KR101693095B1 - 와송 당절임액을 이용한 gaba와 점질물이 강화된 와송 발효물 제조방법 - Google Patents

와송 당절임액을 이용한 gaba와 점질물이 강화된 와송 발효물 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 와송 당절임액을 이용한 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물 제조방법에 관한 것으로, (1) 와송과 설탕을 혼합하여 와송 당절임액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 제조된 와송 당절임액을 배지로 하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM (KCCM 43010) 스타터(starter)를 접종하고 배양하여 점질물을 생산하는 1차 발효 단계; 및 (3) 상기 1차 발효 단계의 발효물에 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 (KACC91727P) 스타터(starter)를 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 점질물 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 와송 발효물 제조방법에 대한 것이다. 그 결과, 점질물, 가바(GABA), 펩타이드(peptide) 및 프로바이오틱스(probiotics) 등의 생리활성물질이 강화된 기능성 식품 소재를 개발할 수 있었다.

Description

와송 당절임액을 이용한 GABA와 점질물이 강화된 와송 발효물 제조방법{Optimized manufacture method of the GABA and mucilage in the Orostachys japonicus sugar extract}
본 발명은 와송 당절임액을 이용한 GABA와 점질물이 강화된 와송 발효물 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 및 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 이용하여 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물을 제조하는 방법에 대한 것이다.
와송은 돌나무과(Crassulaceae)에 속하는 바위솔속(Orostachys) 식물로, 한국, 일본 및 중국 등 주로 동아시아 지역에 많이 분포하고, 우리나라에는 총 7종이 분포하는 것으로 알려져 있다. 와송은 바위솔, 옥송, 암송 등으로 불리며, 와송에 대한 연구 결과, 와송은 세포사멸(apoptosis)을 촉진시키며, 세포 전달(cell transformation) 억제를 통한 항산화효과, 지질 과산화 억제 효과 등이 보고되어 있다. 최근에는 와송에 존재하는 성분으로 프렌델린(friendelin), 에포프렌들라놀(epofriendlanol), 글루티논(glutinone) 및 글루티니올(glutiniol)과 같은 트리테르페노이드(triterpenoid)류와 β-시토스테롤(β-sitosterol) 및 캄페스테롤(campesterol) 등의 스테롤(sterol) 계열 물질, 지방산 에스테르(fatty acid ester)류, 캄프페롤(kampferol) 및 퀘르세틴(quercetin)과 같은 플라보노이드(flavonoid)류, 4-하이드록시벤조익산(4-hydroxybenzoic acid), 3,4-디하이드록시벤조익산(3,4-dehydroxybenzoic acid) 및 갈릭산(gallic acid) 등의 방향족산(aromatic acid) 등이 분리되어 소화기계통의 암에 좋은 것으로 알려지면서 연구가 활발히 진행되고 있다.
유산균은 발효를 통해 젖산 및 여러 가지 대사산물을 생산하는 미생물로서 각종 발효식품, 건강기능식품, 의약품, 사료 첨가제 등으로 광범위하게 이용되고 있으며, 건강 증진 및 질병 예방의 특징을 가지는 프로바이오틱스(probiotics) 균주에 대한 연구와 응용이 증가되고 있다.
류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주는 김치 숙성에 관여하는 균주로서, 류코노스톡 속에 속하는 젖산균은 젖산의 생성 외에도 포도당의 중합체로서 생고분자인 덱스트란을 생합성하는 특징을 가지고 있다. 젖산균의 세포외 효소인 덱스트란수크레이즈(dextransucrase)에 의해 기질인 자당으로부터 과당과 포도당으로 유리시키면 동시에 포도당의 중합반응을 촉매함으로써 고분자 점질성 물질인 덱스트란 다당류를 생산한다.
락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주는 GABA를 생산하는 균주로서 GABA는 자연계에 분포하는 비단백질 아미노산의 일종으로 동물의 뇌나 척수에 존재하는 신경전달물질이면서, 뇌 대사를 촉진시켜서 집중력과 기억력 증진에 관여하는 기능성 식품소재이다. GABA는 아미노산의 전이 반응에 의해 석시닉 세미알데히드(succinic semialdehyde)로 전환된 다음 산화에 의하여 석시네이트(succinate)가 된다. 이와 같이 GABA의 대사는 에너지를 생산하고 TCA 회로에서 산화를 위한 탄소의 제공, 질소 저장화합물 및 아미노산 대사산물 등의 여러 가지 기능이 알려져 있다.
한국공개특허 제10-2014-0131024호(2014.11.12 공개)
본 발명의 목적은 와송 당절임액을 이용하여 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 및 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 이용한 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물 제조 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 와송과 설탕을 혼합하여 와송 당절임액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 제조된 와송 당절임액을 배지로 하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM (KCCM 43010) 스타터(starter)를 접종하고 배양하여 점질물을 생산하는 1차 발효 단계; 및 (3) 상기 1차 발효 단계의 발효물에 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 (KACC91727P) 스타터(starter)를 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 점질물 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 와송 발효물 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물을 제공하는데 있다.
본 발명은 와송 당절임액을 이용한 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물 제조방법에 관한 것으로, 상세하게는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 및 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 이용하여 점질물 및 GABA가 증진된 와송 발효물을 제조하는 방법에 대한 것이다. 본 발명을 통하여, 점질물, 가바(GABA), 펩타이드(peptide) 및 프로바이오틱스(probiotics) 등의 생리활성물질이 강화된 기능성 식품 소재를 개발하고자 하였다.
도 1은 와송 당절임액을 이용한 발효과정을 도식화한 것이다.
도 2는 생와송과 와송 당절임액의 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 젖산 발효물의 pH, 산도 변화를 나타낸다.
도 3은 생와송과 와송 당절임액을 배지로 한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효물의 당도 변화를 나타낸다.
도 4는 생와송과 와송 당절임액을 배지로 한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효물의 총당 함량 변화를 나타낸다.
도 5는 생와송과 와송 당절임액을 배지로 한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효물의 환원당 함량 변화를 나타낸다.
도 6은 생와송과 와송 당절임액을 배지로 한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효물의 점조도 변화를 나타낸다.
도 7은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 이용한 2차 젖산발효물의 pH, 산도 변화를 나타낸다.
도 8은 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154균주를 이용한 2차 발효의 GABA 함량 변화를 나타낸다.
본 발명자들은 와송의 유용물질들을 추출하며 동시에 저장성을 높이기 위하여 당절임법을 이용하여 와송의 유용 물질들을 추출하였다. 제조된 와송 당절임액을 이용하여 기능성물질이 강화된 발효물을 개발하기 위하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM과 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 젖산균을 이용하여 효과적으로 대사산물이 생산되도록 혼합발효의 최적화를 수행하였다. 2차 발효의 GABA 생산을 최적화 하기 위해서는 수크로오스(sucrose)의 농도가 중요한 요인이 될 수 있어 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM에 의한 1차 젖산 발효를 통해 당절임액의 수크로오스(sucrose)를 소비하여 덱스트란과 만니톨을 생산하였으며, 1차 젖산 발효물에 MSG를 첨가한 후 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154에 의한 GABA 생성을 최적화함으로서 와송 당절임액을 이용한 기능성물질이 강화된 발효물을 개발하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 (1) 와송과 설탕을 혼합하여 와송 당절임액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1) 단계에서 제조된 와송 당절임액을 배지로 하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM (KCCM 43010) 스타터(starter)를 접종하고 배양하여 점질물을 생산하는 1차 발효 단계; 및 (3) 상기 1차 발효 단계의 발효물에 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 (KACC91727P) 스타터(starter)를 접종하고 배양하는 2차 발효 단계를 포함하는 점질물 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 와송 발효물 제조방법을 제공한다.
바람직하게는, 상기 와송 당절임액을 제조하는 단계는 와송 및 설탕을 1:0.5-2의 중량비로 혼합하여, 1일 내지 6달 동안 실온에서 당절임할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 1차 발효 단계는 설탕의 농도가 10 내지 30%인 배지에서 25 내지 40℃에서, 1 내지 7일 동안 발효할 수 있고, 상기 2차 발효 단계는 전체 1차 발효물에 대하여 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG) 1 내지 5 중량%를 더 첨가하고, 25 내지 40℃에서, 1 내지 7일 동안 발효할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM (KCCM 43010) 균주는 당근주스에서 분리 및 동정한 균주로서, 수탁번호 KCCM 43010으로 한국미생물보존센터에 수탁되었다.
본 발명에서 사용된 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P)로서 한국식품과학연구원으로부터 분양받아 사용하였다.
본 발명에 있어서, "스타터(starter)"란 발효물을 제조하는 경우에 사용하는 미생물 배양액을 말한다. 따라서 스타터 미생물의 종류는 그 제품의 특성을 결정하게 되며 제품의 품질에 중요한 영향을 미친다. 미생물 중에서 스타터로 사용되고 있는 것은 박테리아, 곰팡이, 효모 등을 들 수 있으며, 이것을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 점질물 및 GABA 증진된 와송 발효물을 제공한다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
< 실시예 1 > 와송을 이용한 당절임 착즙액의 제조
와송에 설탕을 첨가할 경우 삼투압 작용에 의해 몸에 유익한 생리활성 물질이 많이 추출될 수 있으며, 저장성이 증진된다. 이런 의미에서 와송에 있는 유용물질들을 모두 추출하여 영양소 파괴 없이 발효 원료로 이용할 수 있다는 장점이 있다.
이에 와송 당절임액을 제조하기 위하여 와송을 선별한 후 와송의 줄기를 제외한 모든 부분을 설탕과 1:1로 혼합하여 2주간 실온에 두어 와송 당절임액을 제조하였으며, 와송 고형분과 추출액을 모두 혼합, 파쇄하여 이를 와송 당절임액이라 명하여 GABA가 강화된 와송 젖산발효물의 제조를 위한 원료로 이용하였다. GABA를 생산하는 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주는 당이 높은 환경에서 GABA를 효과적으로 생산하지 못하는 점을 고려하여, 와송 당절임액의 설탕을 소비하여 덱스트란을 생성하는 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 이용하여 당을 소비시키는 1차 발효를 진행한 후, GABA를 생산하기 위한 2차 발효를 진행하였다.
< 실시예 2 > 류코노스톡 메센테로이데스 ( Leuconostoc mesenteroides ) SM 균주를 이용한 1차 발효
1. 사용균주와 스타터( starter )의 제조
실험에 사용된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주는 당근주스에서 분리된 젖산균으로 수크로오스(sucrose)를 포함하는 수크로오스 아가(sucrose agar) 배지에서 다량의 점질물을 생산한다. 수크로오스(sucrose) 배지의 조성은 sucrose 2%, yeast extract 0.5%, tryptone 0.25%, K2HPO4 0.25%를 혼합하여 기본배지로 사용하였으며, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 수크로오스 아가(sucrose agar) 배지에 도말하여 25℃ 항온배양기에서 24시간 배양하였다. 배양된 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM의 단일 콜로니는 아가(agar)를 첨가하지 않은 수크로오스(sucrose) 배지 10mL에 1 백금이 접종하고 24℃에서 24시간 정치 배양하여 스타터로 이용하였다.
2. 와송을 이용한 류코노스톡 메센테로이데스 ( Leuconostoc mesenteroides ) SM 균주 1차 발효물의 제조
와송 당절임액을 배지로 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 젖산 발효물의 제조 도식은 도 1과 같다. 당절임법을 이용하여 얻어진 와송 당절임액을 4배 희석하여 K2HPO4 1%, 효모추출물(yeast extract; Y.E) 0.5%를 첨가하고 80℃에서 30분간 살균하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 발효물의 배지로서 이용하였다. 제조된 와송 당절임액 배지에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM starter를 1% 접종하여 25℃에서 3일간 발효하여 화학적 특성을 분석하였다.
3. 와송을 이용한 류코노스톡 메센테로이데스 ( Leuconostoc mesenteroides ) SM 균주 1차 발효물의 생균수 측정
생균수는 발효물 1 mL에 멸균수 9 mL을 첨가하여 10배 희석법을 이용하여 105, 106 배로 희석된 것을 MRS agar plate에 20μL 도말한 후, 25℃ 항온배양기에서 48 시간 배양한 후 생균수를 CFU/mL으로 나타내었다.
4. pH , 산도 및 당도 측정
pH는 배양액 10 mL을 취하여 pH meter (Digital pH meter 420A+, Thermo Orion. Beverly, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 적정 산도는 pH meter를 이용하여 배양액의 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N-NaOH로 적정하고, 그 소비량을 타르타르산(tartaric acid) 및 젖산(lactic acid) 함량(%, v/v)으로 환산하여 나타내었다. 당도는 전자굴절당도계(0-93 °Brix, Refractometer, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하였다.
5. 결과
(1) 와송 당절임액을 이용한 1차 젖산발효의 생균수 , pH , 산도 및 당도 변화
와송 당절임액의 초기 발효기간에 따른 차이를 위하여 생와송 배지의 제조는 줄기를 제외한 생와송에 와송 당절임액과 비슷한 15 °Brix가 되도록 설탕을 첨가하여 파쇄시킨 후 동일한 조건에서 발효하여 비교분석하였다.
생와송과 와송 당절임액을 4배 희석하여 제조한 와송 당절임액에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 이용하여 3일간 젖산 발효하였을 때 생균수를 측정한 결과는 표 1과 같다.
생와송과 와송 당절임액의 1차 발효의 생균수 변화는 2일까지는 109 CFU/mL 이상으로 비슷하게 증가하였으며, 3일째 생와송 발효물에서는 급격히 감소하여 107 CFU/mL로 감소하였는데, 와송 당절임액을 이용한 발효물에서는 109 CFU/mL로 유지되는 것을 알 수 있다. 이로서 생와송 추출물을 이용하였을 때보다, 와송 당절임액의 이용이 균 생육에 유리한 것으로 나타났다.
단위: CFU/mL
1차 발효 시간 (일)
0 1 2 3
생와송 8.10×107 2.30×109 2.18×109 5.30×107
와송 당절임액 8.10×107 2.95×109 2.08×109 5.60×109
pH와 산도를 측정한 결과는 도 2와 같다. 발효 전 생와송 배지를 이용하여 배양하였을 때의 pH는 6.70에서 1일째 4.31로 급격히 감소하여 3일째까지 큰 변화가 없었으며, 와송 당절임액 배지를 이용하여 배양하였을 때의 pH는 배양 전 7.23에서 1일째 4.31로 급격히 감소하여 3일째까지 큰 변화가 없는 것을 알 수 있다.
산도를 측정하였을 때, 생와송 배지를 이용하여 배양한 발효물에서는 발효 전 0.28%에서 1일째 1.99%로 급격히 증가하여 3일째까지 큰 변화가 없음을 확인할 수 있다. 와송 당절임액 배지를 이용하여 배양한 발효물에서는 발효 전 0.20%에서 1일째 1.48%로 급격히 증가하여 3일째까지 큰 변화가 없는 것을 알 수 있다.
생와송과 당절임액 1차 발효의 발효시간에 따른 당도의 변화를 측정한 결과는 도 3과 같다. 발효 전 15.95 °Brix에서 발효 후 15.75 °Brix로 감소하는 것을 알 수 있고, 당절임액을 이용한 1차 발효에서는 발효 전 14.85 °Brix, 3일 배양 후 13.9 °Brix로 감소하는 것을 알 수 있다.
(2) 환원당 및 총당의 함량 변화에 따른 점조도 측정
생와송과 와송 당절임액을 배지로 하여 발효한 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효물의 총당을 측정한 결과는 도 4와 같다.
생와송을 배지로 하였을 때의 총당은 발효 전 15.56%로 나타났으며, 발효 1일째 7.53%로 급격히 감소하였고 발효가 진행됨에 따라 점차 감소하여 3일째 5.29%까지 감소하는 것을 알 수 있다. 반면에 와송 당절임액을 배지로 하였을 때의 총당은 발효 전 11.02%로 생와송 배지보다 낮게 측정됨을 알 수 있었고, 발효시간이 지남에 따라 점차 감소하여 발효 3일째 5.46%로 총당이 감소하는 것을 알 수 있었다.
생와송과 당절임액을 배지로 하여 발효했을 때의 환원당 함량을 도 5에 나타내었다. 환원당은 염기성 용액에서 알데하이드 또는 케톤을 형성하는 당의 일종으로 포도당, 과당, 엿당, 글리세르알데하이드 및 아라비노스 등이 여기에 속한다.
생와송을 배지로하여 1차 젖산발효한 발효물의 환원당 함량은 발효 전 0.28%로 나타났으며 발효 1일째 6.62%로 급격히 증가함을 알 수 있고, 발효 시간이 지남에 따라 점차 감소하여 3일째 2.98%로 감소하는 것을 알 수 있다. 반면에 와송 당절임액을 배지로 하여 발효 하였을 때의 환원당 함량은 발효 전 2.79%로 이미 2주간 추출하면서 수크로오스(sucrose)가 분해되어 글루코오스(glucose)가 생성되어 발효 전 2.79%로 수크로오스(sucrose)를 첨가한 생와송 보다 환원당 함량이 높게 나타남을 알 수 있고, 발효 1일째 5.51%로 증가하여 3일째 까지 점차 감소하여 발효 3일째 3.31%까지 감소하는 것을 알 수 있다.
도 6에 나타낸 점조도 결과를 측정하였을 때, 생와송을 배지로 한 발효물은 발효 2일째까지 급격히 증가하여 3일째부터 감소하는 경향을 보였다. 반면에 생와송 당절임액을 배지로 이용한 발효에서는 점조도의 변화가 없는 것을 알 수 있었다. 이는 총당과 환원당 결과를 보았을 때, 설탕을 첨가한 생와송 배지에는 설탕이 많이 포함되어 있어, 설탕을 덱스트란으로 전환하여 점조도가 증가하였으며, 와송 당절임액에서는 2주간 실온에서 추출하는 과정에서 미생물에 의한 발효에 의해 설탕이 분해되어 환원당이 증가하였으므로, 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 이용한 1차 발효에서 덱스트란을 생성하지 않고 균 생육에 이용하여 당을 소모하였기 때문이라고 판단된다.
이에 따라, 와송의 유용물질을 열처리를 공정을 거치지 않고 설탕 절임한 후 추출한 와송 당절임액을 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 이용한 1차 발효를 통해 점질물 및 GABA를 생산하기 위해 적합한 배지의 생산이 가능하였다.
< 실시예 3 > 락토바실러스 플란타륨 ( Lactobacillus plantarum ) K154 균주를 이용한 2차 젖산발효
1. 사용균주 및 젖산발효 조건
GABA를 생산하는 젖산균은 한국식품연구원에서 분양받은 김치에서 분리된 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154를 Lactobacilli MRS broth agar (Difco. Co. Maryland, USA) 배지에 접종하여 30 ℃, pH 6.5±0.2, 24시간 배양하여 사용하였다.
와송 당절임액을 이용하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주 1차 발효한 발효물을 이용하여 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 균주(기탁번호: KACC 91727P)를 접종하고 2차 젖산발효를 하였다. 젖산발효 조건으로는 1차 발효한 생와송과 와송 당절임액을 3배, 5배 희석하여 총 부피에 소듐 글루타메이트(sodium glutamate) 2%(w/v)와 Y.E를 0.5%(w/v) 첨가하였고, MRS broth에 30℃에서 24시간 배양한 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 스타터를 1% 접종한 후 30℃에서 3일간 배양하였다.
2. 생균수 측정
생균수는 2차 젖산발효한 배양액을 104, 105, 106배로 단계별 희석하여 121℃에서 15분간 멸균한 MRS broth agar 배지에 20㎕ 도말한 후, 30℃ 항온배양기에서 24시간 배양한 생균수를 CFU (colony forming unit)/mL로 나타내었다.
3. GABA 함량 분석
2차 젖산발효한 생와송과 와송 당절임액의 발효기간에 따른 글루타메이트(glutamate) 잔존량과 GABA 전환율을 TLC(Thin-layer chromatography) 분석을 통해 확인하였다.
TLC 전개는 사각 챔버(chamber) (30×25×10 cm)에서 수행하였고, 실리카겔(silica gel) TLC plate는 10×20cm의 크기로 잘라서 사용하였다. 전개용매는 n-부틸 알콜(n-butyl alcohol) : 아세트산(acetic acid glacial): 증류수(distilled water) (3:1:1 - v/v/v)로 혼합하여 실온에서 4시간 이상 포화시켜 사용하였다. 시료는 TLC plate의 끝에서 20 mm 되는 위치에 2 μL를 점적하였고, 시료 간격은 15 mm를 유지하였다. 1시간 이상 점적 후 TLC plate는 50 ℃ dry oven에서 5분간 건조시킨다. 건조된 TLC plate에 발색시약 0.2% 닌하이드린(ninhydrin)을 뿌리고, 100 ℃ dry oven에서 5분간 발색 시킨 후 GABA spot을 확인하였다.
4. 결과
(1) 락토바실러스 플란타륨 ( Lactobacillus plantarum ) K154 균주를 이용하여 2차 젖산 발효한 와송의 생균수 및 pH , 산도 변화
생와송과 당절임액 1차 발효물을 3배, 5배 희석하여 2차 젖산발효의 발효시간에 따른 생균수를 측정한 결과를 표 2에 나타내었다. 1일째 4가지 조건 모두 109 CFU/mL로 증가하여 2일째까지 109 CFU/mL로 유지되었으나, 3일째에 생와송을 이용한 발효에서는 급격히 감소하여 3배는 107, 5배는 108 CFU/mL로 감소하는 것을 알 수 있다. 반면에 와송 당절임액을 이용한 2차 발효에서는 3일째까지 109 CFU/mL로 유지되는 것을 알 수 있다. 이것으로 보아 와송 당절임액이 균생육에 유리한 것을 알 수 있다.
단위: CFU/mL
2차 발효 시간 (일)
0 1 2 3
생와송 3배 희석 2.4×107 1.75×109 3.05×109 3.10×107
5배 희석 5.30×109 1.20×109 1.50×108
와송 당절임액 3배 희석 1.20×109 2.50×109 2.80×109
5배 희석 1.50×109 2.70×109 2.30×109
2차 젖산발효물의 pH와 산도를 측정하여 보았을 때의 결과를 도 7에 나타내었다. pH는 4가지 조건 모두 3일째까지 약 pH 4.7로 유지되는 경향을 보였으며, 산도를 측정한 결과 초기 산도가 1.02%로 가장 높게 나타난 생와송 3배 희석한 발효물에서는 배양 전 1.02%에서 배양 3일 후 0.60%로 산도가 감소하는 경향을 보이는데 반해 다른 발효물에서는 산도가 점차 증가하여 3일 째 1.07%, 1.19%, 0.98%로 대체적으로 1% 초반의 수치를 나타냈다.
(2) 락토바실러스 플란타륨 ( Lactobacillus plantarum ) K154 균주를 이용하여 젖산 발효한 와송의 GABA 함량 변화
와송 당절임액의 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM 균주를 이용한 1차 발효를 통해 당을 소진하였고, 이러한 1차 발효물을 이용하여 3배, 5배 희석하여 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 발효한 발효물의 GABA 함량을 측정한 결과를 도 8에 나타내었다. 3배, 5배 희석한 발효물을 비교하였을 때, 생와송과 당절임액 모두 1차 발효물을 3배 희석하여 2차 발효한 발효물이 MSG가 2일째 모두 소진되어 GABA 함량이 더욱 높은 것을 알 수 있으며, 생와송과 당절임액을 이용한 2차발효의 GABA 전환을 비교하였을 때, 당절임액을 이용한 2차 발효에서 GABA 함량이 약 1% 이상으로 더 높은 것을 알 수 있다.
3일간 2차 젖산발효한 생와송과 와송 당절임액 발효물의 유리아미노산 성분을 분석한 결과는 표 3과 같다. 글루타메이트(Glutamate) 함량에서 생와송 발효물은 배양 전 7631.68 ㎍/mL에서 3일간 배양 후 24.57 ㎍/mL으로 감소하여 나타났으며, GABA 함량에서는 배양 전 11.17 ㎍/mL에서 3일간 배양 후 6163.90 ㎍/mL으로 증가하였다. 와송 당절임액은 배양전 글루타메이트(Glutamate)함량은 6404.60 ㎍/mL에서 3일간 배양 후 42.03 ㎍/mL으로 감소하였으며, GABA 함량은 117.58 ㎍/mL에서 65556.45 ㎍/mL으로 증가하여 생와송을 이용한 2차 젖산발효보다 더 높은 GABA 전환율을 나타냈다.
Amino acids 2차 발효시간 (일)
㎍/mL
Raw Sugar extract
0 3 0 3
Cys 0.00 0.00 0.00 0.00
ASP 51.42 46.73 42.47 68.67
GLU 7631.68 6404.60 24.57 42.03
ASN 22.98 24.65 3.05 29.93
SER 49.43 51.55 5.89 0.00
GLN 7.79 9.31 13.44 0.00
GLY 31.83 34.47 58.05 97.81
HIS 11.30 10.89 9.71 25.87
ARG 35.51 40.45 80.30 63.03
THR 46.51 53.51 22.11 21.02
ALA 126.68 142.13 172.81 181.63
GABA 117.17 117.58 6163.90 6556.45
PRO 39.90 52.54 0.00 0.00
TYR 71.84 77.41 44.09 64.76
VAL 99.18 106.05 64.01 123.11
MET 24.75 25.58 10.97 15.42
Cys2 0.00 0.00 0.00 0.00
ILE 93.49 98.79 61.03 101.70
LEU 149.76 164.45 97.11 158.21
PHE 90.48 100.09 46.86 80.35
TRP 0.00 0.00 0.00 0.00
LYS 85.58 86.92 96.66 86.07
Total 8787.27 7647.69 7017.03 7716.06
한국미생물보존센터(국외) KCCM43010 20121218

Claims (5)

  1. (1) 와송 및 설탕을 1:0.5-2의 중량비로 혼합하여, 1일 내지 6달 동안 실온에서 당절임하여 와송 당절임액을 제조하는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계에서 제조된 와송 당절임액을 10 내지 20 °Brix 당도로 희석하는 단계;
    (3) 상기 (2) 단계에서 희석된 와송 당절임액을 배지로 하여 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SM (KCCM 43010) 스타터(starter)를 접종하고 25 내지 40℃에서, 1 내지 7일 동안 배양하여 점질물을 생산하는 1차 발효 단계; 및
    (4) 상기 1차 발효물 전체에 대하여 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG) 2 중량% 및 효모 추출물(Yeast extract) 0.5 중량%를 더 첨가하고, 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum) K154 (KACC91727P) 스타터(starter)를 접종하여, 25 내지 40℃에서, 1 내지 7일 동안 배양하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)를 생산하는 2차 발효 단계를 포함하는 점질물 및 GABA 증진된 와송 발효물 제조방법.
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