CN105482129A

CN105482129A - 抗癌萃取物及化合物

Info

Publication number: CN105482129A
Application number: CN201510270529.XA
Authority: CN
Inventors: 黄奇英
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-09-30
Filing date: 2011-09-30
Publication date: 2016-04-13
Anticipated expiration: 2031-09-30
Also published as: CN103269706A; US20160051608A1; TWI444194B; JP2015212298A; CN103269706B; JP5902174B2; TW201219047A; US9132158B2; WO2012041256A1; US20120259004A1; US20150132411A1; US9511104B2; US8686030B2; JP2013544766A; CN105482129B

Abstract

本发明公开了抗癌萃取物及化合物。具体地，本发明关于治疗癌症或纤维化，如肝细胞癌、或肝纤维化的新颖方法，为使用从缟瓣属(Graptopetalum？sp.)、红景天属(Rhodiola？sp.)或石莲花属(Echeveria？sp.)植物中所得的萃取物，以及藉由二甲基亚砜(DMSO)萃取该植物，从该萃取物所分离的分液或化合物。

Description

抗癌萃取物及化合物

本申请是申请号为201180047555.6，申请日为2011年9月30日，发明名称为“抗癌萃取物及化合物”的中国专利申请的分案申请。

技术领域

本发明为关于自植物中萃取的具有抗癌活性的新颖萃取物及新颖化合物。

背景技术

石莲(Graptopetalumparaguayense，GP)为一种中国传统中草药，且对于健康有多种帮助。根据其古老的中国处方，GP被认为具有多种有益效用，如：缓和肝的病症、降低血压、美白、缓解疼痛及感染、抑制发炎及改善脑部的功能。

于研究中发现，GP的叶子萃取物可抑制酪胺酸酶及血管收缩素转化酶的活性，以及于体外试验中可清除自由基(Chen,S-J等,石莲(GraptopetalumparaguayenseE.Walther)萃取物于血管收缩素转化酶的抑制效果的研究。FoodChemistry100:1032-1036,2007；Chung,Y-C等,石莲(GraptopetalumparaguayenseE.Walther)的抗氧化活性的研究。FoodChemistry91:419-424,2005；及Huang,K-F等,石莲(GraptopetalumparaguayenseE.Walther)萃取物于菇类酪胺酸酶的抑制效果的研究FoodChemistry89:583-587,2005)。另外，发现GP的水、及50％乙醇的、及95％乙醇的茎部萃取物具有抗氧化活性，该等萃取物亦以人类HCC细胞株(HepG2)的增生作用，进行抑制效果的分析(Chen,SJ等,石莲的茎部萃取物于体外试验的抗氧化活性及抗增生活性AmJChinMed36:369-383,2008)。体内试验研究证明GP的叶子萃取物可抑制小神经胶质细胞活化、氧化压力及iNOS表现，以降低缺血性脑损伤(Kao,TK等,石莲(GraptopetalumparaguayenseE.Walther)的叶子萃取物于缺血性老鼠中可保护、抵抗脑损伤AmJChinMed38:495-516,2010)。

由Hsu等人于2004年申请的美国专利(专利号：7,364,758)，其的体内及体外试验中石莲乙醇萃取物具有抗肝纤维化及抗发炎功效于2008年被授予专利。接着，其的部分连续申请案(美国专利号7,588,776)于2008年提出申请，并于2009年授予专利，其发现石莲水溶性分液对于肝病或肝状况，如发炎、脂肪变性、及纤维化，具有治疗效果。

发明内容

本发明关于从植物中所分离的一种新颖萃取物及其分液及新颖化合物；该植物尤其是指缟瓣属(Graptopetalumsp)的植物。本发明亦提供一种使用该新颖萃取物或新颖化合物以治疗癌症的新颖方法，该癌症尤其是指肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma，HCC)。

在一方面，本发明提供一种具有抗癌活性的萃取物，该萃取物是以二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)从植物中萃取，该植物是选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)及石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组。在本发明中不可预期地发现了该DMSO萃取物具有抗癌活性。

于本发明的一具体实施例中，该植物为石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)。于本发明的一实例中，藉由30％DMSO萃取该植物以取得该萃取物。

另一方面，本发明提供来自植物的含有丰富抗癌成分的分液，该植物为选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)及石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组；尤其为石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)；该分液是藉由二甲基亚砜(DMSO)萃取该植物，并藉由色层分析分离而制备得的分液，称为HH-F3，该分液具有细胞毒杀作用，及于癌细胞中向下调控AURKA、AURKB、及FLJ10540的表现的效果。

本发明的一具体实施例中，使用SephadexLH-20管柱作为层析管柱。根据本发明，该分液具有高度的细胞毒杀效果，以及于Huh7及HepG2细胞中，具有向下调控AURKA、AURKB、及FLJ10540的表现的效果。

于分液HH-F3的机转研究方面，发现分液HH-F3可诱发HCC进行细胞凋亡。换句话说，分液HH-F3对于癌细胞，尤其是HCC，具有疗效。

又一方面，本发明提供一化合物，该化合物具有下式I的结构式，

式I

其中R中有一者为H或原花青素(prucyanidin，PC)单元；而其他的R为OH或原飞燕草素(prodelphindine，PD)单元；n为从21至38的数字；且PC单元：PD单元<1:20。该原花青素(PC)单元的结构为

以及该原飞燕草素(PD)单元的结构为

根据本发明，具有式I结构式的化合物可分离自植物，该植物是选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)或石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组。本发明的一具体实施例中，该化合物是从石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)的分液中纯化而得。具有式I结构式的化合物被发现富含3,4,5-三羟基苯甲基部份(moieties)且具抗癌活性。

又另一方面，本发明提供一组合物或一医药组合物，其包含本发明的萃取物、分液或化合物，及医药上可接受的载剂。再者，该医药组合物具有抗癌活性，其可用以有效预防或治疗癌症，如：肝癌，尤其是HCC。

再一方面，本发明提供该萃取物、该分液或具有式I结构式的化合物于制备用以治疗癌症(尤其是HCC)的医药的用途。

又一方面，本发明提供一种预防或治疗癌症的方法，其包含投与治疗有效量的本发明的萃取物、分液或化合物至有需求的对象。在本发明一实例中，该癌症为HCC。

附图说明

本发明前述的发明内容，以及的后的详细说明，于阅读时可配合图示以更加了解。为了阐述本发明，所呈现的图示为具体实施例中较佳的呈现方式。需明了的是，本发明并不受限于该等具体实施例，或其呈现的图示。

于图示中：

图1提供本发明的分液HH-F3的HPLC图谱，其中该层析图谱及该梯度冲提曲线分别以X线及Y线表示。

图2中显示本发明的分液HH-F3于增加细胞毒杀作用的功效；其中图2(A)图显示于Huh7细胞的效果，及图2(B)图显示于Mahlavu细胞的效果；将自不同溶剂所制得的萃取物进行比较；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)细胞为以自水、丙酮、甲醇、100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、100％DMSO、及30％DMSO制备的GP萃取物，以100、150、250、500、750、1000、及1500μg/ml的浓度处理72小时，接着将该等细胞进行MTT分析。于该等萃取制备物中，该30％DMSO的GP萃取物，于72小时时，具有明显抑制Huh7及Mahlavu细胞存活性的功效。

图3中显示本发明的分液HH-F3，于HSC-T6(A)、及HepG2及Huh7细胞((B)及(C))的间期(interphase)及M期中，可降低许多有丝分裂调控子的降解；其中(A)HSC-T6细胞是以30％DMSOGP萃取物处理。将细胞溶解物以抗Flj10540及抗Aurkb抗体进行免疫墨点法分析；(B)HepG2及Huh7细胞是以不同浓度的30％DMSOGP萃取物处理，及将细胞溶解物以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗体，进行免疫墨点法分析。(C)HepG2及Huh7细胞是以75ng/ml诺可达唑(nocodazole，NOC)处理16～18小时。经过同步剂(synchronizingagent)前处理后，该等细胞遂以750μg/ml30％DMSOGP萃取物或空白对照组(30％DMSO)再处理3小时；再以抗FLJ10540、抗AURKA、及抗AURKB抗体进行西方墨渍法；下列数点需特别注意：(1)相较于位于间期的细胞，AURKA、AURKB、及FLJ10540可于有丝分裂的细胞中高度表现；及(2)经过30％DMSOGP萃取物处理后，可抑制于间期及中期(metaphase)的AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表现程度。

图4中显示本发明的分液HH-F3于HCC细胞株：Huh7细胞(A)、及HepG2及Huh7细胞(B)，的抑制AURKA蛋白表现的效果；其中(A)Huh7细胞是以500μg/ml浓度的GP萃取物处理48小时；该等GP萃取物是从水、丙酮、甲醇、100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、100％DMSO、及30％DMSO所制得；显示以30％DMSOGP萃取物处理后，可抑制AURKA的表现程度；(B)于HepG2及Huh7细胞中，AURKA、AURKB、及FLJ10540的表现程度无法被水及BuOH分液所抑制。

图5中显示本发明的分液HH-F3于两个HCC细胞株：Huh7细胞(A)及Mahlavu细胞(B)中所造成的细胞毒杀的时间及剂量相关性的反应；其中Huh7(A)及Mahlavu(B)细胞是以30％DMSOGP萃取物，于0、250、500、750、及1000μg/ml的浓度处理24、48及72小时，接着进行MTT分析。由30％DMSOGP萃取物于Huh7及Mahlavu细胞所造成的生长抑制的IC50值，于48小时，分别约为500及250μg/ml。

图6中显示不同的GP纯化分液于HCC细胞株中的AURKA蛋白表现的效果；包含图6(A)图阐述本发明的GP萃取物及分液HH-F3的纯化方式；图6(B)图显示HepG2细胞是以30％DMSOGP萃取物，HH-F1、HH-F2、HH-F3、及HH-F4，处理3小时。结果显示，于HepG2细胞处理HH-F1、HH-F2、及HH-F4分液，无法抑制AURKA及AURKB表现程度；图6(C)图显示经过30％DMSOGP萃取物及HH-F3分液的处理后，可抑制AURKA的表现；以及图6(D)图显示经过HH-F3a分液的处理后，可抑制AURKA的表现。

图7中显示本发明的分液HH-F3于抑制Huh7细胞(A、E)、Mahlavu细胞(B、F)、PLC5细胞(C、G)、及HSC-T6细胞(D)的细胞存活性的效果；其中Huh7(A、E)、Mahlavu(B、F)、PLC5(C、G)、及HSC-T6(D)细胞是以HH-F3分液，于5、25、50、及75μg/ml的浓度，处理24、48、及72小时，之后接着进行MTT分析(A至D)及台酚蓝(trypanblue)分析(E至F)。于Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6细胞中，经由HH-F3分液处理，所造成的细胞存活性抑制效果的IC50值，经过处理72小时后，分别约为50、37.5、75、及20μg/ml。

图8中显示该HH-F3分液，于HCC细胞株中，可向下调控AURKA及FLJ10540，以及活化肝脏星状细胞；包含图8(A)图显示Huh7、Mahlavu、及PLC5细胞是以HH-F3分液，于25、50、或75μg/ml的浓度，处理3小时。藉由使用抗FLJ10540及抗AURKA抗体以进行免疫墨点法分析，AURKA及FLJ10540两者的表现是以浓度依存方式被向下调控；以及图8(B)图显示HSC-T6细胞是以HH-F3分液，于5、15、或50μg/ml的浓度处理3小时，Flj10540的表现是以浓度依存方式被向下调控。

图9中显示分液HH-F3于HCC细胞株造成细胞凋亡的效果；其中Huh7及Mahlavu细胞是以5、25、及50μg/mlHH-F3处理48小时；图9上图及图9下图显示经过HH-F3分液处理24及48小时(图9上图)及48小时(图9下图)，该细胞溶解物遂进行免疫墨点法分析抗切割的硫胱氨酸蛋白酶-3(anti-cleavedcaspase-3)及切割的PARP(cleavedPARP)(图9上图)以及抗FAS、抗Bcl-2、及抗Bcl-xL(图9下图)，结果显示抗切割的硫胱氨酸蛋白酶-3、切割的PARP及FAS的表现程度提高了，而Bcl-2及Bcl-xL则是下降，此显示细胞已进行细胞凋亡。

图10中显示该分液HH-F3于降低粒线体的膜电位，以及于HCC细胞株中增加ROS的生成；包含图10(A)图及图10(B)图是以JC-1粒线体膜电位分析法来分析Huh7及Mahlavu细胞的粒线体膜电位(ΔΨ)，结果显示经过分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml浓度处理48小时后(n＝2)，该等细胞的ΔΨ降低了(RFU＝ΔΨ)；图10(C)图及图10(D)图是以氢化乙啡啶(hydroethidine，HE)染色法测量细胞内的超氧化物(O2-)的程度，结果显示经过分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml浓度处理48小时后，相较于对照组的HCC细胞(Huh7及Mahlavu细胞以DMSO处理)，经过分液HH-F3处理后的细胞内的超氧化物(O2-)的程度下降了；以及图10(E)图及图10(F)图是以DCFH测量细胞内过氧化物的程度，结果显示经过分液HH-F3，以5、10、15、25、及50μg/ml浓度处理48小时后，相较于对照组的HCC细胞(Huh7及Mahlavu细胞以DMSO处理)，细胞内过氧化物程度增加了，且发现经过分液HH-F3处理后的Huh7及Mahlavu细胞，其细胞内的过氧化物及超氧化物的生成，是随着剂量相关性方式增加。

图11显示该分液HH-F3于Huh7细胞中抑制AKT-Ser473磷酸化及活化PTEN蛋白表现的效果；经过分液HH-F3于25、50、或75μg/ml浓度处理48小时后，以抗FLJ10540、抗AURKA、抗AKT-Ser473、及抗PTEN抗体进行免疫墨点分析；结果显示AURKA、FLJ10540、AKT-Ser473的表现是向下调节的(减少的)；然而PTEN则是随着浓度相关性方式向上调节的(增加的)。

图12中显示本发明的GP萃取物及分液HH-F3于降低硬化病变肝中羟脯胺酸的含量及肿瘤负荷的功效；其中将试验动物分为四组；如同材料及方法所述，其中一组是仅给予自来水(正常组)或给予DEN溶液(另一组)；图12(A)图显示于硬化病变的动物中，其胆汁流速减低了，其可被纪录以测量肝功能(*P<0.05；ANOVA)；图12(B)图显示于硬化病变的动物中，其脾脏的大小变大了；其中测量脾脏的重量及体重(bodyweights，BWs)，并以脾脏重量/BW表示；相较正常组，该DEN组的脾脏重量/BW比例明显较高；此显示脾肥大是因硬化病变相关的门脉高血压所导致(P<0.05，ANOVA)；然而仅高剂量组的脾脏重量/BW比例是明显低于该等DEN组别者(P<0.05，ANOVA)；图12(C)图显示于硬变肝中的胶原蛋白含量增加；其中肝硬化病变是藉由肝的羟脯胺酸含量测量，且当将高剂量组、HH-F3组及对照组相比较时，可观察到羟脯胺酸含量明显降低；图12(D)图显示由DNE诱导的α-SMA的表现程度。于DEN处理过程中，每一组肝样本的福尔马林/石蜡切片以抗α-SMA抗体进行染色，再以数字相机系统于10倍视野下观察最深的染色区域来判别α-SMA(+)区域所占的百分比(*P<0.05；**P<0.005，ANOVA)；图12(E)图显示由DEN所诱导的氧化压力。NBT(氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazoliumbluechloride))为一种染剂，当接触到超氧化物时，该染剂会被还原成不可溶的蓝色甲瓒(formazan)衍生物，且该蓝色沈淀物可做为一组织学上的指针，并藉由光学显微镜可判别出组织中超氧化物的存在，即可判别NBT(+)聚集的密度；如同材料及方法所述，于10倍视野下观察最深的染色区域以判别；图12(F)图显示肿瘤负荷的测量，其中该些肝脏是取自牺牲的动物，并将该等肝脏切成5-mm切片，并计数及测量所有直径大于3mm的可视肿瘤结节的数量及大小。肿瘤负荷是以所有肿瘤结节的体积总和表示(**P<0.005，***P<0.001相较于DEN组)；以及图12(G)图显示化学诱导的HCC及硬化病变的外观图，其中经过添加DEN于饮用水中，并以口服投与9周的老鼠，导致于其硬变肝脏中出现许多的肝肿瘤，以及可观察到于该些动物的表面有肉芽的形成，以及不均质边界的多个肝肿瘤的形成。

图13中显示红景天(Rhodiolarosea)萃取物于抑制HCC细胞株的细胞存活性，及向下调节AURKA蛋白表现的功效。

具体实施方式

除非有其他的定义，本文所使用的技术性及科学性术语的意义，与该领域具有通常技艺者一般理解的意义相同。

除非上下文中另有清楚指出，否则本文所用的单数形“一(a)”、“一(an)”及“该(the)”包含复数形式。因此，举例而言，当指出为“一样本(asample)”，对于该领域具有通常技艺者可知为包含复数的样本及其同等物。

本发明提供从植物中以DMSO萃取的新颖萃取物(简称为GP萃取物)，该植物选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)或石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组。本发明中不可预期地发现了该GP萃取物具有抗癌活性。

根据本发明，该萃取物可藉由二甲基亚砜(DMSO)以现有技艺中常用方法或标准方法萃取植物以制得。在本发明一实例中，将该植物的叶子磨碎并冻干为粉末，再与DMSO进行剧烈震荡(vortex)，较佳为30％DMSO。于以DMSO萃取前，可使用甲醇(MeOH)进一步萃取。

于本文所用的术语“缟瓣属(Graptopetalum)”，是指任何属于缟瓣属(Graptopetalum)的植物或其一或多部分。多于一种(species)的缟瓣属(Graptopetalum)的组合、或其部分亦可被考虑。该缟瓣属(Graptopetalum)较佳为石莲(Graptopetalumparaguayense)。

于本文所用的术语“红景天属(Rhodiola)”，是指任何属于红景天属(Rhodiola)的植物、或部分或其部分。多于一种(species)的红景天属(Rhodiola)的组合、或其部分亦可被考虑。该红景天属(Rhodiola)较佳为红景天(Rhodiolarosea)。

于本文所用的术语“石莲花属(Echeveria)”，是指任何属于石莲花属(Echeveria)的植物、或部分或其部分。多于一种(species)的石莲花属(Echeveria)的组合、或其部分亦可被考虑。该石莲花属(Echeveria)较佳为石莲(Echeveriapeacockii)。

本发明的一较佳具体实施例中，该植物为石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)。

于本文所用的术语“萃取物”，是指藉由将物质与溶剂浸泡或混合以萃取而得的溶液。于本发明中，该萃取物为DMSO萃取物。

本发明亦提供从植物中取得的含有丰富抗癌成分的分液，该植物是选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)及石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组；该分液是藉由二甲基亚砜(DMSO)萃取该植物，并藉由色层分析以分离取得的分液，称为HH-F3。于本发明的一实例中，该植物为石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)。该分液是藉由DMSO萃取该植物，并藉由色层分析以分离取得分液，称为HH-F3。于本发明一实例中，色层分析是使用SephadexLH-20管柱。发现该分液具有细胞毒杀效果，以及于癌细胞中，特别是HCC细胞株，如Huh7及HepG2细胞中，具有向下调控AURKA、AURKB及FLJ10540表现的效果。于分液HH-F3的机转研究方面，发现分液HH-F3可诱发HCC进行细胞凋亡。因此，该分液HH-F3为一种具潜力的治疗剂，可用以预防或治疗癌症，尤其是肝癌，如HCC。

根据本发明的一实例，藉由将分液HH-F3进行透析获得的一种次分液(sub-fraction)，称为HH-F3a。接着，从HH-F3a分液中分离活性化合物，其与已知的原花色素(proanthocyanidin)化合物不同。该所得的化合物为富含3,4,5-三羟基苯甲基部份的原花色素。该化合物具有下式I的结构式，

式I

以及该原飞燕草素(PD)单元的结构为

因此，本发明提供式I化合物，其被证明具有抗癌活性。于本发明的一实例中，该具有式I的化合物可从缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)或石莲花属(Echeveriasp.)植物中以DMSO萃取得到DMSO萃取物。透过西方墨渍法分析AURKA的向下调控表现情形以筛选DMSO萃取物，并透过透析及进一步纯化得到称为“HH-F3”的次分液。

本发明提供一种医药组合物，其包含治疗有效量的本发明的萃取物、分液或式I化合物，及医药上可接受的载剂。

于本文所用的术语“治疗有效量”，是指药剂的量足以达成所欲的治疗目的。例如，治疗HCC的石莲花有效量为足以杀死HCC细胞的剂量。给予药剂的治疗有效量可能会随着不同因子而有所不同，诸如药剂的本质、投与方式、动物的大小及种类、及投与目的皆会对治疗有效量有所影响。每一个体案例的治疗有效量可以藉由熟谙技艺的技能者，根据本发明所揭露者及现有技艺所建立的方法，以经验决定。

本发明的医药组合物可藉由任何适用的路径投与，包含但不限于非经口服的或经口服的投与方式。该用于非经口服的医药组合物包含溶液、悬浮液、乳化液、及固态的可注射的组合物，其在使用前可用溶剂立刻溶解或悬浮。该注射型可藉由将一种或多种的活性成分溶解、悬浮、或乳化于稀释剂中以制得。该等稀释剂的例子为用于注射的蒸馏水、生理食盐水、植物油、酒精及其组合。再者，该注射型可能包含稳定剂、助溶剂、悬浮剂、乳化剂、缓和剂、缓冲液、保存剂等。该注射型于最后的制备步骤是经灭菌的、或以无菌步骤制得。本发明的医药组合物亦可制备成无菌的固态制备物，例如，藉由冷冻干燥，且可在灭菌后使用、或于使用前立速溶于无菌的可注射水或其他无菌的稀释剂中以使用。

根据本发明，该组合物亦可透过口服路径投与，其中该组合物可为固态或液态。该固态组合物包含片剂、丸剂、囊剂、分散的粉剂、颗粒及其类似物。该口服组合物亦包含漱口水，其可藉此黏贴于口腔中，以及舌下片剂。该囊剂包含硬胶囊及软胶囊。于该等口服用固态组合物，一种或多种的活性化合物可被单独地混合或以稀释剂、结合剂、粉碎剂、润滑剂、稳定剂、助溶剂、并接着以一传统方式制备成制备物。若有必要时，该等制备物可以包覆剂进行包覆，或可以两种或多种包覆层包覆。另一方面，该口服用液态组合物包含医药上可接受的水溶液、悬浮液、乳化液、糖浆、酏剂等。于该等组合物中，一种或多种活性化合物可被溶解、悬浮或乳化于常用的稀释剂中(如纯化水、乙醇或其混合物等)。除了该等稀释剂外，该组合物亦可包含浸润剂、悬浮剂、乳化剂、甜味剂、调味剂、芳香剂、保存剂及缓冲液及其类似物。

于实例中的本发明萃取物、分液或化合物或其医药组合物，经确认可于HCC细胞中造成细胞凋亡，进而指出该等物质具有抗癌活性，其可用于预防或治疗癌症，尤其是HCC。另外，其可有效治疗纤维化，尤其是肝纤维化。

因此，本发明提供该萃取物、该分液或式I化合物于制备用于治疗癌症(尤其是HCC)的医药的用途。另外，本发明提供用于预防或治疗癌症或纤维化(尤其是HCC及肝纤维化)的方法，其包含投与本发明的治疗有效量的萃取物、分液或化合物至有需求的对象。

以下所提供的实例是用于阐述本发明，但不应以任何方式局限本发明范围的方式来解读。

实例

实例1：从GP或红景天(Rhodiolarosea)萃取及纯化

将石莲(Graptopetalumparaguayense)(称作GP)的叶子磨碎，且于-20℃冷冻干燥成粉末，并于萃取前储存于25℃的防潮室中。首先，1.5gGP粉末与10ml100％的甲醇(MeOH)一起剧烈震荡5分钟，接着以1500g进行5分钟离心。经移除上清液后，将10ml的水、100％丙酮、100％甲醇、100％乙醇、70％乙醇、50％乙醇、100％DMSO及30％DMSO加入各个离心沈淀物以悬浮成各个萃取物。该等悬浮物分别藉由剧烈震荡5分钟以混合，并于1500g、5分钟、离心两次，再于9300g离心5分钟，并于室温藉由层流方式以0.45μm滤纸过滤。将30％DMSO上清液可以SephadexLH-20管柱进行分馏得到四个分液(F1-F4)、或以150mg/ml的原液(是指30％DMSOGP萃取物)存放于-20℃。该GP萃取物或分液HH-F3亦以透析膜(MWCO12-14,000)(SpectrumLaboratories,RanchoDominguez,CA)进行对水透析，以取得活性化合物。透过西方墨渍法，分析AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表现程度来分析活性分子，其称为分液HH-F3。此外，该分液HH-F3进一步以HPLC、及¹H-及¹³C-NMR光谱分析以辨识该活性分子的结构。

相似地，将植物红景天(Rhodiolarosea)(简称为RS)冻干成粉末，并于萃取前存于25℃的防潮室中。将1.5g的RS粉末溶解于10ml水中，且接着以1500g离心5分钟，接着于室温藉由层流方式以0.45μm滤纸过滤。该样本以150mg/ml的原液存放于-20℃。

于本发明的分液HH-F3进行化学性分析，根据于¹H及¹³CNMR光谱中大量的芳香族讯号，鉴定出其主要成分为多酚类化合物。于HH-F3分液的主要化合物经鉴定为单宁，归因于经冷冻干燥后其特有的粉红色，并带有部分银色似金属光泽的特征。藉由色度分析法分析浓缩的单宁量以测定HH-F3分液的总单宁含量约为68％，其中于OD₅₀₀监测时以儿茶素作为标准。该HH-F3分液的HPLC图谱(图1)显示两组化合物(A组和B组)，其于HH-F3分液中具有截然不同的分子量范围，且于B组中可侦测到一主要及一次要的成分。一富含原花色素的高分子量分液HH-F3a(相较于起始物质HH-F3的量，HH-F3a有71.9％的产量)是从HH-F3分液经透析以制得。简单来说，HH-F3(112.1mg)藉由透析膜(MWCO12-14,000)进行对水透析，得到内膜分液(HH-F3A，80.6mg)及外膜分液(7.4mg)。经以西方墨渍法(图6(D)图)测量AURKA的消失，以判别出该分液含有活性化合物。HH-F3a的原花色素分液的主要骨架是决定为原花色素聚合物(见如下)，及其生理化学特性，包含列于表一的平均分子量(mMW)、平均聚合度(mDP)、PC：PD的比例及立体化学(顺式：反式)。mMW及mDP是藉由分析降解的尾端及延长的单体的比例以决定。此外，为了简化制备步骤，遂施行另一种藉由将GP萃取物直接对水透析的方法(方法II)，而由方法II所制备的化合物的生理化学数据亦列于表一中。列于表一的生理化学特性指出由方法II所制备的分液与方法I(用以制备HH-F3a的方法)所制得者相同。

HH-F3a的预测结构：具有高原飞燕草素比例(>95％)的聚合的原花色素(21<n<38)。

表一

本发明具有式I结构式的原花色素聚合物的生理化学特性

¹制备HH-F3a的方法(藉由SephadexLH-20色层分析)

²藉由透析

由于没有自GP取得的聚合性化合物被报告过，因此，以另一种珍贵的景天科(Crassulaceae)草药红景天(Rhodiolarosea)(金色的根)的多酚化合物来做为参考化合物，以鉴定HH-F3a的结构。R.rosea被报导具有聚合性原花色素(PAC)。HH-F3a分液的主要成分的结构与R.rosea的原花色素化合物十分相近(见表二)，但具有不同的原花青素单元(PC单元)较次讯号(<5％)，此讯号无法于¹³CNMR光谱(δ_C114ppm，B环C-2'及C-5')中被侦测到。此外，该PAC化合物易于许多常见的葡萄品种中发现，像是葡萄(Vitisvinifera)。因此，亦以得自葡萄(Vitisvinifera)的PACs进行比较。表二显示自R.rosea及葡萄(V.vinifera)(一种常见的葡萄品种)的原花色素聚合物的生理化学特性。比较表二的数据，于HH-F3a分液的原花色素化合物的PD对PC比例为2.5×内、R.rosea的mDP及mMW为3.0×，以及30至80×、1.1至4.9×、及4.7至41.3×，较葡萄(Vitisvinifera)的mDP、mMW及3-O-没食子酰基(3-O-galloyl)百分比(％)高。就我们所知，尚无任何原花色素化合物从GP中被分离出，且亦无具有相同生理化学特性的原花色素化合物被报告过。此证据即表明于HH-F3a分液中所发现的原花色素化合物为一新颖化合物，其富含3,4,5-三羟基苯甲基部份(包含一个B环的PD单元及没食子酸(gallicacid))；其与R.rosea中所发现者十分相似，但相较于葡萄皮及种子中所发现者来的高。

表二

已知的原花色素聚合物的生理化学特性

¹欧洲葡萄与地中海及中亚同本质者

实例3：功效实例

1.存活试验

将细胞种于24孔盘中(每孔4,000-5,000细胞)，过夜培养，接着以30％DMSOGP萃取物或HH-F3分液处理0、24、48、或72小时。经处理后，以1xPBS(137mMNaCl、2.7mMKCl、10mMNa₂HPO₄、2mMKH₂PO₄)轻轻地清洗细胞三次，接着以0.5μg/mlMTT(溴化3-(4,5-二甲基唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓)培养2小时。将培养基移除，并将溶解于100％DMSO的深蓝色晶体，于室温中作用10分钟。以ELISA分析仪于570nm测量其OD值。

2.西方墨渍法

所有的样本藉由加温至95℃10分钟以变性，并进行8％或10％的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，于焦集胶体(stackinggel)及分离胶体(runninggel)分别以80V及100V进行。经SDS-PAGE后，藉由Bio-Rad转渍系统，将蛋白质转渍到聚偏氟乙烯(polyvinylidenedifluoride，PVDF)膜。待蛋白质转渍后，将该膜以丽春红(PonceauS)染剂染色以确认蛋白转渍的效率及一致性。再以5％的无脂的脱脂牛奶(BD)，将该膜于室温进行阻隔(block)30分钟，接着以初级抗体于4℃整夜培养。之后，以1xTris缓冲的生理食盐水Tween-20(TBST)冲洗膜三次(每次10分钟)。该膜再以二级抗体培养2小时。接着，以1xTBST冲洗三次(每次10分钟)。藉由加入HRP受质过氧化物溶液/发光胺反应剂(luminolreagents)(Immobilon^TM西方化学发光受质，微孔，以1：1比例混合)即可使二级抗体的讯号可视化，并以FujifilmLAS4000发光影像分析系统侦测。

3.细胞计量

将细胞种于12孔盘中(每孔10,000-30,000细胞)整夜，并接着以HH-F3分液处理0、24、48、或72小时。将该等细胞以胰蛋白酶消化后，接着经与0.4％台酚蓝混合后计算。

4.细胞周期分析及流式细胞仪

经胰蛋白酶处理后的细胞，以1xPBS清洗三次，将该等细胞以800g离心5分钟。接着，将该等细胞重新悬浮于溶于PBS的70％乙醇中，并置于-20℃超过16小时。经800g离心5分钟后，该细胞沈淀物以含有100μg/mlRNAseA(Sigma-Aldrich)的冷PBS重新悬浮20分钟。接着，将该等细胞以20μg/ml碘化丙啶(PI，Sigma-Aldrich)进行染色20-30分钟，并以BDFACSCanto测量及以FlowJo软件分析其DNA含量。

5.粒线体膜电位分析

粒线体膜电位是使用JC-1(碘化5,5',6,6'-四氯-l,1',3,3'-四乙基苯并咪唑碳花青)分析；JC-1是购自CaymanChemicalCo.。以每孔7000个细胞的密度，将培养的细胞种于96孔黑色盘中，整夜培养，接着使用或不使用HH-F3分液处理48小时。将JC-1染色溶液加入每孔中，并于37℃黑暗中轻轻地混合15-30分钟。将盘子以400g、室温离心5分钟，并将上清液移除。接着，将JC-1分析缓冲液加入每一孔中，接着以400g、室温离心5分钟，之后将上清液移除。最后，将JC-1分析缓冲液加入每一孔中，并以荧光盘分析仪分析。

6.测量ROS程度

细胞内生成的超氧化物自由基(O₂ ^-)可藉由氢化乙啡啶荧光(hydroethidinefluorescence)(AATBioquest，Inc.)分析。该等细胞使用或不使用HH-F3分液处理48小时。将氢化乙啡啶(10μM)加至每孔中，并于37℃、黑暗中，轻轻地混合30-60分钟。细胞的荧光可于波长520nm(激发)及610nm(发射)监测。

细胞内的过氧化物程度可由二氯荧光素(dichlorofluorescein，DCFH)双醋酸盐(MarkerGeneTechnologies，Inc.)测定。以HH-F3分液处理48小时，将培养基移除，并以PBS将细胞清洗两次。接着于37℃黑暗中，将细胞与最终浓度20μMDCFH于无血清培养基中培养30-60分钟。再以PBS清洗细胞，并维持于200μl培养基。细胞的荧光可于波长485nm(激发)及528nm(发射)监测。

7.动物及实验环境

于实验期间开始时为6周龄的Wistar品系大鼠(Wistaralbinorat)用于进行试验，共120只雄性大鼠(150-180g)。于研究期间，所有动物给予标准食物及水以自由采食方式喂食，于疾病诱导前7天驯化。

试验方法

将大鼠随机分为正常组(N＝10)、二乙基亚硝胺(diethylnitrosamine，DEN)组(N＝30)、低剂量GP组(N＝30)、及高剂量GP组(N＝30)。我们另外取5只大鼠做为HH-F3处理组。除了正常组以外，其余组别的大鼠每天以DEN水溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)作为饮用水达63天，并从第64天开始，以自来水喂饲14天。DEN溶液为每周配制，且配制成个别剂量，该个别剂量是根据动物对于先前剂量所反应的增重/减重来决定。第42天以后记录可见的肝肿瘤，以及于第63天后观察肝纤维化。于试验期间，该等动物会每周秤重，以计算增重率，且每周测量水的消耗量。自第42天开始，于低剂量组，每天给予每只大鼠0.6g的冻干GP粉末；于高剂量组，每天给予每只大鼠1.8g的冻干GP粉末，长达3周。

采集步骤及肝脏型态的评估

所有的动物于第84天进行安乐死。该等动物进行整夜禁食，接着以CO₂吸入方式牺牲。待大鼠牺牲后，将其身体、肝脏及脾脏秤重，根据解剖标准，于尸体解剖后将各个器官的状况记录。迅速地采集所有肝叶，并彻底的于每个时间点检查肝脏表面的状况，以及肝(liverfoci)的发育，持续性结节(PNs)的发育、或癌的发育；随后，将肝脏切成5-mm的切片。计算所有于肝表面的肉眼可见的结节，并于5-mm切片决定其数量及大小。

肿瘤负荷评估

为了建立肿瘤发育的模式，喂食动物DEN，所有肝叶皆被迅速地采取，且计算所有肉眼可视的肝脏表面结节，并于5-mm切片决定其数量及大小。肿瘤负荷是于每只动物估计所有直径超过3mm的肿瘤结节的体积总和，比较各组以进行评估。

胆汁流速

将动物牺牲前，先以80mg/kg克他明(ketamine)进行深度麻醉，以测量胆汁流速。为了要测量胆汁流速，将PE10硅管置于总胆管，接着与可记量的聚乙烯管连接。每5分钟间隔测量一次管中的胆汁流。

病理学评估

经放血后，将每一个肝叶的肿瘤解取下来，做成约5-mm厚度的组织切片。以5μm的厚度进行切片，并以苏木色素(hematoxylin)及曙红染料(eosin)染色，再藉由已公开的诊断标准来进行组织病理分析。

α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)免疫组织化学染色法

以福尔马林将肝脏样本固定，以石蜡包埋，接着切成5μm切片。将该等切片脱蜡、复水，并接着以0.03％过氧化氢处理10分钟，以停止内生性过氧化酶活性。之后以PBS冲洗两次，再将该等切片以抗人类α-SMA单株抗体(1:50稀释，DakoCytomation，丹麦)于室温培养1小时。对于α-SMA染色，再将该等切片冲洗，并以二级抗体，兔抗鼠IgG(1:200稀释)，于室温进一步培养1小时。接着以相似方法培养该等切片。经染色后，将该等切片以苏木色素进行对比染色，以进行显微镜检验。α-SMA阳性区域(肝脏切片的mm²/cm²)的百分比是以数字相机系统HC-2500(FujiPhotoFilm)、AdobePhotoshop5.0J版、及Image-ProPlus3.0.1J版测量。

肝脏的羟脯胺酸含量的分析

将肝脏样本秤重，并将20mg的冷冻样本以20ml6NHCl进行水解，以及小心地磨碎。此外，每毫克组织加入6NHCl以达到总量30ml。该于HCl中被磨碎的组织，是以120℃进行水解16小时。经短暂于冰上冷却后，以8000g离心10分钟，将上清液移除，并换入新管中；蒸发所散失的体积是以水来补充。加入同等体积的6NNaOH进行混合，接着以石蕊试纸将溶液调整至pH4-9。将40μl的中和后样本溶液加入96孔ELISA盘的孔中，并以含有5ml的7％氯胺T(chloramineT，Sigma-Aldrich)及20ml的醋酸/柠檬酸缓冲液的溶液进行氧化。之后，加入150mLEhrlich溶液。最终混合物于60℃培养35分钟，接着于室温再培养10分钟，之后于560nm判读其吸光值。标准溶液含有100、80、60、40、20、及0mg/ml的可信的4-羟基-L-脯胺酸(4-hydroxy-L-proline，Sigma-Aldrich)以相同方式处理。标准曲线是于此范围内(r＝0.99)线性化。肝脏的羟脯胺酸量值是以羟脯胺酸(mg)/湿肝脏重量(g)表示。所有的分析会重复三次。

氧化压力的免疫细胞化学分析

采用硝基四氮唑蓝(nitrobluetetrazolium，NBT，Sigma-Aldrich)灌注法以定位肝脏中重新合成(denovo)的ROS生成。将被NBT灌注的肝脏移除，并固定于锌/福尔马林溶液中，并进行组织检查甲臜(formazan)的沈淀。以AdobePhotoshop7.0.1影像软件分析以判读蓝色NBT沈淀物的密度。

结果

于Huh7及Mahlavu细胞上不同GP制备物的效果

为了测试GP的潜在的生物活性，不同制备所得的GP萃取物包含制备水萃取物、丁醇萃取物、丙酮萃取物、甲醇萃取物、100％乙醇萃取物、70％乙醇萃取物、50％乙醇萃取物、100％DMSO萃取物及30％DMSO萃取物，并用以处理人类HCC细胞。如图1所示，以不同制备方式得到的GP萃取物所造成的生长抑制效果，是以剂量依赖方式评估。MTT分析结果指出30％DMSO萃取物可明显地抑制Huh7(图2(A)图)及Mahlavu(图2(B)图)细胞的存活性。

于活化的肝的星状细胞及HCC细胞株的间期及有丝分裂期时，GP可降低AURKA、AURKB及FLJ10540蛋白表现程度

AURKA、AURKB及FLJ10540为致癌基因，且于HCC中为过量表现。因此，我们将不同制备所得的GP萃取物测试其是否可于人类HCC细胞株中抑制该等致癌蛋白。我们发现GP萃取物(从100％甲醇取得，再以30％DMSO萃取，如同方法章节所述，称作30％DMSOGP萃取物)可于活化的肝的星状细胞(HSC-T6)(图3(A)图)抑制Flj10540及Aurkb的蛋白表现程度，以及于HCC细胞(HepG2及Huh7)(图3(B)图)中压抑FLJ10540、AURKA、及AURKB的蛋白表现程度。于分裂中期的AURKA及FLJ10540表现程度较分裂间期高。我们接着探讨GP于HCC细胞有丝分裂期间是否可抑制该两个蛋白的表现。将Huh7及HepG2细胞以50-75ng/ml诺可达唑(nocodazole)处理18小时，接着以30％DMSOGP萃取物处理3小时，且不将诺可达唑冲洗掉。于先前发现一致，于有丝分裂期间，AURKA、AURKB、及FLJ10540皆高度地表现。于间期及中期(图3(C)图)，AURKA、AURKB、及FLJ10540的蛋白表现程度皆下降，然而，我们检查其他有丝分裂蛋白的表现则无明显变化，包含PIN1、HURP、及PLK(数据未显示)。

该30％DMSOGP萃取物(分液HH-F3)，而不是其他不同溶剂所制备的其他萃取物，可于HCC细胞株抑制AURKA蛋白表现

人类HCCHuh7细胞是以500μg/ml不同制备所得的GP萃取物处理48小时。该30％DMSO萃取物可于该等细胞中明显抑制AURKA蛋白表现程度(图4(A)图)。相反地，从水或丁醇所得的GP萃取物，经3小时处理后，于HepG2细胞无法抑制AURKA或AURKB蛋白表现程度(图4(B)图)。由于AURKA及FLJ10540于HCC为过量表现，我们分析GP对于HCC细胞的生长是否有影响。我们发现30％DMSOGP萃取物以50％细胞存活率抑制浓度(IC₅₀)，可造成Huh7及Mahlavu细胞的细胞毒杀；经48小时后处理，其IC₅₀分别约为500及250μg/ml(图5)。

HH-F3可于HCC细胞株中抑制AURKA蛋白表现

该30％DMSOGP萃取物于活化的肝的星状细胞及肝癌细胞可降低AURKA及FLJ10540蛋白表现程度(图2)，故我们推测可藉此分析方式从GP中纯化出活性分子。我们便以SephadexLH-20管柱，从30％DMSOGP萃取物中取得四个分液(图6(A)图)。当以西方墨渍法分析后处理3小时的样本，仅第三个分液(称作HH-F3)可于HepG2细胞抑制AURKA及AURKB的表现，而其他分液(HH-F1、HH-F2及HH-F4)不会抑制AURKA及AURKB的蛋白表现(图6(B)图)。一并考虑，从30％DMSO所制得的GP萃取物，以及HH-F3分液，经3小时后处理，皆可于HepG2细胞抑制AURKA及AURKB的蛋白表现程度(图6(B)图及图6(C)图)。我们进一步自HH-F3中以透析取得具活性的次分液，称作HH-F3a(相较于起始物质HH-F3的量，HH-F3a有71.9％的产量)。藉由西方墨渍法测量AURKA的消失，以判读该HH-F3a分液，而非HH-F3b分液，包含活性化合物(图6(D)图)。

HH-F3分液降低HSC-T6细胞及HCC细胞株的细胞存活性。

为了探讨HH-F3分液于细胞存活性的功效，将Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6细胞以HH-F3分液于5、25、50、75、及100μg/ml的浓度，处理24、48、及72小时。该等测试细胞种类对于HH-F3处理所反应的存活率，亦以MTT分析法分析。于第72小时，Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6细胞经HH-F3分液处理的IC₅₀值分别约为50、37.5、75、及20μg/ml(图7(A)图至图7(D)图)。为了进一步确认此一发现，再藉由将Huh7、Mahlavu、及PLC5细胞进行台酚蓝染色以判定细胞的存活性。经24、48、及72小时，于5、25、50、75、及100μg/ml的浓度处理后，HH-F3分液处理导致的细胞存活率降低被证明为时间及剂量依存方式(图7(E)图至图7(G)图)。一并考虑，30％DMSOGP萃取物及HH-F3分液可抑制HCC细胞及活化的肝星状细胞的存活性。

接着，将Huh7、Mahlavu、PLC5、及HSC-T6细胞以25、50、及75μg/ml的HH-F3分液处理3小时。该HH-F3分液可用以抑制三种被测的HCC细胞株及HSC-T6细胞的AURKA及FLJ10540的表现(图8(A)图及图8(B)图)。我们分析FLJ10540及Aurora激酶家族(AURKA、AURKB、及AURKC)的基因表现量的变化，以探讨HH-F3分液的抑制效用是否发生在转录阶段。将HepG2细胞以50μg/mlHH-F3分液处理6小时，再藉由微数组(U133A芯片，Affymetrix)分析基因表现程度，以及藉由西方墨渍法分析蛋白表现程度。相较于对照组，经HH-F3分液处理后，前述特定基因的基因表现无任何变化(数据未呈现)，尽管于蛋白表现程度上是有减少的。因此，HH-F3分液可能是于蛋白层次上调控HCC细胞生长，而非于转录层次。

于HCC细胞中，HH-F3分液经由细胞凋亡导致其细胞死亡

藉由使用碘化丙啶(PI)染色，以分析萃取物的HH-F3分液于HCC细胞的细胞周期模式的效用。将Huh7及Mahlavu细胞以5、25、及50μg/ml的HH-F3处理48小时。如图8(A)图显示，该HH-F3分液会干扰Huh7及Mahlavu细胞的细胞周期运行。经50μg/mlHH-F3分液处理48小时后，Huh7的sub-G1族群为22％，而Mahlavu的sub-G1族群为26％。相较于Huh7细胞，HH-F3分液于Mahlavu细胞的sub-G1族群上产生较大幅度的增加，此点于先前证明的细胞毒杀效果一致。我们接着分析HH-F3分液于诱导Huh7及Mahlavu细胞的细胞凋亡性死亡的能力。于浓度5、25、及50μg/ml处理24及48小时，切割的硫胱氨酸蛋白酶-3及切割的PARP的蛋白表现量是以剂量依存方式增加。于相同浓度时，HH-F3分液亦会导致细胞凋亡分子FAS的向上调控，及BCL2及BCL-XL的向下调控(图9下图)。该等数据显示HH-F3分液可诱导与硫胱氨酸蛋白酶相依的细胞凋亡性死亡(图9上图)。

该HH-F3分液于HCC细胞株中降低粒线体膜电位及增加ROS

于生理及病理情况中，活性氧化物(ROS)及粒线体于细胞凋亡中皆扮演重要角色。我们接着探讨HH-F3分液是否经由外在路径或内在路径以诱发细胞凋亡。我们测试于HCC细胞中粒线体膜电位，内在路径中的一种指针，是否可能被改变。将Huh7及Mahlavu细胞以5、25、及50μg/mlHH-F3分液处理，经48小时处理后，检测该等细胞的粒线体膜电位。相较于对照组，细胞凋亡的细胞数目增加了。此与粒线体膜电位(ΔΨ)的结果吻合，其显示经HH-F3分液处理后，Huh7及Mahlavu细胞的膜电位皆下降了(图10(A)图)。

许多报告指出当ΔΨ损失后，ROS会生成。ROS包含超氧化物阴离子、过氧化氢、及氢氧自由基；该等物质皆衍生自氧。ROS是为光合作用及有氧呼吸时的电子传递过程中所产生者。一定生理浓度的ROS可维持正常的细胞性功能，以及ROS亦参与细胞内的讯息传递及氧化还原调控。过多的ROS量可造成氧化压力，由于其会造成脂质、蛋白质及DNA的氧化，因此对于细胞具有潜在的伤害性。故，我们测试HH-F3分液是否会刺激HCC细胞于ROS生成上的变化。藉由氢化乙啡啶荧光分析细胞内生成的O₂ ^-，以及藉由DCFH双醋酸盐判读细胞内的过氧化物的量。经HH-F3分液处理后的细胞，其细胞内过氧化物(图10(C)图及图10(D)图)及超氧化物(图10(E)图及图10(F)图)的细胞生成量，于HCC细胞中是增加的。此显示，该HH-F3分液可藉由内在路径以造成细胞凋亡。

HH-F3分液降低Akt的磷酸化，以及增强PTEN的表现

于HCC中，部分的细胞增生路径与细胞凋亡的抑制及异常有关，例如AKT路径。由于HH-F3造成HCC细胞的细胞毒杀，我们接着探讨HH-F3是否会影响HCC细胞的细胞增生路径。将Huh7细胞以5、25、及50μg/mlHH-F3分别处理48小时。于Huh7细胞中，于HH-F3处理下，AKT的Ser⁴⁷³磷酸化为向下调控，然而总AKT蛋白则未受影响(图11)。有趣的是，HH-F3活化了磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)的蛋白量，该PTEN是为PI3K/AKT依存的讯号传递的负调控者。此结果显示，HH-F3可能调控细胞增生的AKT讯号传递路径以诱发细胞凋亡。

GP萃取物增加硬化病变动物的胆汁分泌

藉由胆汁流速以评估肝硬化进而反应肝功能(图12(A)图)、藉由量化脾脏重量/体重的比例，一种硬化病变相关的肝门脉高血压的指标(图12(B)图)、以及分析由DEN所诱导的α-SMA表现(图12(D)图)。所有的数据皆证实，经高剂量GP处理后，肝硬化的状态有改善，且可观察到胆汁流量明显增加、脾脏大小明显降低、及α-SMA(+)区域所占的百分比明显降低。

GP萃取物及HH-F3降低硬化病变肝的羟脯胺酸含量

藉由测量肝的羟脯胺酸含量可判读肝的纤维化。于DEN诱导动物可观察到羟脯胺酸量明显地增加(143±30μg/g)。相反地，经以低剂量GP、高剂量GP或HH-F3处理后，羟脯胺酸含量分别为98±18μg/g(P<0.05相较于DEN组)，70±10μg/g(P<0.05)，及72±8.2μg/g(P<0.05)(图12(C)图)。

GP萃取物及HH-F3降低氧化压力

NBT(氯化硝基四氮唑蓝)为一种染剂，当接触到超氧化物时，该染剂会被还原成不可溶的蓝色甲臜(formazan)衍生物，且该蓝色沈淀物可做为一组织学上的指针，并藉由光学显微镜可判别出组织中超氧化物的存在。NBT(+)聚集的密度可于10倍视野下观察最深的染色区域以判别。于DEN诱导动物(23±3)可观察到NBT(+)聚集明显地增加。相反地，经以低剂量GP、高剂量GP或HH-F3处理后，NBT(+)聚集的密度分别为13±4(P<0.05相较于DEN组)，4.2±0.6(P<0.005)，及6.2±2.1(P<0.05)(图12(E)图)。此等发现显示由DEN所造成的氧化压力可藉由GP萃取物及HH-F3处理而降低。

GP萃取物及HH-F3降低肿瘤负荷

肝脏是取自牺牲的动物，并将该等肝脏切成5-mm切片。计数及测量所有直径大于3mm的可视肿瘤结节的数量及大小。肿瘤负荷是以所有肿瘤结节的体积总和表示。于DEN诱导动物的可视肿瘤(肿瘤负荷2350±905mm³)。相反地，经以低剂量GP、高剂量GP或HH-F3处理后，其肝脏的肿瘤负荷分别为110±105mm³(P<0.005相较于DEN组)，23±31mm³(P<0.005)，及86±12(P<0.05)(图12(F)图)。该等肝脏的代表性照片显示，于硬化病变大鼠的肝脏中有多个肝肿瘤。可观察到于该些动物表面有肉芽发生，以及有不均质边界的多个肝肿瘤的形成，以及经以低剂量GP、高剂量GP或HH-F3处理后该些可视的肿瘤数目及不均质地肝表面皆可获得改善。

该红景天(Rhodiolarosea)萃取物亦被测试，且发现其可抑制HCC细胞的存活性及向下调控AURKA蛋白表现(图13)。

我们相信本领域技术人员可藉由本说明，且不需进一步阐述，即可将本发明发挥至最广泛地范围。因此，于此提供的本说明书及申请专利范围应被理解为仅做为示例性的目的，而不应以任何方式局限本发明的范围。

Claims

1.一种化合物，具有如式I结构：

其中R中有一者为H或原花青素(procyanidin，PC)单元，而其他的R为OH或原飞燕草素(prodelphindine，PD)单元；n为从21至38的数字；以及PC单元对PD单元的比例不超过1：20。

2.根据权利要求1所述的化合物，是从植物的萃取物中所分离；该植物是选自由缟瓣属(Graptopetalumsp.)、红景天属(Rhodiolasp.)及石莲花属(Echeveriasp.)所组成的群组。

3.根据权利要求1所述的化合物，是从石莲(Graptopetalumparaguayense)或红景天(Rhodiolarosea)所分离。

4.一种医药组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物，及医药上可接受的载剂。

5.根据权利要求4所述的医药组合物，其具有抗癌活性。

6.一种用于预防或治疗癌症的医药组合物，包含治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物，及医药上可接受的载剂。

7.根据权利要求6所述的用于预防或治疗癌症的医药组合物，其中该癌症为肝癌。

8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗癌症的医药组合物，其中该肝癌为肝细胞癌(HCC)。

9.一种用以预防或治疗癌症的方法，包含投与治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物至有需求的对象。

10.根据权利要求9所述的方法，其中该癌症为肝癌。

11.根据权利要求10所述的方法，其中该肝癌为肝细胞癌(HCC)。

12.一种用于预防或治疗纤维化的方法，包含投与治疗有效量的根据权利要求1所述的化合物至有需求的对象。

13.根据权利要求12所述的方法，其中该纤维化为肝纤维化。