KR101971438B1 - 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비수리의 초음파 추출물의 혈관 염증질환 치료 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초음파추출법을 이용하여 혈관 염증질환 예방/개선/치료 효과가 있는 비수리 추출물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비수리 초음파 추출물은 혈관 내피세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있다. 따라서 비수리 초음파 추출물은 상기와 같은 다양한 기작을 통해 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 고지혈증, 뇌졸증과 같은 혈관 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 특히 비수리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물{A pharmaceutical composition for preventing or treating vascular inflammation diseases comprising an Lespedeza cuneata ultrasound extract as an active ingredient}

본 발명은 비수리의 초음파 추출물의 혈관 염증질환 치료 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 초음파추출법을 이용하여 혈관 염증질환 예방/개선/치료 효과가 있는 비수리 추출물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상이 나타난다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.

염증반응에 관여하는 인자들의 작용을 기술하면 다음과 같다.

보체계(complement system)는 면역반응의 초기에 염증 활성화 및 증폭작용을 하는 체액성 주요인자이다. 보체의 활성화 과정에서 생성되는 활성단백질(아나필라톡신류; C3a, C4a, C5a)과 복합단백질(membrane attack complex, MAC)은 다양한 염증 질환(류마치스성 관절염[Sato, Y. et al, Ann. Rheum. Dis. 52, 795-800, 1993], 전신홍반성낭창[Takematsu, H. et al, Clin. Exp. Rheumatol. 10, 433-438, 1992], 성인호흡기질환 증후군[Langlois, P. F. et al, Heart Lung. 18, 71-84, 1989], 알쯔하이머성 치매[McGeer, D. L. et al, 8, 80-83 1995])과 관련이 있으며, 장기이식 초급성 거부반응의 직접적인 원인이 되고 있다[White, D. 14, 3-5, 1996].

VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)는 혈관내피세포 표면에서 발현되는 세포부착분자로서 대표적인 염증반응 단백질이다. 정상적인 경우 매우 낮은 수준으로 발현되어 있으나 TNF-α, 인테페론-γ, 인터루킨-1 β 등 싸이토카인류 염증매개물질에 의하여 자극을 받으면 발현량이 급속히 증가되어 혈류 중 이동하는 단핵구나 임파구 등 염증세포를 부착하고 염증세포가 염증발생 조직으로 이동하는데 역할을 한다. 따라서, VCAM-1의 발현은 염증세포가 염증발생 부위로 이동 및 집속하는 초기에 작용하여 염증반응의 증폭작용에 중요한 작용을 한다.

동맥경화는 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 질환으로서, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환의 원인이 된다. 동맥경화의 초기 발생에 관한 가설은 "손상에 대한 반응(responce-to-injury hypothesis)"으로서, 유전적 변이, 과산화물, 고혈압, 당뇨, 혈장 호모시스테인 농도 증가, 미생물 감염 등의 원인에 의하여 혈관 내피세포가 정상적인 항상성을 유지하지 못하는 기능부전 상태가 되는 것이다. 내피세포가 기능부전 상태로 되면 세포부착물질이 크게 발현되고 세포 투과성이 증가되어 혈중 면역세포, 혈소판, 지방질 등의 부착 및 조직으로의 투과성이 증가되며, 이들 면역세포들의 염증매개인자 및 성장인자 분비 등 염증반응 때문에 동맥경화성 병변이 발생 및 발달하게 된다는 것이다[Russel R., New England J. of Med. 340(2), 115-126, 1999]. 이때 혈중 저밀도 지단백질(low density lipoprotein, 이하 LDL)이 산화, 당결합, 집적화, 당단백 결합 등의 원인으로 변형-LDL(modified-LDL, 이하 MLDL)이 생성되고, 이들은 혈관 내피세포 및 평활근의 자극 및 손상을 유발한다[Steinberg D., J. Biol. Chem. 272, 20963-20966, 1997; Griendling K.K. et al., Circulation 96, 3264-3265, 1997; Bavab M. et al, Artheriosler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 831-42, 1996]. 이로 인하여, 내피세포의 혈관세포부착물질-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) 발현 및 염증세포의 염증매개인자 방출이 촉진되면 LDL은 내피세포 아래에 유입 및 축적이 되고, 축적된 LDL 및 산화된 MLDL은 다시 대식세포, T 임파구 등 면역세포의 유입 및 활성화를 유발하는 과정을 되풀이하여 병변의 염증반응을 촉진하게 된다[Rajavashisth T.B. et al., Nature, 344, 254-257, 1990; Quinn M. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 2995-2998, 1987]. 그 후 병변으로 유입된 대식세포나 임파구로부터 방출된 가수분해효소, 염증매개인자, 성장인자 등의 작용으로 병반은 괴사하게 되고, 괴사된 병소 부위로 단핵구의 유입, 평활근의 이동 및 분화, 섬유성 조직의 형성 등의 반복적인 과정을 통하여 병변 조직은 MLDL을 핵으로 한 괴사조직에 섬유질이 덮인 복잡한 구조의 섬유질 병변으로 발달하게 되며[Fuster V. et al. eds. Artherosclerosis and coronary artery disease. vol. 1, 539-555; 585-594; vol. 2, 492-510, Philadelphia, Lippincott-Raven, 1996], 발달된 병변 조직으로부터 혈전이 생성되고 동맥이 경화되어 혈류장애 등 순환기 질환이 나타나게 되는 것이다[Russel R., New England J. of Med. 340(2), 115-126, 1999; Wong, M.-L. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(15), 8681-8686, 2000].

따라서, 동맥경화는 혈중 콜레스테롤 및 LDL 등 지방질의 함량이 높을 경우 발생하게 되지만, 단순한 지방질 축적에 의해서만 발생되는 것이 아니라 동맥 내피세포 아래로 지방질의 유입 및 축적되는 과정과 그 후 일어나는 병변의 발달 및 세포 괴사에 이르는 일련의 과정이 내피세포, 대식세포 및 임파구 등이 관여하는 전형적인 염증 반응인 것이다.

한편, 비수리는 전국 각처의 산과 들에서 자라는 다년생 초본 혹은 초본성 아관목이다. 생육환경은 햇볕이 잘 드는 곳이면 어디든지 자란다. 키는 약 1m이고, 잎은 어긋나고 잎 표면에는 털이 없으며 뒷면에 잔털이 있고 잎의 길이가 1~2 ㎝, 폭이 0.2~0.4 ㎝이다. 줄기는 가늘게 위로 올라가며 잔털이 많이 있다. 꽃은 잎보다 짧게 잎겨드랑이에 나비 모양으로 붙어 백색으로 피는데 중앙부에 자주색 줄무늬가 있다. 열매는 암갈색으로 10월에 달리고 안에는 황록색 바탕에 적색 반점이 있는 1개의 씨가 들어 있다. 뿌리를 포함한 전초는 약용으로 이용한다.

이러한 비수리는 다양한 기능성이 알려져 있으나, 혈관 염증질환과 관련된 의약품 또는 기능성식품 소재로서의 용도로는 연구가 미미한 실정이다.

이에 본 발명자는 천연물질 유래의 소재로서 생체에 부작용이 없으면서 혈관 염증질환 치료 활성이 우수한 물질을 찾고자 모색하던 중, 비수리 초음파 추출물이 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; 염증단백질인 NF-κB의 활성화를 억제시키며; 또한, 다양한 염증성 사이토카인 및 케모카인의 생성을 효과적으로 억제하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2011-0109558호

따라서 본 발명의 목적은 인체에 안전하면서 혈관 염증질환의 예방 또는 치료 효과가 우수한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 인체에 안전하면서 혈관 염증질환의 예방 또는 개선 효과가 우수한 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 인체에 안전하면서 혈관 염증질환의 예방 또는 개선 효과가 우수한 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 비수리의 유효성분을 효과적이며 빠르게 추출할 수 있는 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 상기 방법으로 제조된 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비수리 초음파 추출물은 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하여 추출되는 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 혈관 염증질환은 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 빈혈, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 혈관기형 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비수리 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계를 포함하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매는 물 또는 에탄올 수용액일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 비수리를 20~40v/v%의 에탄올 수용액 용매에 침지시키고, 20~30℃에서 2시간 동안 초음파를 처리하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파의 주파수는 20~30 kHz일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조되는 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

본 발명에 따른 비수리 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있다. 따라서 비수리 초음파 추출물은 상기와 같은 다양한 기작을 통해 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 고지혈증, 뇌졸증과 같은 혈관 염증질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 특히 비수리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 비수리의 초음파 추출물의 추출시간별(A), 에탄올 용매 농도별(B) 추출 수율을 나타낸 그래프이다.
도 2는 비수리 초음파 추출물 처리 농도별 단핵구의 혈관내피세포 부착 억제 정도를 확인할 결과이다.
도 3a는 비수리 초음파 추출물(100 μg/mL), 대나무 잎 추출물(100 μg/mL), BAY(CAS 19542-67-7, 10 μM)의 처리에 따른 단핵구의 혈관내피세포 부착 억제 정도를 확인할 결과이다.
도 3b는 비수리 에탄올 추출물(60% EtOH, 24 시간(초음파 처리 없음); 20% EtOH, 2 시간(초음파 처리 없음)), 비수리 초음파 추출물(100 μg/mL), 대나무 잎 추출물(100 μg/mL), BAY(CAS 19542-67-7, 10 μM)의 처리에 따른 단핵구의 혈관내피세포 부착 억제 정도를 확인할 결과이다.
도 4는 웨스턴 블랏 분석을 통해 비수리 초음파 추출물의 처리 농도별 혈관내피세포에서 VCAM-1의 발현량을 측정한 결과이다.
도 5는 비수리 초음파 추출물의 처리 농도별 혈관내피세포에서 NF-κB 프로모터 바인딩 활성 억제 정도를 확인한 결과이다.
도 6은 비수리 초음파 추출물의 처리 농도별 혈관내피세포에서 IKKα/β, IκBα, p65, p105/50의 발현양 및 인산화 정도를 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 7은 비수리 초음파 추출물의 처리 농도별 혈관내피세포에서 NF-κB p65의 세포질로부터 핵으로의 이동 여부를 확인하기 위하여 웨스턴 블랏으로 분석한 결과이다.
도 8은 비수리 초음파 추출물의 처리 농도별 혈관내피세포에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 각각의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 9는 비수리 초음파 추출물을 C57BL/6 마우스에 농도별로 경구투여한 후 마우스 혈관에서 IL-1β, IL-6, TNF-α, MCP-1 각각의 mRNA 발현 수준을 측정한 결과이다.
도 10은 비수리 초음파 추출물을 C57BL/6 마우스에 농도별로 경구투여한 후 마우스 혈관에서 F4/80과 VCAM-1 발현 정도를 면역형광분석을 통해 살펴본 것이다.
도 11은 비수리 초음파 추출물의 LC-MS/MS chromatograms을 나타낸 것이다.
도 12는 비수리 초음파 추출물의 세포독성을 평가한 결과이다.
도 13은 비수리 초음파 추출물의 세포특이적 항염활성을 확인한 실험 결과이다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 "약제학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 혈관 염증질환)의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 혈관 염증질환)의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 제공한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에서의 "혈관 염증질환"은 대표적인 염증인자인 NF-κB의 활성에 기인하는 질환으로써, 예를 들어, 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 빈혈, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 혈관기형 및 말초혈관질환 등을 포함한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분(비수리 초음파 추출물) 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분(비수리 초음파 추출물) 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 비수리 초음파 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 99.9 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 비수리 초음파 추출물 이외에, 비수리 초음파 추출물과 반응하여 부작용을 일으키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 항염증제 또는 동맥경화 치료제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 혈관 염증질환은 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 빈혈, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 혈관기형 및 말초혈관질환 등을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비수리 초음파 추출물은 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하여 추출되는 추출물일 수 있다.

본 발명에서 "식품 조성물"이라는 용어는, 그를 섭취하는 대상체에 제공되는 영양소에 관계없이, 그 생물의 하나 이상의 기능에 유리하게 작용하여 보다 나은 건강 상태를 제공하는 식품을 의미한다. 결과적으로, 상기 식품 조성물은 질병 또는 질병-유발 인자의 예방, 개선 또는 치료를 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 발명의 "식품 조성물"이라는 용어는 기능성 식품 또는 특정 영양 목적을 위한 식품 또는 의약 식품의 동의어로서 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분(비수리 초음파 추출물) 이외에 통상적인 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이 외에도 바인더, 분해제, 코팅제, 윤활제 등과 같은 제약학적으로 통상적으로 사용되는 다양한 첨가제와 제형화되어 조제될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 비수리 초음파 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 99.9 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 비수리 초음파 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 식품 조성물은 상기 기재한 유효성분(비수리 초음파 추출물) 이외에 추가로 식품학적으로 허용 가능하거나 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 식품 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 식품 조성물의 제제 형태는 정제, 캡슐제, 분말, 과립, 액상, 환, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 또는 점적제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.

상기와 같은 방식으로 제제화된 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가될 수 있다.

본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한, 상기 식품 조성물은 유효성분(비수리 초음파 추출물) 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 비수리 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고, 대표적인 염증인자인 NF-κB의 활성을 억제하는 효과가 우수하며, 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제할 수 있는바, 혈관 염증질환의 예방 또는 개선을 목적으로 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 비수리 초음파 추출물은식용 가능한 약용작물로부터 유래한 추출물에 해당하는바 화학약품과 같은 부작용이 거의 없이 동맥경화와 같은 질환 개선을 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한, 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 혈관 염증질환의 예방 또는 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(비수리 초음파 추출물)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분(비수리 초음파 추출물)을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(비수리 초음파 추출물)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분(비수리 초음파 추출물)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계를 포함하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 상기 a) 단계는 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계이다.

상기 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 물 또는 20~60v/v% 에탄올 수용액을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 비수리를 20~60v/v%의 에탄올 수용액에 침지시키고, 20~30℃에서 1~24시간 동안 초음파를 처리하는 단계일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 비수리를 20~60v/v%의 에탄올 수용액 용매에 침지시키고, 20~30℃에서 2시간 동안 초음파를 처리하는 단계이다.

본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 상기 초음파 처리에서 초음파의 주파수는 20~30 kHz일 수 있다.

본 발명의 상기 b) 단계는 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계로서, 구체적으로 상기 a) 단계를 거친 용액을 0~10℃에서 3000~5000 rpm의 속도로 5~30분간 원심분리하고, 분리한 상층액을 공극이 0.2~10 μm인 멤브레인으로 여과하는 단계일 수 있다.

본 발명의 비수리 초음파 추출물의 제조방법은 상기 b) 단계 이후에 추가적으로 c) 여과된 추출물을 분말화하는 단계를 더 거칠 수 있다.

즉, 본 발명의 상기 b) 단계를 통해 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한, 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서, 비수리 초음파 추출물은 상기 a), b) 및 c) 단계를 거쳐 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

상기 제조방법으로 제조된 비수리 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있는바, 죽상경화(동맥경화)와 같은 혈관 염증질환의 예방/개선/치료에 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

재료 준비

혈관내피세포(human umbilical vein endothelial cells, 이하 간략하게 HUVECs라 약칭함) 및 단핵구 THP-1 세포는 각각 CEFO (Seoul, Korea) 및 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea)에서 구입하였다. 화학시약은 SigmaAldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. HUVEC 세포 배양배지는 CEFO (Jongno-gu, Seoul, Korea)로부터 수득하였다. RPMI 1640, 페니실린스트렙토마이신 및 FBS(fetal bovine serum)는 Thermo Scientific HyClone (Logan, UT, USA)로부터 구입하였다. 재조합 TNF-α는 BD PharMingen (San Diego, California, USA)로부터 제공받았다. VCAM-1, F4/80, α-Tubulin 및 β-actin에 대한 항체는 Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다. VCAM-1, IKKα, IKKβ, phospho-IKKα/β (Ser176/180), NF-κB p65, phospho-NF-κB p65 (Ser536), IκBα, phospho-IκB-α (Ser32), NF-κB1 p105/p50에 대한 항체는 Cell Signaling Biotechnology (Beverly, MA, USA)에서 구입하였다. 마우스 항-라민(lamin) 항체는 EMD Millipore Corporation (Temecula, CA, USA)에서 구입하였다. Alexa Fluor^TM488 goat 항-랫트 IgG (H+L) 2차 항체는 Thermo Fisher Scientific Inc. (Eugene, Oregon, USA)에서 구입하였다.

세포배양

HUVEC 세포는 HUVEC 성장 배지에서 배양하고 유지하면서 실험에 사용하였다. THP-1 세포는 10% FBS 및 0.05 mM 농도의 2- 메르캅토에탄올이 보충된 RPMI-1640 배지에서 성장시켰다.

동물 및 실험 설계

모든 동물은 관리를 받았으며, 연구 프로토콜 (KFRI-M-14013)은 한국식품연구원에서 동물 사용 및 관리 지침에 따라 승인되고 수행되었다. 10주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 Central Lab에서 구입하였다. Animal Inc. (서울, 대한민국). 마우스는 12시간의 밝음/어두움 주기가 있는 에어컨이 설치된 실내 (23±2℃)에 보관하였으며, 음식물과 수돗물에 자유 급이를 하였다. 25 마리의 마우스를 무작위로 각 그룹에 할당하였다 (그룹당 5 마리 마우스, 총 25 그룹) : (i) 정상 대조군, (ⅱ) TNF-α 처리군 (TNF-α), (ⅲ) TNF-α 및 20 mg/kg·day 비수리 초음파 추출물 처리군, (iv) NF-α 및 100 mg/kg·day 비수리 초음파 추출물 처리군 및 (v) TNF-α 및 100 mg/kg/day 대나무 잎 추출물 처리군, 비수리 초음파 추출물 처리군 (20 또는 100 mg/kg·day) 및 대나무 잎 추출물 처리군 (100 mg/kg/day)는 마우스에 3일간 경구 투여하였다. 3일간 경구 투여를 실시하고, 1시간 후, TNF-α의 복강 내 주사 (i.p.)를 25 μg/kg으로 7일 연속 투여하였다. 이때 대조군 마우스는 동일 기간 PBS를 복강 주사하였다.

통계 분석

데이터는 평균±표준편차로 나타내었으며, 유의적 차이는 one-way ANOVA (분산 분석)을 사용하여 결정하였다. 확률값 p <0.05는 통계적 유의성의 기준으로 사용되었다.

<실시예 1>

비수리 초음파 추출물 제조 및 초음파 추출 조건의 최적화

본 발명에 사용되는 초음파추출법은 초음파추출기 MIX SONIC (MIRAE ULTRASONIC TECH. CO, Korea)를 사용하여 28 kHz, 진폭 80% 조건에서 초음파를 발생시켜 추출하였으며, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 25℃로 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.

본 발명은 사실상 에너지 크기가 큰 20 kHz의 주파수를 비수리에 직접적으로 처리함으로써 세포벽을 깨뜨리며 세포 내에 함유된 다양한 생리활성을 보이는 물질을 추출할 수 있다. 이에 반해, 종래의 초음파 추출의 경우 식물 세포를 깨뜨릴 수 있는 주파수의 범위를 사용하지 않으며, 단순히 추출물을 활성화시키기 위한 공정에 해당한다. 참고로, 종래에 사용되는 주파수의 경우 100~120 kHz와 같은 파장이 긴 주파수를 사용하며, 이러한 주파수는 세포벽을 파쇄할 수 없다.

본 실험에 사용된 비수리(학명: Lespedeza cuneata, 국내산)는 건조된 것을 구입하여 사용하였다. 시료는 분쇄기(Wonder Blender, OSAKA CHEMICAL Co., Osaka, Japan)를 이용하여 분쇄한 후 분말 형태로 수득하였다. 비수리 분말을 0, 20, 40 및 60v/v%의 에탄올 수용액에 각각 침지시키고, 초음파 추출법을 이용하여 25℃에서 추출시간을 각각 1, 2, 3, 6, 9, 12 및 24시간으로 하여 비수리의 유효성분을 추출하였다. 추출물을 4℃에서 원심분리(4000rpm, 20분)하고, 분리한 상층액을 공극이 0.22 μm인 멤브레인으로 여과하고 IKA RV 10 Rotary Evaporator (IKA　 Works, Guangzhou, China)를 이용하여 100 mL까지 농축시킨 다음, 완전히 동결건조하여 비수리 추출물을 얻었다. 한편, 종래 에탄올 추출법에 기반한 비수리 추출물의 본 발명의 초음파 추출물과의 효과 비교를 위하여 건조 분말에 100배량(w/v)의 에탄올(60%)을 가하여 25℃에서 24시간 동안 교반하여 추출한 비수리 에탄올 추출물을 L0 시료로 준비하였다.

비수리 추출물의 수율(%)은 하기 수식을 이용하여 계산하였다. 하기 수식에서 Weight of crude sample은 초음파 추출이 끝난 후 동결건조한 시료의 무게를 의미하며, Weight of sample은 추출 전 시료의 무게를 의미한다.

그 결과 하기 표 1 및 도 1에서 나타낸 바와 같이, 에탄올 함량 20% 일 때 시간별 추출 수율은 2시간에서 9%로 가장 높았고, 2시간 추출 시간에서 에탄올 함량별에서도 20%가 가장 높은 수율을 나타내었다.

따라서, 교반 추출 대비 높은 추출 수율과 비수리의 표준물질인 이소퀘르시트린과 비슷한 항염증 기능성(항염증 기능성은 NO 생성억제 효능으로 평가하였음)을 나타내고, 비교적 단시간인 2시간 에탄올 함량 20%인 L6를 최적 추출조건으로 선정하였다.

추출조건 및 추출조건별 비수리 추출물의 추출 수율(%)

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (v/v%)	시료 명칭	추출 수율 (%)
에탄올 용매	25	24	60	L0	6.7
초음파	25	1	0	L1	6.7
			20	L2	7.8
			40	L3	8.5
			60	L4	7.5
		2	0	L5	5.8
			20	L6	9.0
			40	L7	8.0
			60	L8	6.7
		3	0	L9	7.3
			20	L10	8.3
			40	L11	8.3
			60	L12	6.3
		6	0	L13	6.5
			20	L14	7.3
			40	L15	8.0
			60	L16	7.5
		9	0	L17	7.0
			20	L18	8.0
			40	L19	8.7
			60	L20	8.0
		12	0	L21	7.7
			20	L22	8.7
			40	L23	9.3
			60	L24	9.5
		24	0	L25	7.0
			20	L26	9.0
			40	L27	8.8
			60	L28	8.8

<비교예 1>

대나무( Phyllostachys pubescens ) 잎 추출물 제조

가로×세로 각각 1cm로 자른, 건조된 대나무 잎 1 kg을 70% 에탄올 수용액 10 L를 용매로 이용하여 80℃에서 7시간 동안 3회 반복 가열하여 추출하였다. 추출물을 감압농축 및 동결건조 과정을 거쳐 최종적인 대나무 잎 추출물을 제조하였으며, 하기 실험의 양성대조군 시료로 사용하였다. 대나무 잎 추출물은 혈중 콜레스테롤 개선, 혈중 중성지방 개선, 항산화의 기능성을 가진 개별인정 원료이다.

참고로, 상기 대나무 잎 추출물은 A standardized bamboo leaf extract inhibits monocyte adhesion to endothelial cells by modulating vascular cell adhesion protein-1 (Nutr Res Pract 2013) 논문을 참고하여 추출하였다.

<실험예 1>

비수리 초음파 추출물의 혈관내피세포에서 TNF-α 유도된 단핵구의 부착 억제 효과

단핵세포의 혈관내피세포에 부착은 동맥경화가 발생하는 중요한 요소이다. 이에, 본 실험에서는 상기 실시예 1을 통해 제조된 비수리 초음파 추출물(L6 시료)이 TNF-α에 의해 유도된 THP-1(인간 단핵구) 세포가 혈관내피세포인 HUVEC 부착에 어떠한 영향을 미치는지를 살펴보기 위해 부착 에세이를 실시하였다. 한편, 대나무잎 추출물은 혈중 콜레스테롤 개선, 혈중 중성지방 개선, 항산화의 기능성을 가진 개별인정 원료이며, Choi(Nutr Res Pract. 2013)의 논문에서는 HUVEC과 THP-1 세포의 부착을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서 논문을 참고하여 추출한 대나무잎 추출물을 양성 대조군으로 사용하였다.

단핵구-혈관내피세포 부착 분석을 위하여, THP-1 세포(5×10⁵ cells/mL)는 2 μM Calcein-AM (Sigma)와 함께 37℃ PBS에서 15분 동안 배양시켰다. HUVEC 세포 (3×10⁵ cells/mL)는 96-웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하여 한층에 가득차도록에 성장시키고 37℃에서 1시간 동안 다양한 농도의 샘플로 활성화시킨 후, 분석 5시간 전에 10 ng/mL 농도의 TNF-α로 자극하였다. 이후, 형광 표지된 THP-1 세포를 활성화된 HUVEC에 첨가하고 추가로 1시간 동안 배양하였다. 결합되지 않은 PBS를 3번 세척한 후, 형광 플레이트 판독기 (SpectraMax M2e, Molecular Devices Corporation, USA)를 사용하여 485 및 538nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 세기로 단핵구(THP-1) 부착 정도를 측정하였다. 부착된 THP-1 세포를 형광 현미경(Nikon Eclipse Ti-S, Tokyo, Japan)으로 확인하고 이미지를 Metamorph (Molecular Devices, Danville, PA) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

그 결과 도 2에서 나타낸 바와 같이, 비수리 초음파 추출물 처리 농도에 의존적으로 단핵구의 혈관내피세포 부착 정도가 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 도 3a에서 나타낸 바와 같이, 비수리 초음파 추출물과 대나무 추출물(양성 대조군)을 100 μg/mL 농도로 처리하였을 때 각각 49.9%, 37.9%로 단핵구의 부착이 감소하였고, 비수리 초음파 추출물은 대나무 잎 추출물(양성 대조군) 보다 단핵구 부착 감소 정도가 12.0%의 높게 나타났다. 한편, NF-κB 억제제로 알려진 BAY(CAS 19542-67-7)을 10 μM 처리하였을 때, 본 발명의 비수리 초음파 추출물과 비슷한 감소 효과를 나타내었다. 뿐만 아니라, 부착된 단핵구 세포를 형광 현미경으로 확인한 결과, 본 발명의 비수리 초음파 추출물에서 THP-1 세포 부착이 감소하는 결과를 확인할 수 있었다.

또한, 도 3b에서 나타낸 바와 같이, 초음파 처리를 거치지 않은 비수리 에탄올 추출물(60% EtOH, 24 시간, 20% EtOH, 2 시간) 대비 본 발명의 비수리 초음파 추출물의 경우 THP-1 세포 부착이 두드러지게 감소되는 것으로 나타나, 비수리 초음파 추출물의 단핵세포의 혈관내피세포에 결합억제 효능이 우수한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 효능은 대나무 추출물(양성 대조군) 보다 월등히 우수하며, NF-κB 억제제로 알려진 BAY(CAS 19542-67-7)을 10 μM 처리 하였을 때 보다 효과적인 것을 확인하였다.

<실험예 2>

비수리 초음파 추출물의 혈관내피세포에서 TNF-α 유도된 NF-κB 활성 및 발현에 미치는 효과

<2-1> VCAM-1 발현에 미치는 영향

TNF-α는 염증반응을 일으키는 사이토카인인데, 주로 활성화된 대식세포에서 생성이 되며, 백혈구, 내피세포 그리고 비만세포에서도 생성이 된다. 특히, TNF-α는 내피세포에서 NF-κB의 활성화를 통해 염증반응을 일으킨다는 것은 잘 알려진 사실인데, TNF-α는 염증반응을 동반하는 여러 가지 병변에서 높은 수치로 발견이 된다. TNF-α는 TNF-α 수용체인 TNFR(TNF Receptor) 의존적인 신호전달기전을 통해 전사인자인 NF-κB를 활성화시킨다. NF-κB가 활성화하여 세포 표면 부착분자(vascular cell adhesion molecule 1, VCAM-1)의 발현을 유도하게 되는 것이다.

따라서, 본 실험에서는 비수리 초음파 추출물이 HUVEC 세포에서 TNF-α에 의해 증가한 VCAM-1의 발현을 억제시켜 항염증 효능을 나타낼 수 있는 확인하였다.

웨스턴 블랏 분석을 위해, HUVEC 세포 (2×10⁵ cells/mL)를 24시간 동안 10cm 접시에 분주하였다. 상기 세포에 비수리 초음파 추출물을 처리하여 1시간 동안 반응시킨 후 10 ng/mL 농도의 TNF-α로 처리하였다. 배양 후, 세포를 수집하고 저온 PBS로 2회 세척한 후, 세포 용해 완충액 (Cell Lysis Buffer) (Cell Signaling Biotechnology, Beverly, MA, USA)에서 용해시키고 30분 동안 얼음 상에 유지시켰다. 용해물(lysate) 단백질을 원심 분리를 통해 세척하고 농도를 DC Protein Assay kit (Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 결정하였다. 용해물을 10% SDS-PAGE를 진행한 다음 PVDF 멤브레인 (Millipore, Immobilon　-Ptransfermembrane)으로 옮겼다. 전달 후 멤브레인을 4℃에서 밤새 특이 항체로 반응시켰다. 단백질 밴드는 화학 발광 검출 키트 (ATTO, Tokyo, Japan)를 사용하여 호스라디쉬 퍼옥시다아제(HRP)-컨쥬게이트된 2차 항체와 하이브리드시킨 후 시각화하였다.

그 결과 도 4에서 나타낸 바와 같이, 비수리 초음파 추출물을 처리한 경우 농도 의존적으로 세포 내 VCAM-1의 발현이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

<2-2> NF-κB 프로모터 바인딩 활성억제 효과

본 실험에서는 TNF-α에 의해 산화적 스트레스가 증가한 HUVEC 세포에 비수리 추출물을 처리하는 경우 NF-κB 프로모터 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하였다.

비수리 초음파 추출물의 NF-κB 프로모터 활성을 평가하기 위해, 본 실험에서는 NF-κB 프로모터 플라스미드를 함유하는 pGreenFire (pGF1) 벡터를 제작하였다. NF-κB 프로모터를 갖는 pGF1을 안정하게 발현시키기 위해 리포펙타민(ThermoFisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 293T 세포를 pGF1 플라스미드로 형질감염시켰다. 상기 형질감염 배지를 형질감염 후 4시간 째에 교체한 후, 세포를 36시간 동안 배양하였다. 바이러스 입자는 0.45 μm 주사기 필터를 사용하여 여과하여 수집한 다음 폴리브렌 (Millipore) 1 μg/mL과 혼합하고 24시간 동안 HUVEC 세포에 감염시켰다. 세포 배양 배지를 새로운 배양 배지로 교체하고 세포를 퓨로마이신 (1 μg/mL)으로 36시간 동안 선별하기 전에 24시간 더 배양하였다. 선택된 HUVEC 세포 (8×10³ 세포/mL)는 96-웰 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 80-90 %의 confluence에 도달하면, 10 ng/mL 농도의 TNF-α를 처리하기 전에 1시간 동안 세포에 비수리 초음파 추출물을 처리한 다음 5시간 동안 배양하였다. 이후, 100 μL의 용해 완충액 [0.1M 인산 칼륨 완충액 (pH 7.8), 1% 트리톤 X-100, 1mM 디티오트레이톨(DTT) 및 2mM EDTA]으로 세포를 파쇄한 후, 루시퍼라아제 활성을 루미노미터(SpectraMax L, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 이용하여 측정하였다. 루시퍼라아제 기질로써 Beetle Luciferin, Potassium Salt(Promega)을 사용하였다.

그 결과 도 5에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 처리한 모든 농도에서 NF-κB 프로모터 바인딩 활성이 억제되는 것을 확인하였으며, 특히 100 μg/mL의 농도로 처리한 경우, NF-κB 프로모터 바인딩 활성이 50.6%까지 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

<2-3> NF-κB 신호전달과정에 미치는 영향

NF-κB(Nuclear Factor Kappa B)는 다양한 자극을 통해 활성화될 수 있다. 이 자극들은 각자 독특한 수용체를 통해서 세포 내부로 신호를 전달한다. 외부의 자극을 받은 수용체는 세포 내부로 각각 다른 경로를 거쳐 IKK 복합체로 신호를 전달한다. IKK 복합체는 IκB와 NF-κB 복합체에 작용하여 IκB를 인산화시킨다. 인산화된 IκB는 β-TrCP에 의해서 유비퀴틴화(ubiquitination) 된다. 평상시에 NF-κB는 IκB의 결합으로 인해 그 활성이 저해를 받게 되는데 IκB가 유비퀴틴화(ubiquitination)로 분해됨으로써 다시 활성을 띄게 되고 핵으로 이동하여 여러 유전자를 발현시킨다.

따라서 본 실험에서는 TNF-α에 의해 산화적 스트레스가 증가한 HUVEC 세포에 비수리 추출물을 처리하는 경우 NF-κB 및 IκBα의 발현양 및 인산화 정도를 웨스턴 블랏으로 분석하였다

웨스턴 블랏 분석은 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 진행하였다.

그 결과 도 6에서 나타낸 바와 같이, TNF-α만을 처리한 실험군의 경우 p-IKKα/β의 증가로 인하여 p-IκBα의 양은 증가하는 반면 IκBα 양은 감소하는 것을 나타남으로써 인산화 증가에 의한 IκBα의 분해가 일어나는 것을 확인하였다. 반면에, 비수리 초음파 추출물을 처리한 실험군에서는 p-IκBα의 경우 그 양이 현저하게 감소하는 것으로 나타남으로써 IκBα의 인산화가 억제되었고, p65의 인산화가 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 3>

비수리 초음파 추출물의 혈관내피세포에서 TNF-α 유도된 p65의 핵으로의 이동에 미치는 영향

본 실험에서는 TNF-α에 의해 NF-κB p65의 세포질로부터 핵으로의 이동 단계에 대해 비수리 초음파 추출물이 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 하였다.

HUVEC 세포 (2×10⁶ 세포/mL)를 10cm 접시에 분주한 후 37℃에서 24시간 동안 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 비수리 초음파 추출물로 1시간 동안 교체하였다. 이후, 세포에 10 ng/mL 농도의 TNF-α를 처리하고 30분 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 수집하고 차가운 PBS로 2회 세척하였다. 제조자의 지시에 따라 NE-PER 핵 및 세포질 추출 시약 (Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA)을 이용하여 핵 단백질 추출물을 준비하였다.

단백질양은 웨스턴 블랏으로 분석하였으며, 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 진행하였다.

그 결과 도 7에서 나타낸 바와 같이, 비수리 초음파 추출물이 TNF-α에 의해 세포질로부터 핵으로의 이동이 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 4>

비수리 초음파 추출물의 혈관내피세포에서 TNF -α 유도된 염증성 사이토카인 및 케모카인에 미치는 효과( in vitro )

혈관내피세포에서 TNF-α에 유도되는 다양한 염증성 사이토카인 및 케모카인을 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 처리한 경우 어떠한 영향을 미치는지를 RT-PCR으로 분석하였다.

제조사의 지침에 따라 RNeasy　MiniKit(Qiagen,Valencia,CA,USA)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. RNA의 역전사는 ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Osaka, Japan)를 사용하여 수행하였다. 첫번째 가닥 cDNA는 1 μg의 총 RNA로부터 준비되었다. 실시간 PCR 반응은 0.1 μg cDNA, 1 μM 각각의 프라이머 (하기 표 2 참조) 및 Power SYBR　Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, CA)를 함유한 20 μL의 부피에서 수행되었다. 먼저 샘플들을 초기 변성을 위해 94℃에서 5분 동안 반응시킨 후 전체 40 사이클을 증폭시켰다. 각 사이클에 관한 시간과 온도는 95℃에서 5초 변성, 60℃에서 10초간 어닐링 및 연장으로 이루어졌다. 반응은 StepOnePlus Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems)으로 수행하였다. 유전자 발현 수준은 참조 유전자 GAPDH의 발현 수준을 기준으로하여 표준화하였다. 2^{- ΔΔCT} 방법을 사용하여 계산되는 상대적인 유전자 발현 변화는 대조군 샘플에 비교하여 number-fold 변화로써 기록하였다.

qRT-PCR를 위한 프라이머 서열

유전자	프라이머 서열 (5→3)
IL-1β	포워드	GCACAAGGCACAACAGGCTGC
	리버스	CAGGTCCTGGAAGGAGCACTTCA
IL-6	포워드	TTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCA
	리버스	AGGGCTGAGATGCCGTCGAGGATG
TNF-α	포워드	ATCAATCGGCCCGACTATCTC
	리버스	GCAATGATCCCAAAGTAGACCTG
MCP-1	포워드	CTGCTCATAGCAGCCACCTT
	리버스	CAGGTGACTGGGGCATTGAT

그 결과 도 8에서 나타낸 바와 같이, 혈관내피세포에서 비수리 초음파 추출물을 처리한 실험군에서 TNF-α에 의해 유도된 IL-1β, IL-6, TNF-α의 mRNA 발현이 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, 100 μg/mL 농도의 비수리 초음파 추출물을 처리하는 경우 IL-1β, IL-6, TNF-α가 각각 69.3%, 23.6%, 21.4%의 높은 저해 효능이 나타났다.

<실험예 5>

비수리 초음파 추출물의 마우스 혈관에서의 TNF -α 유도된 염증성 사이토카인에 미치는 효과( in vivo )

본 발명의 비수리 초음파 출물이 혈관염증을 갖는 동물모델에 적용시 실제적으로 혈관염증을 억제할 수 있는지를 확인하였다.

10주령의 C57BL/6 마우스를, 3일간 비수리 추출물을 경구 투여하였고, 7일간 비수리 초음파 추출물을 투여 후, 1시간 후 TNF-α을 복강 투여하였다. 활성화된 NF-κB는 염증성 사이토카인 생성을 증가시키고, 혈관 염증을 악화시킨다. 마우스 대동맥에서 TNF-α에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, TNF-α과 케모카인인 MCP-1을 RT-PCR으로 분석하였다. 이때, 양성대조군으로 혈중 콜레스테롤 개선 및 혈중 중성지방 개선의 기능성을 인정받은 대나무 잎 추출물을 사용하였다. RT-PCT은 상기 실험예 4와 동일한 방법으로 진행하였으며, RT-PCR 분석에서 사용한 프라이머 서열을 하기 표 3에 나타내었다.

qRT-PCR를 위한 프라이머 서열

유전자	프라이머 서열 (5→3)
IL-1β	포워드	ACCTGGGCTGTCCTGATGAGAG
	리버스	TGTTGATGTGCTGCTGCGAGAT
IL-6	포워드	TGGGACTGATGCTGGTGACAAC
	리버스	AGCCTCCGACTTGTGAAGTGGT
TNF-α	포워드	TGGAACTGGCAGAAGAGGCACT
	리버스	AGAGGCTGAGACATAGGCACCG
MCP-1	포워드	AGCACCAGCACCAGCCAACT
	리버스	GTGAATGAGTAGCAGCAGGTGAGTG

그 결과 도 9에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 처리한 실험군에서 TNF-α에 의해 유도된 IL-1β, IL-6, TNF-α 및 MCP-1의 mRNA 발현이 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도, 100 mg/kg·day의 비수리 초음파 추출물은 현재 항-콜레스테롤 기능성을 인정받은 개별인증형 원료인 대나무 잎 추출물보다 IL-1β, IL-6, TNF-α가 각각 22.3%, 10.6%, 24.9%의 차이로 유의적으로 더욱 높은 저해 효능을 보여주었다.

<실험예 6>

비수리 초음파 추출물의 마우스 혈관에서의 TNF -α 유도된 F4/80과 VCAM -1 발현에 미치는 효과( in vivo )

본 발명의 비수리 초음파 출물이 혈관염증을 갖는 동물모델에 적용시 실제적으로 혈관염증으로 인한 혈관 내막에 세포부착 및 침윤을 억제할 수 있는지를 확인하였다.

참고로, VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1)는 인터류킨1, 종양괴사인자α, 인터페론γ, 인터류킨4 등 염증성 시토키닌이나 리포다당에 의해 24~48시간을 정점으로 발현, 유도하는 세포접착분자로서, 염증부위로의 림프구 침윤, 줄기세포와 스트로마세포의 접착, 근관 형성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.

10주령의 C57BL/6 마우스를, 3일간 비수리 추출물을 경구 투여하였고, 7일간 비수리 초음파 추출물을 투여 후, 1시간 후 TNF-α을 복강 투여하였다. 마우스 대동맥에서 면역형광분석을 실시하였다.

면역형광분석을 위해, 대동맥을 갖는 마우스 심장을 동결 절편 화합물(FSC 22, Leica Microsystems, USA)을 침투시켜 포매시킨 후, 연속적으로 냉동절편기(LEICA CM1850, Nussloch, Germany)를 이용하여 10 μm 두께로 잘랐다. 세척 후, 절편을 5% 염소 혈청과 함께 실온에서 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단하였다. 이후, 절편을 1차 항체와 함께 밤새 4℃에서 배양하였다. 세척 후 절편을 2 차 항체인 Alexa FluorTM 488 염소 항-래트 IgG (H + L)와 함께 실온에서 1시간 동안 추가 배양하였다. 커버슬립을 건조하고 핵을 표시하기 위해 DAPI (Vector Laboratories)를 갖는 Vectashield를 이용하여 슬라이드에 탑재하였다. 대동맥에서 VCAM-1 및 F4/80 발현 이미지는 형광 현미경 (Nikon Eclipse Ti-S, Tokyo, Japan)을 사용하여 얻었고 이미지는 Metamorph (Molecular Devices, Danville, PA) 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

그 결과 도 10a 및 10b에서 나타낸 바와 같이, TNF-α에 의해 단핵구가 혈관내피세포와의 결합과 혈관 내막(intima)의 침윤을 증가시키고, 세포접착분자인 VCAM-1의 발현을 증가시키는 반면, 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 경구 투여한 실험군에서는 단핵구가 혈관내피세포와의 결합과 혈관 내막의 침윤이 효과적으로 감소되며 세포접착분자인 VCAM-1의 발현도 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 본 발명의 비수리 초음파 추출물의 경우, 양성대조군인 대나무 잎 추출물 대비 F4/80 및 VCAM-1 발현 저감 효과가 더욱 우수한 것으로 나타났다.

<실험예 7>

비수리 초음파 추출물의 구성성분으로 페놀 화합물 동정과 정량화

비수리 추출물의 화합물 분석을 위해 ESI-LC-MS를 사용하였고, 주요 페놀 화합물은 mass spectra과 standard을 비교하여 나타냈다. 분석을 위한 전처리 과정에서 글리콘(glycone)이 가수 분해를 통해 아글리콘(aglycone) 형태로 전환될 수 있다 생각하였고, 그 대사산물을 분석하였다. 정량을 위해 HPLC을 이용하여 얻은 피크 면적으로부터 계산하였다.

그 결과 도 11a 및 11b에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비수리 초음파 추출물의 경우 Kaempferol 7-alloside, querectin 3-galactosyl-(1->4)-rhamnoside, quercetin 7-xyloside 및 kaempferol 7-alloside가 주요 페놀 화합물로 확인되었다.

<실험예 8>

비수리 초음파 추출물의 세포독성 평가

비수리 초음파 추출물의 세포독성 평가를 위해 혈관내피세포인 HUVEC 세포를 96 웰 플레이트(well plate)에 1×10³ cells/mL이 되도록 넣고 CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 본 발명의 추출물 처리한 DMEM 배지 100 μL를 가하고 24시간 배양 후 세포독성을 MTS 방법으로 측정하였다. MTS 방법은 2.0 mL의 MTS(Promega) 용액과 100 μL의 PMS(phenazine methosulfate, Promega) 용액을 혼합하고 각 well에 MTS/PMS 용액을 20 μL씩 넣어서 37℃. 5% CO₂ 배양기에서 1시간 반응시킨 후, 마이크로플레이트 리더기(Microplate reader)를 사용하여 490/640nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 12에서 나타낸 바와 같이 본 발명의 비수리 초음파 추출물은 100 μg/mL까지 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있었다.

<실험예 9>

비수리 초음파 추출물의 세포 특이적 항염 효과

본 실험에서는 비수리 초음파 추출물의 세포 특이적 항염증 효과를 조사하였다. 비수리 초음파 추출물의 다양한 기능성을 측정하기 위하여, NF-κB transactivity, Adhesion capacity, NO production, MMP-1 transactivity 및 Anti-cancer 효과를 살펴보았다.

NF - κB 프로모터 바인딩 활성억제 효과

실험방법은 상기 실험예 <2-2>와 동일하다.

TNF -α 유도된 단핵구의 부착 억제 효과

실험방법은 상기 실험예 1과 동일하다.

NO 생성 억제 효과

Raw 264.7 세포를 10% FBS DMEM 배지를 이용하여 세포 수 2×10⁷ cells/mL로 조절한 후 96 웰 플레이트에 배양하였다. 24시간 후 시료를 1시간 전 처리한 후 다시 LPS(1 μg/mL)와 시료를 포함하는 배지로 교환하여 다시 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 세포배양 상등액 50 μl와 Griess 시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphtylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 50 μL 를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, sodium nitrite(NaNO₂)를 단계적으로 희석하여 얻은 표준농도 곡선에 대한 값으로 정량화 하였다.

자외선에 의한 MMP -1 프로모터 바인딩 활성억제 효과

비수리 초음파 추출물의 항피부노화 효과를 스크리닝 위하여, 자외선 조사에 의해 증가한 HaCaT세포에 추출물을 처리하여 MMP-1 프로모터 바인딩 활성억제 효능을 측정하였다.

참고로, 피부노화는 유전형질에 의해 결정되는 내인성 노화와 반복적인 자외선 조사에 의해 발생하는 외인성 노화로 나뉠 수 있다. 피부노화는 대부분 자외선에 의해 발생하기 때문에 피부노화는 자외선에 의한 광노화와 동일한 의미를 갖는다고 할 수 있다. 이러한 광노화의 원인을 살펴보면 반복적인 자외선에 의해 과발현 된 MMP-1이 피부의 80% 이상을 구성하고 있는 콜라겐을 분해시키면서 주름이 발생한다.

따라서 MMP-1을 전사하는 전사인자인 AP-1이 결합하는 DNA consensus sequence와 luciferase가 결합된 유전자를 피부세포(HaCaT)에 삽입하여 안정적으로 이를 발현하는 세포주를 확립하였다. 특히, luciferase는 적은 농도도 검출이 가능하며 간편하고 경제적이면서 객관적인 데이터 분석을 할 수 있기 때문에 다양한 연구에 활용되고 있다. 본 연구에서는 확립된 MMP-1 reporter gene이 안정적으로 발현되는 HaCaT 세포를 활용하여 비수리 초음파 추출물의 항피부노화 효능을 간접적으로 측정하였다. 자세한 실험방법은 다음과 같다.

Transformation 및 DNA 추출: Competent cell에 MMP-1 plasmid DNA를 42℃로 1분 배양하고 반응액을 LB 배지 0.4 mL에 넣고 37℃에서 250 rpm으로 1시간 동안 진탕 배양하였다. 미리 만들어 놓은 LB 배지 플레이트(ampicillin 100 μg/mL)에 진탕 배양한 배지를 도말하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 다음날 액체 LB 배지(ampicillin 100 μg/mL) 100 mL에 single colony를 접종하고 37℃에서 진탕 배양하였다. 세포가 충분히 자라면 Plasmid midi kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 시약 제조사가 제공한 시험법(QIAZEN) 에 따라 수행하였다.

Transfection: 293T 세포에 NF-κB-luciferase viral vector를 transfection 하여 viral particle을 얻었다. 293T 세포를 10 cm dish에 7×10⁵ cell/plate로 분주 한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 transfection을 위하여 항생제가 없는 serum free 배지로 교환하고 4 μg MMP-1 plasmid DNA, psPAX2, pMD2G DNA 각각 3 μg, 100 μL Opti MEM 혼합액과 20 μL lipofectamine, 100 μL Opti MEM 혼합액을 만들어 준비하였다. 준비한 DNA 혼합물과 transfection reagent를 혼합 후 vortexing 하고 상온에서 5분간 반응시킨 후 DNA-reagent mixture를 배지에 넣어 혼합하고 24시간 배양하였다.

Infection: 인간 각질형성세포(HaCaT cell)는 60% confluent가 되도록 미리 준비하였다. 새로운 배지 5 mL과 transfection 시킨 cell의 배지 5 mL을 혼합 후, 0.45 μM membrane filter로 filter하였다. 준비된 cell의 배지를 제거하고, Polybrene 1 μg/mL을 함유하는 filteration 된 배지를 넣은 후 24시간 배양하였다. 이후 infection되지 않은 control 세포와 infection 한 세포에 puromycin이 1 μg/mL를 함유한 배지로 교환하여, infection 되지 않은 세포가 100% 사멸될 때까지 selection을 실시하였다. 선택된 배지를 배양함으로써 MMP-1-luciferase vector가 삽입된 HaCaT 세포주를 구축하였다.

항피부노화 스크리닝: MMP-1 luc 발현된 HaCaT 세포를 계수 후 96 well plate에 1×10⁵ cells/mL로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 세포 배양기에 24시간 배양하였다. Phenol red가 없는 serum free DMEM 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 시료를 100 μg/mL 농도로 처리 1시간 후 UVB (0.04 J/㎠)를 조사하였다. 5시간 뒤 배지를 제거하고 100 μL의 lysis buffer로 세포를 1시간 동안 용해하였다. 용해액 50 μL에 50 μL의 luciferase reagent를 첨가하여 Spectramax (Molecular devices, Silicon Valley, CA, United States)를 이용하여 측정하였다. 자외선 조사는 4개의 Westeting hous F520 lamps(National Biological, Twinsburg, OH)로 조사하였다. Kodak Kodacel K6808 필터가 장착된 UVB 조사 챔버를 만들어 290 nm 이하의 파장을 제거하였다.

항암 효과

비수리 초음파 추출물의 항암 효과를 살펴보기 위하여, 인간 대장암세포주 및 폐암세포주에 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 처리한 후 암세포 사멸 정도를 측정하였다.

자세하게는, 인간 대장암세포(HT29, HCT116)와 폐암세포(HCC827, HCC827 GR)를 4×10⁴ cell/mL의 농도가 되도록 한 후 96 웰 플레이트에 24시간 배양하였다. 이후 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리한 후 다시 24시간 배양하고, MTS([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)와 phenazine methosulfate(PMS) 혼합액 20 μL를 가하고 1시간 후 490 nm와 690 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 추출물의 암세포의 사멸효능은 490 nm 흡광도에서 690 nm 흡광도를 빼 준 후 무처리군을 100%으로 하여 상대적인 값을 나타냈다.

다양한 효과 실험 결과 하기 표 4 및 도 13에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비수리 초음파 추출물이 혈관 염증 질환과 관련된 NF-κB transactivity과 단핵구의 세포 부착 실험에서 60% 이상 억제하였고, 활성산소의 일종으로 세포독성, 조직손상에 관여하며 특히 염증 유발에 중요한 역할을 하는 NO을 43.0% 억제하였다. 반면에, 피부노화에 관여하는 자외선에 의해 증가된 MMP-1 transactivity와 인간 폐암세포 HCC 827와 HCC 827 GR, 대장암세포 HCT 116와 HT 29을 이용하여 항암효능을 살펴본 결과 저해하는 효과가 나타나지 않았다. 따라서, 비수리 초음파 추출물은 혈관 염증질환에 특이적으로 작용할 수 있음을 확인하였다.

비수리 초음파 추출물의 기능성 분석

Functionality	NF-κB transactivity	Adhesion capacity	NO production	MMP-1 transactivity	Anti-cancer
					HCC 827	HCC 827 GR	HCT 116	HT 29
Inhibition (%)	63.9	62.7	43.0	10.8	3.9	12.1	26.7	14.2

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

LCE: 비수리 초음파 추출물
BLE: 대나무 잎 추출물

Claims (12)

1. 비수리 에탄올 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 혈관 염증질환은 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 빈혈, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 혈관기형 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 비수리 에탄올 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
4. 비수리 에탄올 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 혈관 염증질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
5. 제4항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
6. 제4항에 있어서,
   상기 혈관 염증질환은 죽상경화(동맥경화), 허혈성 심근경색, 협심증, 관상동맥질환, 고혈압, 뇌졸중, 빈혈, 편두통, 부정맥, 중풍, 혈관종, 혈관섬유종, 고지혈증, 혈관기형 및 말초혈관질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
7. 제4항에 있어서,
   상기 비수리 에탄올 초음파 추출물은 혈관 내피 세포에 죽상 경화를 일으킬 수 있는 세포부착인자의 발현과 단핵구의 세포 유착을 감소시키고; NF-κB의 활성화를 억제시키며; 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β의 생성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품.
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