KR20230050119A - 곡물 발효에 적합하며 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 mg7011 - Google Patents
곡물 발효에 적합하며 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 mg7011 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 (KACC 81147BP)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곡물 발효에 적합하며 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 (KACC 81147BP)에 관한 것이다. 본 발명에서 발굴한 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)은 우수한 프로바이오틱 및 쌀 발효를 위한 스타터 특성을 보였다. 본 발명의 균주는 위장 안정성(산담즙 내성, 장내 상피세포 부착), 건강증진기능성(항산화 활성, 항염증 활성, 장보호능), 안전성(바이오제닉아민 생성 효소 부재, 비용혈성)과 같은 프로바이오틱 특성이 있다. 또한, 본 발명의 균주는 α-amylase(아밀라아제), phytase(피타아제) 효소 활성 등이 뛰어나 쌀 발효 스타터로서의 적합성이 있었다. 결론적으로 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011은 프로바이오틱 및 쌀 발효를 위한 스타터 특성을 동시에 가지는 유산균으로서 다양한 식품 소재로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 (KACC 81147BP)에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 곡물 발효에 적합하며 프로바이오틱 기능이 있는 신규의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 (KACC 81147BP)에 관한 것이다.
유산균은 다양한 발효식품의 주요 미생물로, 유기산과 항균물질을 생성하여 발효 제품의 안전성을 높이고 저장 수명을 늘린다. 또한 유산균은 탄수화물, 단백질, 펩타이드 및 지질 등 식품 내 구성물질들을 효소활성을 통해 향기성분을 생성하여 바람직한 산미 및 향미를 형성한다. 한편, 유산균은 가장 일반적으로 사용되는 프로바이오틱스로 여겨진다.
프로바이오틱스는 숙주에게 건강상의 이점을 주는 살아있는 미생물로, 이를 선발하기위해서는 다음과 같은 특성을 고려해야한다; 산과 담즙에 내성을 가지고, 사람의 장내 상피에 부착되어야하며, 면역을 조절하고, 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 살모넬라 속(Salmonella sp.), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile) 등과 같은 유해균을 억제한다. 그 외에도 콜레스테롤 수치를 낮추고, 영양과 장 건강을 개선하며, 면역 반응을 조절하고, 암을 예방할 수 있는 등의 다양한 효능을 가지고 있다. 따라서, 건강 기능성의 프로바이오틱 특성을 지닌 유산균을 개발하는 것에 대한 다양한 연구가 이루어지고 있다.
일반적으로는 프로바이오틱스를 제공하는 제공원으로는 유제품이 있으나, 다양한 인종그룹에서 높은 유당 불내증 발병이 나타나며, 예민한 환자들에게 우유 단백질이 알레르기 반응을 유발할 수 있으며, 아토피 질환과 관련이 있다고 보고된 바 있다. 또한, 우유는 4~5%의 지방을 함유하고 있으며, 많은 양의 유제품 섭취 시 혈액 내 총 콜레스테롤 및 LDL-콜레스테롤 함량이 증가하여 심장 질환의 주요 위험 요소가 될 수 있다. 이와 같이 유제품 기반 식품의 건강상 우려가 증가함에 따라 소비자의 관심이 채소, 과일 및 곡물과 같은 비유제품의 프로바이오틱 식품으로 전환되고 있다.
한편, 곡물은 전세계적으로 주요 주식으로써 소비되며(동아시아의 찐 쌀, 유럽 및 북미의 밀,보리빵, 아프리카 및 남미의 수수, 옥수수죽 등), 탄수화물, 섬유질, 단백질, 비타민, 미네랄이 풍부하고, 오랫동안 발효의 주요 기질로 사용되었다. 미생물이 여러 물질을 대사하고 효소를 생산하므로, 발효 곡물은 발효되지 않은 곡물에 비해 영양적 및 감각적 특성, 소화율, 저장성이 향상된다. 곡물의 발효는 주로 자연 발효에 의존하는 반면 유제품은 대부분 종균 배양에 의존한다. 그러나, 곡물은 영양소 공급원으로 작용하여, 리모시락토바실러스 및 비피도박테리움 속의 성장을 촉진하고, 이의 산 및 담즙 내성을 증가시키기때문에 비유제품 프로바이오틱 식품의 가장 잠재적인 대체제로 여겨진다. 종균을 이용하여 곡물을 발효시키려는 시도가 있었지만, 발효 특성 및 프로바이오틱 기능이 정의된 종균을 개발하기 위한 추가 연구가 필요하다.
한편, 이노시톨에 6개의 인산이 에스터결합으로 연결되어 있는 피틴산은 주로 곡물, 씨앗, 콩에 풍부하며, 인 저장 기능을 한다. 그러나, 이 화합물은 미네랄 및 단백질과 복합체를 형성하여 장 내에서 영양소 흡수를 억제하기 때문에 항영양제로 여겨진다. 발효 시 박테리아가 생성하는 피타아제(phytase)를 포함하는 포스파타아제(phosphatase)에 의해 피틴산이 분해될 수 있으므로 곡물 종균 발효는 영양가를 향상시키는 효과적인 방법 중 하나이다. 따라서 곡물용 스타터를 개발하기 위해서는 후보 균주의 피타아제 활성을 조사하는 것이 중요하다.
본 발명은 발효 종균으로서 적합하고 우수한 프로바이오틱스 기능을 가지는 신규 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum)은, 바람직하게 항염 프로바이오틱 활성 또는 GABA (4-aminobutyrate) 생성능이 있는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 곡물에 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물을 제공한다. 이때, 상기 곡물은 일 예로 쌀, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 라이밀, 메일, 퀴노아, 옥수수, 콩일 수 있다.
본 발명에서 발굴한 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)은 우수한 프로바이오틱 및 쌀 발효를 위한 스타터 특성을 보였다. 본 발명의 균주는 위장 안정성(산-담즙 내성, 장내 상피세포 부착), 건강증진기능성(항산화 활성, 항염증 활성, 장보호능), 안전성(바이오제닉아민 생성 효소 부재, 비용혈성)과 같은 프로바이오틱 특성이 있다. 또한, 본 발명의 균주는 α-amylase(아밀라아제), phytase(피타아제) 효소 활성 등이 뛰어나 쌀 발효 스타터로서의 적합성이 있었다. 결론적으로 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011은 프로바이오틱 및 곡물 발효를 위한 스타터 특성을 동시에 가지는 유산균으로서 다양한 식품 소재로 활용될 수 있다.
도 1은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 안전성 테스트 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 모의 위장조건에서의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 생균수(log CFU/mL)(n=3)를 나타낸 것이다.
도 3은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장 상피세포 부착능에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 분획물의 항산화 활성(n=3)을 나타낸 것이다.
도 5는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 것(n=3)이다.
도 6은 장 투과도를 저하하는 과산화수소에 대한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장 보호 효과를 나타낸 것(n=3)이다.
도 7은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 생균수 (bar graph) 및 pH (line graph)를 나타낸 것(n=3)이다.
도 8은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 TLC 당 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀 내 유기산 생성량을 나타낸 것이다.
도 10은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 HPLC 당 분석결과를 나타낸 것이다.
도 2는 모의 위장조건에서의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 생균수(log CFU/mL)(n=3)를 나타낸 것이다.
도 3은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장 상피세포 부착능에 대한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 분획물의 항산화 활성(n=3)을 나타낸 것이다.
도 5는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 것(n=3)이다.
도 6은 장 투과도를 저하하는 과산화수소에 대한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장 보호 효과를 나타낸 것(n=3)이다.
도 7은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 생균수 (bar graph) 및 pH (line graph)를 나타낸 것(n=3)이다.
도 8은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 TLC 당 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀 내 유기산 생성량을 나타낸 것이다.
도 10은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 HPLC 당 분석결과를 나타낸 것이다.
건강을 향상시키는 프로바이오틱스 및 곡물 발효를 위한 스타터 특성을 동시에 가지는 유산균을 개발하여 이를 식품에 적용하게 되면, 현대의 소비자의 수요에 맞게 발효 식품으로서의 활용 가능성이 높아질 수 있을 것이다. 따라서 본 발명에서는 프로바이오틱스로서의 건강기능성을 가지면서, 곡물 발효를 위한 스타터로서의 조건을 충족하는 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 개발하여 제공한다.
본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 타입균주와 동일하게 탄수화물(D-리보오스(ribose), D-갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 프럭토오스(fructose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose))을 대사하였다. 또한, 추가적으로 여러 탄수화물(L-아라비노오스(arabinose), 만노오스(mannose), 멜리바이오스(melibiose), 트레할로오스(trehalose), 라피노오스(raffinose), 글루콘에이트(gluconate), 5-케토글루콘에이트(gluconate))을 대사하였다. 또한, 다양한 효소 활성을 나타내는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011은 바이오제닉아민 생성 관련 유전자를 보유하지 않고, 용혈능이 없어 식품에 사용하기에 안전함을 확인할 수 있었다. 또한 산-담즙 내성을 나타내고, 장 부착능이 뛰어났으며, 높은 항산화 활성 및 항염증 활성을 나타내고, 장 상피를 손상시키는 과산화수소로부터 보호하여 장 건강을 증진시키는 등의 건강기능성을 나타내었다. 이를 통해 실제적으로 활용하기에도 안전하며 뛰어난 프로바이오틱 종균임을 확인할 수 있었다.
한편, 본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011은 곡물에 종균을 접종하여 얻은 쌀 발효물의 발효 특성, 성분을 분석하였을 때, 본 발명의 균주를 쌀 발효에 적용시, 잘 생장하여 쌀 스타터로서의 적합성을 확인할 수 있었다. 또한, 젖산을 생성하고 전분을 분해하여 다양한 올리고당을 생성하고, 효소 활성이 있어 전분과 피틴산이 풍부한 환경에서 이를 분해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 아울러, 본 발명의 균주를 종균으로 사용하여 요거트를 제조하였을 때 역시 잘 생장하였고, 여러 형태의 요거트에 적용할 수 있는 점도를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 알콜, 4-aminobutyrate (GABA), 아미노산, 페놀릭화학물 및 미오-이노시톨이 증가하여 향미가 풍부한 발효식품 제조가 가능함을 확인하였다.
또한, 본 발명은 곡물에 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물을 제공한다. 이때, 상기 곡물은 어느 것이든 제한되지는 않으나, 일 예로 일 예로 쌀, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 라이밀, 메일, 퀴노아, 옥수수, 콩일 수 있으며, 더 바람직하게는 쌀일 수 있다.
한편, 본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 발효 종균으로 사용하여 발효 식품을 제조시, 본 발명 균주를 종균으로 사용하는 것 외에는 당업계에 널리 알려진 발효 방법들을 선택적으로 적용 사용할 수 있다. 따라서, 각 제품별로 구체적인 발효 방법에 대한 설명은 생략하기로 한다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 또는 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1: 리모시락토바실러스 퍼멘텀(
Limosilactobacillus fermentum
) MG7011 동정 및 생화학적 특성 분석]
1) 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀(
Limosilactobacillus fermentum
) MG7011 동정
균 배양액으로부터 prep kit (Solgent, 대전)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였으며, Solgent (대전)에 의뢰하여 universal primer 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')를 사용한 PCR 반응을 진행하였다. NCBI BLAST program (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 증폭된 16S rDNA 서열의 상동성 비교를 통해 동정하였다. 그 결과, 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) DSM 20052T 타입균주와 99.93% 유사한 것으로 나타났으며, 해당 균주를 MG7011이라고 명명하고, 기탁기관인 국립농업과학원 미생물은행(KACC)에 2021년 07월 05일자로 기탁하여 기탁번호 KACC81147BP를 부여받았다.
하기에서 본 발명의 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) MG7011과 프로바이오틱스 특성 비교 실험을 위해 여러 미생물들을 사용하여 테스트하였고, 그 상세 조건은 하기 표 1과 같았다.
Test microorganisms | Collections | Culture conditions |
Limosilactobacillus fermentum MG7011 | KACC 81147BP | 37℃, MRS |
Limosilactobacillus fermentum (Type) | KACC 11441 | 37℃, MRS |
Limosilactobacillus fermentum (Commercial) | KCCM 35469 | 37℃, MRS |
Lactiplantibacillus plantarum WCFS1 | ATCC BAA-793 | 37℃, MRS |
Lactiplantibacillus rhamnosus GG | KCTC 5033 | 37℃, MRS |
Limosilactobacillus reuteri | ATCC 23272 | 37℃, MRS |
Enterococcus faecalis | KCCM 11729 | 37℃, BHI |
Listeria monocytogenes | ATCC19115 | 37℃, BHI |
2) 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀(
Limosilactobacillus fermentum
) MG7011 생화학적 특성
2-1) 탄수화물 대사 특성 (API 50CH)
MG7011의 탄수화물 대사 특성은 API CHL kit (BioMeriux Co., Marcy-l'toile, France)를 이용하여 측정하였다. 유산균 배양액으로부터 균체를 원심분리 및 세척하여 얻고, 이를 API 50 CHL 배지에 재현탁하였다. 120μl의 현탁액을 스트립의 각 튜브에 분주하고 미네랄 오일로 건조하지 않도록 튜브위에 분주하였다. 이를 37℃에서 48시간동안 배양하고, 그 후 파란 지시색이 노랗게 변하면 양성으로 표기하였다(25번은 검정으로 변한다).
API web (https://apiweb.biomerieux.com)에서 생화학적 특성에 따라 분석 결과, MG7011은 91.3% 리모시락토바실러스 퍼멘텀으로 동정되었다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀(Limosilactobacillus fermentum) DSM 20052T 타입균주의 분석결과는 API test finder(https://bacdive.dsmz.de/api-test-finder)의 데이터(ID 4654)를 참고하였다. 그 결과, 표 2와 같이 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011은 타입균주와 공통적으로 D-리보오스(ribose), D-갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 프럭토오스(fructose), 말토오스(maltose), 락토오스(lactose), 수크로오스(sucrose)를 대사하였다. 추가적으로 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011은 L-아라비노오스(arabinose), 만노오스(mannose), 멜리바이오스(melibiose), 트레할로오스(trehalose), 라피노오스(raffinose), 글루콘에이트(gluconate), 5-케토글루콘에이트(gluconate)를 대사하였으나, 타입균주는 해당 탄수화물을 대사하지 못하였다.
No | Carbohydrate | MG7011 | DSM20052 | No | Carbohydrate | MG7011 | DSM20052 | |
0 | Control | - | - | 25 | Esculin | - | - | |
1 | Glycerol | - | - | 26 | Salicin | - | - | |
2 | Erythritol | - | - | 27 | Cellobiose | - | - | |
3 | D-arabinose | - | - | 28 | Maltose | + | + | |
4 | L-arabinose | + | - | 29 | Lactose | + | + | |
5 | D-ribose | + | + | 30 | Melibiose | + | - | |
6 | D-xylose | - | - | 31 | Sucrose | + | + | |
7 | L-xylose | - | - | 32 | Trehalose | + | - | |
8 | D-adonitol | - | - | 33 | Inulin | - | - | |
9 | D-xylopytanoside | - | - | 34 | Melezitose | - | - | |
10 | D-galactose | + | + | 35 | Raffinose | + | - | |
11 | Glucose | + | + | 36 | Starch | - | - | |
12 | Frutose | + | + | 37 | Glycogen | - | - | |
13 | Mannose | + | - | 38 | Xylitol | - | - | |
14 | Sorbose | - | - | 39 | Gentiobiose | - | - | |
15 | Rhamnose | - | - | 40 | Turanose | - | - | |
16 | Dulcitol | - | - | 41 | Lyxose | - | - | |
17 | Inositol | - | - | 42 | Tagatose | - | - | |
18 | Mannitol | - | - | 43 | D-fucose | - | - | |
19 | Sorbitol | - | - | 44 | L-fucose | - | - | |
20 | Mannopyranoside | - | - | 45 | D-arabitol | - | - | |
21 | Glucopytanoside | - | - | 46 | L-arabitol | - | - | |
22 | N-acetyl-glucosamine | - | - | 47 | Gluconate | + | - | |
23 | Amygdalin | - | - | 48 | 2-ketogluconate | - | - | |
24 | Arbutin | - | - | 49 | 5-ketogluconate | + | - |
2-2) 효소 활성 측정 (API ZYM)
MG7011의 효소 활성은 API ZYM kit (BioMeriux Co., France)를 이용하여 측정하였다. 유산균 배양액으로부터 균체를 원심분리 및 세척하여 얻고, 이를 API resuspension medium에 재현탁하였다. 현탁액을 스트립의 각 튜브에 분주하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 시약 A, B를 넣어주고, 컬러차트에 따라 각 효소 활성을 0~5점으로 표기하였다(negative=0, weak positive= 1 or 2, positive= 3, 4, or 5).
그 결과, 표 3과 같이 MG7011은 지질 대사 효소(esterase, esterase-lipase), 펩티데이즈(leucine arylamidase, valine arylamidase), 포스페데이즈(acid phosphatase, Naphtol-AS-BI-phosphohyedrolase) 및 갈락토시데이즈(α- 및 β-) 활성을 보였다. 이같은 결과는 MG7011이 다양한 영양소를 잘 소화할 수 있도록 도울 것으로 생각된다. 또한, MG7011은 높은 α-glucosidase 활성을 나타냈는데, 이는 말단의 α-1,4 결합을 끊은 효소로, 전분 및 올리고당으로부터 포도당을 생성할 것으로 예상된다. 한편, MG7011은 대장암의 주요 요인으로 여겨지는 β-glucosidase 활성이 부재하여 안정성을 나타냈다.
Enzymeb | MG7011 |
Esterase(C4) | 4 |
Esterase-Lipase(C8) | 1 |
Leucine arylamidase | 4 |
Valine arylamidase | 2 |
Acid phosphatase | 2 |
Naphtol-AS-BI-phosphohyedrolase | 3 |
α-galactosidase | 5 |
β-galactosidase | 5 |
α-glucosidase | 5 |
bMG7011은 alkaline phosphatase, lipase(C14), cystine arylamidase, trypsin, α-chymotrypsin, β-glucuronidase, β-glucosidase, N-acetyl-β-glucosaminidase, α-mannosidase, α-fucosidase에 대하여 음성(효소활성부재)으로 판단함.
[실시예 2 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 생체 아민 유전자 및 용혈능 활성 확인]
프로바이오틱스는 아미노산과 단백질로부터 건강에 부정적인 영향을 줄 수 있는 바이오제닉 아민(Biogenic amine)을 생성해서는 안된다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 안전성을 평가하기 위해 multiplex-PCR 방법을 사용하여 genomic DNA로부터 바이오제닉 아민 형성과 관련된 각 유전자와 16S rRNA 유전자를 검출했다. hdc (histidine decarboxylase)와 tyrdc (tyrosine decarboxylase) 유전자는 다음 프라이머 쌍을 사용하여 증폭되었다: hdc: HDC3 (5'-GATGGTATTGTTTCKTATGA- 3')와 HDC4 (5'-CAAACACCAGCATCTTC- 3'); tyrdc: TD2 (5'-ACATAGTCAACCATRTTGAA- 3')와 TD5 (5'-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG- 3'); 16s rRNA 유전자: 27F와1492R.
multiplex-PCR에서 각 바이오제닉 아민 유전자의 프라이머 세트를 16S rRNA 프라이머와 함께 혼합하여 동시에 증폭되었다. 16S rRNA 유전자는 PCR 반응 및 실험 조건에 대한 양성 대조군이다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 게놈 DNA는 PCR 반응에서 주형으로 사용되었다. 증폭 프로그램은 다음과 같다: 95℃에서 5분에 이어서 95℃에서 45초, 58℃에서 45초, 72℃에서 75초를 32사이클한 뒤, 72℃에서 5분동안 최종 연장된다. 리모시락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729의 DNA를 각각 hdc, tyrdc 유전자에 대한 양성 대조군으로 사용했다. 용혈 분석을 위해, 7% 말 혈액 (MB CELL, Seoul, Korea)이 첨가된 BHI 한천 플레이트에 균 배양액 10 ㎕를 접종하였다. 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)를 양성대조군으로 사용하여 37℃에서 24시간 혐기성 배양한 후, 배지에서 용혈을 관찰하였다.
도 1은 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 안전성 테스트 결과를 나타낸 것이다. 도 1의 (A)는 바이오제닉 아민 효소 여부; 레인 M은 1kb DNA 마커; 레인 B는 주형 DNA가 없는 음성대조군; 레인 P는 양성대조군, hdc (히스티딘 데카복실라제, 440bp)를 가지는 리모시락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272와 tyrdc (티로신 데카복실라제, 1100bp)를 가지는 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729; 7011은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011; 16S rRNA는 1503bp로 증폭되었다. 도 1의 (B)는 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 용혈 활성 분석 결과이다. 왼쪽은 양성 대조군 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes); 오른쪽은 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011이다.
도 1의 (A)에서 보이듯이, MG7011 균주는 각각 히스타민과 티라민을 생성하는 hdc(히스티딘 데카복실라제) 및 tyrdc(티로신 데카복실라제) 유전자를 보유하지 않는다. 반면, 이들 유전자에 대한 PCR 산물은 양성 대조군 균주인 리모시락토바실러스 류테리(L. reuteri) ATCC 23272 및 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis) KCCM 11729의 genomic DNA에서 검출되었다. 식품 생산에 적합한 유산균을 찾을 때 고려해야할 또다른 중요한 특성은 미생물의 용혈 활성이 없는 것이다. MG7011 균주의 용혈 활성을 평가하기 위해, 말 혈액을 포함한 한천 배지에 균을 접종하고 37℃, 24시간 동안 배양 후 용혈을 조사했다. 그 결과, 도 1의 (B)와 같이 양성 대조군 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)는 용혈 활성으로 해석될 수 있는 투명한 환(clear zone)을 보여주었으며, 반면 MG7011 균주는 주변에 투명한 환이 생성되지 않았다. 이러한 결과는 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011에는 바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc 및 tyrdc 유전자가 없으며, 용혈능이 없음을 보여준다.
[실시예 3 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 산 및 담즙 내성 확인]
사람의 위장관 내에서 살아남기 위해서, 프로바이오틱스는 낮은 pH 및 담즙환경에서도 생존해야 한다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 산 및 담즙 내성을 분석하고자 하였고, 상업균주 리모시락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1, 락티카제이바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG (LGG) 와 비교하였으며 또한 동일종의 타입균주 리모시락토바실러스 퍼멘텀(L. fermentum) KACC 11441 (LFT)와 상업균주 KCCM 35469 (LFC)를 추가로 비교하였다.
유산균은 MRS 배지에서 밤새 배양하고 6,000 x g에서 10분동안 원심 분리하여 얻었다. 세포는 pH 7.2의 PBS(phosphate-buffered saline)를 사용하여 3회 세척한 후 HCl을 사용하여 pH 3.0 및 2.5로 조절된 동일한 부피의 PBS에 재현탁시켰다. 37℃에서 0, 90, 180분 배양한 후, MRS 한천 배지에 세포를 도말하여 37℃에서 48시간 배양 후 생존 세포를 계수하여 산 내성을 평가하였다. 담즙염에 대한 내성은 0.3%(w/v) 담즙염(Sigma, St. Louis, MO, USA)이 포함된 PBS 용액에 세포를 현탁 및 37℃에서 배양하여 산 내성과 동일한 방법으로 측정되었다.
그 결과는 도 2와 같았다. 도 2는 모의 위장조건에서의 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 생균수(log CFU/mL)(n=3)를 나타낸 것으로, 도 2의 (A)는 산성 조건 (pH 3.0), 도 2의 (B)는 산성 조건 (pH 2.5), 도 2의 (C)는 0.3% 담즙염 조건에서의 결과이다. 도 2의 (A) 및 (B)와 같이, pH 3.0에서는 모든 균주가 높은 내성을 보였으나, pH 2.5에서 90분 및 180분 처리시 생균수가 급격히 저하되었다. 반면, MG7011은 실험균주들 중 가장 높은 생존력을 보였으며, 이같은 결과는 담즙환경(도 2의 (C))에서도 상업균주 WCFS1과 같이 높은 생존력을 보였다. 결과적으로 MG7011은 비교 균주들보다 더 높은 산 내성을 가지며, WCFS1와 유사한 담즙 내성을 보여주므로 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주가 위장관 환경에 내성이 있는 것으로 간주되었다.
[실시예 4 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 장 상피 세포 부착능 확인]
부착 분석은 Messaoudi et al에 의해 설명된 방법(Messaoudi et al., 2012, "In vitro evaluation of the probiotic potential of Lactobacillus salivarius SMXD51", Anaerobe, 18:584-589)으로 수행되었다. 인간 결장 상피 세포계 Caco-2와 HT-29 세포는 Korean Cell Line Bank (KCLB; Seoul, Korea)로부터 얻어졌고, 10% 소 태아 혈청(FBS; Hyclone)과 10,000 U/mL 페니실린(penicillin) 및 10 mg/mL 스트렙토마이신(streptomycin) (Hyclone) 각 1% (0.85% NaCl에서)가 첨가된 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM; Hyclone, Logan, UT, USA)에서 성장했다. Caco-2와 HT29 세포를 웰 당 대략 4.7x105 세포의 밀도로 24-well 세포 배양 플레이트(웰 당 2cm2)에 배양했다. 세포가 80% 이상 포화되면 항생제가 없는 배지로 교체하였다. MRS 배지에서 MG7011을 배양한 후, MG7011을 원심분리로 회수하여 PBS(pH 7.4)로 2회 세척하여 혈청과 항생제가 없는 DMEM에 108 CFU/ml 농도로 재현탁시켰다. 그런 다음 MG7011 세포를 각 웰의 Caco-2와 HT29 세포 단일층에 접종하고 37℃(5% CO2)에서 2시간동안 배양하였다. 배양 후 부착되지 않은 MG7011은 PBS로 2회 세척하여 제거했다. 부착된 MG7011은 0.1% Triton X-100 및 0.1% trypsin-EDTA (Sigma)를 포함한 분리 용액으로 15분간 처리했다. 부착된 MG7011 수를 계산하기 위해, 분리된 세포의 현탁액을 희석하여 MRS agar plate에 분주하고 37℃에서 배양했다. 상업균주 리모시락토바실러스 플란타럼(L. plantarum) WCFS1, 락티카제이바실러스 람노서스(L. rhamnosus) GG (LGG)를 동일한 방법으로 실험하여 비교하였다.
그 결과는 도 3과 같았다. 도 3은 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 7011의 장 상피세포 부착능에 대한 결과(n=3)로, 도 3의 (A)는 Caco-2 세포, (B)는 HT-29 세포에 대한 결과이다. 통계 분석은 LGG와 비교하여 수행되었다(# p<0.05). 도 3과 같이 WCFS1과 LGG는 각각 100개의 Caco-2 세포당 4000CFU, 2500CFU에 해당하는 부착능을 나타낸 반면, MG7011은 5200CFU의 균이 부착되어 더 높은 부착능을 보였다. 또한, HT-29 세포의 경우, WCFS1과 LGG는 각각 2400CFU, 1100CFU가 부착되었는데, MG7011은 1700CFU로 상업균주와 유사한 수준으로 높은 부착능을 보여 양성 대조군과 견줄 정도로 장 부착능이 우수함을 확인할 수 있었다.
[실시예 5 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 항산화 활성 확인]
리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능 분석법으로 측정되었다. 세가지 균 분획물 제조를 위해 MG7011을 전 배양, 본 배양을 각각 12시간씩 수행하고, 600 nm에서 흡광도를 1.0으로 맞췄다. MG7011을 2회 세척하고 0.85% 식염수에 재현탁하여 균체(intact cell) 분획물을 만들었다. 세포외 추출물의(CFE, Cell free extract)의 경우, 초음파 처리기(VP-050N; Taitec Corp., Saitama, Japan)를 사용하여 10분 동안 초음파 분해 처리를 한 후, 원심분리(10,000 x g 4℃, 5분)에 의해 세포 파편을 제거하였다. 세포외상징액(CFS, Cell free supernatant)은 균 배양액을 10,000xg 4℃, 10분간 원심분리한 후, 상징액을 1M NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 조절 및 필터링(0.2㎛)하여 제조하였다. 그 후 ethanolic DPPH 용액(100 μL, 0.4 mmol/L)을 각 균 분획물과 혼합하여 37℃의 암실에서 30분간 배양하고, 517 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과는 도 4와 같았다. 도 4는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 분획물의 항산화 활성(n=3)을 나타낸 것이다. 양성대조군으로 ascorbic acid (AA; Sigma, USA)를 사용하였으며, 0.5~3 ㎍/ml의 농도로 측정하였다. WCFS1(*** p<0.001) 및 LGG(## p<0.01)와 유의한 차이가 나타났다. 도 4와 같이, MG7011의 균체(Intact cell) 및 세포외상징액(CFS, Cell free supernatant)은 대조군과 비슷한 수준의 약 15.8% 및 13.4% DPPH 소거능을 보였으며, 특히 세포추출액(CFE, Cell free extract)은 ascorbic acid (AA) 3㎍/ml에 해당하는 높은 수준의 약 30% DPPH 소거능을 나타냈다. 따라서 MG7011은 상업 프로바이오틱스(LGG, WCFS1)보다 우수한 항산화 활성을 가지고 있다고 판단되었다.
[실시예 6 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 항염증 활성 확인]
산화질소(NO, Nitric oxide)는 여러 질병과 관련하여 염증 매개인자로 여겨진다. 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 항염증 활성을 분석하기 위해, 유산균 두 분획물을 준비하고 LPS(lipopolysaccharide)로 유도된 RAW 264.7 대식세포에 산화질소(NO)의 생성 억제효과를 Griess 반응으로 측정하였다. 먼저 배양액의 흡광도를 600 nm에서 1.0으로 조정하고, 90℃에서 30분간 열처리하였다. 이후 10,000 x g에서 5분간 원심분리한 후, 균체를 PBS로 2회 헹구고 DMEM에 현탁시켜 열처리균체(Heat-killed)를 준비하였다. 세포외추출물(lysate)은 위의 방법에 따라 제조하였다.
본 실험을 위해 RAW 264.7 세포를 5x105 cells/mL의 농도로 96 웰 플레이트에 배양한 후 세포에 LPS (1 ㎍/mL)와 열처리균체 및 세포외추출물을 24시간 동안 처리하였다. 24시간 후, 각 웰의 상징액과 동량의 Griess 시약을 혼합한 뒤 10분간 암실에 두고, 그 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite 농도는 NaNO2로 그린 표준곡선을 이용하여 계산하였으며, 산화질소 생성 억제제인 메틸 아르기닌(Methyl arginine, MA)을 양성대조군으로 설정하였다.
그 결과는 도 5와 같았다. 도 5는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 산화질소(NO) 생성 억제 효과를 나타낸 것(n=3)이다(** p<0.01, *** p<0.001). 도 5와 같이 LPS로 처리하지 않은 대조군은 약 0.4 μM의 NO가 측정되었으나, LPS로 처리시 약 6.5 μM의 NO가 현저히 생성되었다. 그러나 NO 생성효소의 저해제인 메틸 아르기닌(Methyl arginine, MA)을 5 μM 및 20 μM 처리시 각 4.2 및 2.8 μM NO가 생성되어 농도의존적으로 억제됨을 보였다. 열처리균체의 경우 모든 유산균이 NO 억제효과를 보였으며, 특히 MG7011은 약 1.8 μM의 NO 농도로 높은 억제효과를 보였다. 그러나, 유산균의 세포 추출액은 LGG (3.8 μM NO) 균주만 LPS와 비교하여 유의한 효과를 보였다. 따라서 MG7011의 균체는 우수한 항염증 활성을 보일 것으로 판단되었다.
[실시예 7 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주의 장 보호능 측정]
리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장내 산화적 스트레스에 대한 장 보호능을 측정하기 위해 장벽환경에 대한 전기저항도(TEER, Transepithelial electrical resistance)와 장 투과도를 측정하였다.
장벽환경은 12-well Transwell® insert filter (polycarbonate membrane with 0.4 ㎛ pore size, 12 mm diameters; Costar, Corning Life Science, Kennebunk, USA)에 Caco-2 세포를 5x104 cells per cm2의 농도로 배양하여 조성하였다. DMEM 배지는 TEER 측정시 200 Ω·cm2 이상으로 포화상태가 될 때까지 2일 간격으로 교체하였다. TEER 값은 millicell-ERS (Electrical Resistance System; Millipore, Billerica, USA)을 이용하여 2일 간격으로 측정하였다. 실험 직후에는 항생제가 없는 배지로 교체하였으며, 각 insert에 108 CFU/mL의 균주를 30분간 처리하고, 과산화수소(H2O2,) 100 μM을 Transwell 상하단에 2시간동안 처리하였다. TEER값은 과산화수소 처리 후 30분마다 측정하였으며, 초기값을 기준으로 %로 계산하였다; TEER (Ω·cm2)/initial TEER (Ω·cm2)×100 (%).
장 투과도는 FITC-dextran 분석법을 이용하여 측정하였다. FITC-dextran (분자량 4,000; FD4; Sigma, St. Louis, MO, USA)의 세포단층 투과량은 세포 투과도의 지표로 사용할 수 있다. 과산화수소처리된 Caco-2 세포에 FITC-dextran(100 ㎍/mL)을 넣은 후 암실에 4시간 동안 방치하였다. 그 후 Transwell 하단의 용액 100 ㎕을 black 96-well opaque plate에 옮기고 형광도를 측정하였다. 형광도는 spectrophotofluorometry (LS55 fluorescence spectrometer, Perkin Elmer Instruments, Waltham, USA)을 이용하여 485 nm 및 535 nm (excitation and emission wavelengths)에서 측정하였다. 유산균을 넣지 않은 처리구를 대조군으로 하며, 이를 기준으로 %로 계산하였다.
그 결과는 도 6과 같았다. 도 6은 장 투과도를 저하하는 과산화수소에 대한 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 장 보호 효과를 나타낸 것(n=3)으로(*p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001), 도 6의 (A)는 30분 간격으로 측정한 TEER값이고, (B)는 최종 2시간 후 TEER값이며, (C)는 FITC-dextran 투과 형광도를 나타낸 것이다. 도 6의 (A) 및 (B)와 같이 과산화수소 처리 120분 후 Caco-2 세포막의 전기저항도값이 42.34%로 급격히 저하되었으나, MG7011 실험구(74.06%)는 과산화수소 처리 120분 후 양성대조군 LGG(72.64%)보다도 높은 전기저항도를 보였다. 세포의 손상을 측정할 수 있는 또 다른 방법으로 장 상피세포를 통과한 FITC-dextran의 형광도를 측정하였을때, 도 6의 (C)와 같이 양성대조군 LGG와 MG7011 모두 과산화수소 처리 대조구(100% 기준)보다 낮은 형광도(79.2% 및 72.6%)를 나타냈으며, MG7011은 LGG보다 유의하게 낮은 형광투과도를 보였다. 따라서 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011은 장 상피를 손상시켜 투과율을 높이는 과산화수소로부터 보호하여 장 건강을 증진시킬 수 있음을 알 수 있다.
[실시예 8 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 이용한 쌀 발효 및 이의 발효물 특성 분석]
본 실시예에서는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 쌀 발효하여 쌀 발효물을 제조하고, 이의 특성(발효 특성, 성분, 쌀 관련 효소 활성)을 분석하였다.
1) 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 이용한 쌀 용액 발효
쌀가루 50g와 증류수 1,000 ml를 혼합하고 121℃에서 15분간 고압멸균(autoclave)하였다. 그 후 실온에서 충분히 식히고, 유산균 배양액 10 ml를 상기 쌀용액 1,000 ml에 접종하고 37℃에서 3일간 혐기배양하였다. 쌀 발효물은 24시간마다 샘플링하였으며, 발효 후에는 -20℃에서 보관하였다.
2) 쌀 발효물의 생균수 및 pH 측정
쌀 발효 중 하루 간격으로 생균수 및 pH를 측정하였다. 생균수는 쌀 발효물을 0.85% NaCl을 이용하여 연속희석 및 MRS배지에 분주하고 37℃에 배양하여 콜로니수를 측정하였다. 이를 CFU/ml로 계산하였으며, log CFU/ml로 나타내었다. pH는 pH 미터기 (Orion Versa, Thermo, USA)를 이용하여 측정하였다.
그 결과는 도 7과 같았다. 도 7은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 을 접종한 5% 쌀의 생균수 (bar graph) 및 pH (line graph)를 나타낸 것(n=3)이다. 배양 2일차에 가장 높은 생장 (8 log CFU/mL)를 보였으며, 그 이후 생균수가 감소하였다. 또한 발효가 진행됨에 따라 pH가 배양 2일차까지 감소하였으며, 3일차에 5.2로 약간 증가하였다. 이는 유기산이 알코올 등과 결합하여 에스터(ester)와 같은 향미 형성에 이용되어 감소된 것으로 추측된다. 따라서 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011은 쌀에서 잘 생장하여 쌀 스타터로 적절하다고 판단된다.
3) 쌀 발효물의 당 정성/정량분석 및 유기산 정량분석
먼저 배양일별 발효된 쌀에서의 탄수화물 변화(쌀 전분 분해)를 측정하기위해, 얇은막크로마토그래피 (TLC) 분석을 이용하였다. 발효일별 쌀발효물과 0.5% (w/v)의 스탠다드 혼합물 (glucose, maltose, maltotriose, maltopentaose, maltoheptaose, and soluble starch)을 실리카겔 플레이트(Sigma, USA)에 분주하였다. 그 후 플레이트는 혼합된 전개용매 (Nitromethane : Water : 1-Propanol = 2 : 3 : 5 (v/v))에 전개하고 건조하였다. 염색용매 (0.5% α-naphtol and 5% H2SO4 in methanol)에 담근 후 110℃의 오븐에서 10분간 방치하였다.
그 결과는 도 8과 같았다. 도 8은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 TLC 당 분석 결과를 나타낸 것이다. 발효전 쌀 용액 내 포도당(glucose) (DP1)이 존재하며, 발효가 진행됨에 따라 소모된 것을 볼 수 있다. 또한 배양 3일차에 DP2~DP5에 해당하는 올리고당을 생성하였으며, 이는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011이 쌀 내의 전분을 분해하여 나타난 것으로 판단된다.
다음으로, 보다 정확한 발효 특성을 확인하기 위하여 유기산과 당을 HLPC 분석을 통해 정량하였다. 발효일별 쌀발효물 5 mL을 10,000 × g 10분 조건으로 원심분리하고, 그 상층액을 0.2 μm 필터 (Whatman, UK)를 이용하여 여과하였다.
유기산 (젖산 및 아세트산)은 HPLC (1260 Infinity, Agilent Technologies, USA), Aminex HPX-87H 칼럼 (300 × 7.8mm; BioRad, California, USA), UV (215 nm) detector을 이용하였으며, 자세한 조건은 다음과 같다; 이동상 : 0.008N H2SO4, 샘플주입량 : 20 μl, 유량속도 : 0.6 mL/min. 당 (glucose, maltose, maltotriose, maltotetrose, maltopentaose, and maltohexaose)은 HPLC (Acme 9000, Younglin, Korea), VN-50 4D 칼럼 (150 × 4.6mm; Shodex, Japan), RI detector을 이용하였으며, 자세한 조건은 다음과 같다: 이동상 : 67% Acetonitrile (v/v), 샘플주입량 : 10 μl, 유량속도 : 0.3 mL/min. 표준곡선을 위한 standard 물질으로는 lactic acid, acetic acid (Wako, Japan), glucose, maltose (Junsei, Japan), maltotriose, maltotetrose, maltopentaose, maltohexaose (TCI, Japan)을 사용하였다. 쌀발효물 내 다양한 물질은 각 표준물질의 머무름시간에 따라 분류하였다.
그 결과는 도 9 및 10과 같았다. 도 9는 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀 내 유기산 생성량을 나타낸 것으로, MG7011이 발효 3일동안 약 1.6mM의 젖산을 생산하였으며 아세트산은 검출되지 않았다. 도 10은 발효일별 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011을 접종한 5% 쌀의 HPLC 당 분석결과를 나타낸 것이다. 또한 발효 전 쌀에 약 0.8mM의 포도당(glucose)이 측정되었으며, 그 후 검출되지않다가 발효 3일차에 다양한 당이 검출되었다. 발효 3일차의 쌀에서는 0.80mM glucose (DP1), 1.96mM maltose (DP2), 2.71mM maltotriose (DP3), 1.70mM maltotetraose (DP4), 0.65mM maltopentaose (DP5)이 측정되었다. 이는 TLC결과와 일치하며, 해당 균주가 전분을 분해하여 올리고당을 생성할 수 있음을 의미한다.
4) 쌀 발효물의 쌀 관련 효소 활성 측정
리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011의 쌀 관련 효소 활성을 측정하고자 하였다. 균이 생성하는 여러 효소 알파-아밀라아제(α-amylase), 글루코아밀라아제(glucoamylase)는 전분을 분해하며, 피타아제(phytase)는 피틴산을 분해한다. 알파-아밀라아제는 가닥 내부의 α-1,4 결합을 무작위로 분해하며, 글루코아밀라아제는 비환원단말단에서부터 α-1,4 결합 및 α-1,6 결합을 분해한다. 또한 피타아제는 피틴산의 인과의 결합을 끊어낸다. 본 실험에서는 보다 정확한 피타아제 활성 측정을 위해, 유도물질로 피틴산 1% (w/v)을 포함하는 modified chalmers 배지를 사용하였다. 유산균 배양에 일반적으로 사용하는 MRS는 이미 많은 인이 포함되어있으므로, 해당 효소 활성이 측정되지 않을 수 있으며, chalmers배지의 조성에는 인이 포함되어 있지않기 때문이다. 다양한 배양액(3일간 배양한 쌀 발효물, 18시간 동안 배양한 MRS 및 MCP (1% (w/v) 피틴산을 첨가한 modified chalmers 배지)을 10,000 x g 10분 조건으로 원심분리하고, 상징액을 조효소로 사용하였다.
알파-아밀라아제 활성을 측정하기 위해 상징액 0.1 mL과 1% starch (w/v) 0.1 mL 을 혼합하고 37℃에 30분간 방치하였다. 배양 후 10분 간격으로 0.6 mL의 DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) 시약을 넣어 반응을 종결하고, 5분간 끓는 물에 넣었다. 그 후 상징액의 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 표준곡선은 상징액 대신 2~10 mM glucose를 이용하여 그렸다. 효소활성 1 Unit은 실험조건하 1분당 1 μmol의 reducing sugars 생성하는 것으로 계산하였다.
글루코아밀라아제 활성을 측정하기 위해 상징액 0.1 mL 과 1% starch (w/v) 0.1 mL을 혼합하고 37℃에 30분간 방치하였다. glucose assay kit (GAGO20; Sigma-Aldrich, USA)를 이용하여, 배양 후 10분 간격으로 1 mL의 glucose oxidase / peroxidase 시약과 o-dianisidine 시약 혼합물을 넣고 37℃에 10분간 방치하였다. 그 후 12N 황산을 넣어 반응을 종결하고, 상징액의 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 표준곡선은 상징액 대신 0.5~2.5mM glucose를 이용하여 그렸다. 효소활성 1 Unit은 실험조건하 1분당 1 μmol의 glucose 생성하는 것으로 계산하였다.
피타아제 활성을 측정하기 위해 상징액 0.1 mL과 3 mM(in 0.2M sodium acetate buffer, pH 4.0)의 피틴산 0.4 mL을 혼합하고 37℃에 30분간 방치하였다. 배양 후 10분 간격으로 0.5 mL의 5% trichloroacetic acid를 넣어 반응을 종결하고, 0.5 mL의 발색시약(1.5% (w/v) ammonium molybdate in 5.5% (v/v) sulfuric acid solution : 2.7% (w/v) ferrous sulfate solution = 1:4)을 넣어주었다. 그 후, 상징액의 흡광도를 700nm에서 측정하였다. 표준곡선은 상징액 대신 2~10 mM KH2PO4를 이용하여 그렸다. 효소활성 1 Unit은 실험조건하 1분당 1 nmol의 phosphate 생성하는 것으로 계산하였다.
그 결과, 하기 표 4와 같이 MG7011은 발효 쌀에서 약 0.1U, MRS 배지에서 약 0.08U의 높은 알파-아밀라아제 활성을 보였다. 그러나, 글루코아밀라아제 활성은 약 0.02U으로 낮게 측정되었다. 또한 피타아제 활성은 chalmers배지에서 17.7U의 높은 활성을 보였는데, 이는 해당 효소가 inducible하므로 배양 조건에 따라 활성이 다르게 나타날 수 있기 때문으로 여겨진다. 결론적으로 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011은 전분과 피틴산이 풍부한 환경에서 이를 분해할 수 있다고 판단된다.
Strain | α-amylase | Glucoamylase | Phytase | ||||
5% rice | MRS | 5% rice | MRS | 5% rice | MRS | Chamlers +phytate |
|
MG7011 | 0.1115 | 0.08 | 0.022 | - | - | - | 17.653 |
[실시예 9 : 본 발명 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 이용한 발효 쌀 요거트 제조 및 이의 특성 분석]
본 실시예에서는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 이용한 쌀 요거트를 제조 후 이의 특성(발효 특성 및 대사산물)을 분석하였다.
1) 리모시락토바실러스 퍼멘텀 MG7011 균주를 이용한 쌀 요거트 제조
시중의 액상형 및 호상형 등 여러 타입의 쌀 요거트 제조를 위해, 5% 및 10% (w/v) 쌀을 포함하는 쌀 용액을 상기 실시예 8과 동일하게 제조하였다. 1% (v/v, 107 CFU/mL)의 유산균을 접종하고 30℃에서 24시간 동안 발효하였으며 그 후, 4℃에 보관하였다.
2) 쌀 요거트의 발효 특성 분석
발효 전 후 쌀 요거트의 생균수, pH 및 점도를 측정하였다. 생균수와 pH는 상기 실시예 8과 동일하게 측정하였으며, 점도는 회전식 점도계 RVDV-Ⅱ+Pro viscometer (Brookfield Engineering, Middleboro, USA)를 이용하여 일정한 온도 17℃에서 측정하였다. 약 250 mL의 샘플을 250 mL 비커에 담고 spindle no 2~4를 이용하였다. 점도 값은 30초 간격으로 기록하여 centipoise (cP)으로 표시하였다. 각 실험은 표시된 대로 3반복으로 수행되었으며 데이터는 평균값 ± 표준 편차로 표시하였다. 통계 분석은 IBM SPSS 소프트웨어 버전 22 (SPSS Inc., USA)를 사용하여 수행되었다. 독립적인 T-검정을 사용하여 두 그룹 간의 차이를 분석하고 Tukey's test를 이용한 일원 분산 분석 (ANOVA)으로 여러 그룹 간의 차이를 분석했다. 0.05 미만의 P-값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
그 결과는 표 5와 같이 MG7011은 초기생균수 6.6 log CFU/mL에서 생장하여 7.5 및 7.4 log CFU/mL의 발효 후 생균수를 나타냈으며, 이는 약 7.4배 증가한 것이었다. 균의 성장에 따라, pH 또한 약 6.2로부터 4.9~5.0으로 감소하였다. 정확한 점도 측정을 위하여, 각 샘플의 온도를 17℃로 일정하도록 조정하였으며, 적절한 spindle을 사용하였다. 그 결과, 5% 쌀요거트의 점도는 발효전 861cp에서 269cp로 감소하였으며, 10% 쌀 요거트의 점도는 발효전 37,575cp에서 16,935cp로 감소하였다. 시중의 제품들과 비교하여, 5% 발효 쌀 요거트는 액상형 요거트에 가까운 점도를 보였으며, 10% 발효 쌀요거트는 호상형 중 그릭요거트보다 높은 점도를 보였다.
생균수 (log )CFU/mL | pH | 점도 | ||
5% 쌀요거트 (w/v) |
발효 전 | 6.68±0.05 | 6.17±0.05 | 861.25±32.09 |
발효 후 | 7.55±0.01*** | 4.87±0.04*** | 269.28±2.01*** | |
10% 쌀요거트 (w/v) |
발효 전 | 6.65±0.04 | 6.25±0.05 | 37575±749.58 |
발효 후 | 7.42±0.05*** | 5.01±0.04*** | 16935±962.64*** | |
액상형요거트 | A | - | - | 44.78±0.26 |
B | - | - | 46.8±1.20 | |
호상형요거트 | C(플레인) | - | - | 1739±31.03 |
D(그릭) | - | - | 7037.5±96.01 |
3) 쌀 요거트의 대사산물 분석
1H-NMR 을 이용하여 5% 및 10% 발효된 쌀 요거트로부터 단당류, 이당류, 알콜, 유기산, 아미노산, 페놀릭화합물, 비타민 및 미오-이노시톨(myo-inositol)를 포함하는 다양한 대사산물(단위: mM)을 분석하였다. 그 결과는 표 6 및 7과 같았다.
5% 쌀요거트 | 10% 쌀요거트 | |||
Compounds | 발효 전 | 발효 후 | 발효 전 | 발효 후 |
Monosaccharides | 1.013±0.044 | 0.91±0.027 | 1.961±0.12 | 1.296±0.036 ** |
Fructose | 0.549±0.045 | 0.828±0.025 ** | 0.808±0.067 | 1.182±0.025** |
Glucose | 0.464±0.051 | 0.083±0.01 *** | 1.153±0.074 | 0.114±0.016*** |
Disaccharides | 0.283±0.04 | 0.696±0.168 * | 0.704±0.057 | 0.903±0.039 * |
Maltose | 0.097±0.043 | 0.563±0.14 * | 0.181±0.033 | 0.697±0.026*** |
Sucrose | 0.186±0.008 | 0.132±0.045 | 0.317±0.033 | 0.207±0.021*** |
Alcohols | 2.884±0.25 | 6.157±0.34 *** | 4.889±0.177 | 11.387±0.357 *** |
Glucitol | 2.013±0.139 | 3.504±0.267 ** | 2.655±0.115 | 5.318±0.183*** |
Mannitol | 0.683±0.076 | 1.386±0.064 *** | 1.647±0.062 | 2.123±0.026*** |
Ethanol | 0.188±0.042 | 1.267±0.061 *** | 0.586±0.086 | 3.946±0.202*** |
Organic acids | 0.196±0.012 | 1.661±0.017 *** | 0.348±0.001 | 3.228±0.047 *** |
Lactate | 0.035±0.007 | 1.426±0.011 *** | 0.039±0.002 | 2.552±0.04*** |
Acetate | 0.115±0.001 | 0.155±0.005 *** | 0.191±0.007 | 0.523±0.011*** |
Butyrate | 0.011±0.002 | 0.016±0.003 | 0.022±0.002 | 0.025±0.004 |
Propionate | 0.011±0.002 | 0.015±0.001 * | 0.008±0.002 | 0.03±0.003*** |
2-Aminobutyrate | 0.01±0.002 | 0.018±0.004 | 0.017±0.004 | 0.032±0.01 |
4-Aminobutyrate | 0.014±0.001 | 0.031±0.007 * | 0.022±0.008 | 0.067±0.008** |
Amino acids | 0.669±0.083 | 0.834±0.185 | 0.908±0.093 | 1.22±0.067 * |
Alanine | 0.024±0.001 | 0.018±0.001 * | 0.062±0.001 | 0.077±0*** |
Arginine | 0.043±0.013 | 0.054±0.008 | 0.064±0.009 | 0.074±0.007 |
Asparagine | 0.113±0.009 | 0.138±0.042 | 0.094±0.008 | 0.114±0.014 |
Aspartate | 0.055±0.011 | 0.043±0.018 | 0.052±0.008 | 0.06±0.007 |
Cysteine | 0.047±0.006 | 0.052±0.027 | 0.04±0.009 | 0.048±0.002 |
Glutamate | 0.038±0.005 | 0.053±0.011 | 0.081±0.011 | 0.09±0.001 |
Glutamine | 0.021±0.003 | 0.036±0.008 | 0.041±0.001 | 0.05±0.01 |
Glycine | 0.167±0.017 | 0.07±0.012 ** | 0.186±0.034 | 0.107±0.018* |
Histidine | 0.029±0.014 | 0.021±0.004 | 0.044±0.002 | 0.032±0.006 |
Isoleucine | 0.003±0.002 | 0.007±0.003 | 0.01±0.003 | 0.018±0.002 |
Leucine | 0.009±0.007 | 0.01±0.003 | 0.013±0.002 | 0.036±0.001*** |
Lysine | 0.026±0.005 | 0.032±0.004 | 0.043±0.004 | 0.047±0.003 |
Methionine | 0.007±0.005 | 0.012±0.003 | 0.013±0.005 | 0.022±0.003 |
Phenylalanine | 0.016±0.005 | 0.011±0.003 | 0.019±0.005 | 0.017±0.004 |
Proline | 0.009±0.007 | 0.048±0.014* | 0.082±0.023 | 0.128±0.024 |
Threonine | 0.041±0.008 | 0.188±0.063* | 0.021±0.007 | 0.254±0.069** |
Tryptophan | 0.01±0.007 | 0.022±0.004 | 0.023±0.004 | 0.026±0.002 |
Tyrosine | 0.007±0.003 | 0.011±0.004 | 0.011±0.002 | 0.016±0.004 |
Valine | 0.004±0.003 | 0.008±0 | 0.008±0.001 | 0.016±0.002 |
5% 쌀요거트 | 10% 쌀요거트 | |||
Compounds | 발효 전 | 발효 후 | 발효 전 | 발효 후 |
Phenolics | 0.076±0.006 | 0.135±0.006 *** | 0.104±0.004 | 0.197±0.003 *** |
4-Hydroxybenzoate | 0.008±0.002 | 0.017±0.001** | 0.021±0.003 | 0.025±0.002 |
Chlorogenate | 0.011±0.002 | 0.017±0.004 | 0.013±0 | 0.022±0.001*** |
Ferulate | 0.012±0.003 | 0.015±0.006 | 0.01±0.003 | 0.039±0.004** |
Gallate | 0.012±0.004 | 0.017±0.003 | 0.013±0.004 | 0.025±0.005 |
Protocatechuate | 0.012±0.002 | 0.028±0.005* | 0.023±0.001 | 0.035±0.001*** |
Syringate | 0.011±0.002 | 0.012±0.002 | 0.008±0.001 | 0.011±0.001 |
Vanillate | 0.009±0.001 | 0.028±0.003** | 0.016±0.003 | 0.039±0.01* |
Vitamin | 0.38±0.036 | 0.422±0.026 | 0.389±0.07 | 0.5±0.005 |
Ascorbate | 0.328±0.029 | 0.358±0.035 | 0.304±0.07 | 0.407±0.003 |
Pyridoxine | 0.006±0.002 | 0.014±0.002* | 0.006±0.001 | 0.008±0.001 |
Riboflavin | 0.006±0.005 | 0.008±0.004 | 0.006±0.001 | 0.011±0.001* |
Choline | 0.039±0.002 | 0.043±0.004 | 0.072±0.001 | 0.074±0.002 |
myo-inositol | 0.06±0.023 | 0.268±0.051 ** | 0.129±0.02 | 0.308±0.043 ** |
표 6 및 7과 같이 MG7011으로 쌀을 발효한 후 알콜, 유기산, 아미노산, 페놀릭화합물 및 미오-이노시톨(myo-inositol)이 증가하였다. 자세하게, 단당 및 이당류에서는 포도당(glucose)이 감소하고 프럭토오스(fructose)가 증가하였으며, 또한 말토오스(maltose)가 증가하고 수크로오스(sucrose)가 감소하였는데, 이는 균의 효소작용에 의한 것이다. 쌀 내에 존재하는 수크로오스가 포도당 및 프럭토오스로 분해되며, 포도당은 유산균에 의해 빠르게 대사되어 락테이트(lactate), 아세테이트(acetate), 에탄올(ethanol) 및 글루시톨(glucitol)로 전환된다. 말토오스는 유산균의 아밀레이즈(amylase)가 쌀 내 전분을 분해하여 생성된다. 또한, MG7011은 4-aminobutyrate (GABA)를 약 2배 이상 생성하였으며, 유산균이 대사하여 소모된 것으로 추측되는 글리신(glycine) 등 농도가 감소한 아미노산과 유산균에 의해 생성된 것으로 추측되는 트레오닌(threonine) 등 농도가 증가한 아미노산이 분석되었다. 또한, MG7011은 프로토카츄에이트(protocatechuate)와 바닐레이트(vanillate) 같은 페놀릭 화합물이 유의하게 증가하였으나, 비타민의 증가는 유의하지 않았다. 또한, 발효 전보다 발효 후 미오-이노시톨 함량이 2.3배 이상 증가하였다. 이는 쌀 내에 존재하는 피틴산이 피타아제(phytase)에 의해 분해되어 생성된 것으로, 인을 포함한 미네랄(mineral) 함량도 증가했을 것으로 추측된다.
기탁기관명 : 농업생명공학연구원
수탁번호 : KACC81147BP
수탁일자 : 20210705
Claims (4)
- 리모시락토바실러스 퍼멘텀 (Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP).
- 제1항에 있어서,
상기 리모시락토바실러스 퍼멘텀 (Limosilactobacillus fermentum)은,
항염 프로바이오틱 활성 또는 GABA(4-aminobutyrate) 생성능이 있는 것을 특징으로 하는 리모시락토바실러스 퍼멘텀 (Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP).
- 곡물에 리모시락토바실러스 퍼멘텀 (Limosilactobacillus fermentum) MG7011 (KACC 81147BP)을 종균으로 접종하여 발효시킴으로써 제조되는 발효 곡물.
- 제3항에 있어서,
상기 곡물은,
쌀, 밀, 보리, 수수, 기장, 귀리, 호밀, 라이밀, 메일, 퀴노아, 옥수수, 콩 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 발효 곡물.
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CN116656578A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-08-29 | 杭州微致生物科技有限公司 | 一种发酵粘液乳杆菌vb216及其应用 |
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-
2021
- 2021-10-07 KR KR1020210133427A patent/KR102574498B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (2)
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---|
Front Microbiol., Vol.12, Article No.745952, pp.1-14(Epub.2021.09.29.)* * |
대한민국 등록특허 제10-1750468호(등록일자: 2017.06.19.)에는, 락토바실러스 퍼멘툼 MG901(Lactobacillus fermentum MG901) KFCC11651P 또는 락토바실러스 플란타룸 MG989(Lactobacillus plantarum MG989) KFCC11650P를 포함하는 가드네렐라 바지날리스(Gardnerella vaginalis) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에 의한 질염의 개선, 예방 또는 치료용 조성물에 대해 기재되어 있다. |
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CN116656578A (zh) * | 2023-07-26 | 2023-08-29 | 杭州微致生物科技有限公司 | 一种发酵粘液乳杆菌vb216及其应用 |
CN116656578B (zh) * | 2023-07-26 | 2023-11-28 | 杭州微致生物科技有限公司 | 一种发酵粘液乳杆菌vb216及其应用 |
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