에 비하여 대조군에서 높게 측정되었으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 대조군 보다 측정량이 감소한 것을 볼 수 있다. 특히 간 조직에서 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 ROS가 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하는 것을 볼 수 있다.
산화적 스트레스는 LPS로 유도된 간손상에 중요한 역할을 하고, ROS의 과도한 생성은 항산화 시스템 불균형을 초래하고 결국 세포 손상을 야기한다. 따라서 ROS는 조직 손상 개선에 주요한 요인으로 작용하는데, 본 발명에 따른 약학 조성물을 투여한 경우 혈청 및 간 조직에서 ROS가 모두 감소하였고, 특히 간 조직에서는 유의성 있게 감소하는 것을 볼 수 있는바, 간 손상의 개선 효과가 있음을 알 수 있다.
[ 평가예 8] 웨스턴 블럿
상기 평가예 5의 정상군, 대조군 및 투여군의 마우스 간의 세포질 단백질을 얻기 위해 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 15 mM CaCl2, 1.5 M 수크로스, 0.1 M DTT 및 프로테아제 억제제 복합체(protease inhibitor cocktail)를 첨가한 버퍼 A를 넣고 조직 분쇄기로 분쇄한 후 10% NP-40 용액을 첨가하였다. 아이스 위에서 20분간 정치시킨 후 12,000 rpm으로 2분간 원심분리 하여 세포질 단백질을 포함하고 있는 상층액을 분리하였다.
핵 단백질을 얻기 위해 10% NP-40가 더해진 버퍼 A에 두 번 헹구고 100㎕의 버퍼 C (50mM HEPES, 50mM KCl, 0.3mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1mM DTT, 0.1 mM PMSF 및 10% 글리세롤)을 첨가하여 재부유 시킨 뒤 10분마다 볼텍스를 3번 하였다. 4℃에서 12,000 rpm으로 10분간 원심 분리한 후 핵 단백질을 포함하고 있는 상층액을 얻어 -80℃에서 각각 냉동 보관하였다.
간 조직의 세포질 단백질의 iNOS, COX-2, TNF-α, β-actin 및 핵단백질 AP-1, NF-κB p65, 히스톤 단백질의 발현을 측정하기 위해 10 ㎍의 단백질을 8 ~ 15% SDS-폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기 영동 후, 아크릴아마이드 겔을 니트로셀룰로스 멤브레인으로 이동시켰다. 준비된 멤브레인에 각각의 1차 항체를 처리하여 4℃에서 밤새 반응시킨 다음 PBST로 6분마다 5회 세척하고, 각각 처리된 1차 항체에 사용되는 2차 항체 (PBST로 1:3000로 희석해서 사용)를 사용하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 6분마다 5회 세척하였다. 그리고 빛을 발하는 화학 물질 증폭제(enhanced chemiluminescence, ECL) 용액을 GE Healthcare (Arlington Heights, IL, USA)에 노출시킨 후, Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd., Seoul, Korea)에 감광시켜 단백질 발현을 확인한 후, 해당 밴드를 ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation, Tokyo, Japan) 프로그램을 사용하여 정량한 뒤, 도 7 내지 11에 나타내었다.
도 7 및 8에서 보는 바와 같이, 염증성 매개 인자인 AP-1과 NF-κB p65의 발현량을 측정한 결과, 대조군의 경우 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 대조군에 비하여 유의성 있게 발현이 감소한 것을 볼 수 있다.
또한, 도 9 내지 11에서 보는 바와 같이, COX-2, iNOS 및 TNF-α과 발현량을 측정한 결과, 대조군의 경우 정상군에 비하여 유의성 있게 증가하였으나, 실시예 1, 3 및 4의 발효물을 투여한 경우 대조군에 비하여 발현이 현저히 감소한 것을 볼 수 있고, 특히 COX-2의 발현에 있어서는 실시예 3 및 4의 발효물을 투여한 경우가, iNOS의 발현에 있어서는 실시예 1, 3 및 4 모두, TNF-α의 발현에 있어서는 실시예 4의 발효물을 투여한 경우가 대조군에 비하여 발현량이 유의성 있게 감소한 것을 볼 수 있다.
이를 통하여, 본 발명의 약학 조성물은 NF-κB과 AP-1의 신호전달 조절에 의해 염증전구물질의 형성을 억제함을 알 수 있다.
[평가예 9] 조직 분석
상기 평가예 5의 정상군, 대조군 및 투여군의 마우스의 간 조직을 적출한 다음, 10% 중성 포르말린에 18시간 이상 고정시킨 다음, 탈수를 거쳐 파라핀 포매 후 4 ㎛의 절편을 제작하였다. 이후 Hematoxylin & eosin (H&E) 염색을 실시하고, 광학 현미경 하에서 관찰하였다. 그 결과는 도 12의 (a) 내지 (e)에 나타내었다.
도 12의 (a) 내지 (e)에서 보는 바와 같이, 정상군(a)에 비하여 대조군(b)에서는 혈관 주위의 염증 정도가 증가하였으며, 핵의 모습이 현저하게 줄어든 모습을 관찰할 수 있다. 하지만 실시예 1의 발효물 투여군(c)과 실시예 3의 발효물 투여군(d) 및 실시예 4의 발효물 투여군(e) 에서는 혈관 주위의 염증 정도가 줄어든 모습과 핵의 유무가 뚜렷이 구분되는 모습을 관찰할 수 있다.
본 발명의 상기 실험에서 모든 수치는 평균 ± 표준오차 (Mean±S.E.M)로 표시하였으며, SPSS (22.0 for Windows program)을 사용하여 one-way analysis of variance (ANOVA)로 유의수준 p-value < 0.05에서 검정하였다.
이상의 결과로 볼 때 LPS에 의해 유발된 쥐의 급성 간 세포 손상에서 본 발명의 약학 조성물은 항산화 및 항염증에 유의미한 효과를 확인할 수 있다. 특히나, 1차 발효물(실시예 1)에 비하여 2차 발효까지 진행한 발효물(실시예 3 및 4)가 더욱 우수한 효과를 갖는 것을 볼 수 있고, 특히 2차 발효 시 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 균주를 사용한 발효물(실시예 4)가 그 효과가 가장 뛰어난 것을 볼 수 있다.

Claims (25)

  1. 와송(Orostachys japonicus)의 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 와송의 발효물은 와송을 효소 및 발효 균주의 배양액 중 1종 이상에 의해 발효시킨 것인, 약학 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 와송의 발효물은 와송을 효소로 1차 발효시킨 뒤 발효 균주의 배양액으로 2차로 발효시킨 것인, 약학 조성물.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 아밀로글루코시다제가 0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5의 중량비로 혼합된 것인, 약학 조성물.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 발효 균주는 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 포함하는, 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 발효 균주는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 포함하는, 약학 조성물.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 발효 균주의 배양액은 발효 균주를 106~109cells/ml의 양으로 포함하는, 약학 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 발효물은 동결건조물인, 약학 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 간 질환은 자가면역성 간 질환, 약물 유인성 간 질환, 알코올성 간 질환, 감염성 간 질환 및 선천성 대사성 간 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물.
  11. 와송(Orostachys japonicus)의 발효물을 유효성분으로 포함하는 간 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 와송의 발효물은 와송을 효소 및 발효 균주의 배양액 중 1종 이상에 의해 발효시킨 것인, 식품 조성물.
  13. 와송을 준비하는 단계; 및
    와송을 발효하는 단계를 포함하는, 간 질환의 예방 또는 개선용 약학 조성물의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 와송을 발효하는 단계는 효소 및 발효 균주의 배양액 중 1종 이상을 사용하여 수행되는, 약학 조성물의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 와송을 발효하는 단계는, 와송을 효소로 1차 발효하는 단계; 및 발효 균주의 배양액으로 2차 발효하는 단계를 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    상기 효소는 셀룰라아제(cellulase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 아밀로글루코시다제(Amyloglucosidase)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 약학 조성물의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 효소는 셀룰라아제, 헤미셀룰라아제 및 아밀로글루코시다제가 0.5~1.5:0.5~1.5:0.5~1.5의 중량비로 혼합된 것인, 약학 조성물의 제조방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 발효 균주는 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici) 및 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 균주를 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 발효 균주는 페디오코커스 에시디락티시(Pediococcus acidilactici)를 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  20. 제 14 항에 있어서,
    상기 발효 균주의 배양액은 발효 균주를 106~109cells/ml의 양으로 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  21. 제 14 항에 있어서,
    상기 와송을 준비하는 단계는 와송에 용매를 첨가하여 와송 현탁액을 준비하는 단계를 더 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 효소는 와송 현탁액의 총 부피에 대하여 5~20부피%의 양으로 첨가되는, 약학 조성물의 제조방법.
  23. 제 21 항에 있어서,
    상기 발효 균주의 배양액은 와송 현탁액의 총 중량에 대하여 0.05~0.5중량%의 양으로 첨가되는, 약학 조성물의 제조방법.
  24. 제 14 항에 있어서,
    상기 와송을 발효하는 단계에 후속적으로, 동결건조하는 단계를 더 포함하는, 약학 조성물의 제조방법.
  25. 제 13 항에 있어서,
    상기 간 질환은 자가면역성 간 질환, 약물 유인성 간 질환, 알코올성 간 질환, 감염성 간 질환 및 선천성 대사성 간 질환으로 이루어진 군에서 선택되는, 약학 조성물의 제조방법.
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