JP2020152690A

JP2020152690A - 脂質吸収抑制剤

Info

Publication number: JP2020152690A
Application number: JP2019054238A
Authority: JP
Inventors: 博子友寄; Hiroko Tomoyose; 欣也渥美; Kinya Atsumi; 久野　斉; Hitoshi Kuno; 斉久野
Original assignee: Denso Corp
Current assignee: Denso Corp
Priority date: 2019-03-22
Filing date: 2019-03-22
Publication date: 2020-09-24
Anticipated expiration: 2039-03-22
Also published as: JP7344661B2

Abstract

【課題】食品及び医療分野における、微細藻類の新規用途を提供することを課題とする。【解決手段】コッコミクサ属の微細藻類の抽出油を有効成分として含む脂質吸収抑制剤が提供される。当該脂質吸収抑制剤は、過剰な脂質の吸収を抑制することに有用である。【選択図】なし

Description

本発明は脂質吸収抑制剤に関する。詳細には、微細藻類の抽出油を有効成分とした脂質吸収抑制剤及びその用途等に関する。

藻類は昆布やワカメといった大型の藻類（巨大藻類）と、顕微鏡で観察できる微細藻類に大別される。微細藻類は単細胞を単位とする直径10ミクロン程度の大きさであり、約10万種類が存在する。近年、微細藻類の機能性が注目され、エネルギー分野、食品分野、医療分野、環境分野など、広範な分野での利用が期待されている（例えば特許文献１〜７を参照）。

特開２０１８−０９５７２３号公報特開２０１４−２１７３０３号公報特開２０１９−０１７３２８号公報特開２０１５−０６３４７４号公報特開２０１５−０６３４７４号公報特開２００５−２４７７５７号公報特開２００３−１０２４６７号公報

今後、微細藻類の利用分野は更に拡大すると予想される。本発明が解決すべき課題は、このような潜在的価値の高い微細藻類の新たな用途を見出し、特に食品及び医療分野においてその利用を図ることにある。

上記課題の下で本発明者らはコッコミクサ属（Coccomyxa）微細藻類に注目した。コッコミクサ属微細藻類（特にコッコミクサ sp. KJ株）は脂質を高収率で生産し、特にバイオ燃料の分野での利用価値が高く（例えば特許文献１、２を参照）、その一方で抗ウイルス剤への利用も検討されている（例えば特許文献５、６を参照）。コッコミクサ属微細藻類は栄養素等の有用成分も多く含み、健康食品への適用も期待できる。そこで、コッコミクサ属微細藻類の豊富な栄養素と有用機能性成分に関して詳細な検討を行った。特に、偏食や疾病等による低栄養者、高齢者等の栄養改善に利用できるとの期待の下、脂質吸収促進作用の有無を調べた。その結果、当初の期待に反し、コッコミクサ属微細藻類の代表として用いたコッコミクサ sp. KJ株の抽出油が脂質吸収促進とは正反対ともいえる作用、即ち、脂質の吸収を抑制する作用を発揮するという、驚くべき事実が判明した。

近年、食生活の欧米化等を背景として高脂肪食の摂取量が増え、それに伴い肥満や糖尿病、高血圧、脳卒中、心臓病などの生活習慣病／メタボリックシンドロームが社会問題となっている。このような状況の中、脂質の吸収を抑制する薬剤や食品（素材、材料）の提供が求められている。本発明者らの検討がもたらした上記知見は、このようなニーズ（需要）に応えるものといえ、その意義は大きい。
主として上記の成果及び考察に基づき、以下の発明が提供される。
［１］コッコミクサ属微細藻類の抽出油を有効成分として含む脂質吸収抑制剤。
［２］前記コッコミクサ属微細藻類がコッコミクサ sp. KJ株又はその変異株である、［１］に記載の脂質吸収抑制剤。
［３］前記抽出油が有機溶媒抽出物である、［１］又は［２］に記載の脂質吸収抑制剤。
［４］前記有機溶媒がエタノール、アセトン及びヘキサンからなる群より選択される一又は二以上の有機溶媒である、［３］に記載の脂質吸収抑制剤。

［５］前記抽出油がメタノール−クロロホルム抽出物である、［１］又は［２］に記載の脂質吸収抑制剤。
［６］［１］〜［５］のいずれか一項に記載の脂質吸収抑制剤を含む、過剰な脂質の摂取又は吸収に起因する病態又は疾患の治療又は予防用組成物。
［７］前記病態又は疾患が、肥満、メタボリック症候群、糖尿病、耐糖能異常、肥満関連腎臓病、高血圧、動脈硬化性疾患、脳梗塞、脂質異常症、脂肪肝、睡眠時無呼吸症候群又は肥満低換気症候群である、［６］に記載の組成物。
［８］医薬、医薬部外品又は食品である、［６］又は［７］に記載の組成物。

ラットを用いた脂質吸収実験の結果。リンパ液中のTG濃度の時間変化を示す。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。Wistar系雄ラット（実験時7週齢）を使用。n=7 ラットを用いた脂質吸収実験の結果。リンパ液中のTG量の時間変化を示す。**P<0.01, ***P<0.001。Wistar系雄ラット（実験時7週齢）を使用。n=7 ラットを用いた脂質吸収実験の結果。投与したTGのリンパ液での回収率（積算）を示す。**P<0.01, ***P<0.001。Wistar系雄ラット（実験時7週齢）を使用。n=7 ラットを用いた脂質吸収実験の結果。6時間後のTG回収率（積算）を示す。**P<0.01。Wistar系雄ラット（実験時7週齢）を使用。n=7

１．脂質吸収抑制剤
本発明の第１の局面は脂質吸収抑制剤に関する。本発明において「脂質吸収抑制」とは、生体（典型的にはヒト生体）において、摂取した脂質の腸管からの吸収を抑制ないし阻害することをいう。この作用／効果の結果として、生体内で吸収される脂質の量が減少する。従って、本発明の脂質吸収抑制剤は、摂取した脂質の吸収率を低下させることに有用である。但し、本発明の脂質吸収抑制剤を、摂取した脂質の吸収を遅延させることに利用することもできる。

本発明の脂質吸収抑制剤の有効成分はコッコミクサ属（Coccomyxa）微細藻類の抽出油である。その抽出油に脂質吸収抑制活性が認められる限り、コッコミクサ属微細藻類は特に限定されないが、好ましい例として、コッコミクサ sp. KJ株又はその変異株を挙げることができる。コッコミクサ sp. KJ株（KJデンソー）は、２０１３年６月４日付で独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）（千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８１２０号室）に受託番号ＦＥＲＭＰ−２２２５４として寄託され、２０１５年６月２日付でプタベスト条約の規定下で受託番号ＦＥＲＭＢＰ−２２２５４として国際寄託に移管されている。尚、以前のシュードココミクサ属（Pseudococcomyxa）は、最新の分類ではコッコミクサ属に含まれることになった（参考文献：PLoS One. 2015 Jun 16;10(6):e0127838. doi: 10.1371/journal.pone.0127838. eCollection 2015.)。

コッコミクサ sp. KJ株の変異株は、紫外線、X線、γ線などの照射、変異原処理、重ビーム照射、遺伝子操作（外来遺伝子の導入、遺伝子破壊、ゲノム編集による遺伝子改変等）等によって得ることができる。脂質吸収抑制活性を示す抽出油を回収できる変異株が得られる限りにおいて、変異株の取得方法、特性等は特に限定されない。

コッコミクサ属微細藻類の培養方法は特に限定されない。コッコミクサ属微細藻類を培養するための培地としては、微細藻類の培養に通常使用されているものでよく、例えば、各種栄養塩、微量金属塩、ビタミン等を含む公知の淡水産微細藻類用の培地、海産微細藻類用の培地のいずれも使用可能である。培地としては、例えば、AF6培地が挙げられる。AF6培地の組成（100mlあたり）は以下のとおりである。
NaNO₃ 14mg
NH₄NO₃ 2.2mg
MgSO₄・7H₂O 3mg
KH₂PO₄ 1mg
K₂HPO₄ 0.5mg
CaC_l2・2H₂O 1mg
CaCO₃ 1mg
Fe-citrate 0.2mg
Citric acid 0.2mg
Biotin 0.2μg
Thiamine HCl 1μg
Vitamin B₆ 0.1μg
Vitamin B₁₂ 0.1μg
Trace metals 0.5ml
Distilled water 99.5ml

栄養塩としては、例えば、NaNO₃、KNO₃、NH₄Cl、尿素などの窒素源、K₂HPO₄、KH₂PO₄、グリセロリン酸ナトリウムなどのリン源が挙げられる。また、微量金属としては、鉄、マグネシウム、マンガン、カルシウム、亜鉛等が挙げられ、ビタミンとしてはビタミンB1、ビタミンB12等が挙げられる。

培養方法は、通気条件で二酸化炭素の供給とともに攪拌を行えばよい。その際、蛍光灯で12時間の光照射、12時間の暗条件などの明暗サイクルをつけた光照射、又は、連続光照射して培養する。培養条件も、コッコミクサ属微細藻類の増殖に悪影響を与えない範囲内であれば特に制限はされないが、例えば培養液のpHは3〜9とし、培養温度は10〜35℃にする。

尚、コッコミクサ sp. KJ株の培養方法に関しては、特開２０１５−１５９１８、ＷＯ２０１５／１９０１１６Ａ１、Satoh, A. et al., Characterization of the Lipid Accumulation in a New Microalgal Species, Pseudochoricystis ellipsoidea (Trebouxiophyceae) J. Jpn. Inst. Energy (2010) 89:909-913.等が参考になる。

本発明の脂質吸収抑制剤の有効成分（抽出油）の抽出方法は、脂質吸収抑制活性を示す成分を含有する抽出油が得られる限り、特に限定されない。例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトン、ジエチルエーテル、クロロホルム、ヘキサン（n-hexane）等の有機溶媒を単独で又は二種類以上混合して用いた抽出法（抽出法の操作については、後述の実施例を参考にすることができる）を採用することができる。成分、組成、濃度等が異なる溶媒／混合溶液で段階的又は連続的に抽出することにしてもよい。好ましい態様の一つでは、エタノール、アセトン又はヘキサン、或いはこれらの中の二つ以上を用いて抽出する。この態様の抽出法で得られた抽出油を用いれば、例えば、食品用途に特に適した脂質吸収抑制剤を構成することができる。

抽出方法としては、浸漬による抽出、加熱抽出、連続抽出、超音波抽出、ソックスレー抽出等、公知の方法を適用することができる。抽出油を精製した後に本発明の有効成分として用いることにしてもよい。精製方法の例として、シリカゲル、アルミナ等の充填剤を用いたカラムクロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、濃縮等を例示することができる。

抽出に先立ち、回収した藻体を乾燥処理及び／又は破砕処理に供してもよい。言い換えれば、乾燥した藻体、乾燥且つ破砕された藻体（典型的には乾燥粉末）、又は破砕された藻体を調製し、これを用いて抽出操作を行うことにしてもよい。

２．脂質吸収抑制剤を含む組成物
摂取した脂質の吸収を抑制することは、過剰な脂質の摂取又は吸収に起因する病態又は疾患の治療又は予防に有効な対策となる。そこで本発明の第２の局面は、脂質吸収抑制剤の用途として、過剰な脂質の摂取又は吸収に起因する病態又は疾患の治療又は予防用の組成物を提供する。

本発明の組成物は、好ましくは医薬、医薬部外品又は食品の形態で提供される。即ち、本発明は好ましい態様として、本発明の脂質吸収抑制剤を有効成分として含有する医薬組成物、医薬部外品組成物及び食品組成物を提供する。本発明の組成物の予防ないし治療の対象となる病態又は疾患（以下、説明の便宜上「標的疾患」と呼ぶ）の具体例は、肥満、メタボリック症候群、糖尿病、耐糖能異常、肥満関連腎臓病、高血圧、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、狭心症等）、脳梗塞、脂質異常症、脂肪肝、睡眠時無呼吸症候群、肥満低換気症候群である。尚、糖尿病、耐糖能異常、肥満関連腎臓病、高血圧、動脈硬化性疾患（心筋梗塞、狭心症等）、脳梗塞、脂質異常症、脂肪肝、睡眠時無呼吸症候群、肥満低換気症候群等は、肥満関連疾患でもある。

「肥満」とは一般的には体内に脂肪組織が過剰に蓄積した状態をいう。本明細書では用語「肥満」は広義に解釈されるものとし、その概念に肥満症を含む。「肥満症」とは肥満に起因ないし関連する健康障害（合併症）を有するか又は将来的に有することが予測される場合であって、医学的に減量が必要とされる病態をいう。肥満の判定法には、例えば、国際的に広く使用されているBMI（body mass index）を尺度としたものがある。BMIは、体重(kg)を身長(m)の二乗で除した数値（BMI=体重(kg)/身長(m)²)である。BMI<18.5は低体重（underweight）、18.5≦BMI<25は普通体重（normal range）、25≦BMI<30は肥満1度（pre-obese）、30≦BMI<35は肥満2度（obese class I）、35≦BMI<40は肥満3度（obese class II）、40≦BMIは肥満4度（obese class III）と判定される（WHO）。また、BMIを利用して、日本人の成人の標準体重（理想体重）を以下の式、標準体重(kg)＝身長(m)²×22から計算し、実測体重が標準体重（計算値）の120％を超える状態を肥満とする判定法もある。もっとも、標準体重（理想体重）は性別、年齢、又は生活習慣の差異などによって個人ごとに相違することから、肥満の判定をこの方法で一律に行うことは妥当でないと考えられている。

「メタボリック症候群」とは、肥満・内臓脂肪の蓄積を基盤としてインスリン抵抗性、動脈硬化惹起性リポ蛋白異常、高血圧を合併し、心血管病に罹るリスクが高くなった状態をいう。メタボリック症候群の診断基準については、2005年4月に内科系8学会（日本動脈硬化学会、日本肥満学会、日本糖尿病学会、日本高血圧学会、日本循環器学会、日本内科学会、日本腎臓病学会、日本血栓止血学会）が合同で以下の診断基準を作成している。
＜日本内科学会等８学会による診断基準＞
以下の(a)に加え、(b)〜(d)の中の二つ以上を満たす。
(a)腹囲：男性は85cm以上、女性は90cm以上
(b)中性脂肪が150mg/dl以上かつ／又はHDL-Cが40mg/dl未満
(c)血圧が130/85mmHg以上
(d)空腹時血糖が110mg/dl以上

尚、国際糖尿病連盟（IDF）は、以下の世界統一診断基準を作成している。
＜国際糖尿病連合（IDF）の診断基準＞
以下の(a)に加え、(b)〜(e)の中の二つ以上を満たす。
(a)腹囲：男性は90cm以上、女性は80cm以上
(b)中性脂肪が150mg/dl以上
(c)空腹時血糖が100mg/dl以上
(d)HDL-C：男性は40mg/dl未満、女性は45mg/dl未満
(e)血圧が130/85mmHg以上

（１）医薬組成物・医薬部外品組成物
本発明における「医薬」及び「医薬部外品」は、標的疾患に対する治療的又は予防的効果を示す薬剤組成物である。治療的効果には、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること（軽症化）、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。後者については、重症化を予防するという点において予防的効果の一つと捉えることができる。このように、治療的効果と予防的効果は一部において重複する概念であり、明確に区別して捉えることは困難であり、またそうすることの実益は少ない。尚、予防的効果の典型的なものは、標的疾患に特徴的な症状や病態の発現（発症）又は再発を阻止ないし遅延することである。尚、標的疾患に対して何らかの治療的効果又は予防的効果、或いはこの両者を示す限り、本発明の医薬組成物ないし医薬部外品組成物に該当する。

本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の製剤化は常法に従って行うことができる。製剤化する場合には、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を含有させることができる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、D-マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。無痛化剤としてはベンジルアルコール、クロロブタノール、ソルビトール等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としては塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等と用いることができる。

製剤化する場合の剤型も特に限定されず、例えば錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、注射剤、外用剤、及び座剤などとして本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物を提供できる。

本発明の医薬組成物には、期待される治療効果や予防効果を得るために必要な量（即ち治療上有効量）の有効成分が含有される。同様に本発明の医薬部外品組成物には、期待される改善効果や予防効果等を得るために必要な量の有効成分が含有される。本発明の医薬組成物又は医薬部外品組成物に含まれる有効成分量は一般に剤型や形態によって異なるが、所望の投与量を達成できるように有効成分量を例えば約0.01重量％〜約99重量％、好ましくは約0.1重量％〜約80重量％の範囲内で設定する。

本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物はその剤型・形態に応じて投与される。好ましくは、経口で対象に適用されるが、非経口（例えば、皮下、筋肉又は腹腔内注射、経皮、経鼻）で投与することを妨げるものではない。ここでの「対象」は特に限定されず、ヒト及びヒト以外の哺乳動物（ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ニワトリ、ウズラ等である）を含む。好ましい態様では、適用対象はヒトである。

本発明の医薬組成物及び医薬部外品組成物の投与量・使用量は、期待される効果が得られるように設定される。有効な投与量の設定においては一般に適用対象の症状、年齢、性別、体重などが考慮される。当業者であればこれらの事項を考慮して適当な投与量を設定することが可能である。最適な投与量は予備実験によって決定すればよい。

投与スケジュールとしては例えば一日一回〜数回、二日に一回、或いは三日に一回などを採用できる。投与スケジュールの作成においては、適用対象の症状や有効成分の効果持続時間などを考慮することができる。後述の実施例に示した実験結果に鑑みれば、本発明の有効成分は、生体の腸管内で脂質との共存状態が形成されるように摂取ないし投与されると良好な脂質吸収抑制効果を発揮すると考えられる。従って、脂質を含む食事の前（例えば食前5分〜1時間、好ましくは食前10分〜40分）、食中、食後（例えば食後1時間以内、好ましくは食後40分以内）に投与されることが好ましい。

以上の記述から明らかな通り本出願は、標的疾患の患者又は潜在的患者（将来罹患するおそれのある者）に対して本発明の医薬組成物を治療上有効量投与することを特徴とする、治療法や予防法も提供する。

（２）食品組成物
本発明の組成物の一態様は、本発明の脂質吸収抑制剤を含有する食品組成物である。本発明での「食品組成物」の例として、米飯類、パン類、野菜加工品、食肉加工品、麺類、みそ汁、スープ、菓子類（例えば、ビスケット、クッキー、チョコレート、キャンディ、ケーキ、アイスクリーム、チューインガム、タブレット）、茶飲料、清涼飲料水、炭酸飲料、果汁飲料、乳飲料、乳酸菌飲料、発酵乳飲料、アルコール飲料、スプレッド／ジャム類（マーガリン、ファストスプレッド、ジャム等）、ふりかけ、マヨネーズ／ドレッシング類、ソース／タレ類、栄養補助食品ないし保健機能食品（栄養機能食品、機能性表示食品、特定健康用食品）、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品を挙げることができる。脂質を含む食品（例えばチョコレート、ケーキ、アイスクリームなどの菓子類、スプレッド類、マヨネーズ／ドレッシング類）や脂質を含む食品に利用されるもの（例えばソース／タレ類）は、本発明の有効成分が直接的かつ効率的に作用し得るものであり、特に好ましい形態といえる。栄養補助食品ないし保健機能食品、食品添加物、愛玩動物用食品、愛玩動物用栄養補助食品の場合、粉末、顆粒末、錠剤（タブレット）、カプセル、ペースト、液体等の形状で提供することができる。食品組成物の形態で提供することによって、本発明の有効成分を日常的に摂取したり、継続的に摂取したりすることが容易となる。

本発明の食品組成物には、治療的又は予防的効果が期待できる量の有効成分が含有されることが好ましい。含有量（添加量）は、それが使用される対象となる者の病状、健康状態、年齢、性別、体重などを考慮して定めることができる。

１．微細藻類コッコミクサ sp. KJ株の抽出油（コッコミクサ藻由来抽出油）の調製
以下の手順（１）〜（６）に従い、コッコミクサ sp. KJ株の抽出油（コッコミクサ藻由来抽出油）を調製した。

（１）乾燥藻体の取得
既報の方法に準じてコッコミクサ sp. KJ株を培養した。具体的には、AF6培地にコッコミクサ sp. KJ株を植藻した後、2％CO₂（v/v）を通気し、光（300μmol/m²/s）を照射しながら室温（25℃）で48時間培養した。培養液から遠心分離により藻体を回収した。回収した藻体をドラムドライヤで乾燥させ、乾燥藻体500gを得た。

（２）藻体の造粒
藻体500gに215mLの蒸留水を足し、よくかき混ぜた（水分含有条件30％）。水分を含ませた藻体をディスクペレッター(押し出し造粒機型式F(PV)-5/11/175D；不二パウダル社製)にセットし、スクリーン(Φ1.0mm t1.0mm)の条件で本機を稼働し、円柱型の円柱型粒状藻体を得た。次に、この円柱型粒状藻体100gをマルメライザー(転動造粒機型式QJ-230T-1型；ダルトン社製)にセットし、マルメプレート3.0mm、回転数600〜1000rpm、運転時間2分で本機を稼働させ、円柱型粒状藻体の角をとった。

（３）油分の抽出
ソックスレー抽出器(GLサイエンス社製)で油分を抽出した。抽出溶媒はメタノール：クロロホルム＝2310mL：990mLとし、突沸を防ぐため、沸騰石を20個程度入れた。円筒ろ紙(86R 内径53×外径60×高さ200mm； ADVANTEC社製)に、角をとった円柱型粒状藻体100gを充填した後、24時間、常温で稼働し、油分を抽出した。

（４）メタノール−クロロホルムの除去
ロータリーエバポレータでメタノール−クロロホルムを除去した。抽出した油分をメスフラスコに入れ、ロータリーエバポレータにセットした後、メタノール及びクロロホルムが蒸発する条件下、湯浴（40℃）でメスフラスコを回転させてメタノール及びクロロホルムを蒸発させ、油分を含む半固体液状物質を得た。

（５）油分試料の調製
半固体液状物質を3,500rpm、30分の条件で遠心分離し、上澄みを別容器に移して、濃縮液を得た。残った沈殿物にヘキサンを一定量添加し、20分間超音波処理して、再度同条件で遠心分離し、上澄みを濃縮液に足し加えた。

（６）秤量
秤量した結果、130gのコッコミクサ藻由来抽出油が得られた。コッコミクサ藻由来抽出油を遮光瓶に移し、窒素封入の後、使用直前まで5℃で保存した。

２．ラットを用いた脂質吸収実験
２−１．方法
＜実験動物飼育条件＞
実験動物には入荷時6週齢Crlj:WI(Wistar) 系雄ラット（日本チャールズ・リバー（株）神奈川）14匹を用いた。予備飼育期間はCE-2（(株)日本クレア東京）を与え、飼育室は12時間（8時〜20時）のライトサイクルで、室温22℃に維持した。予備飼育約1週間後、7週齢時に半永久胸管リンパカニュレーション手術を施し、2日間の回復期間の後に本実験を行った。本実験は試料溶液を投与前に30分間、投与後1時間ずつ合計6時間経時的にリンパ液を回収した。回収したリンパ液は分析まで-80℃の冷凍庫で保存した。なお、本実験の実験前日、17時30分から一晩絶食を行った（自由飲水）。実験動物の飼育は日本実験動物学会の指針に従い、動物実験は熊本県立大学命倫理委員会の承認を得て行った（受付番号29-05）。

＜半永久胸管リンパカニュレーション手術法＞
動物にペントバルビタール麻酔（64.8 mg/kg体重）を施し、胸管にヘパリン（持田製薬株式会社、東京）生理食塩水（25 IU/mL）を満たしたシラスコン医療用チューブSH（内径0.5 mm、外径1.0 mm、カネカメディックス）を挿入した。チューブを内皮に固定して縫合した後に頭皮を約0.5 cm切開し、チューブを皮下に通して10 mLシリンジ（テルモ、東京）で作製した固定具で頭部に固定した。チューブにチップ（0.1-10 μl、サーモフィッシャーサイエンティフィック、東京）の先端を切ったものを取り付け、ヘパリン生理食塩水（500 IU/mL）で調製した60％ポリビニルピロリドン溶液（ナカライ化学薬品、京都）を満たし、熱を加えて封をした。チューブの頭部側先端に、ガラスカラムキャップを装着し、縫合前にアプシード（第一三共株式会社、東京）をふりかけ、腹部を縫合した後に元のプラスチックケージにて回復させた。なお、回復期間は自由飲水、自由摂食とし、室温は予備飼育期間と同様にした。

＜投与溶液調製＞
動物はコントロール群とコッコミクサ藻由来抽出油群（以下、抽出油群）の2群に分けた。2群に投与した脂肪酸含有量が同程度になるように以下のように抽出油投与試料を調製した。抽出油群には、コッコミクサ藻から抽出した抽出油：ナタネ油（和光純薬工業、大阪）が重量比で1：3になるように混合した。なお、抽出油に含まれる脂肪酸含量は日本食品標準成分表2015年版（7訂）分析マニュアルに則り測定した。その分析結果を用いて、脂肪酸含有量が同程度になるように計算し、動物に投与した。なお、コントロール群には菜種油を投与した。投与した成分は、動物の体重100 gあたりで換算して、コントロール群で脂肪酸0.7 g、抽出油群で脂肪酸0.7 gであった。

＜分析＞
リンパ液中のトリグリセリド（TG）濃度は、トリグリセリドEテストワコー（和光純薬工業、大阪）で測定した。湯浴槽にはUNI THERMO SHAKER NTS-1300（(株)東京理化器東京）、吸光度計にはU-2900形ダブルビーム分光光度計（(株)HITACHI 東京）を使用した。

＜統計解析＞
血中濃度の群間比較には、student’s t検定を行い、P＜0.05をもって有意差ありとした。解析には、4stepsエクセル統計付属のアドインソフトStatcelを用いた。

２−２．結果・考察
（１）リンパ液中のTGの動き
試料を経口投与すると、試料中のTGは腸管から吸収され、リンパ液中に輸送される。そのとき、2群ともリンパ液中のTG濃度は時間と共に徐々に上昇した。しかし、抽出油群は、コントロール群に比べ、TG濃度が低く抑えられた（図１）。採取したリンパ液の量とTG濃度からリンパ液中のTG量を計算した（図２）。その結果、2群ともTG量は時間と共に増加したが、抽出油群のTG量はコントロール群に比べて低値で推移した（TG量の増加が抑制された）。

（２）腸管におけるTG吸収に与える影響
経口投与した試料中のTG量に対し、腸管で吸収されリンパ液中に輸送されたTG量を求め、時間ごとの回収率として示した（図３）。
回収率(％)＝（腸管からリンパ液へ輸送されたTG量）／（経口投与したTG量）×100

その結果、抽出油群では、TGの回収率がコントロール群の約40％であり、生体内でのTGの吸収（取り込み）が大幅に抑制されたことが明らかとなった（図４）。

以上の通り、コッコミクサ藻由来抽出油に顕著なTG吸収抑制効果が認められた。

本発明の脂質吸収抑制剤は、例えば、肥満及び肥満関連疾患、メタボリック症候群等の予防・治療に有用である。本発明の脂質吸収抑制剤の有効成分は微細藻類由来であり、高い安全性も期待できる。従って、日常的ないし継続的な摂取（投与）にも適する。

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。

Claims

コッコミクサ属微細藻類の抽出油を有効成分として含む脂質吸収抑制剤。
前記コッコミクサ属微細藻類がコッコミクサ sp. KJ株又はその変異株である、請求項１に記載の脂質吸収抑制剤。
前記抽出油が有機溶媒抽出物である、請求項１又は２に記載の脂質吸収抑制剤。
前記有機溶媒がエタノール、アセトン及びヘキサンからなる群より選択される一又は二以上の有機溶媒である、請求項３に記載の脂質吸収抑制剤。
前記抽出油がメタノール−クロロホルム抽出物である、請求項１又は２に記載の脂質吸収抑制剤。
請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質吸収抑制剤を含む、過剰な脂質の摂取又は吸収に起因する病態又は疾患の治療又は予防用組成物。
前記病態又は疾患が、肥満、メタボリック症候群、糖尿病、耐糖能異常、肥満関連腎臓病、高血圧、動脈硬化性疾患、脳梗塞、脂質異常症、脂肪肝、睡眠時無呼吸症候群又は肥満低換気症候群である、請求項６に記載の組成物。
医薬、医薬部外品又は食品である、請求項６又は７に記載の組成物。