KR101424167B1 - 곡물에서 분리된 신규한 유산균을 이용한 혼합곡의 발효 방법 및 이의 대량 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곡물에서 분리된 신규한 복합유산균을 이용한 혼합곡의 발효 방법 및 대량 생산 방법에 관한 것으로 구체적으로 락토바실러스 플랜타럼, 스트렙토코커스 써모필러스, 엔테로코커스 피칼리스로 혼합곡을 발효하여 프로테아제(protease)와 아밀라제(amylase) 역가가 높은 발효혼합곡을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 소화가 어렵고 거친 조직감 등으로 인한 일반 혼합곡의 단점이 유산균 발효과정을 통해 보완되고 프로테아제와 아밀라제에 의해 섭취 및 소화가 용이한 기능성이 우수한 발효혼합곡을 제조할 수 있다.
또한 건강에 유익함에도 상기와 같은 문제점으로 기피되던 혼합곡을 용이하게 섭취할 수 있게 해 현대인의 건강 개선에 도움을 줄 것으로 기대된다.

Description

곡물에서 분리된 신규한 유산균을 이용한 혼합곡의 발효 방법 및 이의 대량 생산 방법{The fermentation method for mixed grains using novel lactic acid bacteria isolated from grains and its production methods}
본 발명은 곡물에서 분리된 신규한 복합유산균을 이용한 혼합곡의 발효 방법 및 상기 발효방법을 이용한 대량 생산 방법에 관한 것으로 구체적으로 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 균을 하나 또는 둘 이상 혼합한 복합유산균으로 혼합곡을 발효시켜 프로테아제(protease)와 아밀라제(amylase) 역가가 높은 발효혼합곡 제조 방법에 관한 것이다.
사람의 중요한 에너지원인 곡류는 껍질이 제거되지 않은 완전곡물에 영양원이 골고루 들어 있어 사람에게 가장 좋다. 이는 대부분의 중요한 영양소와 항산화물질 및 미네랄 등이 곡물의 외피와 껍질부분에 다양하게 함유되어 있기 때문이다. 따라서 쌀의 경우에도 도정한 백미보다 현미가 영양적으로 더 균형을 갖추고 있다. 다른 곡물의 경우에도 외피와 눈이 부착된 상태의 곡물을 섭취하는 것이 영양이 골고루 함유되어 있어 건강에 유용하다. 이와 같은 사실은 많이 알려져 있지만, 외피와 껍질이 그대로 있는 완전곡물의 섭취를 기피하고 있는 실정이다. 그 이유는 외피가 부착된 곡물은 거칠어 먹기 힘들고 맛이 없으며 소화가 잘 되지 않기 때문이다.
완전곡물을 기피하는 생활 습관으로 인하여 현대인들에게 당뇨병, 비만 및 고혈압 등과 같은 성인병이 최근 크게 증가하고 있다. 이러한 성인병으로 고생하는 사람들은 잡곡을 섭취하려고 노력을 하지만 소화 흡수력이 낮아 그 효과는 크지 않다. 잡곡류의 섭취가 건강에 도움이 된다는 많은 보고가 있다. 잡곡류를 효율적으로 섭취하여 각종 성인병을 예방하고 소화효율을 높이는 것이 필요하다.
또한 현대인들의 불규칙한 식사습관 및 각종 인스턴트 식품의 섭취와 각종 화학 약제의 음용으로 장내 유산균의 수도 급격히 감소되어 있는 상태이다. 이를 위해서는 유산균의 섭취가 매우 중요하다. 대부분의 발효식품은 액상발효로 제조된다. 주식으로 항상 섭취하는 곡물을 고형상태에서 발효하여 발효 효과를 나타내게 하는 것은 중요한 과제이다.
본 발명은 현미와 백태를 주재료로 한 혼합곡물에서 잘 생장하는 유산균을 이용하여 유산균 곡물발효물 및 이의 제조방법을 제공함으로써 곡물의 소비를 촉진하여 농가의 경제적 문제 해결에 도움을 줄 뿐만 아니라, 기능성이 우수한 유산균 곡물발효물을 제공하여 국내외 소비자의 건강향상에 일조하고자 한다.
등록특허공보 제10-1192673 복합유용발효미생물을 이용한 혼합곡의 발효 방법 및 대량 생산 방법
따라서 본 발명의 주된 목적은 혼합곡에서 잘 자라는 복합유산균으로 혼합곡을 발효시켜 영양성이 높고 섭취가 용이하며 기능성이 우수한 발효혼합곡의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 복합유산균을 이용한 발효혼합곡의 제조방법으로 제조된 발효혼합곡을 대량 생산하여 제공하는데 있다.
본 발명은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 균을 배양한 배양균을 하나 또는 둘 이상을 혼합하여 복합유산균을 만들고, 상기 복합유산균를 액체배지에서 개별 종배양하는 단계, 상기 개별 종배양된 각 균주의 배양액을 0.1 내지 5중량%의 당밀이 포함된 액체배지에 혼합하여 개별 종배양 한 다음 상기 개별 종배양된 배양액을 액체배지에 각각 1 내지 3중량% 첨가하고, 32 내지 38℃에서 1 내지 2일간 본배양하는 단계 및 상기 배양된 본배양액 1 내지 10중량부를 혼합곡 100중량부에 첨가하여 혼합하고 30 내지 40℃에서 1 내지 3일간 배양하는 단계를 포함하는 발효혼합곡 제조방법을 제공한다.
발효혼합곡 제조방법에 사용되는 곡물은 현미, 흑미, 보리현미, 우리밀, 수수, 율무, 백태 및 흑태로 구성되며, 혼합비율은 현미, 흑미, 보리현미 각각 30 내지 45중량부, 백태, 흑태 각각 30 내지 45중량부, 우리밀, 수수, 율무 각각 10 내지 25중량부를 섞어서 혼합곡을 제조한다. 상기 혼합곡은 곡물 형태 그대로 이용하거나 가루로 제분하여 이용할 수 있으며, 가루의 입자 크기는 관계없다.
상기와 같은 구성의 혼합곡을 사용할 경우, 상기 복합유산균의 균주에 제공되는 성분의 상관관계 등으로 인해 발효 시 영양성분 및 기능성이 우수한 발효 혼합곡을 제조할 수 있다.
본 발명의 발효혼합곡 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis)의 개별 종배양은 MRS 액체배지 또는 포도당(glucose), 효모추출물(yeast extract) 및 초산나트륨이 포함된 액체배지를 사용하며, 30 내지 38℃에서 24 내지 48시간 이루어지는 것이 바람직하다.
상기 MRS 액체배지의 성분은 젤라틴(Pancreatic digest of gelatin) 20.0g, 쇠고기추출물 16.0g, 덱스트로스 40g, 인산칼륨(Dipotassium phosphate) 4.0g, 폴리솔레이트80 2.0g, 나트륨 아세테이트 10.0g, 암모늄 시트레이트 4.0g, 황산마그네슘 0.4g을 혼합하여 제조한다.
개별 종배양은 각 균주의 활성상태를 높이고 균수를 조절하기 위한 것으로, 상기 조건에 따라 종배양을 실시하면 본배양에 적합한 상태의 배양액을 수득할 수 있다.
본 발명의 발효혼합곡 제조방법에 있어서, 상기 각 유산균들의 개별 종배양된 배양액의 균주 농도는 1×108내지 2×109cfu/㎖이다.
상기와 같은 균수의 배양액을 본배양에 첨가하면 발효혼합곡 제조에 적합한 상태의 본배양액을 제조할 수 있다.
상기 본배양액을 혼합곡에 첨가하여 혼합할 때에는 배양액을 안개 분사하는 것이 바람직하며, 혼합기 등을 사용하여 혼합할 수 있다.
배양액과 혼합곡을 혼합한 다음 일정량을 혐기적으로 발효시킬 수 있으며, 발효가 완료된 후 건조 및 분쇄를 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 복합유산균을 이용하여 혼합곡을 발효시키는 방법으로 제조된 발효혼합곡을 제공한다.
본 발명에 따르면 소화가 어렵고 거친 조직감 등으로 인한 일반 잡곡의 단점을 보완하여, 섭취 및 소화가 용이하고 기능성이 우수한 유산균 발효혼합곡의 제조방법 에 관한 것이다.
현대인은 불규칙한 식사습관 및 각종 인스턴트 식품의 섭취로 인하여 장내 유산균의 수가 크게 부족하기 때문에, 유산균의 섭취가 매우 중요하다. 그러기 위해서는 유산균을 이용한 액상발효 뿐만 아니라 곡물의 고형상태로 발효하여 유산균 발표식품을 제조하고 이를 섭취하는 것이 필요하다.
본 발명은 현미와 백태를 주재료로 한 혼합곡물을 복합유산균을 이용하여 유산균 곡물발효물 및 이의 제조방법을 제공함으로써 곡물의 소비를 촉진하여 농가의 경제적 문제 해결에 도움을 줄 뿐만 아니라, 기능성이 우수한 유산균 곡물발효물을 제공하여 국내외 소비자의 건강향상에 일조하고자 한다.
또한 건강에 유익함에도 불구하고 상기와 같은 문제점으로 기피되던 잡곡을 보다 용이하게 섭취할 수 있어, 현대인의 건강을 개선할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 혼합곡물 혼합유산균 발효 공정도이다.
본 발명은 신규 미생물인 복합유산균을 이용하여 현미, 흑미, 보리현미, 우리밀, 수수, 율무, 백태 및 흑태를 혼합한 혼합곡물을 발효시켜 발효혼합곡을 제조하는 제조방법에 관한 것이다.
상기 복합유산균은 신규 미생물인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 균을 배양한 배양균을 하나 또는 둘 이상을 혼합하여 만든다.
복합유산균 중 신규 미생물인 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)는 현미로부터 분리된 유산균으로 살모넬라 등의 유해 병원균의 증식을 억제하고, 내산성, 내담즙산성 및 내열성을 가진다. 다른 신규 미생물인 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)는 당화된 곡물을 유산으로 발효시켜 주며 중성인 pH를 4.0~4.5로 낮춰 준다. 스트렙토코커스 써모필러스 균에 의해 곡물이 발효되면 발효곡물의 영양학적 및 생리학적 가치 외에도 발효곡물의 품질특성, 즉 부드러운 맛, 풍미 등이 우수하다. 또 다른 신규 미생물인 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis)는 장내에서 유익한 균의 증식을 촉진시키고, 유해균의 증식을 억제하여 장내 미생물의 균총을 균형있게 유지함으로써 숙주에 유익한 영향을 미치는 곡물발효 균주로 작용한다.
본 발명의 복합유산균을 구성하는 상기 신규 미생물들은 16S rDNA 염기서열에 기초하여 99% 상동성을 보이는 락토바실러스 플랜타럼, 스트렙토코커스 써모필러스 및 엔테로코커스 피칼리스 균으로 각각 동정되었다. 당 이용성 분석 및 단백질분해효소능, 내산성, 내담즙산성, 동결건조 시 수율을 비교하여 신균주임을 확인하였다. 본 발명의 신규 유산균인 락토바실러스 플랜타럼, 스트렙토코커스 써모필러스 및 엔테로코커스 피칼리스는 공지된 유산균과는 다른 단백질분해능, 내산성, 내담즙산성, 동결건조시의 수율 등 서로 다른 특성이 있다.
본 발명의 혼합곡물을 발효시키기 위해서는 상기 복합유산균를 액체배지에서 개별 종배양하는 단계, 및 상기 개별 종배양된 각 균주를 본배양하는 단계로 구성된다. 상기 본배양은 0.1 내지 5중량%의 당밀이 포함된 액체배지에 개별 종배양된 신규 미생물인 상기 균주 배양액을 각각 1 내지 3중량%를 첨가하고, 32 내지 38℃에서 1 내지 2일간 본배양한다.
혼합곡물을 발효시키기 위해서 배양된 상기 본배양액 1 내지 10중량부를 혼합곡 100중량부에 첨가하여 혼합하고 30 내지 40℃에서 1 내지 3일간 배양하는 방법으로 발효혼합곡물의 제조방법을 제공한다.
발효혼합곡물 제조방법에 사용되는 곡물은 현미, 흑미, 보리현미, 우리밀, 수수, 율무, 백태 및 흑태로 구성되며, 혼합비율은 현미, 흑미, 보리현미 각각 30 내지 45중량부, 백태, 흑태 각각 30 내지 45중량부, 우리밀, 수수, 율무 각각 10 내지 25중량부를 섞어서 혼합곡을 제조한다. 상기 혼합곡은 가루로 제분하여 혼합하여, 가루의 입자 크기는 관계없다.
상기와 같은 구성의 혼합곡을 사용할 경우, 상기 복합유산균의 균주에 제공되는 성분의 상관관계 등으로 인해 발효 시 영양성분 및 기능성이 우수한 발효 혼합곡을 제조할 수 있다.
(실시예 1)
각 균주의 개별 종배양 분리된 유산균 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis)를 적당량 취하여 상업적으로 제조하여 판매하고 있는 MRS 고체배지(Beef Extract 10.0g, Yeast Extract 5.0g, Dextrose 20.0g, Sorbitan Monooleate 1.0g, Ammonium Citrate 2.0g, Sodium Acetate 5.0g, MnSO4.H2O 0.05g, Na2HPO4 2.0g, Agar 15g; 55g/ℓ)에 도말하여 35에서 1일 정도 배양한 다음, 단일 콜로니(colony)를 취하여 한천을 제외한 동일한 구성의 MRS 액체배지 300㎖에 접종하였다. 이를 35℃에서 2일 배양한 후 종균으로 사용하였다. 균수는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)이 9.2×108 cfu/㎖, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)가 9.4×108 cfu/㎖, 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis)가 1.1×109 cfu/㎖였다.
(실시예 2)
복합유산균 본배양
복합미생물의 대량 배양액은 상기 실시예 1에서 제조된 각 균주배양액을 종균으로 사용하여 제조하였다. 복합유산균을 대량으로 배양하기 위하여 10ℓ의 수도수에 60g의 식용당밀을 충분히 녹이고 여기에 상기 실시예 1의 종배양액을 각각 200㎖씩 첨가하였다. 이어서 수도수를 첨가하여 최종 20ℓ가 되도록 하였다. 이 미생물 혼합액을 35℃에서 2일간 배양하였다. 배양된 복합유산균 배양액의 pH는 4.3이었다. 상기 배양액의 균수는 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum)이 6.8×108 cfu/㎖, 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)가 4.5×108 cfu/㎖, 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis)가 6.1×108 cfu/㎖였다.
(실시예 3)
효소능 조사
3-1 a-아밀라아제
① 시약
㉮ 1 % 가용성전분용액:가용성전분(최순품) 1 g을 물에 녹이고 호화하여 100 mL로 한다.
㉯ 맥바인(Mcllvaine) 완충액(pH 6.0 또는 7.0):0.1 N 인산일수소나트륨액 일정량에 0.1 N 구연산액을 넣어 pH 6.0 및 7.0으로 각각 만든다.
㉰ 0.1% 염화칼슘용액:염화칼슘(순품) 1 g을 물에 녹여 1 L로 한다.
㉱ 요오드시액:요오드 0.2 g과 요오드칼륨 2 g을 물에 녹여 100 mL로 하고 그 1 mL에 1 N 염산 1 mL를 넣고 물로 100 mL로 한다.
② 장치
분광광도계(Spectrophotometer)
③ 시험용액의 조제
검체 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 20 mL 시험관 2개를 준비하여 각각 시험용, 공시험용으로 한다. 시험용 시험관에 1% 가용성전분용액 5 mL, 맥바인완충액(pH 6.0 또는 7.0으로서) 13 mL와 0.1% 염화칼슘용액 1 mL를 넣고 37℃로 가온하고 검액 1 mL를 넣은 후 37℃에서 30분간 방치한다. 별도로 100℃에서 30분간 가열하여 활성을 잃은 검액 1 mL를 위와 같이 조작하여 공시험용으로 한다. 시험용과 공시험용반응액 0.2 mL에 요오드시액 10 mL를 넣은 것을 시험용액으로 한다.
④ 시험조작
물을 대조액으로 하여 액층 1 cm 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 작아야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.
3-2 프로테아제
① 시약
㉮ 0.6% 카제인용액:카제인(최순품)을 건조하여 0.6 g을 달아 0.1 N 수산화나트륨액 20 mL에 가열하여 녹여서 식힌 다음 0.1 M 인산을 넣어 pH 7.0으로 조정하고, pH 7.0 완충액 20 mL를 넣어 100 mL로 한다.
㉯ 0.4 M 삼염화초산액:삼염화초산(순품) 65.4 g을 물에 녹여 1 L로 한다.
㉰ 0.4 M 탄산나트륨액:탄산나트륨(순품) 42.5 g을 물에 녹여 1 L로 한다.
㉱ 포린시액:식품첨가물공전에 따라 만들어 원액으로 한다.
㉲ 완충액:0.1 M 인산염완충액(pH 6.0 또는 8.0) 또는 0.1 M 초산염 완충액 (pH 6.0 또는 8.0)
② 장치
분광광도계(Spectrophotometer)
③ 시험용액의 조제
검체 약 5.0 g을 정밀히 달아 물 또는 완충액에 녹여 100 mL로 한 다음 여과하여 검액으로 한다. 0.6% 카제인용액 1 mL를 시험관에 넣고 37℃의 항온수욕중에서 가온한 다음 여기에 검액 1 mL를 정확히 넣고 잘 흔들어 섞는다. 곧 37℃의 항온수욕중에 넣고 정확히 10분간 반응시킨 다음 여기에 0.4M 삼염화초산액 2 mL를 넣고 다시 37℃에서 25분간 방치한 다음 이것을 여과한다. 여액 1 mL를 시험관에 정확히 취하여 0.4 M 탄산나트륨용액 5 mL 및 포린시액(원액을 3배 희석한 액) 1 mL를 넣어 잘 흔들어 섞는다. 37℃에 서 20분간 방치한 다음 발색된 액을 시험용액으로 한다. 이와는 별도로 검액 1 mL를 정확히 취하여 시험관에 넣고 37℃에서 10분간 방치한 후 0.4 M 삼염화초산액 2 mL를 넣어서 혼화하고 0.6% 카제인용액 1 mL를 넣어 37℃에서 25분간 방치한 다음 이하 시험용액과 동일하게 조작하여 공시험용액으로 한다.
④ 시험조작
물을 대조액으로 하여 액층 1 cm, 파장 660 nm에서 흡광도를 측정한다. 이때 시험용액의 흡광도는 공시험의 흡광도보다 0.030이상 커야 한다. 발색의 정도가 지나쳐 측정이 곤란한 경우는 검액을 희석하여 시험하고 희석배수를 적용한다.
(실시예 4)
발효혼합곡의 대량 제조 및 유산균 및 효소능
혼합곡을 발효하기 위하여 각종 곡물을 표 1과 같은 중량비로 구성하였다. 각각의 곡물을 비율에 맞추어 혼합기에 넣고 혼합을 하였다. 혼합곡물의 중량을 기준으로 10%의 복합미생물 배양액을 안개분사로 분사하면서 20분간 혼합하였다. 충분히 혼합된 혼합곡을 1㎏씩 알루미늄파우치에 넣고 봉한 후 35℃의 배양실에서 2일간 발효하였다. 발효 후 50℃ 건조기내에서 수분이 10% 이내로 되도록 건조 후 유산균수
와 프로테아제 및 아밀라제 역가는 다음과 같았다(표 2 참조).
곡물 시험구1 시험구2 시험구3
현미 20 25 30
흑미 10 10 10
보리현미 10 10 10
백태 20 30 30
흑태 10 10 5
우리밀 10 5 5
수수 10 5 5
율무 10 5 5
분석항목 시험구1 시험구2 시험구3
유산균수(cfu/g) 4.5×105 6.3×105 7.1×105
프로테아제 (AU/g) 128 256 256
아밀라제 (AU/g) 256 512 512
상기 실시예 4에서 발효혼합곡은 현미, 흑미, 보리현미, 우리밀, 수수, 율무, 백태 및 흑태를 사용하였다. 상기 실시예 4에서 사용된 곡물의 혼합비율은 현미, 흑미, 보리현미 각각 30 내지 45중량부, 백태, 흑태 각각 30 내지 45중량부, 우리밀, 수수, 율무 각각 10 내지 25중량부 사이의 수치를 선택하여 혼합곡을 제조하였다. 상기 혼합곡은 곡물 형태 그대로 이용하거나 가루로 제분하여 이용할 수 있으며, 가루의 입자 크기는 관계없다.
그 결과 각 시험구의 혼합곡 비율이 증가할수록 유산균 수 및 효소의 역가가 증가하는 것을 보여주고 있다. 상기 표1 및 표2에서 프로테아제와 아밀라제의 역가는 효소의 활성도를 보여 주는 것으로서 시험구 2 및 시험구 3에서 가장 높은 효소 활성도를 보여주고 있으며, 유산균 수에서는 시험구 3이 가장 많았다. 즉 현미와 흑태의 함량이 높은 발효혼합곡에서 유산균의 활성이 높았다.

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  4. 복합유산균을 이용한 프로테아제와 아밀라제 활성이 증가된 발효혼합곡물의 제조방법에 있어서,
    상기 복합유산균은 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 엔테로코커스 피칼리스(Enterococcus faecalis) 균을 혼합하여 복합유산균을 만들고,
    상기 복합유산균을 당밀이 0.1 내지 5중량% 포함된 액체배지에서 개별 종배양한 다음,
    상기 개별 종배양된 배양액을 각각 1 내지 3중량%를 액체배지에 첨가하여 32 내지 38℃에서 1 내지 2일간 본배양한 후,
    상기 본배양 단계에서 배양된 배양액 1~10중량부를 혼합곡물 100중량부와 혼합하고 30 내지 40℃에서 1 내지 3일간 배양하여 복합유산균을 이용한 발효혼합곡물을 제조하되,
    상기 혼합곡물은 현미, 흑미, 보리현미 각각 30 내지 45중량부와 백태, 흑태 각각 30 내지 45중량부 및 우리밀, 수수, 율무 각각 10 내지 25중량부를 혼합한 혼합곡물로 구성되는 것을 특징으로 하는 복합유산균을 이용한 발효혼합곡물의 제조방법.
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