JP7104758B2 - 枸杞発酵物、その製造方法及び使用 - Google Patents
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Description
本発明は、食品加工分野に関し、具体的には、枸杞発酵物の製造方法に関し、特に複数種類の乳酸菌の組み合わせを用いる発酵、及び肝疾患（ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）の予防及び／又は治療における得られた枸杞発酵物の使用に関する。
枸杞は、台湾衛生福利部中医薬司食品薬物管理署によって発表されている食品用の漢方薬と食品用の原材料の両方を提供できるものである。枸杞は強力で広範なヘルスケア機能を有するため、様々なヘルスケア製品の生産に最適な原材料の１つとなっている。そのため、枸杞に関連する医薬品又は健康食品の開発は、枸杞加工の主な発展方向となっている。
伝統医学では、枸杞は、補肝腎、潤肺、明目などの効果を有する漢方薬である。枸杞には豊富なカロテノイド、ゼアキサンチン、ビタミンＡ１、Ｂ１、Ｂ２、Ｃなど、カルシウム、鉄などの栄養成分が含まれるため、目の健康に有益であり、明目の効果を有するので、枸杞は、俗に「明眼子」とも呼ばれる。また、枸杞は、１４種類のアミノ酸、ベタイン、クコ多糖類などの機能性成分を含むことで、個体の免疫力を向上させることができ、補気、強精、滋補肝腎、酸化防止、老化防止、抗疲労、抗腫瘍、抗ウイルス、及び神経保護などの作用を有する。さらに、現代の薬理学的研究によっても、枸杞は、フラボンなどの成分を含むことで、血圧、血中脂質、血糖値を下げる作用を有し、アテローム性動脈硬化症を防止でき、肝臓保護の効果を奏することが明らかとなった。
乳酸菌は、炭水化物を使用して発酵することで大量の乳酸を生成する細菌の総称であり、米国食品医薬品局によって一般的に認められている安全な食品として定義されている。乳酸菌は、腸管の栄養とコロニーのバランスを改善し、宿主の粘膜とシステムの免疫機能を調節することによって宿主に有益な生理学的効果をもたらすことができる。具体的には、乳酸菌が宿主の胃腸管内に定着することにより、様々な有機酸を生成し、腸管のｐＨを下げ、有害な細菌の増殖を抑制し、宿主健康に有利であるいくつかの単一又は組成が明確な混合微生物（プロバイオティクス）を腸管内で大量に増殖させ、宿主体内の正常細菌叢（ｎｏｒｍａｌ ｆｌｏｒａ）の生成を変化させる。科学的研究によると、プロバイオティクスは、腸管内で大量に増殖し、抗生物質の大量使用による偽膜性腸炎、便秘及び慢性下痢を治療し、肝臓を保護し、高血圧と動脈硬化を防止し、老化を防止し、血清コレステロールを減少させ、がんを予防し、腫瘍の成長を抑制することができる。
近年、乳酸菌は、特殊な生理活性を有する食品に広く使用されており、本来の食品分野（例えば、発酵乳製品）に加えて、他の機能性食品、栄養補助食品、薬用生物製品、飼料の開発にも徐々に使用されている。乳酸菌を含む食品には、主に乳酸菌を直接添加したものや乳酸菌で発酵させたものが含まれる。食品分野では、最も一般的な用途は、発酵乳、活性乳酸菌飲料、チーズ、ヨーグルトオイル、ヨーグルトワイン、フルーツジュースなどの乳製品の分野に関連する。
枸杞の栄養価を高め、有効成分の含有量を増加させ、天然枸杞を食べることによる不快感を軽減するために、枸杞発酵物を製造するための代替的な方法により、上述の問題を改善することが提案された文献がある。関連する枸杞発酵物の製造方法の主な研究方向は、原材料の使用と発酵方法の変更にあり、これらの方法にはまだ次の欠点が存在する。（１）原料は複合成分であり、成分が複雑である。（２）製造工程が複雑であるため、製造コストが高い。（３）発酵周期が長く、発酵により汚染が発生するリスクが高い。（４）発酵に用いるコロニーは発酵物中の活性成分の含有量を効果的に向上できない。（５）抽出液で発酵を行うことで、原料の栄養成分が減少する。
上記の事情に鑑み、当該技術分野では、従来技術の不足を解決し、枸杞発酵物の使用価値を向上させるために、枸杞発酵物を製造する改良方法を開発する必要がある。
本明細書は、読者が本開示の内容について基本的な理解を有するように、開示の簡略化された要約を提供することを目的としている。本明細書の内容は、本開示の完全な説明ではなく、本発明の実施例の重要／肝心な要素を指摘し、又は本発明の範囲を限定することを意図していない。
そこで、本発明は、従来技術の不足を解決するために、原料組成が簡単で、製造工程が簡単で、ヘルスケア効果が顕著である機能性枸杞発酵物の製造方法を提供することを目的とする。本発明の枸杞発酵物の製造方法は、
枸杞を溶媒に溶解させ、枸杞溶液を得るステップ（ａ）と、
乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に加えるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、枸杞発酵物を得るステップ（ｃ）と、
を含む。
上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、及びペディオコッカス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のうちの少なくとも２種の菌種から構成される。
枸杞を溶媒に溶解させ、枸杞溶液を得るステップ（ａ）と、
乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に加えるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、枸杞発酵物を得るステップ（ｃ）と、
を含む。
上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、及びペディオコッカス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のうちの少なくとも２種の菌種から構成される。
本発明の一実施形態によれば、上記乳酸菌組成物は、各構成菌種を用いて等菌数比で調製してなる。
本発明の一実施形態によれば、上記枸杞は、アフリカン枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ａｆｒｕｍ）、寧夏枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ）、中国枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、新疆枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｄａｓｙｓｔｅｍｕｍ）、ハマアカザ葉枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｈａｌｉｍｉｆｏｌｉｕｍ）、西北枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｔａｎｉｎｉｉ）、黒果枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ）、アラビア枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｓｈａｗｉｉ）、トルクメニスタン枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｔｕｒｃｏｍａｎｉｃｕｍ）、又はそれらの組み合わせである。本発明の一実施形態によれば、上記枸杞は寧夏枸杞である。本発明の一実施形態によれば、上記枸杞は中国枸杞である。
本発明の好ましい実施形態によれば、ステップ（ａ）において、上記溶媒は水であり、上記枸杞溶液は５－１０％（重量比）の上記枸杞を含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、ステップ（ｂ）において、１０５－１０７のコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＣＦＵ）／ｍｌで上記乳酸菌組成物を上記枸杞溶液に加える。
本発明の好ましい実施形態によれば、ステップ（ｃ）において、上記混合物を３５℃で２４時間発酵させる。
したがって、本発明は、枸杞発酵物をさらに提供する。上記枸杞発酵物は本発明の製造方法により製造される。
本発明の他の態様では、薬物製造における本発明の枸杞発酵物の使用が提供される。上記薬物は、被験体の肝疾患（ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ） の予防及び／又は治療に使用される。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記肝疾患は、アルコール性肝疾患（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＬＤ）、薬物性肝疾患（ｄｒｕｇ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、感染性肝疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）、肝線維症（Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＬＦ）又は肝硬変（Ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）であってもよい。一実施例において、上記肝疾患は薬物性肝疾患である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記被験体はヒトである。
本発明の１つ又は複数の具体的な実施例の詳細は、後述する。詳細な説明及び特許出願の範囲に基づいて、本発明の他の特徴及び利点が明らかになるであろう。以下の実施形態を参照することにより、当業者は、本発明の基本的な精神及び他の目的、ならびに本発明の技術的手段及び実施態様を容易に理解することができる。
以下の詳細な説明、特許出願の範囲及び添付する図面を参照することにより、本発明の内容及び他の特徴、態様及び利点は、より明白で理解可能であろう。
本発明をより詳細かつ完全にするために、以下に、本発明の実施態様及び具体的な実施例について例示的な説明を提供する。しかし、以下の説明は本発明の具体的な実施例を実施又は使用する唯一の形式ではない。実施形態には、複数の具体的な実施例の特徴、並びにこれらの具体的な実施例を構築及び操作するための方法手順及び順序が含まれる。他の具体的な実施例により同じ又は均等の機能及び手順を実現することもできる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例及び添付する特許請求の範囲で使用される特定の用語をここで説明する。本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって理解及び使用されるのと同じ意味を有する。文脈と矛盾することなく、本明細書で使用される単数名詞には名詞の複数形が含まれ、複数の名詞は名詞の単数形が含まれる。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲において、単数形の「ｏｎｅ」（ａ及びａｎ）には、文脈に基づいて別段の指示がない限り、複数の参照値が含まれる。また、本明細書及び特許請求の範囲において、「少なくとも１つ」（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）と「１又は複数」（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）は同義であり、いずれにも１、２、３又はそれ以上が含まれる。さらに、本明細書及び特許請求の範囲において、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも１つ」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣのうちの少なくとも１つ」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＢとＣ、ＡとＣ、及びＡとＢとＣが含まれる。
便宜上、本明細書、実施例及び添付する特許請求の範囲で使用される特定の用語をここで説明する。本明細書で別段の定義がない限り、本明細書で使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって理解及び使用されるのと同じ意味を有する。文脈と矛盾することなく、本明細書で使用される単数名詞には名詞の複数形が含まれ、複数の名詞は名詞の単数形が含まれる。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲において、単数形の「ｏｎｅ」（ａ及びａｎ）には、文脈に基づいて別段の指示がない限り、複数の参照値が含まれる。また、本明細書及び特許請求の範囲において、「少なくとも１つ」（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）と「１又は複数」（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）は同義であり、いずれにも１、２、３又はそれ以上が含まれる。さらに、本明細書及び特許請求の範囲において、「Ａ、Ｂ及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣのうちの少なくとも１つ」及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣのうちの少なくとも１つ」には、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＢとＣ、ＡとＣ、及びＡとＢとＣが含まれる。
本発明のより広い範囲を定義するために使用される数値範囲及びパラメータはおおよその数値であるが、特定の実施形態における関連数値は、可能な限り正確にここに提示されている。ただし、どの数値にも本質的にテスト方法による標準偏差が必然的に含まれる。ここで、「約」とは、通常、実際の値が特定の値又は範囲の±１０％、５％、１％、又は０．５％以内であることを意味する。或いは、「約」との用語は、当業者の考慮に応じて、実際の値が平均値の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。実験例を除いて、又は特に明記されていない限り、本明細書で使用されるすべての範囲、量、値、及びパーセンテージ（例えば、材料の量、時間の長さ、温度、動作条件、量比及び他の同様のものを説明するために使用される）は、「約」によって修飾されることを理解されたい。従って、特に断りのない限り、本明細書及び添付する特許請求の範囲に開示された数値パラメータは概算の数値であり、必要に応じて変更することができる。少なくともこれらの数値パラメータは、示された有効桁数と、一般的なキャリーメソッドを適用して取得された数値として理解されるべきである。ここで、数値範囲は、ある端点から別の端点まで、又は２つの端点の間として表される。特に指定のない限り、ここに記載されている数値範囲には端点が含まれる。
本明細書において、上記「菌数」（ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ）との用語は、総菌数（ｔｏｔａｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ）又は生菌数（ｖｉａｂｌｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｕｎｔ）を意味する。例えば、総菌数は、「直接顕微鏡カウント法」（ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｕｎｔ）又は「濁度測定法」（ｔｕｒｂｉｄｉｔｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）により測定された単位面積、体積又は重量の総菌数であってもよい。生菌数は、「定量平板法」（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｌａｔｉｎｇ）により測定された単位面積、体積又は重量のＣＦＵ（例えば、ＣＦＵ／ｃｍ２、ＣＦＵ／ｍｌ、ＣＦＵ／ｇなど）、或いは「希釈培養カウント法」（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ）により測定された単位体積又は重量の最確数（ｍｏｓｔ ｐｒｏｂａｂｌｅ ｎｕｍｂｅｒ，ＭＰＮ）（例えば、ＭＰＮ／ｍｌ、ＭＰＮ／ｇなど）であってもよい。直接顕微鏡カウント法とは、染色剤（例えば、クリスタルバイオレット）で染色した後、顕微鏡で直接観察することによりカウントし、総菌数を推算する方法をいう。濁度測定法とは、分光計により４９０から５５０ｎｍの波長を読み取り、細菌含有懸濁液の吸収率又は屈折率を測定し、標準曲線と比較して測定される細菌の濃度及び総菌数を推算する方法をいう。定量平板法とは、段階的に希釈した後の菌液を塗布した後、その単一コロニーの数をカウントし、生菌数を推算する方法をいう。希釈培養カウント法とは、希釈された濃度が異なる一連の菌液を３回繰り返して培養し、菌含有試験管の数（陽性反応の数）をカウントし、最確数表（ＭＰＮ比較表）に基づいて生菌数を推算する方法をいう。本発明のいくつかの実施形態によれば、上記「菌数」は生菌数であり、ＣＦＵ／ｍｌをこの生菌数を計算する単位とする。
上記「被験体」（ｓｕｂｊｅｃｔ）とは、本発明の枸杞発酵物により治療され得る哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）をいう。上記「哺乳動物」とは、哺乳綱（Ｍａｍｍａｌｉａ）の全てのメンバーをいい、ヒト、霊長類（例えば、サル）、家庭用及び農業用動物（例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ニワトリ）、齧歯類（例えば、マウス、ラット、モルモット、グラウンドホッグ、ハムスター）、及び動物園動物、運動用動物、ペット（例えば、イヌ、ネコ、トリ）を含む。性別のいずれかが指定されていない限り、「被験体」という用語は男性と女性の両方を指す。いくつかの実施形態において、被験体は、本発明の枸杞発酵物により治療され得る肝疾患に罹患しているヒトをいう。
上記「予防」（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ又はｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）という用語は、ある疾患、又はこの疾患に関連する１若しくは複数種の症状の発展又は発生を排除（ｐｒｅｃｌｕｄｅ）するか、或いはこの疾患の再発を防止することをいう。本明細書において、上記疾患は肝疾患である。
上記「治療」（ｔｒｅａｔｉｎｇ又はｔｒｅａｔｍｅｎｔ）という用語は、所望の薬学的及び／又は生理学的効果を達成するための治癒的又は緩和的治療を指すことができる。例えば、肝疾患、肝疾患に関連する症状、肝疾患の二次疾患（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｄｉｓｅａｓｅ）又は病状（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を罹患している被験体に有効量の本発明の枸杞発酵物を使用又は投与することにより、部分的又は完全に軽減し（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）、改善し（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）、緩和し（ｒｅｌｉｅｖｅ）、発症を遅延し（ｄｅｌａｙ ｏｎｓｅｔ）、進行を阻害し（ｉｎｈｉｂｉｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ）、重症度を軽減し（ｒｅｄｕｃｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ）、及び／又は肝疾患の１種又は複数種の症状若しくは兆候（ｆｅａｔｕｒｅ）の発生を減少させる。
本明細書において、「投与」（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ、ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ又はａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）という用語は、送達方式をいい、本発明の枸杞発酵物を被験体に提供することをいう。投与方式には、経口、静脈内、動脈内、皮内、皮下、筋肉内などの投与経路が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書において、「有効量」（ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）との用語は、必要な用量及び時間内で、本発明の枸杞発酵物による治療を所望の治療効果（例えば、肝疾患の治療）に達させる用量をいう。治療の目的では、有効量は、本発明の枸杞発酵物の治療利益がその毒性又は有害な影響を超える用量であってもよい。上記有効量は、必ずしも疾患（例えば、肝疾患）を治癒するわけではなく、この疾患の発生を遅延、阻害若しくは防止し、又はこの疾患に関連する症状を軽減することができればよい。当業者は、実験動物モデルにより得られた用量から薬物（例えば、本発明の枸杞発酵物）のヒト等価用量（ｈｕｍａｎ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｄｏｓｅ，ＨＥＤ）に換算することができる。例えば、当業者は、米国食品医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＦＤＡ）に開示の「成人の健康なボランティアの治療薬の最初の臨床試験における最大安全開始用量の推定」（Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍａｘｉｍｕｍ Ｓａｆｅ Ｓｔａｒｔｉｎｇ Ｄｏｓｅ ｉｎ Ｉｎｉｔｉａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｉｎ Ａｄｕｌｔ Ｈｅａｌｔｈｙ Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ）に従ってヒトに使用可能な最大安全用量を推算することができる。
ＩＩ．発明の詳細な説明
本発明は、枸杞発酵物の製造方法を提供することを目的とする。この方法の少なくとも一部は、単一の乳酸菌を用いて製造した枸杞発酵物に比べ、多種類の乳酸菌の組成物を用いて製造した枸杞発酵物が疾患（特に、肝疾患）に対して高い治療効果を有する発明者の発見に基づくものである。
本発明は、枸杞発酵物の製造方法を提供することを目的とする。この方法の少なくとも一部は、単一の乳酸菌を用いて製造した枸杞発酵物に比べ、多種類の乳酸菌の組成物を用いて製造した枸杞発酵物が疾患（特に、肝疾患）に対して高い治療効果を有する発明者の発見に基づくものである。
１．枸杞発酵物の製造方法
本発明の一態樣によれば、枸杞発酵物の製造方法が提供される。
この方法は、
枸杞を溶媒に溶解させ、枸杞溶液を得るステップ（ａ）と、
乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に加えるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、上記枸杞発酵物を得るステップ（ｃ）と、
を含む。
上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス、及びペディオコッカス・アシディラクティシィのうちの少なくとも２種類の菌種からなる。
本発明の一態樣によれば、枸杞発酵物の製造方法が提供される。
この方法は、
枸杞を溶媒に溶解させ、枸杞溶液を得るステップ（ａ）と、
乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に加えるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、上記枸杞発酵物を得るステップ（ｃ）と、
を含む。
上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス、及びペディオコッカス・アシディラクティシィのうちの少なくとも２種類の菌種からなる。
本発明の枸杞発酵物を製造するために、まず、枸杞原料を準備する。枸杞の種類は、特に限定されず、アフリカン枸杞、寧夏枸杞、中国枸杞、新疆枸杞、ハマアカザ葉枸杞、西北枸杞、黒果枸杞、アラビア枸杞、トルクメニスタン枸杞又はそれらの組み合わせであってもよい。本発明の好ましい実施形態によれば、上記枸杞原料は寧夏枸杞である。本発明の別の好ましい実施形態において、上記枸杞原料は中国枸杞である。
次に、ステップ（ａ）に記載のように、上記枸杞原料を溶媒に溶解させ、枸杞溶液を得る。本発明の一実施形態によれば、上記枸杞原料を溶媒に加えた後、粉砕又はスラリー化などの微細化処理を行い、枸杞スラリーを調製し、上記枸杞溶液を得る。上記溶媒は、水溶性溶媒であってもよく、水、滅菌水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン又はプロピレングリコール）又はその混合物、リンガー液、リン酸緩衝液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）、トリエタノールアミンを含むリン酸緩衝液、注射用滅菌水、及びブドウ糖注射液などの等張液などを含むが、これらに限定されない。本発明の一実施形態によれば、上記溶媒は水である。後続の乳酸菌発酵の効率を向上させるために、他の添加物を上記溶媒に加えてもよい。上記添加物は、乳酸菌の栄養物、例えば、酵母エキスなどであってもよい。
枸杞溶液の製造に用いる枸杞原料と溶媒との配合比率は、１：５－１：３０の重量比、例えば、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：２１、１：２２、１：２３、１：２４、１：２５、１：２６、１：２７、１：２８、１：２９又は１：３０の重量比であってもよい。好ましくは、枸杞原料と溶媒との比率は、１：１０－１：２０の重量比、例えば、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９又は１：２０の重量比である。本発明の一実施形態によれば、枸杞原料と溶媒との比率は１：１０（即ち、この枸杞溶液に１０％（重量比）の枸杞が含まれる。例えば、約１０ｇの枸杞を取り、９０ｇの蒸留水を加える）。本発明の他の実施例において、枸杞原料と溶媒との比率は１：２０である（即ち、この枸杞溶液に５％（重量比）の枸杞が含まれる）。
ステップ（ｂ）において、乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に接種する。この乳酸菌組成物中の乳酸菌含有量は、１０５－１０７ ＣＦＵ／ｍｌである。例えば、乳酸菌含有量は、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７又は９×１０７ ＣＦＵ／ｍｌである。一実施例において、乳酸菌組成物中の乳酸菌含有量は１０５ ＣＦＵ／ｍｌである。他の実施例において、乳酸菌組成物中の乳酸菌含有量は１０６ ＣＦＵ／ｍｌである。別の実施例において、乳酸菌組成物中の乳酸菌含有量は１０７ ＣＦＵ／ｍｌである。
上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス、及びペディオコッカス・アシディラクティシィのうちの少なくとも２種類の菌種からなる。例えば、上記乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタムとラクトバチルス・ガセリを含む組成物、ラクトバチルス・ファーメンタムとリゥコノストック・メゼンテロイデスを含む組成物、ラクトバチルス・ファーメンタムとペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、ラクトバチルス・ガセリとリゥコノストック・メゼンテロイデスを含む組成物、ラクトバチルス・ガセリとペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、リゥコノストック・メゼンテロイデスとペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、ラクトバチルス・ファーメンタムと、ラクトバチルス・ガセリと、リゥコノストック・メゼンテロイデスを含む組成物、ラクトバチルス・ファーメンタムと、ラクトバチルス・ガセリと、ペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、ラクトバチルス・ファーメンタムと、リゥコノストック・メゼンテロイデスと、ペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、ラクトバチルス・ガセリと、リゥコノストック・メゼンテロイデスと、ペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物、又はラクトバチルス・ファーメンタムと、ラクトバチルス・ガセリと、リゥコノストック・メゼンテロイデスと、ペディオコッカス・アシディラクティシィを含む組成物である。
本発明のいくつかの実施形態によれば、乳酸菌組成物は、２種類の乳酸菌からなり、２種類の乳酸菌を用いて１：０．３－１：５の菌数比率で調製されてなる。例えば、１：０．３、１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５又は１：５の菌数比率で調製されてなる。特定の実施例において、２種類の乳酸菌はそれぞれラクトバチルス・ファーメンタムとラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ファーメンタムとリゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ファーメンタムとペディオコッカス・アシディラクティシィ、ラクトバチルス・ガセリとリゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリとペディオコッカス・アシディラクティシィ、リゥコノストック・メゼンテロイデスとペディオコッカス・アシディラクティシィであり、上記乳酸菌組成物は、上記２種類の乳酸菌を用いて１：１の菌数比率（等菌数比）で調製してなる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、乳酸菌組成物は、３種類の乳酸菌を用いて１：０．３：０．３－１：５：５、例えば、１：０．３：０．３、１：０．３：０．５、１：０．３：１、１：０．３：２、１：０．３：３、１：０．３：４、１：０．３：５、１：０．５：０．５、１：０．５：１、１：０．５：２、１：０．５：３、１：０．５：４、１：０．５：５、１：１：１、１：１：２、１：１：３、１：１：４、１：１：５、１：２：２、１：２：３、１：２：４、１：２：５、１：３：３、１：３：４、１：３：５、１：４：４、１：４：５又は１：５：５の菌数比率で調製してなる。特定の実施例において、３種類の乳酸菌は、それぞれラクトバチルス・ファーメンタムと、ラクトバチルス・ガセリと、リゥコノストック・メゼンテロイデス；ラクトバチルス・ファーメンタムと、ラクトバチルス・ガセリと、ペディオコッカス・アシディラクティシィ；ラクトバチルス・ファーメンタムと、リゥコノストック・メゼンテロイデスと、ペディオコッカス・アシディラクティシィ；ラクトバチルス・ガセリと、リゥコノストック・メゼンテロイデスと、ペディオコッカス・アシディラクティシィである。乳酸菌組成物は、これらの３種類の乳酸菌を用いて１：１：１の菌数比率（等菌数比）で調製してなる。
本発明のいくつかの実施形態によれば、乳酸菌組成物は、４種類の乳酸菌を用いて１：０．３：０．３：０．３－１：３：３：３、例えば、１：０．３：０．３：０．３、１：０．３：０．３：０．５、１：０．３：０．３：１、１：０．３：０．３：２、１：０．３：０．３：３、１：０．３：０．５：０．５、１：０．３：０．５：１、１：０．３：０．５：２、１：０．３：０．５：３、１：０．３：１：１、１：０．３：１：２、１：０．３：１：３、１：０．３：２：２、１：０．３：２：３、１：０．３：３：３、１：０．５：０．５：０．５、１：０．５：０．５：１、１：０．５：０．５：２、１：０．５：０．５：３、１：０．５：１：１、１：０．５：１：２、１：０．５：１：３、１：０．５：２：２、１：０．５：２：３、１：０．５：３：３、１：１：１：１、１：１：１：２、１：１：１：３、１：１：２：２、１：１：２：３、１：１：３：３、１：２：２：２、１：２：２：３、１：２：３：３又は１：３：３：３の菌数比率で調製してなる。特定の実施例において、４種類の乳酸菌はそれぞれラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス及びペディオコッカス・アシディラクティシィであり、上記乳酸菌組成物は、上記４種類の乳酸菌を用いて１：１：１：１の菌数比率（等菌数比）で調製してなる。
次に、ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、枸杞発酵物を得る（ステップ（ｃ））。本発明のいくつかの実施形態によれば、発酵温度は、２０－４２℃、例えば、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１又は４２℃であり、好ましくは２５－３７℃であり、より好ましくは３０－３５℃である。特定の実施例において、発酵温度は３５℃である。本発明のいくつかの実施形態によれば、発酵時間は１２－７２時間、例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５４、６０、６６又は７２時間であり、好ましくは、１２－３６であり、より好ましくは、１６－２４時間である。特定の実施例において、発酵時間は２４時間未満である。
２．枸杞発酵物
本発明は、本発明の製造方法により製造される枸杞発酵物も含む。本発明の枸杞発酵物を保存するために、枸杞発酵物（枸杞残渣を含む）を製造した後、この枸杞発酵物を遠心分離（例えば、回転速度（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ，ｒｐｍ）８，０００／分間で１０分間遠心分離）することで枸杞残渣を除去し、上記枸杞発酵液を取得し、さらに保存のために乾燥粉末にすることができる。濃縮（例えば、蒸発濃縮（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、凍結濃縮（ｆｒｅｅｚｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、減圧濃縮（ｖａｃｕｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）若しくは薄膜濃縮（ｔｈｉｎ－ｆｉｌｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））、及び／又は乾燥（例えば、自然乾燥（ｎａｔｕｒａｌ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、天日乾燥（ｓｕｎ ｄｒｙｉｎｇ））；自然換気乾燥（ｋｉｌｎ ｄｒｙｉｎｇ）（ オーブン乾燥（ｏｖｅｎ ｄｒｙｉｎｇ）とも呼ばれる）；熱風乾燥（ｈｏｔ ａｉｒ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、箱型棚式乾燥（ｃａｂｉｎｅｔ ｄｒｙｉｎｇ）、トンネル乾燥（ｔｕｎｎｅｌ ｄｒｙｉｎｇ）、ベルト乾燥（ｂｅｌｔ ｄｒｙｉｎｇ）、回転乾燥（ｒｏｔａｒｙ ｄｒｙｉｎｇ）、気流乾燥（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｙｉｎｇ）、流動床乾燥（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ ｂｅｄ ｄｒｙｉｎｇ））；噴霧乾燥（ｓｐｒａｙ ｄｒｙｉｎｇ）；フィルム乾燥（ｆｉｌｍ ｄｒｙｉｎｇ）（ ドラム乾燥（ｄｒｕｍ ｄｒｙｉｎｇ）とも呼ばれる）；真空乾燥（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｙｉｎｇ）；凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、真空凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｗｉｔｈ ｖａｃｕｕｍ）、常圧凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｖａｃｕｕｍ））；又はパフ乾燥（ｐｕｆｆ ｄｒｙｉｎｇ））などの過程により枸杞発酵物の乾燥粉末を製造する。本発明の一実施形態によれば、枸杞発酵物は、凍結乾燥法により製造された枸杞発酵物の乾燥粉末である。
本発明は、本発明の製造方法により製造される枸杞発酵物も含む。本発明の枸杞発酵物を保存するために、枸杞発酵物（枸杞残渣を含む）を製造した後、この枸杞発酵物を遠心分離（例えば、回転速度（ｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｓ ｐｅｒ ｍｉｎｕｔｅ，ｒｐｍ）８，０００／分間で１０分間遠心分離）することで枸杞残渣を除去し、上記枸杞発酵液を取得し、さらに保存のために乾燥粉末にすることができる。濃縮（例えば、蒸発濃縮（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、凍結濃縮（ｆｒｅｅｚｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、減圧濃縮（ｖａｃｕｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）若しくは薄膜濃縮（ｔｈｉｎ－ｆｉｌｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ））、及び／又は乾燥（例えば、自然乾燥（ｎａｔｕｒａｌ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、天日乾燥（ｓｕｎ ｄｒｙｉｎｇ））；自然換気乾燥（ｋｉｌｎ ｄｒｙｉｎｇ）（ オーブン乾燥（ｏｖｅｎ ｄｒｙｉｎｇ）とも呼ばれる）；熱風乾燥（ｈｏｔ ａｉｒ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、箱型棚式乾燥（ｃａｂｉｎｅｔ ｄｒｙｉｎｇ）、トンネル乾燥（ｔｕｎｎｅｌ ｄｒｙｉｎｇ）、ベルト乾燥（ｂｅｌｔ ｄｒｙｉｎｇ）、回転乾燥（ｒｏｔａｒｙ ｄｒｙｉｎｇ）、気流乾燥（ｐｎｅｕｍａｔｉｃ ｄｒｙｉｎｇ）、流動床乾燥（ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ ｂｅｄ ｄｒｙｉｎｇ））；噴霧乾燥（ｓｐｒａｙ ｄｒｙｉｎｇ）；フィルム乾燥（ｆｉｌｍ ｄｒｙｉｎｇ）（ ドラム乾燥（ｄｒｕｍ ｄｒｙｉｎｇ）とも呼ばれる）；真空乾燥（ｖａｃｕｕｍ ｄｒｙｉｎｇ）；凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ ｄｒｙｉｎｇ）（例えば、真空凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｗｉｔｈ ｖａｃｕｕｍ）、常圧凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｙｉｎｇ ｗｉｔｈｏｕｔ ｖａｃｕｕｍ））；又はパフ乾燥（ｐｕｆｆ ｄｒｙｉｎｇ））などの過程により枸杞発酵物の乾燥粉末を製造する。本発明の一実施形態によれば、枸杞発酵物は、凍結乾燥法により製造された枸杞発酵物の乾燥粉末である。
本発明の枸杞発酵物を容易に使用するために、枸杞発酵物と薬学的に許容される担体とを医薬組成物に調製し、被験体に特定の投与方式によりこの医薬組成物を投与することができる。上記薬学的に許容される担体は、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩を含む緩衝液）；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジン）；糖類（例えば、グルコース、マンノース、デキストリン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；糖アルコール（例えば、マニトール、ソルビトール）；塩形成カウンターイオン（例えば、ナトリウム）、及び非イオン性界面活性剤（例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ＴＷＥＥＮＴＭ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンブロックコポリマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＴＭ））を含むが、これらに限定されない。本発明は、上記医薬組成物を含む。
３．枸杞発酵物の使用
本発明の別の態様は、肝疾患に罹患している被験体の予防及び／又は治療における本発明の枸杞発酵物の使用に関する。上記肝疾患は、アルコール性肝疾患、薬物性肝疾患、感染性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症又は肝硬変を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の実施例によれば、上記肝疾患は、薬物性肝疾患（例えば、ＡＰＡＰに起因する薬物性肝疾患）である。
本発明の別の態様は、肝疾患に罹患している被験体の予防及び／又は治療における本発明の枸杞発酵物の使用に関する。上記肝疾患は、アルコール性肝疾患、薬物性肝疾患、感染性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝炎、肝線維症又は肝硬変を含むが、これらに限定されない。本発明の特定の実施例によれば、上記肝疾患は、薬物性肝疾患（例えば、ＡＰＡＰに起因する薬物性肝疾患）である。
本発明の枸杞発酵物の用量、投与経路及び投与方法は異なる要素、例えば、被験体の状況、体重、性別、年齢、被験体の重症度、注射経路などによって決定される。これらの要素の重要度は当該技術分野で知られており、通常の実験手順により調整することができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、本発明の枸杞発酵物の治療対象は、哺乳動物、特にヒトである。ヒトを治療する目的を達成するために、本発明の方法では、枸杞発酵物の有効量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重－１０ｇ／ｋｇ体重（例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００又は９５０ｍｇ／ｋｇ体重；１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．２、４．４、４．６、４．８、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２、７．４、７．６、７．８、８．０、８．２、８．４、８．６、８．８、９．０、９．２、９．４、９．６、９．８又は１０ｇ／ｋｇ体重）であり、好ましくは、２５０ｍｇ／ｋｇ体重－２ｇ／ｋｇ体重である。特定の実施例において、本発明の枸杞発酵の有効量（例えば、肝疾患の治療）は２８０ｍｇ／ｋｇ体重である。他の特定の実施例において、本発明の枸杞発酵物の有効量は５６０ｍｇ／ｋｇ体重である。別の特定の実施例において、本発明の枸杞発酵物の有効量は１．７ｇ／ｋｇ体重である。
本発明の枸杞発酵物の有効量は、単回投与又は複数投与の用量に含まれる。いくつかの実施形態において、被験体に複数回投与する際に、投与頻度は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おきに１回、３日ごとに１回、週に１回、２週間ごとに１回、月に１回、２月ごとに１回である。特定の実施形態において、被験体に複数回投与する際の投与頻度は、１日に１回又は複数回である。特定の実施形態において、複数回投与時に、１回目の投与と最後の投与との間の間隔は２ヶ月である。
本発明の枸杞発酵物は、薬物成分として投予経路に応じて経口剤形及び非経口剤形に調製することができる。本発明の医薬組成物を経口剤形に調製する場合、当該技術分野で知られている方法により適切な担体を用いて粉末、顆粒剤、錠剤、丸剤、糖衣丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、ウエハーなどに調製することができる。処方の需要に応じて、フィラー、増量剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を含んで調製してもよい。本発明の医薬組成物を非経口剤形に調製する場合、当該技術分野で知られている方法により適切な担体を用いて注射剤に調製することができる。上記適切な担体は、滅菌水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン又はプロピレングリコール）又はそれらの混合物、リンガー液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン含有リン酸緩衝液、注射用滅菌水、５％のブドウ糖注射液の等張液などを含む。
さらに、本発明の枸杞発酵物を他の薬物と併用して肝疾患を治療することができる。上記薬物は、アデホビル（ａｄｅｆｏｖｉｒ）、ベタイン（ｂｅｔａｉｎｅ，ＢＴ）、エンテカビル（ｅｎｔｅｃａｖｉｒ）、α－インターフェロン（α－ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、ラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ）、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、Ｎ－アセチルシステイン（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ，ＮＡＣ）、ω－３脂肪酸（ｏｍｅｇａ－３ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）、ピオグリタゾン（ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、リバビリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）、ロシグリタゾン（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）、スタチン系薬（ｓｔａｔｉｎ）、テルビブジン（ｔｅｌｂｉｖｕｄｉｎｅ）、テノホビル（ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ）、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ，ＵＤＣＡ）、又はビタミンＥ（ｖｉｔａｍｉｎ Ｅ）であってもよい。一実施形態において、本発明の枸杞発酵物とＮＡＣとを併用して肝疾患を治療する。別の実施形態において、本発明の枸杞発酵物とＢＴとを併用して肝疾患を治療する。別の実施形態において、本発明の枸杞発酵物とＮＡＣ及びＢＴとを併用して肝疾患を治療する。
また、本発明の枸杞発酵物は、食品の製造に適用でき、肝臓保護機能を有し、保健機能食品、栄養補助食品、健康食品又は食品添加剤として食品に使用される。本発明の枸杞発酵物は、茶、果汁、炭酸飲料、イオン飲料などの飲み物；ミルク、ヨーグルトなどの加工乳類；チューインガム、おもち、キャンディー、パン、ビスケット、麺などの食品類などのいかなる形態でも生産することができ、カプセル、丸状、顆粒、液状、粉末、錠状、ペースト状、シロップ、ゲル、ゼリーなどの保健機能食品製剤類などに調製することができる。
本発明が属する技術分野の当業者が本発明を実施するのを容易にするために、以下、いくつかの実施例により本発明の特定の態様を説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと見なされるべきではない。
実施例
材料及び方法
１．細胞培養
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＢ－８０６４ＴＭ）をダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）中で培養した。当該培地には、１％の１００ミリ体積モル濃度のピルビン酸ナトリウム、１％の１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％のウシ胎児血清が補充された。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ中で行った。
材料及び方法
１．細胞培養
Ｈｅｐ３Ｂ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＢ－８０６４ＴＭ）をダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）中で培養した。当該培地には、１％の１００ミリ体積モル濃度のピルビン酸ナトリウム、１％の１００単位／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％のウシ胎児血清が補充された。培養は、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータ中で行った。
２．乳酸菌培養
本実験において、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・バギナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・アシディラクティシィ、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）などの乳酸菌を使用した。
本実験において、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス・ペントーサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｅｎｔｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・サケイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｋｅｉ）、ラクトバシラス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・バギナリス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖａｇｉｎａｌｉｓ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ペディオコッカス・アシディラクティシィ、ペディオコッカスペントサセウス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｐｅｎｔｏｓａｃｅｕｓ）などの乳酸菌を使用した。
これらの乳酸菌をストック原液（ｓｔｏｃｋ）凍結チューブ（２０％（重量比）のグリセリン溶液（不凍液）を含む）に調製し、－８０℃で保存した。使用時に、－８０℃の保存ボックスから菌株を取り出して解凍し、３５℃の嫌気性環境下で１６から１８時間を培養して菌株を活性化した。菌株を活性化した後、菌株を再度３５℃の嫌気性環境下で１６から１８時間培養した。乳酸菌を培養する際に、乳酸菌を乳酸菌専用培養液（ＭＲＳ培養液；Ｄｅ Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ ａｎｄ Ｓｈａｒｐｅ ｂｒｏｔｈ；ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ）又は培養寒天（ＭＲＳ培養寒天；ＭＲＳ ａｇａｒ）中で培養した。
加熱殺菌した乳酸菌は、菌体懸濁液を菌数１０９ＣＦＵ／ｍｌに調整した後、１２１℃下で２０分間加熱することにより製造した。
３．発酵実験
本実験に用いた培地を製造した。本実験に用いた培地には、対照群培地及び枸杞培地が含まれる。１００ｇ培地の製造を例とすると、各組成成分の比率を表１に示す。
本実験に用いた培地を製造した。本実験に用いた培地には、対照群培地及び枸杞培地が含まれる。１００ｇ培地の製造を例とすると、各組成成分の比率を表１に示す。
特定の乳酸菌含有量の各菌株の組み合わせ（表２）を上記培地に接種する前に、これらの菌株の組み合わせを乳酸菌含有量が１０９ＣＦＵ／ｍｌであるストック原液に調製し、さらに、これらのストック原液を上記培地に加え、各培地中の乳酸菌含有量の最終濃度をそれぞれ１０５、１０６又は１０７ＣＦＵ／ｍｌにし、次に、これらの培地を３５℃下で２４、４８又は７２時間培養した。
発酵が完了した後、発酵後の菌数を算出し、各群から１ｍｌの発酵後の培地を取り、１０７、１０８、１０９倍まで１０倍段階希釈し、これらの希釈倍数（即ち、１０７、１０８、１０９）の希釈菌液を１ｍｌ取り、約２５ｍｌの液体のＭＲＳ培養寒天に加え（２回繰り返し）、固まった後、３５℃で４８時間培養した。肉眼でコロニー数をカウントし、コロニー数が２５０に最も近いものを計算基準として上記発酵後の菌数を逆算した。
４．枸杞発酵液の凍結乾燥粉末の調製
１０％（重量比）を含む枸杞培地を調製した後、この培地を１０５ＣＦＵ／ｍｌの各菌株の組み合わせに接種し、３５℃で２４時間培養した。次に、発酵後の枸杞発酵液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集し、さらに、真空濃縮により余分な水分を取り除き、－８０℃で一晩凍結した後、凍結乾燥した。
１０％（重量比）を含む枸杞培地を調製した後、この培地を１０５ＣＦＵ／ｍｌの各菌株の組み合わせに接種し、３５℃で２４時間培養した。次に、発酵後の枸杞発酵液を５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を収集し、さらに、真空濃縮により余分な水分を取り除き、－８０℃で一晩凍結した後、凍結乾燥した。
５．細胞生存率の分析
細胞技術法により細胞生存率を分析した。１×１０５個のＨｅｐ３Ｂ細胞を培養皿に接種し、加熱殺菌した乳酸菌及び１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４８時間共培養した後、細胞を収集し、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）で細胞を染色し、次に、血液細胞カウンターを用いて顕微鏡下で生存細胞の数をカウントした。
細胞技術法により細胞生存率を分析した。１×１０５個のＨｅｐ３Ｂ細胞を培養皿に接種し、加熱殺菌した乳酸菌及び１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、４８時間共培養した後、細胞を収集し、トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ）で細胞を染色し、次に、血液細胞カウンターを用いて顕微鏡下で生存細胞の数をカウントした。
ＭＴＴ試験により細胞生存率を分析した。Ｈｅｐ３Ｂを２４ウェルプレート中で培養した。各ウェルに２×１０５個の細胞を接種し、特定濃度の枸杞発酵液を加え、或いは１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに加え、４８時間培養した後、培地を取り除き、ＭＴＴ試験分析を行った。具体的には、０．２ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、２時間培養した後に取り除き、さらに１ｍｌのＤＭＳＯを加えて紫色の粒状結晶を溶解し、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ５９５ｎｍの吸光度を読み取った。
６．肝機能生化学的指標の検出
特定の処理がなされた後のＨｅｐ３Ｂ細胞を収集し、超音波破砕機（２０キロヘルツ）により細胞を破砕した。破砕は、５秒間超音波破砕、５秒間停止を２分間繰り返した。次に、破砕された細胞を３０，０００×ｇの回転速度で、４℃で３０分間遠心分離し、上清を収集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットによりＡＳＴ（Ａｂｃａｍ）及びＡＬＴ（Ａｂｃａｍ）測定を行い、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ５７０ｎｍの吸光度を読み取った。
特定の処理がなされた後のＨｅｐ３Ｂ細胞を収集し、超音波破砕機（２０キロヘルツ）により細胞を破砕した。破砕は、５秒間超音波破砕、５秒間停止を２分間繰り返した。次に、破砕された細胞を３０，０００×ｇの回転速度で、４℃で３０分間遠心分離し、上清を収集し、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）キットによりＡＳＴ（Ａｂｃａｍ）及びＡＬＴ（Ａｂｃａｍ）測定を行い、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ５７０ｎｍの吸光度を読み取った。
７．マウス薬物性肝損傷モデル
本実験では、６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて実験を行った。５６匹のマウスを表３の通りに８匹／群でランダムに７つの実験群に分けた。全てのマウスを温度２５±１℃、湿度５５±５％の動物室内で飼育し、飼料と水を自由に摂取させた。本実験では、枸杞発酵液凍結乾燥粉末を低、中、高の用量比率（それぞれＦＬＧＪ－Ｌ、ＦＬＧＪ－Ｍ、ＦＬＧＪ－Ｈ；表４）でそれぞれ飼料に混ぜ込んで毎日マウスに給餌した。マウス体重を３０ｇとして、給餌量はマウス体重の１５％であり、１日あたりの飼料量は４．５ｇであった。ＮＡＣ及びＢＴ処理群では、毎日チューブ給餌でＮＡＣ（０．６ｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢＴ（０．０２ｇ／ｋｇ体重；ＡＣＲＯＳ ｏｒｇａｎｉｃｓ）を給餌した。対照群以外の他の群では、１週目から、９週間かけてＡＰＡＰ（４００ｍｇ／ｋｇ体重）を週に２回腹腔内注射し、マウスの薬物性肝損傷を誘導した。９週目に実験終了後にマウスを安楽死させ、その血液及び臓器を取って各項目の分析を行った。実験期間の１、３、５、７、９週目に、眼窩からマウスの血液（３００μｌ）を採取し、血清を分離し、１００μｌ血清を取り、肝機能生化学的指標（ＡＳＴ、ＡＬＴ）の分析を行った。
本実験では、６週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用いて実験を行った。５６匹のマウスを表３の通りに８匹／群でランダムに７つの実験群に分けた。全てのマウスを温度２５±１℃、湿度５５±５％の動物室内で飼育し、飼料と水を自由に摂取させた。本実験では、枸杞発酵液凍結乾燥粉末を低、中、高の用量比率（それぞれＦＬＧＪ－Ｌ、ＦＬＧＪ－Ｍ、ＦＬＧＪ－Ｈ；表４）でそれぞれ飼料に混ぜ込んで毎日マウスに給餌した。マウス体重を３０ｇとして、給餌量はマウス体重の１５％であり、１日あたりの飼料量は４．５ｇであった。ＮＡＣ及びＢＴ処理群では、毎日チューブ給餌でＮＡＣ（０．６ｇ／ｋｇ体重；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＢＴ（０．０２ｇ／ｋｇ体重；ＡＣＲＯＳ ｏｒｇａｎｉｃｓ）を給餌した。対照群以外の他の群では、１週目から、９週間かけてＡＰＡＰ（４００ｍｇ／ｋｇ体重）を週に２回腹腔内注射し、マウスの薬物性肝損傷を誘導した。９週目に実験終了後にマウスを安楽死させ、その血液及び臓器を取って各項目の分析を行った。実験期間の１、３、５、７、９週目に、眼窩からマウスの血液（３００μｌ）を採取し、血清を分離し、１００μｌ血清を取り、肝機能生化学的指標（ＡＳＴ、ＡＬＴ）の分析を行った。
８．酸化防止酵素の測定
グルタチオン（ＧＳＨ）の測定：０．１ｇの肝臓組織を取り、組織を粉砕した後、遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清を取り、グルタチオン検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により肝臓組織中のＧＳＨ濃度を測定した。反応後、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ４０５ｎｍの吸光度を読み取った。
グルタチオン（ＧＳＨ）の測定：０．１ｇの肝臓組織を取り、組織を粉砕した後、遠心分離（１１，０００×ｇ、１０分間、４℃）し、上清を取り、グルタチオン検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により肝臓組織中のＧＳＨ濃度を測定した。反応後、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ４０５ｎｍの吸光度を読み取った。
グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）の測定：０．１ｇの肝臓組織を取り、組織を粉砕した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）し、上清を取り、グルタチオンペルオキシダーゼ検出キット（Ｃａｙｍａｎ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）により肝臓組織中のＧＰｘ濃度を測定し、反応後、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ３４０ｎｍの吸光度を読み取った。
スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の測定：０．１ｇの肝臓組織を取り、組織を粉砕した後、遠心分離（１，５００×ｇ、５分間、４℃）し、上清を取り、スーパーオキシドジスムターゼ検出キット（Ｃａｙｍａｎ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）により肝臓組織中のＳＯＤ濃度を測定し、反応後、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ４５０ｎｍの吸光度を読み取った。
カタラーゼ（ＣＡＴ）の測定：０．１ｇの肝臓組織を取り、組織を粉砕した後、遠心分離（１０，０００×ｇ、１５分間、４℃）し、上清を取り、カタラーゼ検出キット（Ｃａｙｍａｎ Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ）により肝臓組織中のＣＡＴ濃度を測定し、反応後、マイクロプレートリーダーによりデータ結果を測定し、ＯＤ５４０ｎｍの吸光度を読み取った。
９．組織化学的染色
最大の左葉の肝組織を用いてパラフィン標本を作製した。パラフィン標本を作成した後、スライサーにより５μｍの連続したパラフィン切片に切り出し、スライドガラスサンプルを作製した。次に、ヘマトキシリン・エオジン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）組織化学的染色を行った。具体的には、上記肝臓組織切片サンプルをキシレンで脱ろうし、さらに９９．５％、９５％、７０％、５０％及び３０％のエタノールで順に再水和処理した。最後に、蒸留水中で１０分間浸漬した。さらに、サンプルをヘマトキシリンで３０秒染色し、洗浄した後、エオシンで２から５分間染色し、再度洗浄した。最後に、サンプルを封入した後、光学顕微鏡下で組織の形態を観察した。
最大の左葉の肝組織を用いてパラフィン標本を作製した。パラフィン標本を作成した後、スライサーにより５μｍの連続したパラフィン切片に切り出し、スライドガラスサンプルを作製した。次に、ヘマトキシリン・エオジン（ｈａｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）組織化学的染色を行った。具体的には、上記肝臓組織切片サンプルをキシレンで脱ろうし、さらに９９．５％、９５％、７０％、５０％及び３０％のエタノールで順に再水和処理した。最後に、蒸留水中で１０分間浸漬した。さらに、サンプルをヘマトキシリンで３０秒染色し、洗浄した後、エオシンで２から５分間染色し、再度洗浄した。最後に、サンプルを封入した後、光学顕微鏡下で組織の形態を観察した。
１０．統計分析
実験データは、平均値±標準偏差で示される（ｎ≧３）。ＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアにより１元及び２元配置分散分析（１－ｗａｙ ａｎｄ ２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、Ｆ値が有意である場合、シェッフェの方法（Ｓｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｔｅｓｔ）により群間の差異の有意性を測定した（図１）。ＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアによりスチューデントのｔ検定を行った（図２Ａから図２Ｃ、図５Ａから図５Ｃ）。マウス実験結果は、３回の独立実験で得られた結果に対してＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアにより配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、さらにダンカンの新多重範囲検定（Ｄｕｎｃａｎ'ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）により群間の平均値の差異を比較したものである（図６Ａから図６Ｂ、図６Ｄから図６Ｇ）。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを示す。
実験データは、平均値±標準偏差で示される（ｎ≧３）。ＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアにより１元及び２元配置分散分析（１－ｗａｙ ａｎｄ ２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）を行い、Ｆ値が有意である場合、シェッフェの方法（Ｓｃｈｅｆｆｅ'ｓ ｔｅｓｔ）により群間の差異の有意性を測定した（図１）。ＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアによりスチューデントのｔ検定を行った（図２Ａから図２Ｃ、図５Ａから図５Ｃ）。マウス実験結果は、３回の独立実験で得られた結果に対してＳＰＳＳコンピュータ統計ソフトウェアにより配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行い、さらにダンカンの新多重範囲検定（Ｄｕｎｃａｎ'ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ）により群間の平均値の差異を比較したものである（図６Ａから図６Ｂ、図６Ｄから図６Ｇ）。Ｐ＜０．０５は、有意差があることを示す。
実施例１： ＡＰＡＰ誘導肝細胞損傷に対する加熱殺菌した乳酸菌培養液の保護効果
薬物性肝細胞損傷に対する加熱殺菌した乳酸菌培養液の保護効果を研究するために、本実施例において、まず薬物性肝細胞損傷モデルを構築した。このモデルについては、化合物ＡＰＡＰでヒト肝細胞株Ｈｅｐ３Ｂ細胞の傷害を誘導することを例として説明する。特定の濃度（５、１０及び３０ミリ体積モル濃度）のＡＰＡＰでＨｅｐ３Ｂ細胞を２４及び４８時間処理し、対照群と共に細胞生存率、ＡＳＴ及びＡＬＴの発現量を測定した。実験結果を図１に示す。ＡＰＡＰで処理されていない対照群に比べ、特定の濃度のＡＰＡＰで２４又は４８時間処理した後の細胞は、いずれもの細胞生存率が顕著に低下し、かつ用量依存的効果を示した。また、２４時間処理した細胞に比べ、４８時間処理した細胞はより顕著な成長阻害現象を示したことが観察された。これに対し、これらの細胞中のＡＳＴ及びＡＬＴの発現量は顕著に増加し、同様に用量依存的効果を示した。以上のことから、本実験において１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰで細胞を４８時間処理することにより、肝細胞の傷害を効果的に誘導できることが分かった。この結果を利用して研究を行い、肝臓を保護する可能性がある乳酸菌株をスクリーニングした。
薬物性肝細胞損傷に対する加熱殺菌した乳酸菌培養液の保護効果を研究するために、本実施例において、まず薬物性肝細胞損傷モデルを構築した。このモデルについては、化合物ＡＰＡＰでヒト肝細胞株Ｈｅｐ３Ｂ細胞の傷害を誘導することを例として説明する。特定の濃度（５、１０及び３０ミリ体積モル濃度）のＡＰＡＰでＨｅｐ３Ｂ細胞を２４及び４８時間処理し、対照群と共に細胞生存率、ＡＳＴ及びＡＬＴの発現量を測定した。実験結果を図１に示す。ＡＰＡＰで処理されていない対照群に比べ、特定の濃度のＡＰＡＰで２４又は４８時間処理した後の細胞は、いずれもの細胞生存率が顕著に低下し、かつ用量依存的効果を示した。また、２４時間処理した細胞に比べ、４８時間処理した細胞はより顕著な成長阻害現象を示したことが観察された。これに対し、これらの細胞中のＡＳＴ及びＡＬＴの発現量は顕著に増加し、同様に用量依存的効果を示した。以上のことから、本実験において１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰで細胞を４８時間処理することにより、肝細胞の傷害を効果的に誘導できることが分かった。この結果を利用して研究を行い、肝臓を保護する可能性がある乳酸菌株をスクリーニングした。
次に、上記薬物性肝細胞損傷モデルにより肝臓を保護する可能性がある乳酸菌株をスクリーニングした。１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰと、各乳酸菌株で作成された加熱殺菌した乳酸菌培養液（１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ；合計１１株）とを用いてＨｅｐ３Ｂ細胞を４８時間処理し、次いで、細胞生存率及び細胞中のＡＳＴ及びＡＬＴの発現量に対するこれらの培養液の影響を評価した。実験結果から分かるように、ラクトバチルス・ブレビス、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・ペントーサス、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムなどの加熱殺菌した乳酸菌培養液は、ＡＰＡＰで阻害された細胞生存率を効果的に回復させることができる。その中でも、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリ、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムなどの加熱殺菌した乳酸菌培養液の改善効果は最もよい。これらの培養液は、細胞生存率を対照群のレベルまで改善することもできる（図２Ａ）。
ＡＳＴ及びＡＬＴの発現量については、ラクトバチルス・ブレビス、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・サケイ、ラクトバチルス・バギナリス、ラクトバシラス・サリバリウス、ラクトバチルス・ペントーサス、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムなどの加熱殺菌した乳酸菌培養液は、ＡＰＡＰで誘導されたＡＳＴ及びＡＬＴの発現量を顕著に減少できる。その中でも、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリ、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムなどの加熱殺菌した乳酸菌培養液の改善効果は最も高い。これらの培養液は、ＡＳＴ及びＡＬＴの発現量を対照群のレベルまで改善することもできる（図２Ｂから図２Ｃ）。従って、本実験から分かるように、リゥコノストック・メゼンテロイデス、ラクトバチルス・ガセリ、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムなどの加熱殺菌した乳酸菌培養液は、優れた肝臓保護効果を有し、これらの乳酸菌株を枸杞発酵に使用し、関連実験を行うことができる。
実施例２：ＡＰＡＰで誘導された肝細胞損傷に対する枸杞発酵液の保護効果
適切な枸杞発酵液を調製するために、本実験では、特定菌株の組み合わせ（表２）を比較し、３５℃、異なる枸杞添加量（５％、１０％；重量比）、乳酸菌の接種量（１０５、１０６、１０７ＣＦＵ／ｍｌ）及び発酵日数（１、２、３日）などの条件下で発酵を行った後、乳酸菌の増殖数を測定し、得られた実験結果に基づいて最適な発酵条件を確定した。各菌株の組み合わせを上記発酵条件で発酵させた後の菌数を図３Ａから図３Ｏに示す。実験結果から分かるように、濃度が５％又は１０％の対照群培地に対して、１０５、１０６、１０７ＣＦＵ／ｍｌの特定菌株の組み合わせを接種して１日間発酵することにより、５％の枸杞培地で得られた発酵後の菌数は２から３．５倍まで増加し、１０％の枸杞培地で得られた発酵後の菌数は２から８倍もまで増加し、かつ両者の枸杞培地で得られた発酵後の菌数はいずれも１０９ＣＦＵ／ｍｌ以上に達した。以上の結果から分かるように、枸杞添加量１０％（重量比）の培地を用い、１０５ＣＦＵ／ｍｌの乳酸菌を接種し、３５℃下で１日間発酵した後、発酵後の菌数は最大１０９ＣＦＵ／ｍｌのレベルまで達することができる。従って、この発酵条件は最適な発酵条件である。
適切な枸杞発酵液を調製するために、本実験では、特定菌株の組み合わせ（表２）を比較し、３５℃、異なる枸杞添加量（５％、１０％；重量比）、乳酸菌の接種量（１０５、１０６、１０７ＣＦＵ／ｍｌ）及び発酵日数（１、２、３日）などの条件下で発酵を行った後、乳酸菌の増殖数を測定し、得られた実験結果に基づいて最適な発酵条件を確定した。各菌株の組み合わせを上記発酵条件で発酵させた後の菌数を図３Ａから図３Ｏに示す。実験結果から分かるように、濃度が５％又は１０％の対照群培地に対して、１０５、１０６、１０７ＣＦＵ／ｍｌの特定菌株の組み合わせを接種して１日間発酵することにより、５％の枸杞培地で得られた発酵後の菌数は２から３．５倍まで増加し、１０％の枸杞培地で得られた発酵後の菌数は２から８倍もまで増加し、かつ両者の枸杞培地で得られた発酵後の菌数はいずれも１０９ＣＦＵ／ｍｌ以上に達した。以上の結果から分かるように、枸杞添加量１０％（重量比）の培地を用い、１０５ＣＦＵ／ｍｌの乳酸菌を接種し、３５℃下で１日間発酵した後、発酵後の菌数は最大１０９ＣＦＵ／ｍｌのレベルまで達することができる。従って、この発酵条件は最適な発酵条件である。
さらに、肝細胞成長に対する特定菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液の影響を評価した。これらの特定菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液は、最適な発酵条件で発酵して得られたものである。乳酸菌含有量（１０５、１０６、１０７、１０８ＣＦＵ／ｍｌ）を調整した後の各菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液でＨｅｐ３Ｂ細胞を２４時間処理し、実験結果を図４に示す。実験結果から分かるように、対照群に比べ、乳酸菌含有量が１０７、１０８ＣＦＵ／ｍｌの枸杞発酵液を使用する場合、全ての群の枸杞発酵液はいずれもＨｅｐ３Ｂ細胞の成長を阻害することができる。乳酸菌含有量が１０６ＣＦＵ／ｍｌの枸杞発酵液を使用する場合、一部の群の枸杞発酵液はＨｅｐ３Ｂ細胞の成長を阻害することができ、この一部の群は、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ＋ペディオコッカス・アシディラクティシィ、ペディオコッカス・アシディラクティシィ＋ラクトバチルス・ファーメンタム、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ペディオコッカス・アシディラクティシィ、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタム、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ペディオコッカス・アシディラクティシィ＋ラクトバチルス・ファーメンタム、ラクトバチルス・ガセリ＋ペディオコッカス・アシディラクティシィ＋ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株の組み合わせである。乳酸菌含有量が１０５ＣＦＵ／ｍｌの枸杞発酵液を使用する場合、全ての群の枸杞発酵液はいずれもＨｅｐ３Ｂ細胞の成長を阻害しない。上記結果に基づいて、肝細胞の成長に対する枸杞発酵液それ自体の影響を排除するために、乳酸菌の含有量が１０５ＣＦＵ／ｍｌの枸杞発酵液を用いて後の実験を行った。
本実験では、ＡＰＡＰで誘導された肝細胞損傷に対する特定菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液の保護効果を評価した。これらの特定菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液は、最適な発酵條件で発酵して得られたものである。実験では、１０ミリ体積モル濃度のＡＰＡＰと特定菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液（１０５ＣＦＵ／ｍｌ；合計１５群）とを用いてＨｅｐ３Ｂ細胞を４８時間処理し、細胞生存率と細胞中のＡＳＴ及びＡＬＴの発現量に対するこれらの枸杞発酵液の影響を評価した。図５Ａに示される実験結果から分かるように、ラクトバチルス・ファーメンタムの枸杞発酵液以外、他の各菌株の組み合わせの枸杞発酵液はいずれもＡＰＡＰによって阻害された細胞生存率を回復することができる。
ＡＳＴの発現量については、ペディオコッカス・アシディラクティシィ及びラクトバチルス・ファーメンタムの枸杞発酵液以外、他の菌株の組み合わせの枸杞発酵液はいずれもＡＰＡＰで誘導されたＡＳＴの発現量を顕著に減少できる（図５Ｂ）。ＡＬＴの発現量については、ラクトバチルス・ファーメンタムの枸杞発酵液以外、他の菌株の組み合わせの枸杞発酵液はいずれもＡＰＡＰで誘導されたＡＬＴの発現量を顕著に減少できる（図５Ｃ）。ここで、各菌株の組み合わせの枸杞発酵液によりＡＰＡＰで誘導された肝細胞損傷（細胞生存率を低下させること、及び細胞中のＡＬＴ及びＡＳＴの発現量を増加させることを含む）を改善する目的では、順にラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタム、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株の組み合わせの枸杞発酵液の改善効果は最も高い。従って、後は、リゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株の組み合わせの枸杞発酵液を肝臓保護機能が最も良い枸杞発酵液として関連実験を行った。
実施例３：マウスの薬物性肝損傷に対する枸杞発酵液の保護効果
本実施例では、マウス薬物性肝損傷（例えば、ＡＰＡＰに起因した肝損傷）に対するリゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液（ＦＬＧＪ）の保護効果をさらに研究した。
本実施例では、マウス薬物性肝損傷（例えば、ＡＰＡＰに起因した肝損傷）に対するリゥコノストック・メゼンテロイデス＋ラクトバチルス・ガセリ＋ラクトバチルス・ファーメンタムの菌株の組み合わせを含む枸杞発酵液（ＦＬＧＪ）の保護効果をさらに研究した。
本実験は、「材料及び方法」に記載のマウス薬物性肝損傷モデルに従って行った。まず、実験前後のマウス体重、肝臓重量（以下、肝重と略す）、及び肝重／体重比を測定した。実験結果を表５に示す。結果から分かるように、各群のマウスは実験開始時に、体重に有意差がなかったが、実験終了時に、ＡＰＡＰ群のマウスの体重は対照群よりも顕著に軽く（Ｐ＜０．０５）、他の群の体重はＡＰＡＰ群に比べ有意差がなかった。肝重、肝重／体重比については、ＡＰＡＰ群の肝重、肝重／体重比は対照群よりも顕著に低く（Ｐ＜０．０５）、異なる用量のＦＬＧＪ群はＡＰＡＰ群に比べ、肝重、肝重／体重比に有意差がなかったが、改善の傾向があり、かつこの改善の傾向は用量依存的効果を示した。さらに、ＮＡＣ群は、ＡＰＡＰ群に比べ、肝重、肝重／体重比が顕著に増加し（Ｐ＜０．０５）、その肝重／体重比が対照群のレベルまで回復できた。しかし、ＢＴ群はＡＰＡＰ群に比べ、肝重、肝重／体重比に有意差がなかった。
さらに、マウス肝臟に対する枸杞発酵液の保護効果を研究するために、血清中のＡＳＴ及びＡＬＴ濃度を測定した。１、３、５、７、９週目にマウスの眼窩血液を採取し、血清中のＡＳＴ及びＡＬＴ濃度を測定した（図６Ａから図６Ｂ）。実験結果から分かるように、実験開始時（１週目）に，各群の血清ＡＳＴ濃度は対照群に比べていずれも有意差がなかった。３、５、７、９週目に、ＡＰＡＰ群の血清ＡＳＴ濃度は顕著に増加し（Ｐ＜０．０５）、この増加は釣鐘曲線を呈し、５週目に血清ＡＳＴ濃度は最大値に達した。異なる用量のＦＬＧＪ群では、３、５、７、９週目に、いずれかの用量の枸杞発酵液もＡＰＡＰで誘導された血清ＡＳＴ濃度を顕著に減少でき（Ｐ＜０．０５）、用量依存的効果を示した。ＮＡＣ群（陽性対照群）は、３、５、７、９週目のいずれもに血清中のＡＳＴ濃度が顕著に低下したことが観察された（Ｐ＜０．０５）。ＢＴ群は、５、７、９週目後に血清中のＡＳＴ濃度が顕著に低下したことが観察された（Ｐ＜０．０５）（図６Ａ）。
血清中のＡＬＴ濃度については、その実験結果は上記ＡＳＴの測定結果と類似した。つまり、実験開始時（１週目）に、各群の血清ＡＬＴ濃度は対照群に比べいずれも有意差がなかった。３、５、７、９週目に、ＡＰＡＰ群の血清ＡＬＴ濃度は顕著に増加し（Ｐ＜０．０５）、この増加は釣鐘曲線を呈し、５週目に血清ＡＬＴ濃度は最大値に達した。異なる用量のＦＬＧＪ群では、３、５、７、９週目に、いずれかの用量の枸杞発酵液もＡＰＡＰで誘導された血清ＡＬＴ濃度を顕著に減少でき（Ｐ＜０．０５）、用量依存的効果を示した。ＮＡＣ群は、３、５、７、９週目のいずれにも、ＡＰＡＰで誘導された血清中のＡＬＴ濃度が顕著に低下したことが観察された（Ｐ＜０．０５）。ＢＴ群は、３、５週目に、血清中のＡＬＴ濃度が顕著に低下することが観察されず、７、９週目から血清中のＡＬＴ濃度が顕著に低下し始めたことが観察された（Ｐ＜０．０５）（図６Ｂ）。
本実施例では、Ｈ＆Ｅ組織染色によりマウスの肝損傷状況を観察した（図６Ｃ）。実験結果から分かるように、対照群に比べ、ＡＰＡＰで処理した肝組織は、細胞壊死（ｎｅｃｒｏｓｉｓ）及び炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）の現象を顕著に示した（矢印が示すところ）。しかし、異なる用量のＦＬＧＪを投与した後、いずれかの用量の枸杞発酵液も肝細胞壊死及び炎症現象を改善した。また、陽性対照群であるＮＡＣ及びＢＴ群も肝細胞壊死及び炎症現象を改善できた。
本実施例では、さらに肝臓組織酸化防止酵素（グルタチオン（ＧＳＨ）、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）及びカタラーゼ（ＣＡＴ）などを含む）の発現量により肝臓機能を評価した。まず、グルタチオン（ＧＳＨ）については、対照群に比べ、ＡＰＡＰ群の肝臓組織ＧＳＨの発現量は顕著に低下し、約３４％低下した（Ｐ＜０．０５）。異なる用量のＦＬＧＪ群では、いずれかの用量の枸杞発酵液も肝臓組織中のＧＳＨの発現量を顕著に向上させ、用量依存的効果を示した（Ｐ＜０．０５）。ＮＡＣ及びＢＴ群も肝臓組織中のＧＳＨの発現量を顕著に向上させた（Ｐ＜０．０５）（図６Ｄ）。
また、グルタチオンペルオキシダーゼ（ＧＰｘ）については、得られた実験結果は上記と類似した。つまり、対照群に比べ、ＡＰＡＰ群の肝臓組織中のＧＰｘの発現量は顕著に低下した（Ｐ＜０．０５）。異なる用量のＦＬＧＪ群では、いずれかの用量の枸杞発酵液も肝臓組織中のＧＰｘの発現量を顕著に向上させ、用量依存的効果を示した（Ｐ＜０．０５）。ＮＡＣ及びＢＴ群も肝臓組織中のＧＰｘ発現量を顕著に向上させた（Ｐ＜０．０５）（図６Ｅ）。
さらに、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）については、得られた実験結果は上記と類似した。つまり、対照群に比べ、ＡＰＡＰ群の肝臓組織中のＳＯＤの発現量は顕著に低下した（Ｐ＜０．０５）。異なる用量のＦＬＧＪ群では、いずれかの用量の枸杞発酵液も肝臓組織中のＳＯＤの発現量を顕著に向上させ、用量依存的効果を示した（Ｐ＜０．０５）。ＮＡＣ及びＢＴ群も肝臓組織中のＳＯＤの発現量を顕著に向上させた（Ｐ＜０．０５）（図６Ｆ）。
最後に、カタラーゼ（ＣＡＴ）については、得られた実験結果は上記と類似した。つまり、対照群に比べ、ＡＰＡＰ群の肝臓組織中のＣＡＴの発現量は顕著に低下した（Ｐ＜０．０５）。異なる用量のＦＬＧＪ群では、いずれかの用量の枸杞発酵液も肝臓組織中のＣＡＴの発現量を顕著に向上させ、用量依存的効果を示した（Ｐ＜０．０５）。ＮＡＣ及びＢＴ処理群も肝臓組織中のＣＡＴの発現量を顕著に向上させた（Ｐ＜０．０５）（図６Ｇ）。
本実施例に係る動物実験では、マウス体重、肝重、肝重／体重比、血清ＡＳＴ及びＡＬＴ濃度、組織染色、肝臓組織酸化防止酵素などの指標を検出することにより、本発明の枸杞発酵液が明らかな肝臓保護効果を有し、特に、薬物（例えば、ＡＰＡＰ）で誘導された薬物性肝損傷に対して良好な治療効果を有することが証明された。
以上より、本発明の枸杞発酵液は明らかな肝臓保護効果を有するため、本発明の枸杞発酵液は、肝疾患を予防及び／又は治療するための新規薬物に適用できる。
以上の実施形態には本発明の具体的な実施例を説明したが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。当業者は、本発明の原理と趣旨から逸脱しない限り、本発明に対して様々な変更及び修正を加えることができる。従って、本発明の保護範囲は、添付する特許請求の範囲に準ずるべきである。
Claims (10)
- 枸杞発酵物の製造方法であって、
枸杞を溶媒に溶解し、枸杞溶液を得るステップ（ａ）と、
乳酸菌組成物をステップ（ａ）の枸杞溶液に加えるステップ（ｂ）と、
ステップ（ｂ）の混合物を発酵させ、前記枸杞発酵物を得るステップ（ｃ）と、
を含み、
前記該乳酸菌組成物は、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、リゥコノストック・メゼンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、及びペディオコッカス・アシディラクティシィ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）のうちの少なくとも２種類の菌種から構成される製造方法。 - 前記乳酸菌組成物は、各構成菌種を用いて等菌数比で調製してなる請求項１に記載の製造方法。
- 前記枸杞は、アフリカン枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ａｆｒｕｍ）、寧夏枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｂａｒｂａｒｕｍ）、中国枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ）、新疆枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｄａｓｙｓｔｅｍｕｍ）、ハマアカザ葉枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｈａｌｉｍｉｆｏｌｉｕｍ）、西北枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｐｏｔａｎｉｎｉｉ）、黒果枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｒｕｔｈｅｎｉｃｕｍ）、アラビア枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｓｈａｗｉｉ）、トルクメニスタン枸杞（Ｌｙｃｉｕｍ ｔｕｒｃｏｍａｎｉｃｕｍ）、又はそれらの組み合わせである。請求項１に記載の製造方法。
- 前記枸杞は、寧夏枸杞又は中国枸杞である請求項３に記載の製造方法。
- ステップ（ａ）において、該溶媒は水であり、前記枸杞溶液は５－１０％（重量比）の前記枸杞を含む請求項１に記載の製造方法。
- ステップ（ｂ）において、１０５－１０７のコロニー形成単位（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ，ＣＦＵ）／ｍｌで前記乳酸菌組成物を上記枸杞溶液に加える請求項１に記載の製造方法。
- ステップ（ｃ）において、前記混合物を３５℃で２４時間発酵させる請求項１に記載の製造方法。
- 請求項１に記載の製造方法により製造される枸杞発酵物。
- 薬物の製造における請求項８に記載の枸杞発酵物の使用であって、
前記薬物は、被験体の肝疾患（ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）を予防及び／又は治療するために使用される使用。 - 前記肝疾患は、アルコール性肝疾患（ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＡＬＤ）、薬物性肝疾患（ｄｒｕｇ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、感染性肝疾患（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ，ＮＡＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎ－ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ，ＮＡＳＨ）、肝線維症（Ｌｉｖｅｒ ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ＬＦ）又は肝硬変（Ｌｉｖｅｒ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）である請求項９に記載の使用。
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