KR101543509B1

KR101543509B1 - 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101543509B1
Application number: KR1020130076609A
Authority: KR
Inventors: 김호준
Original assignee: 동국대학교 경주캠퍼스 산학협력단
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2015-08-12
Also published as: KR20150003968A

Abstract

본 발명은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 금은화 발효물은 장투과성을 개선시키고, NO 발생을 억제하여 염증을 억제하고, 혈청 염증 지표물질을 억제하고, 장내 유용 미생물을 조절하는 등 내독소혈증에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명의 금은화 발효물은 체중을 감소시키고, 부고환, 신장 및 간에서 지방을 감소시키고, 혈청 대사성 지표물질을 억제하는 등 체중감량 및 대사 개선효과가 우수하므로, 비만 또는 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating obesity, endotoxemia or metabolic disease containing fermented Lonicerae Flos}

본 발명은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

대사성 질환(metabolic disease)은 생체 내 물질대사 장애에 의해서 발생하는 질환의 총칭이다. 대사성 질환은 당질, 지질, 단백질, 비타민, 무기질 및 수분 등의 불균형에 의한 질환을 말하며, 대사병 또는 대사장해라고도 한다. 대사성 질환은 질환의 원인이 다양하고 복합적으로 작용하기 때문에, 명확한 치료법을 개발하기 어려운 실정이다.

비만(obesity)은 음식물의 섭취와 에너지 소비 사이의 불균형으로 인한 대사장애로, 체내에 지방이 과잉 축적된 상태를 말한다. 비만은 섭취된 음식물에 포함되어 있는 지방이 리파아제의 의해 분해 및 흡수되어 세포 내에 축적되거나, 축적된 지방이 지방전구세포를 지방세포로 분화하는 것을 유도하여 지방세포의 부피나 수가 늘어날 때 많이 발생한다.

세계보건기구(WHO)에서는 1996년 비만을 치료가 필요한 질병으로 분류하였다. 비만은 각종 성인병과 만성질환의 원인으로, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 심장질환, 관절염, 호흡기 질환, 성기능 장애 및 암 등을 유발하는데 관여하는 것으로 알려져 있다. 연구 결과에 따르면, 2005년 전세계 비만 인구는 4억 명으로 통계되었으며, 2015년에는 전세계 비만 인구가 7억 명으로 증가할 것으로 예상되고 있다.

현재까지 알려진 비만의 치료법은 약물 투여, 수술, 식이요법 및 운동요법 등이 있으며, 그중 약물투여법이 가장 우수한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 우수한 효과를 내는 약물투여, 특히 항비만 치료용 약물투여는 두통 및 구토 등의 부작용이 있어, 약물을 장기간 투여하기 어렵고 개체의 체질에 따라 부작용의 정도가 상이하게 나타난다는 문제점이 있다. 이와 같은 약물투여의 부작용을 해결하기 위해, 천연물 유래의 소재 또는 안정성이 확보되어 있는 식품을 소재로 한 항비만 소재에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

한편, 장(腸)은 체내로 섭취된 음식물의 영양소를 흡수하는 동시에 내부를 보호하는 방어벽으로 작용하는 소화기관이다. 장은 크게 멱역학적 기전과 비면역학적 기전으로 방어벽의 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다. 장의 비면역학적 방어는 선택적 장투과에 의해 일어난다. 체내 장투과성이 지나치게 증가되면 생명체 활동에 필요한 영양소의 흡수 저하를 가져오며, 유해한 물질의 유입을 차단하는 능력의 상실을 가져오게 된다. 체내로 유입된 독성 물질은 내부 면역계와 상호작용하여 여러 면역반응을 일으키고, 최종적으로 질병을 유발하게 된다.

한편, 위장관 손상이 발생할 경우, 장내세균 및 감염성 합병증이 유발되고, 내독소가 장관장벽을 넘어 장 이외의 기관으로 이동하게 된다. 내독소혈증(endotoxemia)은 장내세균의 일부인 내독소(endotoxin)가 파급되는 현상을 말하며, 장내세균전위는 장내세균 및 각종 세균의 생성물이 장관벽을 넘어 장 이외의 곳으로 파급되는 현상을 말한다. 내독소는 전신 염증반응 증후군(SIRS, systemic inflammatory response syndrome)과 패혈증을 유발하는 것으로 알려져 있다. 장내세균전위나 장관 내독소혈증이 발생하면, 장내세균 및 각종 생성물들은 우선 장간막 림프절로 전파되고, 림파계를 따라 흉관으로 이동하여 간, 비장 및 폐 등의 멀리 떨어진 장기까지 전파되기도 하며 간문맥을 통하여 간과 비장을 거쳐 전신혈류로 파급되기도 한다.

장내세균전위 및 내독소혈증과 연관된 질환으로는 외상, 대동맥류 수술 및 장관이식술, 폐색성 황달, 급성췌장염, 장관폐색증, 간경변증, 심부전, 종양성 질환, 염증성 장 질환, 폐외 급성호흡부전증(extrapulomonary ARDS), 전신적 염증성 반응 증후군과 폐혈증 등이 있으며, 내독소혈증은 이러한 질환의 감염성 합병증과도 상관관계가 있음이 밝혀지고 있다(Adv.Exp.Med.Biol 1999;473:11-30).

한편, 금은화(Lonicerae Flos) 또는 인동물은 인동과(Caprifoliaceae)에 속하는 인동덩굴(Lonicera japonica Thunberg)의 꽃으로, 해열 및 해독 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 금은화는 종기, 상처, 종양, 인후염, 피부질환, 치루, 감모, 열성 이 등의 치료에 사용되어 왔다.

발효 한약이란 한약재를 우수한 종균으로 발효시켜 원래 한약이 가지는 약효를 증가시키거나 새로운 기능을 추가한 약재를 말한다. 일반 한약에 비하여 발효 한약의 경우, 약효가 빠르고 소화흡수율이 뛰어나며 항산화 활성이 우수하다. 또한, 발효 한약은 일반 한약에 비하여 농약 및 중금속 등의 독성물질로부터 상대적으로 안전하고 부작용이 적다는 장점이 있으나, 아직 이에 대한 체계적인 연구는 미미한 실정이다.

본 발명자들은 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 치료 효과가 우수한 천연 소재에 관해 연구하던 중, 금은화 발효물이 장투과성을 개선시키고, NO 발생을 억제하여 염증을 억제하고, 혈청 염증 지표물질을 억제하고, 장내 유용 미생물을 조절하며, 체중을 감소시키고, 부고환, 신장 및 간에서 지방을 감소시키고, 혈청 대사성 지표물질을 억제하는 등 체중감량 및 대사 개선효과가 우수하여 비만, 내국소혈증 또는 대사성 질환에 대한 우수한 치료 효과를 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 금은화 발효물은 장투과성을 개선시키고, NO 발생을 억제하여 염증을 억제하고, 혈청 염증 지표물질을 억제하고, 장내 유용 미생물을 조절하는 등 내독소혈증에 대한 우수한 치료 효과를 가지고 있다. 또한, 본 발명의 금은화 발효물은 체중을 감소시키고, 부고환, 신장 및 간에서 지방을 감소시키고, 혈청 대사성 지표물질을 억제하는 등 체중감량 및 대사 개선효과가 우수하므로, 비만 또는 대사성 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 금은화 발효물의 TEER 변화율을 실험시작 직후에 측정한 결과를 나타낸 도이다(1. 대조군: DSS 무처리군 ; 2. DSS: DSS 처리군; 3. DSS+LF: DSS 및 금은화 추출물 처리군 ; 및 4. DSS+FLF: DSS 및 금은화 발효물 처리군).
도 2는 본 발명에 따른 금은화 발효물의 TEER 변화율을 실험시작 4시간 경과시점에 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 4는 도 1에 기재된 바와 같다.).
도 3은 본 발명에 따른 금은화 발효물의 TEER 변화율을 실험시작 22시간 경과 시점에 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 4는 도 1에 기재된 바와 같다.).
도 4는 본 발명에 따른 금은화 발효물의 HRP 투과성 변화율을 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 4는 도 1에 기재된 바와 같다.).
도 5는 본 발명에 따른 금은화 발효물의 클라우딘-1 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다(1. 정상군; 2. LPS 처리군(대조군); 3. LPS+금은화 추출물 100 ㎍/㎖처리군; 4. LPS+금은화 추출물 400 ㎍/㎖처리군; 5. LPS+금은화 발효물 100 ㎍/㎖처리군; 및 6. LPS+금은화 발효물 400 ㎍/㎖처리군).
도 6은 본 발명에 따른 금은화 발효물의 일산화질소 발생 억제활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다((1. 정상군; 2. LPS 단독처리군(대조군); 3. 금은화 추출물 100 ㎍/㎖+LPS 처리군; 4. 금은화 추출물 200 ㎍/㎖+LPS 처리군; 5. 금은화 추출물 400 ㎍/㎖+LPS 처리군; 6. 금은화 발효물 100 ㎍/㎖+LPS 처리군; 7. 금은화 발효물 200 ㎍/㎖+LPS 처리군; 및 8. 금은화 발효물 400 ㎍/㎖+LPS 처리군).
도 7은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 체중 감소 효과를 시계열적으로 측정한 결과를 나타낸 도이다(1. 정상식이군; 2. 고지방식이군; 3. 고지방식이+LPS 처리군; 4. 고지방식이+LPS+금은화 추출물 처리군; 및 5. 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군; 6. 고지방식이+LPS+초유 처리군).
도 8은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 부고환 조직의 지방 무게 감소 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 9는 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 신장 조직의 지방 무게 감소 효과를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 10은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청 총 콜레스테롤 함량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 11은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청 포도당 함량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 12는 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청 중성지방 함량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 13은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청 HDL-콜레스테롤 함량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 14은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청 GOT 함량 변화를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 15는 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청내 TNF-α 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 16은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 혈청내 CRP의 농도를 측정한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 17은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물 중 하나인 비피도박테리아에 대한 Q-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 18은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물 중 하나인 락토바실러스에 대한 Q-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 19는 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물 중 하나인 박테리오데트에 대한 Q-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 20은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물 중 하나인 피르미쿠테스에 대한 Q-PCR을 수행한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 21은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물에 대한 Q-PCR을 수행한 후, 박테리오데트/피르미쿠테스의 비율을 분석한 결과를 나타낸 도이다(1 내지 6은 도 7에 기재된 바와 같다.).
도 22은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 간조직 지방세포 분화 억제활성을 오일 레드 O 염색을 통해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명에 따른 금은화 발효물을 경구투여한 실험동물의 장내 미생물에 대한 군간 정성분석 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 금은화 발효물을 유효성분으로 함유하는, 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 조성물에서 유효성분인 금은화 발효물은 금은화 열수추출물에 락토바실러스속 균주, 바람직하게는 락토바실라스 플란타룸을 접종하여 발효시켜 얻을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 금은화 발효물은 통상적인 추출 및 발효 방법에 의해 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 통상적인 추출 방법으로는 초음파 추출법, 여과법 및 환류 추출법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일실시예에서는 하기와 같은 방법으로 수득하였다.

먼저, 금은화 분말에 유산균 배양액을 첨가한 후 초음파 처리하고 열수추출한다. 금은화 열수추출물을 고압멸균시킨 후 실온에서 충분히 식힌다. 식은 멸균된 금은화 열수추출물에 락토바실러스 플란타룸를 접종하여 발효시킨다. 수득된 발효물을 고압멸균시키고 원심분리한 후 상층액을 수득함으로써, 금은화 발효물을 얻는다.

상기 비만은 단순 비만, 증후성 비만, 소아비만, 성인비만, 세포 증식형 비만, 세포 비대형 비만, 상체 비만, 하체 비만, 내장지방형 비만 및 피하지방형 비만을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 대사성 질환은 대사성비만, 대사성고지혈증, 대사성당뇨병, 대사성이상지질혈증, 대사성동맥경화 및 대사성고혈압을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 금은화 발효물과 함께 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환에 대하여 예방 또는 치료의 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 금은화 발효물은 1일 1 mg/ kg 내지 10000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 비만, 내독소혈증 및 대사성 질환의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, "건강기능식품"이란, 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야 한다.

본 발명의 조성물은 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 금은화 발효물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 금은화 발효물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 금은화 발효물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제제예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1. 금은화 발효물의 제조]

1. 금은화 발효물의 제조

금은화(Lonicerae Flos) 분말을 동국대학교 일산병원으로부터 제공받아 밀봉한 후, 암소에서 보관하면서 실험에 사용하였다. 제공받은 금은화 분말 30 g을 250 ml 비이커에 넣고 유산균용 MRS 배양액(Lactobacilli MRS broth) 150 ml을 첨가한 후, 실온(15 내지 20℃의 온도)에서 30분간 초음파처리(sonication)하였다. 진탕항온수조(shaking water bath)를 이용하여 70℃의 온도, 70 rpm의 유속 조건에서 3시간 동안 열수추출을 수행하였다. 수득된 금은화 열수추출물을 121℃의 온도에서 15분간 고압멸균(autoclave)시킨 후, 실온에서 충분히 방치하여 냉각시켰다. 식은 멸균된 금은화 열수추출물에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 2×10⁷ CFU/ml의 농도로 접종하고 24시간 동안 37℃의 온도의 배양기에서 발효시켰다. 상기 발효물을 121℃의 온도에서 15분간 고압멸균시킨 다음, 3000 rpm의 유속으로 5분간 원심분리하여 분리된 상층액을 실험에 사용하였으며, 이하 "금은화 발효물"로 명명하였다. 상기 수득된 금은화 열수추출물을 "금은화 추출물"로 기재하여 하기 실험예에서 금은화 발효물의 비교대상으로 제공하였다.

[실험예 1. 금은화 발효물의 장점막 투과성 개선 효과 측정]

본 발명에 따른 금은화 발효물의 장점막 투과성 개선 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물에 대한 장점막 투과성 측정검사(Permeability test)를 수행하였다. 상기 장점막 투과성 측정검사는 TEER(Transepithelial Electrical Resistance) 측정검사, HRP(Horseradish peroxide) 투과성 측정검사 및 치밀간극연접단백질(tight junction protein) 측정검사로 나누어 하기와 같이 수행하였다.

1. 장점막 투과성이 증가된 HCT-116 세포 제작

먼저, HCT-116 세포의 분화가 최대치가 되었을 때, 24-세포/웰 배양 삽입 플레이트(well culture insert plate)(apical)에 멕코이스 5A 배지(McCoys 5A medium), 10% FBS, 1% 페니실린 스트렙토마이신을 첨가한 500μl의 배양액을 사용하여 2×10⁵ 세포/웰의 농도로 넣어 배양하였다. 24-웰 수용기 플레이트(well receiver plate) (basolateral)에는 800μl의 배양액만을 넣고, 37℃의 온도, 5% CO₂, 90%의 습도조건 하에서 24시간 동안 배양하였다. 맥파랜드 스케일(Macfarland Scale)에 상응하는 흡광도를 측정하여 계산한 유산균의 균수가 10⁹ CFU/10μl가 되도록 각각의 균주 10μl를 상기 삽입 플레이트(insert plate)에 넣어 HCT-116 배양액에 첨가하고 24시간 동안 배양하였다. 세포가 잘 부착된 것을 확인한 다음, 장점막 투과성의 증가를 유발하기 위하여, 3% 덱스트란 황산나트륨염(dextran sodium sulphate)(DSS)을 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 실험에서 금은화 추출물 및 금은화 발효물을 동일한 방법으로 HCT-116 세포의 배양시 각각 처리하고, DSS 첨가 후 재배양한 결과인 장점막 투과성 변화를 측정하였다.

2. 금은화 발효물의 TEER 측정검사

본 발명의 금은화 발효물의 장점막 투과성 측정검사를 수행하기 위하여, 상기 1에서 제작된 점막 투과성이 증가된 HCT-116 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 처리하여 TEER(Transepithelial Electrical Resistance)값을 측정하였다.

구체적으로는, 상기 HCT-116 세포를 정단 플레이트(apical plate)에 배양하고 DSS를 처리한 다음, 금은화 추출물 또는 금은화 발효물을 추가로 처리하고 4시간, 22시간후에 각각 Millicell-ERS 기계(Millipore, USA)를 이용하여 TEER 값을 측정하였다. TEER 측정 전극은 사용하기 전에 0점을 확인하였으며, 전극 끝이 긴쪽을 각 트렌스웰(transwell)의 안쪽에 있는 구멍에 넣어 기저외층 플레이트(basolateral plate)의 배지(media)에 잠기도록 하고, 전극의 짧은 쪽은 정단 플레이트(apical plate)의 배지에 닿을 정도로만 넣어 세포 단층막의 손상을 주의하였다. 실험군으로는 HCT-116 세포의 점막에 처리한 물질에 따라 DSS 처리군, DSS 및 금은화 추출물 처리군, DSS 및 금은화 발효물 처리군을 설정하였다. 대조군으로는 DSS 무처리군을 설정하여 DSS를 처리하지 않은 배지를 포함하는 웰의 단층(monolayer) TEER 값을 측정하였다. 대조군 및 실험군을 실험시작 직후, 4시간 경과 시점, 22시간 경과 시점에 각각의 TEER값을 측정하였다. 이때 측정된 모든 값은 동일하게 처리된 총 3개의 웰로부터 계산된 평균값을 의미한다. 측정된 대조군 및 각 실험군의 TEER 값으로부터 대조군을 100%로 하는 TEER 변화율을 계산하였다. 대조군 및 실험군의 TEER 변화율은 하기 수학식 1을 사용하여 대조군 대비 백분율(percentage of control)(%)로 계산되었으며, 이의 결과를 도 1 내지 3에 나타내었다.

도 1 내지 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금은화 발효물 처리군은 HCT-116 세포에 DSS만을 처리한 DSS 처리군에 비하여 높은 TEER 변화율을 나타내었다. 그중 실험시작 직후 측정한 수치를 제외한 나머지 4개의 시점에서의 TEER 값을 토대로 대조군 대비 백분율의 값을 계산한 결과, 각각 약물처리 2시간 후에 100.96%, 4시간 후에 95.58%, 20시간 후에 93.87%, 24시간 후에 90.5%로 측정되어, 대조군에 비하여 장점막 투과성이 유의하게 증가되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 TEER 값을 유의하게 증가시키므로, 점막 투과성을 개선시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

3. 금은화 발효물의 HRP 투과성 측정

본 발명의 금은화 발효물의 장점막 투과성 측정검사를 수행하기 위하여, 상기 1에서 제작된 HCT-116 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 처리하여 HRP(Horseradish peroxide) 투과성 측정검사를 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로는, 상기 HCT-116 세포에 DSS를 첨가하고 22시간 후, 24-웰 배양 삽입 플레이트(상단형)에 기존 배지를 제거한 다음, HRP(peroxide from Horseradish Type VI-A, Sigma) 60μl를 첨가하여 37℃의 온도, 5% CO₂, 90%의 습도 조건하에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 수용기 플레이트(외부기저형)의 배지에 10000배 희석한 배지액 100μl 및 HRP 기질용액인 TMB SOL(3,3'5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)) 100μl를 넣고 혼합하여 10분간 실온에서 반응시켰다. HRP가 처리된 플레이트에 있는 용액의 색이 진하게 변하는 것이 확인되면, 반응중지 용액(Stop solution) (2M H₂SO₄) 100μl를 처리하여 반응을 종결시키고, UV ELISA 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 450nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, HRP의 측정은 HRP의 활성도가 증가할수록 점막 투과성이 높아진 것이며, 수용기 플레이트의 농도가 증가했음을 의미한다. 또한, 측정된 모든 값은 동일하게 처리된 총 3개의 웰로부터 계산된 평균값을 의미한다. 측정된 대조군 및 각 실험군의 HRP 값으로부터 대조군을 100%로 하는 HRP 투과성 변화율을 계산하였다. 대조군 및 실험군의 HRP 투과성 변화율은 하기 수학식 2를 사용하여 대조군 대비 백분율(percentage of control)(%)로 계산되었으며, 이의 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금은화 발효물 처리군은 HRP 투과성 변화율이 174.01%로 측정되어 대조군에 비해 현저히 낮은 수치로 확인되어, 세포 점막 투과성을 현저히 감소시켰음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 HRP 투과성을 현저히 감소시키므로, 세포 점막 투과성을 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

4. 금은화 발효물의 클라우딘-1 유전자 수준 저해활성 측정

본 발명의 금은화 발효물의 장점막 투과성 측정검사를 수행하기 위하여, 상기 1에서 제작된 HCT-116 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물 및 금은화(발효되지 않은)를 처리하여 세포의 치밀간극연접단백질(tight gap junction protein)인 클라우딘-1(claudin-1) 수준 변화를 하기와 같이 측정하였다.

구체적으로는, 상기 HCT-116 세포(1×10⁷ 세포/웰)에 상기 금은화 및 금은화 발효물을 0, 100, 200 또는 400 ㎍/ml의 농도로 각각 2시간 동안 처리한 다음, 0.2 ㎍/ml LPS를 6시간 동안 처리하였다. LPS로 처리한 HCT-116 세포의 총 RNA를 TRIsure reagent(Bioline,UK)를 사용하여 분리한 다음, cDNA를 AccuPower RT premix 키트(Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하여 합성하였다. 프라이머 서열(primers sequences)은 다음과 같다: 글리세르알데하이드(glyceraldehydes)-3-인산디하이드로게나아제(phosphate dehydrogenase) (GAPDH)는 "TGA TGA CAT CAA GAA GGT GGT GAA G 와 TCC TTG GAG GCC ATG TAG GCC AT(서열번호 1)"이고, 클라우딘-1은 "CTT CTA CAA ATG GAC CTC T와 AGC CTA CAC TAC CTC CTA A(서열번호 2)"이다. 연관된 유전자 발현의 정량물은 2-ΔCt수식(ΔCt=Ct-타켓 유전자 ― Ct-GAPDH)에 의해 표현된 후, 하우스키핑(housekeeping) 유전자인 GAPDH에 의해 정상화(normalize) 또는 정상수준으로 되었다. 이의 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 클라우딘-1 유전자는 LPS 처리에 의해 모든 처리군에서 정상군에 비해 유의하게 증가되었다. 본 발명의 금은화 발효물 처리군은, 특히 400 ug/ml의 농도에서, LPS 처리에 의한 클라우딘-1 유전자를 현저하게 감소시켰다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 클라우딘-1 유전자를 현저히 저해하므로, 장내 투과성의 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 2. 금은화 발효물의 항염증 효과 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 대한 항염증 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물에 대한 일산화질소(Nitric oxide; NO) 발생 억제활성을 측정하였다.

1. 세포의 준비 및 배양

쥐의 대식세포주(Murine-leukemic monocyte-macrophage cell)인 RAW 264.7 세포를 한국 세포주 은행(Korea Cell Line Bank) (KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum; FBS)을 첨가한 DMDM 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO, USA)에서 배양하였다. 상기 RAW 264.7 세포주를 10% 가열하여 비활성된(heat inactivated) 소태아혈청(Fetal bovine serum; FBS), 2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신을 첨가하여 혼합한 DMEM 배지에 옮겨 37℃의 온도, 5% CO₂의 조건을 제공하면서 배양하였다.

2. 금은화 발효물의 NO 발생 억제활성 측정

상기 1에서 준비된 대식세포주 RAW 264.7 세포에 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 처리하여 NO 발생 억제활성을 측정하였다.

구체적으로는, 상기 RAW 264.7 세포를 24-웰 프레이트에 각 웰당 2×10^５의 농도로 배양하였다. 미발효 금은화 및 상기 금은화 발효물을 각각 0,100,200 또는 400 ㎍/ml의 농도로 2시간 동안 전처리한 다음, 0.2㎍/ml LPS를 24시간 동안 처리하였다. LPS로 처리된 RAW 264.7 세포의 배양액으로부터 상층액을 분리한 후, 그라쎄 염색 시스템 키트(Griess reagent system kit)(Promeag, WI, USA)를 이용하여 NO를 측정하였다. 이의 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금은화 발효물 처리군은 LPS에 의해 유도된 NO 발생을 농도의존적으로 억제하였다(p<0.01).

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 NO 발생 억제활성이 우수하므로, 염증 및 내독소 반응을 억제하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 3. 금은화 발효물의 체중 감소효과 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 대한 체중 조절 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 시간에 따른 체중 변화율을 측정하였다.

1. 실험동물의 구입 및 사육

실험동물로 생후 8주령의 체중 200±20g인 외관상 건강한 수컷 쥐(rat) 42마리를 오리엔트 바이오(사) (Orient Bio, Seongnam-si, Korea)로부터 구입하였다. 구입한 실험동물은 온도 및 습도가 적절히 조절되는 동물 사육실에서 고형사료(Soyagreentec, Hwaseong-si. Korea)와 물을 자유롭게 급여하면서 일주일 동안 적응시켰다. 고형사료는 20% 단백질, 4.5% 지방, 63% 탄수화물로 구성되었다. 사육실의 환경은 온도 22±2℃, 상대습도 40%~60%로 유지되었다. 사육은 12시간을 주기로 일정하게 공급하여 명암이 엄격하게 유지되는 동물 사육실에서 수행되었으며, 시험기간 중 동물 실험실의 온·습도는 항온, 항습기에 의해 일정하게 유지되었다.

적응기간을 거친 42마리의 수컷 쥐(rat)를 각 케이지당 3 내지 4마리씩 무작위로 선별한 다음, 다음과 같이 식이별로 그룹을 나누어 처리하였다: 정상식이군(Normal Group, 정상군 또는 N, n=7); 고지방식이군(High Fat Diet Group, 대조군 또는 HFD, n=7); 고지방식이+LPS 처리군(High Fat Diet+LPS Group 또는 음성대조군 n=7); 고지방식이+LPS+금은화 추출물 처리군(High Fat Diet+LPS+Lonicerae Flos Group, 금은화 추출물 처리군 또는 LF, n=7); 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군(High Fat Diet+LPS+fermented Lonicerae Flos, 금은화 발효물 처리군 또는 FLF, n=7); 및 고지방식이+LPS+초유처리군(High Fat Diet+LPS+Colostrum Group, 초유처리군 또는 Colostrum군, n=7);의 6개의 그룹(또는 처리군)으로 나누어 실험을 진행하였다.

2. 실험동물의 체중 변화 측정

상기 1에 기재된 그룹별로 식이를 조절하면서 실험동물의 체중을 8주 동안 측정하였다. 상기 실험예 1에서 구입한 금은화 및 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물, 및 시장에서 구입한 초유를 5㎖ 주사기(syringe) (한국백신, Seoul, Korea) 및 경구투여용 관(oral zonde) (동서과학, Seongnam-si, Korea)을 이용하여 매일 일정한 시간에 실험동물에게 경구로 정량투여하였다. 실험동물의 체중은 8주 동안 매주 1회, 일정한 요일 및 시간에 측정되었으며, 전자저울(Sartorius, Goettingen, Germany)을 이용하여 측정하였다. 실험시작 전 측정한 체중와 8주후 측정한 체중간의 차이를 평균으로 나타내었다. 이의 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 정상군은 평균과의 차이가 355±26.74g이었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 평균과의 차이가 456.71±18.49g으로, 정상군에 비해 8주간 체중이 증가되었음을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 평균과의 차이가 359.43±26.11g로 측정되어, 음성대조군에 비해 체중이 감소되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 체중감량 효과가 우수함을 알 수 있다.

5. 통계분석

모든 통계분석(Statistical analysis)은 윈도우용 SPSS(Statistical package for social science,New York. United states) 소프트웨어 프로그램(version 17.0)을 사용하여 이루어졌으며, 각 처리군의 측정값을 평균±표준편차로 표시되었다. One Way ANOVA로 분석하였다. 각 군 간의 차이는 튜키(Tukey) HSD로 사후검정을 시행하였으며, 유의확률(p-value)이 0.05 이하일 경우 유의성을 인정하였다.

[실험예 4. 금은화 발효물의 부고환 조직 지방무게 감소효과 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 대한 부고환 조직 지방무게 감소효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 시간에 따른 부고환 주변조직 지방무게 변화를 측정하였다.

1. 시료 및 조직의 채취

상기 실험예 3에서 8주간의 실험기간이 종료된 실험동물으로부터 시료 및 조직을 채취하였다. 실험종료후, 6시간 동안 절식시키고, 대변 및 소변 샘플을 채취한 후, 66 ㎎/㎖ 락투로오스(lactulose) 및 50 ㎎/㎖ 만니톨(mannitol)이 포함된 용액 1㎖를 투여하였다. LPS를 주입(0.75㎎/㎏)시키고, 18시간 후, 다시 대변 및 소변을 채취하였다. 이후, 마취시키고, 복부 정중선을 따라 개복한 다음, 주사기를 이용하여 심장으로부터 필요한 혈액을 채혈하였다. 채혈한 후 부고환 지방 및 신장 지방을 적출하였으며, 적출한 각 장기를 식염수에 수차례 세척하여 피를 제거하고 물기를 제거한 다음, 10% 포름알데하이드(formaldehyde)에 넣어 보관하였다.

2. 부고환 주변조직 지방의 무게 측정

상기 1에서 수득된 부고환 지방의 무게를 측정하였다. 측정된 부고환 지방의 무게는 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다. 이의 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 부고환 주변조직 지방의 무게 변화율은 정상군이 5.38±0.87g으로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 15.36±2.91g으로 확인되어, 상기 정상군에 비해 부고환 조직의 지방무게가 증가되었음을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 8.96±1.37g로 확인되어, 상기 음성대조군에 비해 부고환 조직의 지방무게가 감소된 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 부고환 조직의 지방을 감소시키는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 5. 금은화 발효물의 신장 조직 지방무게 감소효과 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 대한 신장 조직 지방무게 감소효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 시간에 따른 신장 주변조직 지방무게 변화를 측정하였다.

상기 실험예 4의 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 신장 조직을 적출한 후, 신장 주변조직의 지방의 무게를 측정하였다. 측정된 신장 주변조직 지방의 무게는 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다. 이의 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 신장 주변조직 지방의 무게 변화율은 정상군이 6.62±1.09g으로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군은 25.99±2.61 g으로 확인되어, 정상군에 비해 신장 조직의 지방무게가 증가되었음을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 12.72±3.74 g로 확인되어, 상기 음성대조군에 비해 신장 조직의 지방무게가 감소된 것을 확인하였다(p<0.001). 또한, 상기 고지방식이+LPS+발효된 금은화 처리군은 고지방식이군에 비해 신장 조직의 지방무게가 감소된 것을 확인되었다(p<0.05).

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 신장 조직의 지방을 감소하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 6. 금은화 발효물의 혈청 대사성 지표물질 활성 조절]

본 발명에 따른 금은화 발효물의 혈청 대사성 지표물질(Serum metabolic markers)의 활성을 조절하는 효과에 관해 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 그룹별 혈청 대사성 지표물질 활성을 측정하였다. 상기 대사성 지표물질은 총 콜레스테롤(Total cholesterol), 포도당(glucose), 중성지방(Triglyceride), HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol) 및 GOT으로, 아산제약(Seoul, Korea)의 분석용 키트(AM202-k, AM-2011C, AM-101 등)를 사용하여 비색 정량법을 통해 측정되었다. 측정된 모든 값은 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다.

1. 혈청의 수득

상기 실험예 4의 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 마취된 쥐의 심장에서 주사기를 이용하여 혈액을 채혈하였다. 채혈된 혈액은 4℃의 온도에서 15분간 1000g으로 원심분리 (centrifuge)하여 혈청을 수득한 다음, -70℃의 온도로 유지되는 냉각기(refrigerator)에 넣고, 분석시까지 보관하였다.

2. 혈청 대사성 지표물질 측정

가. 총 콜레스테롤(Total cholesterol) 측정

상기 1에 기재된 바와 같이, 보관중인 혈청의 총 콜레스테롤 함량 변화를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 혈청에서의 총 콜레스테롤 변화율은 정상군이 48.42±7.93 ㎎/㎗으로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 90.49±16.81 ㎎/㎗으로 확인되어, 정상군에 비해 총 콜레스테롤 함량이 증가되었음을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 56.37±8.45 ㎎/㎗으로 확인되어, 상기 음성대조군에 비해 혈청 총 콜레스테롤 함량이 감소되었음을 확인하였다(p<0.001).

나. 포도당(glucose) 함량 측정

상기 1에 기재된 바와 같이, 보관중인 혈청의 포도당 함량 변화를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 혈청에서의 포도당 함량 변화율은 정상군이 244.22±22.13 ㎎/㎗로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 214.05±33.30 ㎎/㎗로 확인되었다. 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 176.20±51.68 ㎎/㎗로 확인되어, 상기 정상군 또는 음성대조군에 비해 포도당 함량이 감소되었음을 확인하였다.

다. 중성지방(Triglyceride) 함량 측정

상기 1에 기재된 바와 같이, 보관중인 혈청의 중성지방 함량 변화를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 혈청에서의 중성지방의 함량 변화율은 정상군이 26.53±6.86 ㎎/㎗로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 59.21±12.20 ㎎/㎗로 확인되었다. 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 43.24±7.67 ㎎/㎗로 확인되어, 상기 음성대조군에 비해 중성지방 함량이 감소되었음을 확인하였다.

라. HDL-콜레스테롤(HDL-cholesterol) 함량 측정

상기 1에 기재된 바와 같이, 보관중인 혈청의 HDL-콜레스테롤 함량 변화를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에 나타낸 바와 같이, 혈청에서의 HDL-콜레스테롤 함량 변화율은 정상군이 34.80±7.10 ㎎/㎗으로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 21.55±4.44 ㎎/㎗으로 확인되어, 정상군에 비해 HDL-콜레스테롤 함량이 감소되었음을 확인하였다(p<0.05). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 26.36±6.05 ㎎/㎗로 확인되어, 상기 음성대조군에 비해 증가하였음을 확인하였다.

마. GOT 함량 측정

상기 1에 기재된 바와 같이, 보관중인 혈청의 GOT 함량 변화를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 14에 나타내었다.

도 14에 나타낸 바와 같이, 혈청에서의 GOT 함량 변화율은 정상군이 23.59±1.34 ㎎/㎗으로 확인되었다. 고지방식이+LPS 처리군(음성대조군)은 124.35±63.38 ㎎/㎗으로 확인되어, 정상군에 비해 GOT 함량이 감소되었음을 확인하였다(p<0.001). 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 10.55±1.93 ㎎/㎗로 확인되어(p<0.001), 상기 정상군 및 음성대조군에 비해 현저히 감소되었음을 확인하였다.

3. 결론

본 발명의 금은화 발효물은 혈청 대사성 지표물질의 활성을 조절하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 7. 금은화 발효물의 혈청 염증 지표물질 활성 조절]

본 발명에 따른 금은화 발효물의 혈청 염증 지표물질의 활성을 조절하는 효과에 관해 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 그룹별 혈청 염증 지표물질의 활성을 측정하였다. 상기 염증 지표물질은 TNF-α 및 CRP로, BD 바이오사이언스(사) (Biosciences. San Diego, CA, USA)의 키트(BD ELISA Rat TNF-α & CRP kit)를 사용하여 측정하였다. 상기 실험예 6의 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 혈청을 수득하여 실험에 사용하였으며, 측정된 모든 값은 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다.

1. TNF-α 농도 측정

혈청내 TNF-α 농도를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 15에 나타내었다.

도 15에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 음성대조군인 고지방식이+LPS 처리군에 비해 TNF-α가 유의하게 감소되었음을 확인하였다(p<0.05).

2. CRP 농도 측정

혈청내 CRP의 농도를 상기 분석용 키트를 이용하여 측정하였으며, 이의 결과를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 음성대조군인 고지방식이+LPS 처리군에 비해 CRP의 농도가 유의하게 감소되었음을 확인하였다(p<0.05).

3. 결론

상기 결과에 의해, 본 발명의 금은화 발효물은 염증 지표물질의 활성을 조절하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 8. Q-PCR을 통한 장내 유용 미생물 분포 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 의한 장내 유용 미생물 분포 변화를 알아보기 위하여, 비만 관련 장내부 균총, 즉 비피도박테리아(Bifidobacteria spp.), 락토바실러스(Lactobacillus spp.), 박테리오데트(Bacteriodetes) 및 피르미쿠테스(Firmicutes)의 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응(real time-PCR)으로 정량화하여 분석하였다.

1. 시료의 수득

비만 관련 장내부 균총 시료를 수득하기 위해, 상기 실험예 4의 1에서 채취 및 보관중이던 실험종료후 6시간 및 18시간 후의 대변 샘플을 사용하였으며, AccuPrep stool DNA 추출 키트(extraction kit) (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 쥐 분변으로부터 게놈 DNA를 추출하였다.

2. 비만 관련 장내부 균총의 Q-PCR 측정

가. 비피도박테리아

상기 1을 통해 수득된 비피도박테리아의 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응으로 정량화하였으며, 이의 결과를 도 17에 나타내었다.

도 17에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 고지방식이군 및 고지방식이+LPS 처리군에 비해 비피도박테리아의 상대적 DNA 수준을 변화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

나. 락토바실러스

상기 1을 통해 수득된 락토바실러스의 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응으로 정량화하였으며, 이의 결과를 도 18에 나타내었다.

도 18에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 고지방식이군 및 고지방식이+LPS 처리군에 비해 락토바실러스의 상대적 DNA 수준을 변화시키는 효과가 있음을 확인하였다.

다. 박테리오데트

상기 1을 통해 수득된 박테리오데트의 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응으로 정량화하였으며, 이의 결과를 도 19에 나타내었다.

도 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 음성대조군인 고지방식이+LPS 처리군에 비해 락토바실러스의 상대적 DNA 수준을 증가시켰음을 확인하였다(p<0.05).

라. 피르미쿠테스

상기 1을 통해 수득된 피르미쿠테스의 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응으로 정량화하였으며, 이의 결과를 도 20에 나타내었다.

도 20에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 음성대조군인 고지방식이+LPS 처리군에 비해 피르미쿠테스의 상대적 DNA 수준을 증가시켰음을 확인하였다(p<0.05).

마. 박테리오데트/피르미쿠테스의 비율

상기 1을 통해 수득된 박테리오데트/피르미쿠테스의 비율에 대한 상대적 DNA 수준을 실시간 중합효소연쇄반응으로 정량화하였으며, 이의 결과를 도 21에 나타내었다.

도 21에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 고지방식이+LPS+금은화 발효물 처리군은 음성대조군인 고지방식이+LPS 처리군에 비해 박테리오데트/피르미쿠테스의 비율을 증가시켰음을 확인하였다(p<0.05).

3. 결론

상기 결과에 의해, 본 발명의 금은화 발효물은 장내 유용 미생물의 수준을 조절하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 9. 금은화 발효물의 간조직 지방무게 감소효과 측정]

본 발명의 금은화 발효물에 의한 간조직 지방무게 감소효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조된 금은화 발효물을 실험동물에게 경구투여한 후, 시간에 따른 간조직 지방무게 변화를 측정하였다. 간조직 지방무게 측정을 위해, 오일레드 0 염색을 수행하였으며, 측정된 모든 값은 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다.

상기 실험예 4의 1에서 적출하여 보관중이던 냉동된 간조직을 실리콘으로 코팅된 슬라이드에 마운트된 상태에서 오일 레드 0 용액(oil red O solution, Cayman chemical, USA)으로 60℃의 온도에서 10분간, 메이어의 헤마톡실린 용액(Mayer's hamatoxylin solution)으로 1분간 염색하였다. 모든 슬라이드는 올림푸스 BX61 현미경(Olympus BX61 microscope, Tokyo, Japan)으로 관찰되었으며, 올림푸스 DP70 디지털카메라(Olympus DP70 digital camera, Tokyo, Japan)를 이용하여 각 슬라이드를 촬영하였다. 이미지 J 소프트웨어(Image J software, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 붉게 표시된 지방조직의 면적을 계산하였으며, 이의 결과를 도 22에 나타내었다.

도 22에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 금은화 발효물 처리군은 지방세포의 분화가 억제되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 간조직에서 지방세포의 분화를 억제하여, 간조직의 지방을 감소하는 효과가 우수함을 알 수 있다.

[실험예 10. 금은화 발효물의 장내 미생물 조정 효과]

본 발명의 금은화 발효물에 의한 장내 미생물 조정 효과를 알아보기 위하여, PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)를 이용한 장내 미생물의 군간 정성분석을 수행하였다. 측정된 모든 값은 상기 실험예 1에 기재된 방법과 동일한 방법으로 통계분석되었다.

구체적으로는, 상기 실험예 4의 1에서 채취 및 보관중이던 실험종료후 6시간 및 18시간 후의 대변 및 소변 샘플을 사용하였으며, AccuPrep stool DNA 추출 키트(extraction kit) (Bioneer, Daejeon, Korea)를 이용하여 쥐 분변으로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 이후, 보편적인 세균성 프라이머(universal bacterial primer) (5'→3': AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG and AAG GAG GTG ATC CAG CC, 서열번호 3)를 이용하여 16s rRNA 유전자에 대한 중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하였다. 이 PCR 엠플리콘(PCR amplicon)을 주형(template)으로 하여, 이중 중합효소연쇄반응(nest PCR)을 수행하였다. 이중 중합효소연쇄반응에 프라이머는 341fGC(5'-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG-3', 서열번호 4) 및 518r(5'-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3', 서열번호 5)이다. 이중 중합효소연쇄반응 엠플리콘(Nest PCR amplicon) 시료를 DcodeTM System(BIO-RAD, USA)를 이용하여 60℃의 온도, 80V의 전압에서 15시간 동안 전기영동(40% 아크릴아마이드/반복수(Acrylamide/bis) (37.5: 1)). 에티디움브로마이드(Ethidium Bromide; EtBr)로 15분간 염색한 후, UV 조사(illumination) (LAS-3000; Fuji photo film, Tokyo, Japan)하에서 겔의 사진을 촬영하였다. 촬영된 DGGE 패턴을 바이오너머릭스 3.0 소프트웨어(Bionumerics 3.0 software, Applied Maths, Sint-Martens-Latem, Belgium)를 이용하여 분석하였다. 이의 결과를 도 23에 나타내었다.

도 23에 나타낸 바와 같이, PCR-DGGE를 이용하여 장내 군간 미생물의 패턴 비교한 결과, 군별로 동물들의 분변내에서 장내 미생물이 군집화되었음을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 금은화 발효물은 장내 군간 미생물 조정 효과가 우수함을 알 수 있다.

이하 본 발명의 금은화 발효물을 함유하는 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 비만, 내독소혈증 또는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제제예 1. 약학적 제제의 제조]

1. 산제의 제조

금은화 발효물 20 ml

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

2. 정제의 제조

금은화 발효물 10 ml

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

3. 캡슐제의 제조

금은화 발효물 10 ml

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

4. 주사제의 제조

금은화 발효물 10 ml

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

5. 액제의 제조

금은화 발효물 20 ml

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

[제제예 2. 식품 제제의 제조]

1. 건강식품의 제조

금은화 발효물 100 ml

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

금은화 발효물 100 ml

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

금은화 발효물(Lonicerae Flos fermentation)을 유효성분으로 함유하는, 내독소혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 금은화 발효물은 금은화 열수추출물을 락토바실러스(Lactobacillus)속 균주로 발효시켜 얻은 것을 특징으로 하는, 내독소혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제 2항에 있어서,
상기 락토바실러스속 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)인 것을 특징으로 하는, 내독소혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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