KR20210072543A - 대추과육 추출물을 이용한 건강 기능성 조성물 - Google Patents
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Abstract
대추과육을 열처리 및 효소처리 한 후 주정으로 추출한 건강 기능성 조성물이 제공된다. 이 건강 기능성 조성물은 항산화 및 항염증 효능이 우수한 대추과육 주정추출물을 유효성분으로 포함한다.
Description
본 발명은 건강 기능성 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 항산화 및 항염증 효능이 우수한 대추과육 추출물을 이용한 건강 기능성 조성물에 관한 것이다.
국내 임산물 중 대추는 매년 800억원대의 생산량을 보이며, 용도 개발이 다변화될 경우 그 생산량은 더욱 증가될 것으로 기대되는 수실류이다. 2018년 산림청 임산물 생산조사의 지역별 총 생산현황(10,734,103kg)을 보면, 대추는 경상북도가 주산지이며 국내 전체 생산의 약 74% (7,833,750kg)를 차지한다.
대추는 대추나무의 열매로서, 과육에는 주로 당분이 들어 있어 식용 과실로 이용된다. 대추 씨에는 베툴린, 베투릭산, 지방 등이 들어 있어 예로부터 한방에서는 약재로 사용한다. 이와 같이 대추는 오랜 기간 민간에서 사용되고 있지만 실제 과학적으로 대추의 건강효능을 규명한 연구는 많지 않다. 이에 본 발명의 발명자는 대추, 특히 대추과육의 건강기능 효능을 밝히고 이를 이용한 식품 조성물을 개발하기 위해 오랜 기간 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 항산화 및 항염증 효능이 우수한 대추과육 주정추출물 및 이를 유효성분으로 포함하는 건강 기능성 조성물을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제들은 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 건강 기능성 조성물은, 전처리로서 열처리 및 효소처리를 거친 대추과육 주정추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 대추과육 주정추출물은: (1) 씨를 제거한 대추과육을 건조하고 분쇄하여 대추과육 분말을 제조하는 단계; (2) 물에 상기 대추과육 분말을 첨가한 후 일정 온도에서 열처리하는 단계; (3) 열처리 결과물에 완충용액을 넣은 후 효소를 넣고 효소처리하는 단계; 및 (4) 효소처리 결과물을 일정 농도의 주정으로 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.
상기 (3) 단계는 상기 열처리 결과물에 아세트산 완충용액을 넣은 후 Viscozyme L 효소를 첨가하여 효소처리하는 것이고, 상기 (4) 단계는 50% 주정으로 추출하는 것이 될 수 있다.
상기 대추과육 추출물은 항산화 효능을 가질 수 있다.
상기 대추과육 추출물은 항염증 효능을 가질 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 구체적인 내용 및 도면들에 포함되어 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 대추과육 주정추출물은 주정추출 전에 열처리 및 효소처리의 전처리 과정을 진행함으로써 향상된 항산화 및 항염증 효능을 가진다. 특히, 효소처리 과정에서 Viscozyme L 효소를 이용한 시험군에서 보다 우수한 항산화 및 항염증 효능이 확인되었다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 대추과육 추출물의 제조방법을 개념적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 대추과육 추출물의 제조방법을 개념적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 전처리 조건별 대추과육 추출물의 DPPH 라디컬 소거 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 전처리 조건별 대추과육 추출물의 FRAP 값을 측정한 그래프이다.
도 5a는 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5b는 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 A549 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 6은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 NO 생성량을 측정한 그래프이다.
도 7은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포에서의 염증성 사이토카인 분비 억제능을 측정한 그래프이다.
도 8은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물 처리 시 A549 세포 내 염증 지표 단백질의 발현 변화를 측정한 그래프이다.
도 9는 대추 추출물의 경구투여 후 혈장의 염증성 사이토카인 농도를 측정한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 대추과육 추출물의 제조방법을 개념적으로 나타낸 도면이다.
도 3은 전처리 조건별 대추과육 추출물의 DPPH 라디컬 소거 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 전처리 조건별 대추과육 추출물의 FRAP 값을 측정한 그래프이다.
도 5a는 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 5b는 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 A549 세포 생존율을 측정한 그래프이다.
도 6은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 NO 생성량을 측정한 그래프이다.
도 7은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포에서의 염증성 사이토카인 분비 억제능을 측정한 그래프이다.
도 8은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물 처리 시 A549 세포 내 염증 지표 단백질의 발현 변화를 측정한 그래프이다.
도 9는 대추 추출물의 경구투여 후 혈장의 염증성 사이토카인 농도를 측정한 그래프이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
본 발명의 건강 기능성 조성물은 항산화 및 항염증 효능이 우수한 대추과육 주정추출물을 유효성분으로 포함한다. 건강 기능성 유효성분의 추출율을 높이기 위해 주정 추출 전에 전처리(열처리 및 효소처리)를 진행하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 대추과육 분말을 80 내지 100℃에서 열처리 한 후, Viscozyme L 효소를 이용해 효소처리를 진행하고, 50% 주정 용액으로 추출할 경우 항산화 및 항염증 효능이 더욱 증진될 수 있다.
실시예 1. 대추과육 추출물의 제조
경상북도 경산에서 재배된 대추를 구입하여 사용하였으며, 추출물의 효능 증대를 위한 다양한 효소는 바이오시스에서 구입하였다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 대추과육 추출물의 제조방법을 개념적으로 나타낸 도면이다.
씨를 제거한 대추과육 10 g을 건조하고 분쇄하여 대추과육 분말을 제조하였다. 대추과육 분말에 다양한 농도(0, 20, 50, 80, 100%)의 주정 용매를 첨가하고 진탕배양기에서 55℃, 250 rpm으로 1시간동안 추출하였다. 이러한 추출물을 여과지(8-μm pore size)로 여과한 후 감압농축 및 동결건조 하여, 대추과육 주정추출물을 제조하였다.
실험예 1. 대추과육 추출물의 총 페놀 및 총 플라보노이드 함량 평가
<1-1> 총 페놀 함량 평가
Folin-Denis법을 응용하여 각 대추과육 주정추출물을 DMSO(dimethyl sulfoxide) 용액에 희석한 후 Folin 시약을 첨가하고, 잘 혼합하여 3분간 방치하였다. 여기에 10% Na2CO3를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 페놀 함량은 gallic acid 당량(gallic acid equivalent)으로 계산하였다.
<1-2> 총 플라보노이드 함량 평가
125 mg/mL 농도의 대추과육 추출물에 10% aluminium nirate과 1 M potassium acetate 및 ethanol를 차례로 가한 후 혼합하여 실온에서 40분간 방치하고 415 nm에서 흡광도를 측정하였다(Moreno et al., 2000). Quercetin (Sigma)을 표준물질로 사용하여 0-100 μg/mL 농도 범위에서 얻은 표준 검량선으로부터 대추과육 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하고, 그 결과를 quercetin 당량(quercetin equivalent)으로 계산하였다.
<1-3> 정량 평가 결과
이상과 같이 대추과육 추출물에 대한 총 페놀 함량 및 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 아래 표 1과 같다. 표 1은 추출 용매의 주정 농도별 대추과육 추출물의 총 페놀 및 총플라보노이드 함량을 나타낸 것이다.
다양한 농도의 주정 용매로 대추과육을 추출한 후 농도별 추출물의 총 페놀 함량을 측정한 결과, 50% 주정 추출물의 총 페놀 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다. 또한, 다양한 농도의 주정 용매로 대추과육을 추출한 후 농도별 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 50% 주정 추출물의 총 플라보노이드 함량이 가장 높은 것으로 확인되었다. 따라서 이후 생리활성이 향상된 대추과육 추출물을 얻기 위한 최적 추출조건 확립 실험에서는 50% 주정 추출 방법을 이용하였다.
실시예 2. 생리활성이 향상된 대추과육 추출물의 제조
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 대추과육 추출물의 제조방법을 개념적으로 나타낸 도면이다.
씨를 제거한 대추과육을 건조하고 분쇄하여 대추과육 분말을 제조하였다. 분쇄된 대추과육 분말 100g에 물 500ml를 첨가한 후 항온수조에서 95℃, 10분간 열처리를 수행하였다. 열처리 후 시료에 효소처리를 위한 완충용액을 추가하였다. 구체적으로 열처리 결과물(즉, 열처리된 시료)에 아세트산 완충용액(pH 5.0)을 추가하여 최종적으로 0.1 M 아세트산 완충용액농도가 되도록 제조한 후 다양한 효소를 넣고 효소처리를 수행하였다. 표 2는 본 실시예에 사용된 효소 종류와 효소처리량(건대추 100 g 기준)을 나타낸 것이다.
사용한 효소는 Viscozyme L (복합효소제로서 β-glucanase, cellulase, hemicellulase를 함유), Fungamyl 800L (α-amylase), AMG 300L (α-glucosidase)이며, 진탕배양기에서 55℃, 1시간동안 효소처리를 수행하였다.
효소처리 결과물에 주정을 첨가하여 전체적으로 50% 주정 용액이 되도록 제조한 후 55℃, 1시간 동안 추출하였다. 이러한 추출물을 여과지(8-μm pore size)로 여과한 후 감압농축 및 동결건조 하여, 최종적으로 전처리(열처리 및 효소처리)된 대추과육 주정추출물을 제조하여 시료로 사용하였다.
실험예 2. 생리활성이 향상된 대추과육 추출물의 정량 평가
<2-1> 총 페놀 함량 평가
Folin-Denis법을 응용하여 전처리(열처리, 효소처리)를 거친 대추과육 주정추출물을 DMSO 용액에 희석한 후 Folin 시약을 첨가하고, 잘 혼합하여 3분간 방치하였다. 여기에 10% Na2CO3를 첨가하여 실온에서 1시간 동안 방치한 후, 725 nm에서 흡광도를 측정하였다 이때 총 페놀 함량은 gallic acid 당량(gallic acid equivalent)으로 계산하였다.
표 3은 전처리 조건에 따른 대추과육 주정추출물의 총 페놀 함량을 나타낸 것이다. 여기서 사용된 시료는 (1) 전처리 없는 대추과육 50% 주정추출물, (2) 전처리로서 열처리만 거친 대추과육 50% 주정추출물, (3) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (4) 전처리로서 열처리와 효소처리(Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (5) 전처리로서 열처리와 효소처리(AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (6) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (7) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물로 구성된다.
<2-2> 총 플라보노이드 함량 평가
시료로 사용되는 125 mg/mL 농도의 대추과육 추출물에 10% aluminium nirate과 1 M potassium acetate 및 ethanol를 차례로 가한 후 혼합하여 실온에서 40분간 방치하고 415 nm에서 흡광도를 측정하였다(Moreno et al., 2000). Quercetin (Sigma)을 표준물질로 사용하여 0-100 μg/mL 농도 범위에서 얻은 표준 검량선으로부터 대추과육 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정하고, 그 결과를 quercetin 당량(quercetin equivalent)으로 계산하였다.
표 4는 전처리 조건에 따른 대추과육 주정추출물의 총 플라보노이드 함량을 나타낸 것이다. 여기서 사용된 시료는 (1) 전처리 없는 대추과육 50% 주정추출물, (2) 전처리로서 열처리만 거친 대추과육 50% 주정추출물, (3) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (4) 전처리로서 열처리와 효소처리(Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (5) 전처리로서 열처리와 효소처리(AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (6) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (7) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물로 구성된다.
<2-3> 정량 평가 결과
효소처리 없는 대추과육 주정추출물에 비해, 열처리 후 효소처리한 대추과육 주정추출물의 경우 전반적으로 총 페놀 함량이 증가함을 확인하였다. 특히, 효소처리 시에 β-glucanase, cellulase, hemicellulase 등의 복합 효소 활성을 갖는 Viscozyme L을 사용한 처리군의 경우, 다른 처리군(즉, 효소처리를 하지 않거나, 다른 효소를 사용하거나, 또는 다른 효소와 Viscozyme L을 함께 처리한 군)에 비해 총 페놀 함량이 크게 증가한 것을 확인하였다.
총 플라보노이드 함량의 경우, 효소처리 없는 대추과육 주정추출물에 비해 열처리 후 효소처리한 대추과육 주정추출물에서 유의적으로 높은 값을 가지는 것으로 확인되었다.
실험예 3. DPPH 라디컬 소거 활성 측정
항산화 활성은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용하여 시료의 라디컬 소거능(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois 방법(Blois MS. Antioxidant determination by the of a stable free radical. Nature. 1954; 181:1198-1200)을 사용하였다. 각 시료 50 μL와 DPPH 라디컬 용액 200 μL을 섞어 37℃에서 30분간 반응한 후 515nm에서 흡광도를 측정하였다. 여기서 사용된 시료는 (1) 전처리 없는 대추과육 50% 주정추출물, (2) 전처리로서 열처리만 거친 대추과육 50% 주정추출물, (3) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (4) 전처리로서 열처리와 효소처리(Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (5) 전처리로서 열처리와 효소처리(AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (6) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (7) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물로 구성된다.
표 5는 전처리 조건별 대추과육 추출물의 DPPH 라디컬 소거 활성을 측정한 표이다. 도 3은 표 5를 도식화한 그래프이다.
| 전처리 조건 | 농도 (mg/mL) |
DPPH radical scavenging activity (% of Control) |
|
| 열처리 | 효소처리 | ||
| No Heat | - | 1 | 12.78 ± 3.79 |
| 2 | 13.71 ± 3.95 | ||
| 4 | 27.66 ± 1.91 | ||
| 8 | 34.32 ± 12.4 | ||
| 16 | 35.37 ± 8.48 | ||
| 32 | 72.03 ± 2.91 | ||
| Heat | No Enzyme | 1 | 13.23 ± 1.49 |
| 2 | 13.94 ± 3.18 | ||
| 4 | 26.9 ± 3.38 | ||
| 8 | 46.52 ± 3.18 | ||
| 16 | 57.45 ± 1.92 | ||
| 32 | 75.98 ± 0.98 | ||
| Heat | Viscozyme (β-glucanase, cellulase, hemicellulase) |
1 | 18.39 ± 2.3 |
| 2 | 22.73 ± 7.51 | ||
| 4 | 36.81 ± 2.65 | ||
| 8 | 59.1 ± 3.6 | ||
| 16 | 65.41 ± 2.02 | ||
| 32 | 81.24 ± 1.68 | ||
| Heat | Fungamyl (α-amylase) |
1 | 20.15 ± 3.07 |
| 2 | 20.5 ± 0.76 | ||
| 4 | 28.17 ± 1.81 | ||
| 8 | 51.33 ± 1.46 | ||
| 16 | 68.31 ± 1.19 | ||
| 32 | 75.63 ± 1.16 | ||
| Heat | AMG (α-glucosidase) |
1 | 21.29 ± 1.55 |
| 2 | 21.93 ± 1.61 | ||
| 4 | 29.03 ± 1.55 | ||
| 8 | 50.98 ± 1.9 | ||
| 16 | 62.06 ± 1.17 | ||
| 32 | 66.17 ± 1.79 | ||
| Heat | V + F (β-glucanase + α-amylase) |
1 | 21.99 ± 1.63 |
| 2 | 23.91 ± 2.94 | ||
| 4 | 37.51 ± 2.84 | ||
| 8 | 64.23 ± 0.99 | ||
| 16 | 74.45 ± 1.84 | ||
| 32 | 77.51 ± 1.97 | ||
| Heat | V + A (β-glucanase + α-glucosidase) |
1 | 19.67 ± 5.77 |
| 2 | 20.4 ± 0.88 | ||
| 4 | 34.38 ± 1.24 | ||
| 8 | 63.34 ± 1.87 | ||
| 16 | 73.53 ± 1.91 | ||
| 32 | 80.95 ± 0.4 | ||
표 5 및 도 3을 참조하면, 전처리로 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물의 DPPH 라디컬 소거능이 가장 높은 것을 확인되었다. 다른 효소 처리군에서도 농도 의존적인 라디컬 활성이 나타났는데 이는 효소 처리에 의해 증가된 환원당들의 항산화 효과에 기인한 것이다.
실험예 4. FRAP value (항산화 지표) 측정
본 실험예에 따른 황산화 지표 측정은, 산성 pH 영역에서 ferric tripyridyltrizaine (Fe3+-TPTZ) 복합체가 환원성 물질에 의해 청색의 ferrous tripyridyl-triazine (Fe2+-TPTZ)으로 환원되어 593 nm의 흡광도가 증가하는 원리를 이용한 것으로, 대부분의 항산화제가 환원력을 가지고 있다는 점에 착안하여 고안된 실험방법이다(Benzie and Strain 1996). 170 μL 물에 7 μL 시료를 섞은 후, 30 μL FRAP 용액 (300 mM acetate buffer, 10 mM TPTZ solution, 20 mM FeCl3, distilled water)을 혼합하여 4 분간 반응시킨 후, 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료의 FRAP 값은 ferrous sulfate의 농도로 작성된 표준곡선에 외삽하여 구하였다. 여기서 사용된 시료는 (1) 전처리 없는 대추과육 50% 주정추출물, (2) 전처리로서 열처리만 거친 대추과육 50% 주정추출물, (3) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (4) 전처리로서 열처리와 효소처리(Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (5) 전처리로서 열처리와 효소처리(AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (6) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 Fungamyl 800L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물, (7) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L 및 AMG 300L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물로 구성된다.
표 6은 전처리 조건별 대추과육 추출물의 FRAP 값을 측정한 표이다. 도 4는 표 6을 도식화한 그래프이다.
| 전처리 조건 | 농도 (mg/mL) |
FRAP Value (mmol/L FeSO4) |
|
| 열처리 | 효소처리 | ||
| No Heat | - | 1 | 0.043 ± 0.01 |
| 2 | 0.06 ± 0.02 | ||
| 4 | 0.082 ± 0.04 | ||
| 8 | 0.15 ± 0.05 | ||
| 16 | 0.252 ± 0.06 | ||
| 32 | 0.316 ± 0.02 | ||
| Heat | No Enzyme | 1 | 0.064 ± 0.03 |
| 2 | 0.098 ± 0.04 | ||
| 4 | 0.089 ± 0.01 | ||
| 8 | 0.159 ± 0.04 | ||
| 16 | 0.319 ± 0.03 | ||
| 32 | 0.344 ± 0.07 | ||
| Heat | Viscozyme (β-glucanase, cellulase, hemicellulase) |
1 | 0.072 ± 0.03 |
| 2 | 0.102 ± 0.03 | ||
| 4 | 0.119 ± 0.03 | ||
| 8 | 0.237 ± 0.04 | ||
| 16 | 0.402 ± 0.05 | ||
| 32 | 0.503 ± 0.02 | ||
| Heat | Fungamyl (α-amylase) |
1 | 0.039 ± 0 |
| 2 | 0.058 ± 0.01 | ||
| 4 | 0.084 ± 0.01 | ||
| 8 | 0.134 ± 0.01 | ||
| 16 | 0.213 ± 0.01 | ||
| 32 | 0.285 ± 0.03 | ||
| Heat | AMG (α-glucosidase) |
1 | 0.055 ± 0.01 |
| 2 | 0.071 ± 0.01 | ||
| 4 | 0.118 ± 0.02 | ||
| 8 | 0.168 ± 0.02 | ||
| 16 | 0.276 ± 0.02 | ||
| 32 | 0.408 ± 0.03 | ||
| Heat | V + F (β-glucanase + α-amylase) |
1 | 0.06 ± 0.01 |
| 2 | 0.091 ± 0.01 | ||
| 4 | 0.134 ± 0.01 | ||
| 8 | 0.216 ± 0.02 | ||
| 16 | 0.3 ± 0.04 | ||
| 32 | 0.521 ± 0.03 | ||
| Heat | V + A (β-glucanase + α-glucosidase) |
1 | 0.05 ± 0.02 |
| 2 | 0.078 ± 0.03 | ||
| 4 | 0.109 ± 0.02 | ||
| 8 | 0.14 ± 0.01 | ||
| 16 | 0.126 ± 0.01 | ||
| 32 | 0.568 ± 0.03 | ||
도 4 및 표 6을 참조하면, 전처리로 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물의 FRAP 값(ferric reducing ability)이 가장 높은 것으로 확인되었다. 즉, 단순히 대추과육을 주정 용매로 추출하는 것보다, 대추과육을 열처리 및 효소처리(Viscozyme L) 한 후 50% 주정 용매로 추출할 경우, 항산화 물질을 효과적으로 추출할 수 있다. 이러한 추출 방법을 가공식품 베이스 제조에 활용하면 기능성이 강화된 대추 음료 또는 잼을 제조할 수 있다.
실험예 5. 대추과육 추출물의 항염증 효능 평가 (
in vitro
)
항염증 효능 평가는 다음과 같은 대추과육 추출물을 시료로 사용하였다.
(1) 전처리 없는 대추과육 50% 주정추출물(이를 'No Heat'라 함)
(2) 전처리로서 열처리만 거친 대추과육 50% 주정추출물(이를 'Heat'라 함)
(3) 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물(이를 'Heat + Enzyme'이라 함)
<5-1> 세포 배양
사람 유래 대식세포인 THP-1 세포와 사람 유래 폐암 세포인 A549 세포를 한국세포주 은행에서 구입하여, DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Invitrogen)에 10% heat-inactivated FBS(fetal bovine serum)와 1% penicillin-streptomycin (Welgene)이 함유된 배지로 배양하였다. 37℃ 온도에서 5% CO2, 95% 산소 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.
<5-2> 대추과육 추출물의 세포 독성 평가
사람 유래 대식세포인 THP-1 세포와 사람 유래 폐암 세포인 A549 세포를 96-well plate에 5 × 103 개/well로 분주한 후, 0-500 μg/mL 농도의 대추과육 추출물을 24시간 처리하였다. 각 대추과육 추출물은 62.5, 125, 250, 및 500 μg/mL의 농도로 처리하였다.
세포 독성은 Cell counting kit (CCK-8; Dojindo laboratories)를 이용하여 생존 세포의 비율을 측정하여 평가하였다.
표 7은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포 생존율을 측정한 표이다. 도 5a는 표 7을 도식화한 그래프이다.
표 8은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 A549 세포 생존율을 측정한 표이다. 도 5b는 표 8을 도식화한 그래프이다.
표 7, 표 8, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, 3가지 종류의 대추과육 추출물은 모두 500 μg/mL 이하의 농도에서 THP-1 및 A549 세포에 독성을 보이지 않았다. 따라서 이후의 세포 실험에서는 대추과육 추출물을 500 μg/mL 이하의 농도로 처리하여 효능을 평가하였다.
<5-3> 염증 지표 NO(Nitric Oxide) 생성량 측정
마우스 유래 대식세포인 Raw 264.7 세포를 2 × 104 cells/mL의 농도로 96-well plate에 분주한 후, 24시간 배양하였다. 세포로부터 NO의 생성 및 분비는 1 μg/mL의 LPS로 유도하였다. 각 대추과육 추출물은 62.5, 125, 250, 및 500 μg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 후 배양액을 회수하여, Griess reagent system kit (Promega)를 이용하여 NO 농도를 측정하였다.
표 9는 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 NO 생성량을 측정한 표이다. 도 6은 표 9를 도식화한 그래프이다.
표 9 및 도 6에 나타난 바와 같이, 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물의 NO 레벨 저해능이 가장 높은 것으로 확인되었다.
<5-4> Pro-inflammatory cytokine 분비량 측정
THP-1 human monocytes (4 × 106 cells/mL)를 100-mm plate에서 24시간 배양 후, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA, 200 nM)를 처리하여 단핵구 세포로부터 대식세포로의 분화를 유도하였다. TPA 처리와 함께, 각 대추과육 추출물을 500 μg/mL의 농도로 처리하였다. 24시간 후, 배양액을 회수하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 사이토카인(cytokine) 농도를 ELISA kit (Human ELISA set. R&D system, Minneapolis, USA)를 이용하여 측정하였다.
표 10은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물의 THP-1 세포에서의 염증성 사이토카인 분비 억제능을 측정한 표이다. 도 7은 표 10을 도식화한 그래프이다.
표 10 및 도 7에 나타난 바와 같이, 전처리로서 열처리와 효소처리(Viscozyme L)를 거친 대추과육 50% 주정추출물의 경우, THP-1 대식세포에서 TNF-α와 IL-6 분비량이 유의적으로 감소되었다(p < 0.1).
<5-5> 대추과육 추출물 처리에 따른 염증 지표 단백질의 발현 변화
THP-1 human monocytes (4 × 106 cells/mL)와 A549 Human lung epithelial cells (2 × 106 cells/mL)를 100-mm plate에 분주하였다. THP-1 세포에 200 nM TPA 및 500 μg/mL 대추과육 추출물을 24시간 처리한 후, 배양액을 회수하여 A549 세포에 처리하였다. 24시간 후, A549 세포를 수집하여 lysis buffer (Tris-HCl 20 mM, NaCl 145 mM, glycerol 10%, EDTA 5 mM, Triton-X 1% and Nonidet 0.5%)로 단백질을 추출하였다. Western blot analysis로 염증 지표 단백질 (nuclear NF-κB (p65), COX-2, iNOS)의 발현을 분석하였다.
도 8은 전처리 조건별 대추과육 주정추출물 처리 시 A549 세포 내 염증 지표 단백질의 발현 변화를 측정한 그래프이다.
도 8에 도시된 바와 같이, 열처리 및 효소처리(Viscozyme L) 후 추출한 대추과육 50% 주정추출물의 경우 A549 세포 내 염증 지표 단백질(iNOS와 NF-κB)의 발현량이 유의적으로 감소되었다(p < 0.1). 즉, 대추과육 추출물은 세포 수준에서 소정의 항염증 효과를 나타내었고, 전처리(열처리 및 효소처리)에 의해 그 항염증 효과가 현저하게 증가되는 것이 관찰되었다.
실험예 6. 마우스 모델을 이용한 대추과육 추출물의 항염증 효능 평가 (
in vivo
)
<6-1> Benzo(a)pyrene에 의한 염증 유발 마우스 모델 확립
앞서 세포 모델계에서 가수분해된 대추과육 추출물의 항염증 효능을 확인하였고, 본 실험에서는 동물모델계에서 그 효능을 검증하고자 한다.
5주령 수컷 C57BL/6J 마우스는 효창 사이언스에서 구입하여 사용하였고, 실험은 경북대학교 생명윤리심사위원회 가이드라인(승인번호 KNU 2019-0157)에 따라 진행하였다. 본 항염증 효능 평가는 다음과 같은 대추과육 주정추출물을 시료로 사용하였다.
(1) 가수분해 하지 않은 대추과육 주정추출물 (non-hydrolyzed jujube ethanol extract, 이를 'NHJE'라 함)
(2) 가수분해된 대추과육 주정추출물 (hydrolyzed jujube ethanol extract, 이를 'HJE'라 함)
시료를 vehicle에 용해하여, 0.75 또는 1.5 g/kg body weight (BW) 농도로 16일 간 매일 마우스에 경구투여(p.o.)하여 급여하였다. Vehicle은 5% (v/v) ethanol, 5% (v/v) Tween-80, 90% (v/v) sterilized drinking water로 이루어진다. 염증은 실험 종료 24시간 전, corn oil에 용해한 benzo(a)pyrene (B(a)P)을 50 mg/kg body weight(BW) 농도로 1회 마우스에 복강주사(i.p.)하여 유발하였다.
표 11은 본 실험예에 사용된 폐 염증 실험 동물 그룹을 나타낸 것이다.
위 표에서 Group 1은 B(a)P 대신 Corn oil을 복강주사한 처리군이고, Group 2는 B(a)P를 복강주사한 처리군이고, Group 3는 대추 주정추출물을 0.75 g/kg BW 농도로 급여(이를 'NHJE-L'라 함)한 후 B(a)P를 복강주사한 처리군이고, Group 4는 대추 주정추출물을 1. 5 g/kg BW 농도로 급여(이를 'NHJE-H'라 함)한 후 B(a)P를 복강주사한 처리군이고, Group 5는 가수분해된 대추 주정추출물을 0.75 g/kg BW 농도로 급여(이를 'HJE-L'라 함)한 후 B(a)P를 복강주사한 처리군이고, Group 6는 가수분해된 대추 주정추출물을 1.5 g/kg BW 농도로 급여(이를 'HJE-H'라 함)한 후 B(a)P를 복강주사한 처리군이다.
<6-2> 대추 추출물의 pro-inflammatory cytokines 분비 억제 효능 분석
16일차에 실험을 종료한 후, 마우스의 혈액을 수집하여 혈장 내 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 양을 ELISA kit (Mouse ELISA set. BD Biosciences, California, USA)를 이용하여 측정하였다.
ELISA 분석용 microplate를 포획항체(capture antibody)로 코팅한 후, 0.05% Tween-20을 포함하는 PBS(phosphate-buffered saline)로 세척하고, assay diluent 용액으로 블로킹(blocking)하였다. 다시 세척 후, 수집한 혈장을 각 well에 분주하고 2시간 반응시켰다. 세척 후, anti-mouse detection antibody와 streptavidin-horseadish peroxidase conjugate를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 세척 후, σ-phenylenediamine 용액을 첨가하여 실온에서 20분간 암반응 시켰다. 2N H2SO4로 반응을 종료시킨 후, microplate reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
표 12는 대추 추출물의 경구투여 후 혈장의 염증성 사이토카인 농도를 측정한 표이다. 도 9는 표 12를 도식화한 그래프이다.
표 12 및 도 9에 나타난 바와 같이, B(a)P 복강주사로 염증이 유발된 마우스에서는 혈장의 염증성 사이토카인 TNF-α와 IL-1β 농도가 증가되었다. 그러나, 가수분해 대추 추출물을 높은 농도(HJE-H)로 경구투여 시 다른 처리군과 비교하여 TNF-α와 IL-1β의 농도가 유의적으로 감소되었다. 즉, 가수분해 하지 않은 대추과육 주정추출물에서는 이와 같은 항염증 효능이 나타나지 않았으나, 열처리 및 효소처리에 의해 가수분해 된 대추과육 주정 추출물은 항염증 효능 물질을 포함하는 것으로 확인되었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (3)
- 전처리로서 열처리 및 효소처리를 거친 대추과육 주정추출물을 유효성분으로 포함하는 건강 기능성 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 대추과육 주정추출물은: (1) 씨를 제거한 대추과육을 건조하고 분쇄하여 대추과육 분말을 제조하는 단계; (2) 물에 상기 대추과육 분말을 첨가한 후 일정 온도에서 열처리하는 단계; (3) 열처리 결과물에 완충용액을 넣은 후 효소를 넣고 효소처리하는 단계; 및 (4) 효소처리 결과물을 일정 농도의 주정으로 추출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 건강 기능성 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 (3) 단계는 상기 열처리 결과물에 아세트산 완충용액을 넣은 후 Viscozyme L 효소를 첨가하여 효소처리하는 것이고,
상기 (4) 단계는 50% 주정으로 추출하는 것을 특징으로 하는 건강 기능성 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190162943A KR20210072543A (ko) | 2019-12-09 | 2019-12-09 | 대추과육 추출물을 이용한 건강 기능성 조성물 |
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|---|---|
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN114521651A (zh) * | 2022-02-21 | 2022-05-24 | 沧州恩际生物制品有限公司 | 一种利用红枣萃取工艺提取的新款红枣提取液 |
-
2019
- 2019-12-09 KR KR1020190162943A patent/KR20210072543A/ko not_active IP Right Cessation
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