TWI759898B - 枸杞發酵物、其製備方法及用途 - Google Patents

Abstract

本揭示內容是關於一種枸杞發酵物的製備方法，該方法包含製備一枸杞溶液，將一乳酸菌組合物加至該枸杞溶液中，以及將包含枸杞溶液及乳酸菌組合物的混合物進行發酵，以得到該枸杞發酵物；其中，該乳酸菌組合物是由發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌，以及乳酸片球菌中的至少兩種菌種所組成。本揭示內容亦涵蓋該枸杞發酵物，以及該枸杞發酵物於預防及/或治療一個體之肝疾病的用途。

Description

枸杞發酵物、其製備方法及用途

本揭示內容是屬於食品加工領域，具體來說是涉及一種枸杞發酵物的製備方法，特別是關於利用數種乳酸菌的組合來進行發酵；以及所得之枸杞發酵物於預防及/或治療肝疾病(liver disease)的用途。

枸杞是國家衛生福利部中醫藥司與食品藥物管理署所公佈之可同時提供食品使用之中藥材與可供食品使用原料，由於枸杞具有強大而廣泛的保健功能，因而使其成為生產各類養生保健品的最佳原料之一，進而開發與枸杞相關的藥品或保健食品便成為主要之枸杞加工的發展方向。

枸杞在傳統醫學中，是屬於一味具有滋腎、潤肺、補肝及明目等藥用功效的中藥材。由於枸杞含有豐富的類胡蘿蔔素、玉米黃素、維生素A1、B1、B2、C等、鈣、鐵等營養成分，有益於眼睛健康，可用於明目，因此枸杞又俗稱為「明眼子」。此外，枸杞中含有14種胺基酸，以及甜菜鹼、枸杞多糖等機能性成分，使其具有提高個體免疫力的作用，可以補氣強精，滋補肝腎、抗氧化、抗老化、抗疲勞、抗腫瘤、抗病毒，以及保護神經等。而在現代藥理研究上也表明，枸杞含有黃酮等成分，使其具有降低血壓、血脂和血糖的作用，能防止動脈粥樣硬化，達到保護肝臟的功效。

乳酸菌是指一種能夠利用碳水化合物進行發酵而產生大量乳酸的細菌的總稱，它們已經被美國食品藥物管理局定義為普遍公認的安全食品。乳酸菌可藉由改善腸道營養與菌群平衡，並調節宿主的黏膜與系統的免疫功能，進而對宿主產生有益的生理作用。具體來說，是藉由乳酸菌定殖(colonize)於宿主的腸胃道內並增殖，產生多種有機酸，降低腸道酸鹼值，抑制有害菌的生長，並使一些有利於宿主健康作用的單一或組成明確的混合微生物(益生菌)在腸道大量增殖，進而改變宿主體內正常菌叢(normal flora)的組成。已有科學研究報導，益生菌在腸道大量繁殖，可以治療因大量使用抗生素而導致的偽膜性腸炎、治療便秘和慢性腹瀉、保護肝臟、防治高血壓和動脈硬化以及抗衰老、降低血清膽固醇、預防癌症和抑制腫瘤生長的作用。

近年來，乳酸菌在特殊生理活性的食品中有廣泛的應用，除了應用於原本的食品領域(例如，發酵乳製品)以外，也正逐步被應用於開發其他功能性食品、膳食補充劑、藥用生物製品及飼料等領域上。含有乳酸菌的食品主要涵蓋該些直接添加乳酸菌的食品和經乳酸菌發酵的食品，且在食品領域中，最普遍的應用仍是有關乳製品領域，包括發酵乳、活性乳酸菌飲料、乾酪、優酪乳油、酸乳酒、果汁等。

為增進枸杞的營養價值，提升其中活性成分的含量，同時降低因食用天然枸杞所造成的不適症狀，曾有公開文獻提出製備枸杞發酵物的替代性方案，藉以改善前述問題，相關枸杞發酵物的製備方法的主要研究方向集中在原料的使用及發酵方式的變化上，該些方法仍存在下述缺陷：(1)原料為複方成分，組成複雜；(2)製程的步驟繁複，使製作成本提高；(3)發酵週期長、發酵污染風險大；(4)選用用於發酵的菌群未能有效提升發酵物中活性成分的含量；(5)以提取液進行發酵，減損原料的營養成分。

有鑑於此，相關領域亟需一種製備枸杞發酵物的改良方法，藉以解決現有技術的不足，並增進枸杞發酵物的應用價值。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

據此，本揭示內容的目的在於解決現有技術的不足，提供一種原料組成單純、製程簡單，保健效果顯著的功能性枸杞發酵物的製備方法。如在本文中具體呈現及廣泛描述的，本揭示內容的枸杞發酵物製備方法包含： (a)   將一枸杞溶於一溶劑中，以得到一枸杞溶液； (b)   將一乳酸菌組合物加至步驟(a)之枸杞溶液中；以及 (c)   將步驟(b)的混合物進行發酵，以得到該枸杞發酵物； 其中， 該乳酸菌組合物是由發酵乳酸桿菌( Lactobacillus fermentum)、格氏乳酸桿菌( Lactobacillus gasseri)、腸膜明串珠菌( Leuconostoc mesenteroides)，以及乳酸片球菌( Pediococcus acidilactici)中的至少兩種菌種所組成。

依據本揭示內容的一實施方式，該乳酸菌組合物是由各組成菌種以等菌數比例配製而成。

依據本揭示內容的一實施方式，其中該枸杞是非洲枸杞( Lycium afrum)、寧夏枸杞( Lycium barbarum)、中華枸杞( Lycium chinense)、新疆枸杞( Lycium dasystemum)、濱藜葉枸杞( Lycium halimifolium)、西北枸杞( Lycium potaninii)、黑果枸杞( Lycium ruthenicum)、阿拉伯枸杞( Lycium shawii)、土庫曼枸杞( Lycium turcomanicum)，或其組合。依據本揭示內容的一操作實施例，該枸杞是寧夏枸杞。依據本揭示內容的一操作實施例，該枸杞是中華枸杞。

依據本揭示內容的一較佳實施方式，在步驟(a)中，該溶劑是水，且該枸杞溶液包含5至10％(重量比)之該枸杞。

依據本揭示內容的一較佳實施方式，在步驟(b)中，是將10 ⁵至10 ⁷菌落生成單位(colony forming unit，CFU)/毫升之該乳酸菌組合物加至該枸杞溶液中。

依據本揭示內容的一較佳實施方式，在步驟(c)中，是將該混合物置於35°C發酵24小時。

據此，本揭示內容亦涵蓋一種枸杞發酵物，所述枸杞發酵物是利用本揭示內容所述之製備方法製備而成。

本揭示內容的另一態樣是關於本揭示內容的枸杞發酵物於製備一藥物之用途，其中該藥物係用以預防及/或治療一個體之肝疾病(liver disease)。

依據本揭示內容的某些實施方式，該肝疾病可以是酒精性肝疾病(alcoholic liver disease，ALD)、藥物性肝疾病(drug-induced liver disease)、感染性肝疾病(infectious liver disease)、非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic liver disease，NALD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化(Liver fibrosis，LF)，或肝硬化(Liver cirrhosis)。在一操作實施例中，該肝疾病是一藥物性肝疾病。

依據本揭示內容的某些實施方式，該個體為人類。

本揭示內容的一或多個具體實例的細節係在下文附隨的說明中闡述。根據詳細說明和申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，本說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義，此處所使用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。並且，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型，而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a及an)包括複數參考值，但依據上下文而另有指示者除外。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、A與C兩者、以及A、B與C三者。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例以外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

在本文中，所述「菌數」(bacterial count)一詞是指總菌數(total bacterial count)或活菌數(viable bacterial count)。舉例來說，總菌數可以是以「直接顯微測數法」(direct count)，或以「濁度測定法」(turbidity measurement)測得每單位面積、體積或重量的總菌數；而活菌數可以是以「定量平板法」(quantitative plating)測得每單位面積、體積或重量的CFU(例如，CFU/平方公分、CFU/毫升、CFU/公克等)，或以「稀釋培養計數法」(dilution culture counting)測得每單位體積或重量的最大可能數(most probable number，MPN)(例如，MPN/毫升、MPN/公克等)。直接顯微測數法是指，以染劑(例如，結晶紫)染色後，直接以顯微鏡觀察方式計數，再推算得總菌數。濁度測定法是指，利用光譜儀讀取490至550奈米的波長，測量含細菌之懸浮液的吸收率或折射率，同時與標準曲線對比後推算待測細菌的濃度與總菌數。定量平板法是指，將一系列連續稀釋後的菌液做稀釋塗抹法後，計數其單一菌落個數再回推活菌數。稀釋培養計數法是指，將一系列經稀釋之不同濃度的菌液進行三重覆的培養，計算其含菌試管數(正反應數目)，再依最大可能數表(MPN對照表)回推活菌數。依據本揭示內容的某些實施方式，所述「菌數」為活菌數，且利用CFU/毫升作為計算該活菌數的單位。

所述「個體」(subject)一詞，是指一種可利用本揭示內容枸杞發酵物來治療的哺乳動物(mammal)。所述「哺乳動物」一詞是指哺乳綱(Mammalia)的所有成員，包括人類、靈長類(例如，猴子)、家用及農用動物(例如，兔、豬、綿羊、山羊、馬、牛、雞)、齧齒類(例如，小鼠、大鼠、天竺鼠、土撥鼠、倉鼠)，以及動物園動物、運動用動物、寵物(例如，狗、貓、鳥)。除非有具體指出其中一種性別，否則「個體」一詞是指男性及女性二者。在某些實施方式中，該個體是指可利用本揭示內容枸杞發酵物來治療一罹患肝疾病的人類。

所述「預防」(preventing或prevention)一詞，是指排除(preclude)一種疾病，或是與該疾病相關的一或多種症狀的發展或發生，或是防止該疾病復發。在本文中，所述疾病為肝疾病。

所述「治療」(treating或treatment)一詞，可以是指一種治癒性或緩解性的處置，藉以達到欲求的藥學及/或生理學效果。舉例來說，是對一個體施用或投予一有效量之本揭示內容枸杞發酵物，所述個體是罹患肝疾病、患有與肝疾病相關的症狀、肝疾病的繼發性疾病(secondary disease)或病症(disorder)，藉以部分或完全地減緩(alleviate)、改善(ameliorate)、緩解(relieve)、延遲發作(delay onset)、抑制病程(inhibit progression)、降低嚴重度(reduce severity)，及/或降低肝疾病的一或多種症狀或徵象(feature)的發生。

此處「投予」(administering、administered或administration)一詞，是指一種傳遞方式，用以將本揭示內容枸杞發酵物提供給個體。傳遞方式包括，但不限於，口服、靜脈內、動脈內、皮內、皮下，或肌肉內等傳遞方式。

在本文中，「一有效量」(an effective amount)一詞，是指一種有效的量，在必要的劑量及時間內，使本揭示內容枸杞發酵物的治療可達到欲求的療效(例如，治療肝疾病)的使用劑量。就治療的目的來說，一有效量也可以是指一種本揭示內容枸杞發酵物的治療利益超越其毒性或有害影響的劑量。所述有效量不必然能夠治癒一種疾病(例如，肝疾病)，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病的發生，或是可緩減與該疾病相關的病徵。本領域技術人員可基於實驗動物模式取得的劑量換算成藥物(例如，本揭示內容枸杞發酵物)的人體等效劑量(human equivalent dose，HED)。舉例來說，本領域技術人員可依據美國食品藥物管理局(US Food and Drug Administration，FDA)所公告的「估算成人健康志願者在初始臨床治療測式的最大安全起始劑量」(Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers)來估算人體使用的最高安全劑量。

II. 發明詳述

本揭示內容的目的在於提供一種用以製備枸杞發酵物的方法，該方法至少一部分是基於發明人發現相較於使用單一乳酸菌所製備之枸杞發酵物，使用包含多種乳酸菌的組合物所製備之枸杞發酵物對疾病(特別是肝臟疾病)具有較高的治療功效。

1. 枸杞發酵物的製備方法

本揭示內容的一態樣提供一種關於枸杞發酵物的製備方法，該方法包含： (a)   將一枸杞溶於一溶劑中，以得到一枸杞溶液； (b)   將一乳酸菌組合物加至步驟(a)之枸杞溶液中；以及 (c)   將步驟(b)的混合物進行發酵，以得到該枸杞發酵物； 其中， 該乳酸菌組合物是由發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌，以及乳酸片球菌中的至少兩種菌種所組成。

為製備本揭示內容枸杞發酵物，首先是備齊枸杞原料，該枸杞的種類並無特別限定，其可以是非洲枸杞、寧夏枸杞、中華枸杞、新疆枸杞、濱藜葉枸杞、西北枸杞、黑果枸杞、阿拉伯枸杞、土庫曼枸杞，或其組合。依據本揭示內容的一較佳實施方式，所述枸杞原料是寧夏枸杞。依據本揭示內容的另一較佳實施方式，所述枸杞原料是中華枸杞。

接著，如步驟(a)所述，將該枸杞原料溶於一溶劑中，以得到一枸杞溶液。依據本揭示內容一實施方式，是將該枸杞原料加入該溶劑後，進行絞碎或打漿等微細化處理，以製成一枸杞漿液，據以獲得所述枸杞溶液。所述溶劑可以是水溶性溶劑包括，但不限於，水、無菌水、乙醇、多元醇(例如，甘油或丙二醇)或其混合物、林格氏液、磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS)、含三乙醇胺的磷酸鹽緩衝液、注射用滅菌水，以及葡萄糖注射液等滲溶液等。依據本揭示內容的一操作實施例，所述溶劑是水。非必要地，可另外添加其他添加物於該溶劑中，藉以提高後續乳酸菌發酵的效率；所述添加物可以是一種乳酸菌的營養物，例如，酵母萃取物等。

有關枸杞原料與溶劑來配製成枸杞溶液的配製比例，其可以是介於1：5至1：30的重量比，例如，1：5、1：6、1：7、1：8、1：9、1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19、1：20、1：21、1：22、1：23、1：24、1：25、1：26、1：27、1：28、1：29或1：30的重量比；較佳地，枸杞原料與溶劑的比例是介於1：10至1：20的重量比，例如，1：10、1：11、1：12、1：13、1：14、1：15、1：16、1：17、1：18、1：19或1：20的重量比。依據本揭示內容的一操作實施例，枸杞原料與溶劑的比例是1：10(即該枸杞溶液中含有10％(重量比)的枸杞，例如，取約10公克之枸杞，加入90公克之蒸餾水)。依據本揭示內容的另一操作實施例，枸杞原料與溶劑的比例是1：20(即該枸杞溶液中含有5％(重量比)的枸杞)。

在步驟(b)中，是將一乳酸菌組合物接種至步驟(a)之枸杞溶液中，其中該乳酸菌組合物中的含菌量為10 ⁵至10 ⁷CFU/毫升，例如，含菌量為1×10 ⁵、2×10 ⁵、3×10 ⁵、4×10 ⁵、5×10 ⁵、6×10 ⁵、7×10 ⁵、8×10 ⁵、9×10 ⁵、1×10 ⁶、2×10 ⁶、3×10 ⁶、4×10 ⁶、5×10 ⁶、6×10 ⁶、7×10 ⁶、8×10 ⁶、9×10 ⁶、1×10 ⁷、2×10 ⁷、3×10 ⁷、4×10 ⁷、5×10 ⁷、6×10 ⁷、7×10 ⁷、8×10 ⁷或9×10 ⁷CFU/毫升。在一操作實施例中，乳酸菌組合物中的含菌量為10 ⁵CFU/毫升。在另一操作實施例中，乳酸菌組合物中的含菌量為10 ⁶CFU/毫升。在再另一操作實施例中，乳酸菌組合物中的含菌量為10 ⁷CFU/毫升。

所述乳酸菌組合物是由發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌，以及乳酸片球菌中的至少兩種菌種所組成。舉例來說，該乳酸菌組合物可以是：包含發酵乳酸桿菌及格氏乳酸桿菌的組合物；包含發酵乳酸桿菌及腸膜明串珠菌的組合物；包含發酵乳酸桿菌及乳酸片球菌的組合物；包含格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌的組合物；包含格氏乳酸桿菌及乳酸片球菌的組合物；包含腸膜明串珠菌及乳酸片球菌的組合物；包含發酵乳酸桿菌及格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌的組合物；包含發酵乳酸桿菌及格氏乳酸桿菌及乳酸片球菌的組合物；包含發酵乳酸桿菌及腸膜明串珠菌及乳酸片球菌的組合物；包含格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌及乳酸片球菌的組合物，或是包含發酵乳酸桿菌及格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌及乳酸片球菌的組合物。

依據本揭示內容的某些實施方式，乳酸菌組合物是由兩種乳酸菌所組成，其中兩種乳酸菌是以1：0.3至1：5的菌數比例配製而成，例如，是以1：0.3、1：0.5、1：1、1：1.5、1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5或1：5的菌數比例配製而成。在一特定實施例中，兩種乳酸菌分別是：發酵乳酸桿菌及格氏乳酸桿菌；發酵乳酸桿菌及腸膜明串珠菌；發酵乳酸桿菌及乳酸片球菌；格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌；格氏乳酸桿菌及乳酸片球菌；腸膜明串珠菌及乳酸片球菌，且是以1：1的菌數比例(等菌數比例)配製成該乳酸菌組合物。

依據本揭示內容的某些實施方式，乳酸菌組合物是由三種乳酸菌所組成，其中各乳酸菌是以1：0.3：0.3至1：5：5的菌數比例配製而成，例如，1：0.3：0.3、1：0.3：0.5、1：0.3：1、1：0.3：2、1：0.3：3、1：0.3：4、1：0.3：5、1：0.5：0.5、1：0.5：1、1：0.5：2、1：0.5：3、1：0.5：4、1：0.5：5、1：1：1、1：1：2、1：1：3、1：1：4、1：1：5、1：2：2、1：2：3、1：2：4、1：2：5、1：3：3、1：3：4、1：3：5、1：4：4、1：4：5或1：5：5的菌數比例配製而成。在一特定實施例中，三種乳酸菌分別是：發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌及腸膜明串珠菌；發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌及乳酸片球菌；發酵乳酸桿菌、腸膜明串珠菌及乳酸片球菌；格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌及乳酸片球菌，且是以1：1：1的菌數比例(等菌數比例)配製成該乳酸菌組合物。

依據本揭示內容的某些實施方式，乳酸菌組合物是由四種乳酸菌所組成，其中個別乳酸菌是以1：0.3：0.3：0.3至1：3：3：3的菌數比例配製而成，例如，是以1：0.3：0.3：0.3、1：0.3：0.3：0.5、1：0.3：0.3：1、1：0.3：0.3：2、1：0.3：0.3：3、1：0.3：0.5：0.5、1：0.3：0.5：1、1：0.3：0.5：2、1：0.3：0.5：3、1：0.3：1：1、1：0.3：1：2、1：0.3：1：3、1：0.3：2：2、1：0.3：2：3、1：0.3：3：3、1：0.5：0.5：0.5、1：0.5：0.5：1、1：0.5：0.5：2、1：0.5：0.5：3、1：0.5：1：1、1：0.5：1：2、1：0.5：1：3、1：0.5：2：2、1：0.5：2：3、1：0.5：3：3、1：1：1：1、1：1：1：2、1：1：1：3、1：1：2：2、1：1：2：3、1：1：3：3、1：2：2：2、1：2：2：3、1：2：3：3或1：3：3：3的菌數比例配製而成。在一特定實施例中，四種乳酸菌分別是：發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌及乳酸片球菌，且是以1：1：1：1的菌數比例(等菌數比例)配製成該乳酸菌組合物。

接著，將步驟(b)的混合物進行發酵，以得到枸杞發酵物(步驟(c))。依據本揭示內容某些實施方式，發酵溫度是介於20至42°C之間，例如，20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42°C；較佳地，是介於25至37°C之間；更佳地，是介於30至35°C之間。在一特定實施例中，發酵溫度是35°C。依據本揭示內容某些實施方式，發酵時間是介於12至72小時之間，例如，12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、54、60、66或72小時；較佳地，是介於12至36小時之間；更佳地，是介於16至24小時之間。在一特定實施例中，發酵時間是不超過24小時。

2. 枸杞發酵物

基於上述，本揭示內容亦涵蓋利用本揭示內容製備方法所製得之枸杞發酵物。為保存本揭示內容枸杞發酵物以備後續之用，可在製得枸杞發酵物(其中含有枸杞渣漬)後，並將該枸杞發酵物進行離心(例如，以每分鐘轉速(revolutions per minute，rpm)8,000，離心10分鐘)以去除該枸杞渣漬，據以獲得所述枸杞發酵液，進一步將其製成乾燥粉末以利保存，其中可藉由濃縮(例如，蒸發濃縮(evaporation concentration)、冷凍濃縮(freeze concentration)、減壓濃縮(vacuum concentration)，或薄膜濃縮(thin-film concentration))，及/或乾燥(例如，自然乾燥(natural drying)(例如，日曬(sun drying))；自然換氣乾燥(kiln drying)(另稱烘乾(oven drying))；熱風乾燥(hot air drying)(例如，箱型棚架式乾燥(cabinet drying)、隧道式乾燥(tunnel drying)、帶式乾燥(belt drying)、迴轉乾燥(rotary drying)、氣流乾燥(pneumatic drying)、流動層乾燥(fluidized bed drying))；噴霧乾燥(spray drying)；薄膜乾燥(film drying)(另稱轉筒乾燥(drum drying))；真空乾燥(vacuum drying)；冷凍乾燥(freeze drying)(例如，真空冷凍乾燥(freeze-drying with vacuum)、常壓冷凍乾燥(freeze-drying without vacuum))；或膨發乾燥(puff drying))等過程來製備枸杞發酵物的乾燥粉末。依據本揭示內容的一操作實施例，是將枸杞發酵物以冷凍乾燥法製備枸杞發酵物的乾燥粉末。

為便於使用本揭示內容枸杞發酵物，可將該枸杞發酵物與一藥學上可接受的載體配製成一種藥學組合物，以便於對個體以特定投予方式施用該藥學組合物。所述藥學上可接受的載體包括，但不限於，緩衝液(例如，含磷酸鹽、檸檬酸鹽的緩衝液)；抗氧化劑(例如，抗壞血酸)；親水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；胺基酸(例如，甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸、離胺酸)；糖類(例如，葡萄糖、甘露糖、糊精)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；糖醇(例如，甘露醇、山梨醇)；成鹽平衡離子(例如，鈉)；以及非離子型表面活性劑(例如，聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(TWEEN™)、聚乙二醇(PEG)、及聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物(PLURONIC™))。基於上述，本揭示內容亦涵蓋上述的藥學組合物。

3. 枸杞發酵物的用途

本揭示內容的另一態樣是關於本揭示內容枸杞發酵物於預防及/或治療一罹患肝疾病之個體的用途，其中所述肝疾病包括，但不限於，酒精性肝疾病、藥物性肝疾病、感染性肝疾病、非酒精性脂肪肝疾病、非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維化，或肝硬化。依據本揭示內容的一特定實施例，所述肝疾病是藥物性肝疾病(例如，由APAP所引起的藥物性肝疾病)。

本揭示內容枸杞發酵物的用量、給藥途徑和給藥方案會取決於不同的因素，例如，依據個體的狀況、體重、性別、年齡、個體的嚴重程度、注射途徑等決定。這些因素所佔比重是本領域所熟知的，並可藉由常規實驗步驟來調整。依據本揭示內容的某些實施方式，本揭示內容枸杞發酵物的治療對象是一哺乳動物，特別是人類。為達到治療人類的目的，本揭示內容方法枸杞發酵物的有效量是介於10毫克/公斤體重至10公克/公斤體重(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或950毫克/公斤體重；1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8或10公克/公斤體重)的範圍；較佳地，是介於250毫克/公斤體重至2公克/公斤體重的範圍。在一特定實施例中，本揭示內容枸杞發酵物的有效量(例如，用於治療肝疾病)是280毫克/公斤體重。在另一特定實施例中，本揭示內容枸杞發酵物的有效量是560毫克/公斤體重。在再另一特定實施例中，本揭示內容枸杞發酵物的有效量是1.7公克/公斤體重。

本揭示內容枸杞發酵物的有效量可以是涵蓋在一單一劑量或多次劑量中。在某些實施方式中，當對個體施用多次劑量時，對個體施用所述多次劑量的頻率可以是每天三劑、每天二劑、每天一劑、每隔一天一劑、每三天一劑、每週一劑、每兩週一劑、每個月一劑或每兩個月一劑。在一特定實施方式中，對個體施用所述多次劑量的頻率是每天一或多劑。在一特定實施方式中，多次劑量的第一劑與最後一劑的間隔期間為二個月。

本揭示內容枸杞發酵物作為藥物成分，依據投予途徑可製成口服劑型和非口服劑型。當本揭示內容藥物組合物被製成口服劑型時，可依據本領域所熟知的方法配合適當的載體來製成粉末、顆粒劑、片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠囊劑、液劑、凝膠劑、糖漿劑、懸浮液、晶片等。根據配方的需要可包含填充劑、增量劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑等稀釋劑或賦形劑來進行配製。當將本揭示內容藥物組合物製成非口服劑型時，可依據本領域所熟知的方法配合適當的載體一起配製成注射劑的形式，所述合適的載體包括無菌水、乙醇、多元醇(例如，甘油或丙二醇)或其混合物、林格氏液、磷酸鹽緩衝液、含三乙醇胺的磷酸鹽緩衝液、注射用滅菌水、5％之葡萄糖注射液等滲溶液等。

進一步地，可將本揭示內容枸杞發酵物與其他藥物合併使用來治療肝疾病，所述藥物可以是：阿德福韋(adefovir)、甜菜鹼(betaine，BT)、恩替卡韋(entecavir)、α-干擾素(α-interferon)、拉美夫定(lamivudine)、二甲雙胍(metformin)、N-乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine，NAC)、ω−3脂肪酸(omega-3 fatty acids)、皮利酮(pioglitazone)、雷巴威林(ribavirin)、羅格列酮(rosiglitazone)、斯他汀類藥物(statin)、替比夫定(telbivudine)、替諾福韋(tenofovir)、熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)，或維他命E(vitamin E)。在一實施方式中，是將本揭示內容枸杞發酵物與NAC併用來治療肝疾病。在另一實施方式中，是將本揭示內容枸杞發酵物與BT併用來治療肝疾病。在另一實施方式中，是將本揭示內容枸杞發酵物與NAC及BT併用來治療肝疾病。

另外，本揭示內容枸杞發酵物可應用於製備食品，具有保護肝臟的功能，以保健功能食品、營養補品、保健食品或食品添加劑的形式用作食品中。本揭示內容枸杞發酵物可以是以任何形式進行生產，例如，茶、果汁、碳酸飲料、離子飲料等飲品類；牛奶、優酪乳等加工乳類；口香糖、年糕、糖果、麵包、餅乾、麵等食品類；可製成膠囊、丸、顆粒液狀、粉末、片狀、糊狀、糖漿、凝膠、果凍等保健功能食品製劑類等。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料及方法

1. 細胞培養

將Hep3B細胞(ATCC ^®HB-8064™)培養在杜氏改良式基礎培養基(Dulbecco’s modified Minimal Essential Medium，DMEM)中，並補充1％之100毫體積莫耳濃度之丙酮酸鈉、1％之100單位/毫升之青黴素/鏈黴素，以及10％之胎牛血清，並培養在37°C下、含5％之CO ₂的培養箱中。

2. 乳酸菌培養

在本實驗中，使用短毛乳酸桿菌( Lactobacillus brevis)、發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌、約氏乳酸桿菌( Lactobacillus johnsonii)、戊醣乳酸桿菌( Lactobacillus pentosus)、沙克乳酸桿菌( Lactobacillus sakei)、唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivarius)、陰道乳酸桿菌( Lactobacillus vaginalis)、腸膜明串珠菌、乳酸片球菌、戊醣片球菌( Pediococcus pentosaceus)等乳酸菌。

將該些乳酸菌製成儲備原液(stock)凍管(含20％(重量比)之甘油溶液抗凍液)，並保存於-80°C下。使用時，自-80°C保存箱中取出菌株並解凍，並於35°C的厭氧環境下培養16至18小時活化菌株。在活化菌株後，將菌株再次於35°C的厭氧環境下培養16至18小時。培養乳酸菌時，是將乳酸菌培養在乳酸菌專用培養液(曼駱夏培養液，De Man, Rogosa and Sharpe broth，MRS broth)或培養瓊脂(曼駱夏培養瓊脂，MRS agar)中。

製備熱致死乳酸菌時，是將菌體懸浮液調整至含菌數為10 ⁹CFU/毫升後，於121°C下加熱20分鐘即得。

3. 發酵實驗

製備本實驗所使用的培養基，含控制組培養基及枸杞培養基，以配製100公克的培養基為例，各組成成分的比例如表1所示。

表1      培養基100公克的各組成成分

組別	枸杞	葡萄糖	酵母萃取物	沸水
5％(重量比)之控制組	-	2.25公克	3公克	94.75公克
10％(重量比)之控制組	-	4.5公克	3公克	92.5公克
5％(重量比)之枸杞液	5公克	-	3公克	92公克
10％(重量比)之枸杞液	10公克	-	3公克	87公克

在將特定含菌量的各菌株組合(表2)接種至上述培養基之前，先將該些菌株組合調整至含菌量為10 ⁹CFU/毫升之儲備原液，再將該些儲備原液加入上述培養基中，並使各培養基中的含菌量最終濃度分別為10 ⁵、10 ⁶或10 ⁷CFU/毫升，接著將該些培養基於35°C下培養24、48或72小時。

表2      菌株組合

腸膜明串珠菌	腸膜明串珠菌 + 乳酸片球菌 (接種比例1：1)	腸膜明串珠菌 + 格氏乳酸桿菌 + 乳酸片球菌 (接種比例1：1：1)
格氏乳酸桿菌	腸膜明串珠菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1)	腸膜明串珠菌 + 格氏乳酸桿菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1：1)
乳酸片球菌	格氏乳酸桿菌 + 乳酸片球菌 (接種比例1：1)	腸膜明串珠菌 + 乳酸片球菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1：1)
發酵乳酸桿菌	格氏乳酸桿菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1)	格氏乳酸桿菌 + 乳酸片球菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1：1)
腸膜明串珠菌 + 格氏乳酸桿菌 (接種比例1：1)	乳酸片球菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1)	腸膜明串珠菌 + 格氏乳酸桿菌 + 乳酸片球菌 + 發酵乳酸桿菌 (接種比例1：1：1：1)

在發酵完成後，計算發酵後菌數，各組取1毫升之發酵後的培養基進行10倍序列稀釋至10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹倍，取1毫升之該些稀釋倍數(即10 ⁷、10 ⁸、10 ⁹)之稀釋菌液，加入約25毫升之液態曼駱夏培養瓊脂中(執行二重複)，待其凝固後，於35°C下培養48小時。以肉眼計算菌落數，取菌落數最接近250者作為計算依據，並回推上述之發酵後菌數。

4. 製備枸杞發酵液凍乾粉末

配製含10％(重量比)之枸杞培養基後，將該培養基接種10 ⁵CFU/毫升之各菌株組合，於35°C下培養24小時。接著，將發酵後的枸杞發酵液以5000 rpm離心10分鐘，收集上清液，再以真空濃縮去除多餘水分，並於-80°C下冷凍過夜後，再進行冷凍乾燥。

5. 細胞存活率分析

利用細胞技術法來進行細胞存活率分析，將Hep3B細胞1×10 ⁵個細胞種於培養皿中，加入熱致死乳酸菌與10毫體積莫耳濃度之APAP(Sigma-Aldrich)共同培養48小時後，收集細胞，並以台酚藍(trypan blue)將細胞染色，接著利用血球計數器於顯微鏡下計數存活細胞數目。

利用MTT試驗來進行細胞存活率分析，將Hep3B培養於24孔盤中，各孔種植2×10 ⁵個細胞，加入特定濃度之枸杞發酵液，或另加上10毫體積莫耳濃度之APAP(Sigma-Aldrich)，培養48小時後，去除培養基，並進行MTT試驗分析：加入0.2毫克/毫升之MTT試劑(Sigma-Aldrich)培養2小時後移除，再加入1毫升之DMSO溶解紫色顆粒結晶，以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD595奈米的吸光值。

6. 肝功能生化指標檢測

收集經由特定處理後的Hep3B細胞，並利用超音波破碎儀(20千赫)進行細胞破碎。破碎條件為超音波破碎5秒，休息5秒持續2分鐘。接著，將破碎後細胞以轉速30,000×g，於4°C下離心30分鐘，收集上清液，並利用酵素免疫測定法(ELISA)套組進行AST(Abcam)及ALT(Abcam)測定，以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD570奈米的吸光值。

7. 小鼠藥物性肝損傷模式

本實驗是利用6週齡大的雄性C57BL/6小鼠進行實驗，將56隻小鼠依表3隨機分為7組實驗組別，每組8隻小鼠。所有小鼠均飼養於溫度25±1°C、濕度均為55±5％的動物房內，並使小鼠可隨意食用飼料及水。本實驗是將枸杞發酵液凍乾粉末依低、中、高劑量比率(分別為FLGJ-L、FLGJ-M、FLGJ-H，表4)分別混入飼料中每天餵食小鼠，餵食量為小鼠體重的15％，以小鼠體重為30公克計算，每天餵食飼料量為4.5公克。在NAC與BT處理組的部分，則是每天以管餵方式給予NAC(0.6公克/公斤體重；Sigma-Aldrich)與BT(0.02公克/公斤體重；ACROS organics)。除了控制組以外，其他組別從第1週開始，每週2次以腹腔注射APAP(400毫克/公斤體重)，以誘發小鼠的藥物性肝損傷，共進行9週。在第9週實驗結束後犧牲小鼠，取其血液及臟器進行各項分析。於實驗期間的第1、3、5、7及9週，以眼窩採血採集小鼠血液(取300微升)，分離出血清(取100微升)以進行肝功能生化指標(AST、ALT)分析。

表3      小鼠實驗組別

組別	處理方式
1	控制組	每週2次腹腔注射PBS，每天管餵PBS。
2	APAP	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天管餵PBS。
3	APAP + FLGJ-L	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天給予3.5公克/公斤枸杞發酵液。
4	APAP + FLGJ-M	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天給予7.0公克/公斤之枸杞發酵液。
5	APAP + FLGJ-H	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天給予21公克/公斤之枸杞發酵液。
6	APAP + NAC	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天管餵給予600毫克/公斤之NAC。
7	APAP + BT	每週2次腹腔注射400毫克/公斤之APAP，每天管餵給予20毫克/公斤之BT。

表4      含枸杞發酵液凍乾粉末之小鼠飼料的配製比例

組別	比例-30公克之小鼠
FLGJ-L	4.5公克之飼料(含0.105公克之枸杞發酵液凍乾粉末)
FLGJ-M	4.5公克之飼料(含0.21公克之枸杞發酵液凍乾粉末)
FLGJ-H	4.5公克之飼料(含0.63公克之枸杞發酵液凍乾粉末)

8. 抗氧化酵素測定

麩胱甘肽(GSH)測定：取0.1公克之肝臟組織，將組織磨碎後離心(11,000×g、10分鐘、4°C)，取上清液，並利用麩胱甘肽檢測套組(Invitrogen)來測定肝臟組織中的GSH濃度，反應後以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD405奈米的吸光值。

麩胱甘肽過氧化酶(GPx)測定：取0.1公克之肝臟組織，將組織磨碎後離心(10,000×g、15分鐘、4°C)，取上清液，並利用麩胱甘肽過氧化酶檢測套組(Cayman Ann Arbor)來測定肝臟組織中的GPx濃度，反應後以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD340奈米的吸光值。

超氧化物歧化酶(SOD)測定：取0.1公克之肝臟組織，將組織磨碎後離心(1,500×g、5分鐘、4°C)，取上清液，並利用超氧化物歧化酶檢測套組(Cayman Ann Arbor)來測定肝臟組織中的SOD濃度，反應後以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD450奈米的吸光值。

過氧化氫酶(CAT)測定：取0.1公克之肝臟組織，將組織磨碎後離心(10,000×g、15分鐘、4°C)，取上清液，並利用過氧化氫酶檢測套組(Cayman Ann Arbor)來測定肝臟組織中CAT濃度，反應後以微量盤讀值儀測量數據結果，讀取OD540奈米的吸光值。

9. 組織化學染色

取最大左葉的肝組織來製備石蠟標本。在石蠟標本完成後，利用切片機切成5微米的連續石蠟切片，並製成載玻片樣本備用。接著進行蘇木紫-伊紅(haematoxylin-eosin，H&E)組織化學染色，是將上述肝臟組織切片樣本以二甲苯進行脫蠟，再依序以99.5％、95％、70％、50％及30％之乙醇進行復水，最後浸泡於蒸餾水中10分鐘。接著，將樣本以蘇木紫染色30秒，清洗後，再以伊紅染色2至5分鐘，之後再度清洗。最後，將樣本進行封片後，於光學顯微鏡下觀察組織型態。

10. 統計分析

實驗數據是以平均值±標準差來表示(n ≥ 3)。利用SPSS電腦統計軟體進行單因子及雙因子變異數分析(1-way and 2-way ANOVA)，且當F值為顯著時，再以雪費檢定(Scheffe’s test)測定組與組間之差異的顯著性(第1圖)。利用SPSS電腦統計軟體進行學生氏t檢定(第2A至2C圖、第5A至5C圖)。小鼠實驗結果皆是經由3次獨立實驗所得之結果，並利用SPSS電腦統計軟體進行變異數分析(ANOVA)，再以鄧肯多重差距檢定(Duncan’s multiple range test)比較組間平均值差異(第6A至6B、6D至6G圖)。 P＜0.05視為具有顯著性差異。

實施例 1 熱致死乳酸菌培養液對於 APAP 所誘發之肝細胞損傷的保護功效

為瞭解熱致死乳酸菌培養液對於藥物性肝細胞損傷的保護功效，在本實施例中首先建立藥物性肝細胞損傷的模式，該模式是以化合物APAP來誘發人類肝細胞株Hep3B細胞的傷害為例說明。以特定濃度(5、10及30毫體積莫耳濃度)之APAP處理Hep3B細胞24及48小時，與控制組一同測量細胞存活率、AST及ALT表現量。實驗結果如第1圖所示，相較於未經APAP處理的控制組來說，利用特定濃度之APAP處理24或48小時後的細胞，均顯示出細胞存活率明顯降低，並且呈現出劑量依賴性效應。此外，觀察到相較於處理24小時的細胞來說，處理48小時的細胞呈現出更顯著的生長抑制現象。相反地，在該些細胞中的AST及ALT表現量則是顯著增加，同樣呈現出劑量依賴性效應。據此，本實驗確立10毫體積莫耳濃度之APAP處理細胞48小時，可有效誘發肝細胞的傷害，遂以此條件進行後續的研究，以篩選出具有護肝潛力的乳酸菌株。

接著，利用上述之藥物性肝細胞損傷模式來篩選出具有護肝潛力的乳酸菌株。以10毫體積莫耳濃度之APAP與各乳酸菌株所製成的熱致死乳酸菌培養液(1×10 ⁸CFU/毫升；共11株)共同處理Hep3B細胞48小時，接著評估該些培養液對於細胞存活率與細胞中的AST與ALT表現量之影響。實驗結果說明，短毛乳酸桿菌、腸膜明串珠菌、格氏乳酸桿菌、沙克乳酸桿菌、戊醣乳酸桿菌、乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌等的熱致死乳酸菌培養液，可有效地回復由APAP所抑制的細胞存活率，其中又以腸膜明串珠菌、格氏乳酸桿菌、乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌等的熱致死乳酸菌培養液的改善效果更佳，該些培養液甚至可改善細胞存活率回復至與控制組相當(第2A圖)。

而在AST及ALT表現量的部分，短毛乳酸桿菌、腸膜明串珠菌、格氏乳酸桿菌、沙克乳酸桿菌、陰道乳酸桿菌、唾液乳酸桿菌、戊醣乳酸桿菌、乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌等的熱致死乳酸菌培養液，可顯著地降低由APAP所誘發的AST及ALT表現量，其中又以腸膜明串珠菌、格氏乳酸桿菌、乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌等的熱致死乳酸菌培養液的改善效果更佳，該些培養液甚至可改善AST及ALT表現量回復至與控制組相當(第2B至2C圖)。因此，本實驗確立腸膜明串珠菌、格氏乳酸桿菌、乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌等的熱致死乳酸菌培養液具有較佳的護肝功效，因而將該些乳酸菌株用於枸杞發酵中，並進行相關實驗。

實施例 2 枸杞發酵液對於 APAP 所誘發之肝細胞損傷的保護功效

為製備適當的枸杞發酵液，本實驗比較特定菌株組合(如表2所示)，於35°C下，以不同的枸杞添加量(5％、10％，重量比)、乳酸菌接種量(10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷CFU/毫升)，以及發酵天數(1、2、3天)等條件進行發酵後，檢測乳酸菌增殖數量，並依據所得到的實驗結果來選出最佳的發酵條件。各菌株組合以上述各發酵條件進行發酵後，所獲得之發酵後菌數如第3A至3O圖所示。實驗結果說明，相較於對應濃度的5％或10％之控制組培養基來說，在接種10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷CFU/毫升之特定菌株組合並進行發酵1天後，利用5％之枸杞培養基所得到的發酵後菌數可增加2至3.5倍，而利用10％之枸杞培養基所得到的發酵後菌數甚至可增加2至8倍，並且利用兩種枸杞培養基所得到的發酵後菌數皆可達到10 ⁹CFU/毫升以上。由上述結果可知，於35°C下，利用枸杞添加量10％(重量比)之培養基，並接種10 ⁵CFU/毫升之乳酸菌，在發酵1天後可使發酵後菌數達到最大量至10 ⁹CFU/毫升的規模，因此該發酵條件為最佳的發酵條件。

接著，測試含特定菌株組合之枸杞發酵液對於肝細胞生長的影響，其中該些含特定菌株組合之枸杞發酵液是以最佳發酵條件進行發酵後製得。以調整含菌量(10 ⁵、10 ⁶、10 ⁷、10 ⁸CFU/毫升)後之各菌株組合的枸杞發酵液處理Hep3B細胞24小時，實驗結果如第4圖所示。實驗結果說明，與控制組相比，使用含菌量為10 ⁷、10 ⁸CFU/毫升之枸杞發酵液，全部組別的枸杞發酵液均會抑制Hep3B細胞生長。而使用含菌量為10 ⁶CFU/毫升之枸杞發酵液，則有部分組別的枸杞發酵液會抑制Hep3B細胞生長，所述部分組別為：腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌+發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌+乳酸片球菌、乳酸片球菌+發酵乳酸桿菌、腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌+乳酸片球菌、腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌+發酵乳酸桿菌、腸膜明串珠菌+乳酸片球菌+發酵乳酸桿菌、格氏乳酸桿菌+乳酸片球菌+發酵乳酸桿菌的菌株組合。至於使用含菌量為10 ⁵CFU/毫升之枸杞發酵液，則全部組別的枸杞發酵液均不會抑制Hep3B細胞生長。基於上述結果，為排除枸杞發酵液本身對於肝細胞生長所造成的影響，因此使用含菌量為10 ⁵CFU/毫升之枸杞發酵液進行後續實驗。

本實驗評估含特定菌株組合之枸杞發酵液對於APAP所誘發之肝細胞損傷的保護功效，其中該些含特定菌株組合之枸杞發酵液是以最佳發酵條件進行發酵後製得。實驗是以10毫體積莫耳濃度之APAP與含特定菌株組合之枸杞發酵液(10 ⁵CFU/毫升；共15組)共同處理Hep3B細胞48小時，接著評估該些枸杞發酵液對於細胞存活率與細胞中的AST與ALT表現量之影響。實驗結果如第5A圖所示，除了發酵乳酸桿菌的枸杞發酵液以外，其餘各菌株組合的枸杞發酵液均可明顯回復由APAP所抑制的細胞存活率。

而在AST表現量的部分，除了乳酸片球菌及發酵乳酸桿菌的枸杞發酵液以外，其餘各菌株組合的枸杞發酵液均可顯著降低由APAP所誘發的AST表現量(第5B圖)。至於ALT表現量的部分，除了發酵乳酸桿菌的枸杞發酵液以外，其餘各菌株組合的枸杞發酵液均可顯著降低由APAP所誘發的ALT表現量(第5C圖)。其中，就各菌株組合的枸杞發酵液改善由APAP所導致之肝細胞損傷(包括使細胞存活率降低與細胞中的ALT及AST表現量增加)的目的來說，依序以格氏乳酸桿菌+發酵乳酸桿菌、腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌、腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌+發酵乳酸桿菌之菌株組合的枸杞發酵液所達到的改善效果為最佳，因此，後續以腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌+發酵乳酸桿菌之菌株組合的枸杞發酵液作為最佳護肝潛力的枸杞發酵液，並進行相關實驗。

實施例 3 枸杞發酵液對於小鼠之藥物性肝損傷的保護功效

本實施例進一步測試含腸膜明串珠菌+格氏乳酸桿菌+發酵乳酸桿菌之菌株組合的枸杞發酵液(FLGJ)對於小鼠藥物性肝損傷(例如，由APAP所引起的肝損傷)的保護功效。

本實驗是依「材料及方法」章節中的小鼠藥物性肝損傷模式來進行實驗。首先測量實驗前後的小鼠體重、肝臟重量(以下簡稱肝重)，以及肝重與體重比，實驗結果如表5所示，顯示出各組小鼠於實驗起始時，體重並無明顯差異，但於實驗終止時，可見APAP組的小鼠體重明顯低於控制組( P＜0.05)，而其餘各組與APAP組相比，小鼠體重則無顯著差異。在肝重、肝重與體重比的部分，APAP組之肝重、肝重與體重比明顯低於控制組( P＜0.05)，而不同劑量之FLGJ組與APAP組相比，肝重、肝重與體重比雖然不具有顯著差異，但有改善的趨勢，且該改善趨勢呈現出劑量依賴性效應。此外，NAC組與APAP組相比，肝重、肝重與體重比則顯著增加( P＜0.05)，且其肝重與體重比可回復至與控制組相當的程度。然而，BT組與APAP組相比，肝重、肝重與體重比則不具有顯著差異。

表5      各組小鼠的體重、肝重、肝重與體重比的結果

組別	初始體重 (公克)	最終體重 (公克)	肝重 (公克)	肝重/體重 (％)
控制組	23.2±0.2	30.9 ± 1.4	1.07 ± 0.10 #,	3.47 ± 0.18 #
APAP	23.5 ± 0.4	27.3 ± 1.1 *	0.86 ± 0.05 *	3.16 ± 0.07 *
APAP + FLGJ-L	23.5 ± 0.6	28.4 ± 0.7 *	0.89 ± 0.13 *	3.13 ± 0.39 *
APAP + FLGJ-M	23.4 ± 0.7	27.7 ± 0.9 *	0.91 ± 0.07 *	3.29 ± 0.19
APAP + FLGJ-H	23.6 ± 0.3	28.3 ± 1.4 *	0.93 ± 0.03 *	3.28 ± 0.06
APAP + NAC	23.1 ± 1.7	27.5 ± 1.2 *	0.97 ± 0.05 *,#	3.60 ± 0.18 #
APAP + BT	23.5 ± 0.3	27.8 ± 1.1 *	0.86 ± 0.05 *	3.10 ± 0.05 *

P＜0.05視為具有顯著性差異；*： P＜0.05對比控制組；#： P＜0.05對比APAP組。

進一步檢測血清中的AST及ALT濃度，以瞭解枸杞發酵液對於小鼠肝臟的保護功效。於特定期間(第1、3、5、7、9週)採集小鼠眼窩血液，並測量血清中的AST及ALT濃度(第6A至6B圖)。實驗結果說明，在實驗起始(第1週)時，各組的血清AST濃度與控制組相比均無顯著差異。而在第3、5、7、9週時，APAP組的血清AST濃度明顯增加( P＜0.05)，該增加情形並呈現出鐘型效應，在第5週時血清AST濃度達到最大值。在不同劑量之FLGJ組中，在第3、5、7、9週時，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著降低由APAP所誘發之血清AST濃度( P＜0.05)，並且呈現出劑量依賴性效應。NAC組(作為正控制組)則是在第3、5、7、9週時，均觀察到血清中的AST濃度有顯著降低( P＜0.05)，而BT組則是在第5、7、9週後，始觀察到血清中的AST濃度有顯著降低( P＜0.05)(第6A圖)。

在血清中的ALT濃度的部分，其實驗結果與上述AST的測量結果相仿。亦即，在實驗起始(第1週)時，各組的血清ALT濃度與控制組相比均無顯著差異。而在第3、5、7、9週時，APAP組的血清ALT濃度明顯增加( P＜0.05)，該增加情形並呈現出鐘型效應，在第5週時血清ALT濃度達到最大值。在不同劑量之FLGJ組中，在第3、5、7、9週時，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著降低由APAP所誘發之血清ALT濃度( P＜0.05)，並且呈現出劑量依賴性效應。而在NAC組的部分，在第3、5、7、9週時，NAC均可顯著抑制由APAP所誘發之血清中ALT濃度( P＜0.05)。至於BT組，則是在第3、5週時，未觀察到血清中的ALT濃度有顯著降低，反而是在第7、9週後，始可觀察到血清中的ALT濃度有明顯降低( P＜0.05)(第6B圖)。

本實施例並利用H&E組織染色來觀察小鼠的肝損傷情形(第6C圖)。實驗結果顯示出，相較於控制組來說，經APAP處理的肝組織明顯呈現出細胞壞死(necrosis)及發炎(inflammation)的現象(箭頭指示處)。但投予不同劑量之FLGJ後，任一劑量的枸杞發酵液均可改善肝細胞壞死及發炎的現象。同時，作為正控制組的NAC與BT組亦可改善肝細胞壞死及發炎的現象。

本實施例進一步以肝臟組織抗氧化酵素(包括麩胱甘肽(GSH)、麩胱甘肽過氧化酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)及觸酶(CAT)等)的表現量來評估肝臟功能。首先，在麩胱甘肽(GSH)的部分，與控制組相比，APAP組中的肝臟組織GSH表現量顯著下降，約下降34％( P＜0.05)。在不同劑量之FLGJ組中，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著提升肝臟組織中的GSH表現量，並呈現出劑量依賴性效應( P＜0.05)。NAC及BT組亦可顯著提升肝臟組織中的GSH表現量( P＜0.05)(第6D圖)。

其次，在麩胱甘肽過氧化酶(GPx)的部分，所得到的實驗結果與上述相仿，亦即，與控制組相比，APAP組中的肝臟組織GPx表現量顯著下降( P＜0.05)。在不同劑量之FLGJ組中，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著提升肝臟組織中的GPx表現量，並呈現出劑量依賴性效應( P＜0.05)。NAC及BT組亦可顯著提升肝臟組織中的GPx表現量(P＜0.05)(第6E圖)。

此外，在超氧化物歧化酶(SOD)的部分，所得到的實驗結果與上述相仿，亦即，與控制組相比，APAP組中的肝臟組織SOD表現量顯著下降( P＜0.05)。在不同劑量之FLGJ組中，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著提升肝臟組織中的SOD表現量，並呈現出劑量依賴性效應( P＜0.05)。NAC及BT組亦可顯著提升肝臟組織中的SOD表現量( P＜0.05)(第6F圖)。

最後，在觸酶(CAT)的部分，所得到的實驗結果與上述相仿，亦即，與控制組相比，APAP組中的肝臟組織CAT表現量顯著下降( P＜0.05)。在不同劑量之FLGJ組中，任一劑量的枸杞發酵液均可顯著提升肝臟組織中的CAT表現量，並呈現出劑量依賴性效應( P＜0.05)。NAC及BT處理組亦可顯著提升肝臟組織中的CAT表現量( P＜0.05)(第6G圖)。

作為小結，在本實施例中利用動物實驗，藉由檢測各項指標，包括小鼠體重、肝重、肝重與體重比、血清AST及ALT濃度、組織染色、肝臟組織抗氧化酵素等，已說明本案枸杞發酵液具有明確的護肝功效，特別是針對由藥物(例如，APAP)所引發的藥物性肝損傷而言，可具有良好的治療功效。

總結上述，本揭示內容已提供充分實驗數據證實，本發明枸杞發酵液具有明確的護肝功效，因此，本發明枸杞發酵液有潛力作為用於預防及/或治療肝臟疾病的新穎藥物。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍及附隨圖式後，本揭示內容及其他特徵、態樣及優點將更明顯易懂，其中：

第1圖是依據本揭示內容的一實施方式所繪示的長條圖，說明利用特定濃度的乙醯胺酚(Acetaminophen，化學名為N-乙醯對胺苯酚(N-acetyl- p-aminophenol，APAP))處理人類肝癌細胞株(Hep3B細胞)24或48小時後，測得細胞存活率、AST濃度及ALT濃度變化的結果。 P＜0.05視為具有顯著性差異；*： P＜0.05對比控制組。

第2A至2C圖是依據本揭示內容的一實施方式所繪示的長條圖，說明利用10毫莫耳體積濃度之APAP與特定熱致死乳酸菌(heat-killed lactobacillus)培養液(含菌數1×10 ⁸CFU/毫升)共同處理Hep3B細胞48小時後，測得細胞存活率(第2A圖)、天門冬胺酸轉胺酶(aspartate aminotransferase，AST)濃度(第2B圖)及丙胺酸轉胺酶(alanine aminotransferase，ALT)濃度(第2C圖)的結果，其中 Pp為戊醣片球菌( Pediococcus pentosaceus)、 Lb為短毛乳酸桿菌( Lactobacillus brevis)、 Lm為腸膜明串珠菌、 Lg為格氏乳酸桿菌、 L. sakei為沙克乳酸桿菌( Lactobacillus sakei)、 Lv為陰道乳酸桿菌( Lactobacillus vaginalis)、 L. salivarius為唾液乳酸桿菌( Lactobacillus salivarius)、 Lj為約氏乳酸桿菌( Lactobacillus johnsonii)、 Lp為戊醣乳酸桿菌( Lactobacillus pentosus)、 Pa為乳酸片球菌，以及 Lf為發酵乳酸桿菌。實驗數據是以平均值±標準差呈現(n ≥ 3)， P＜0.05視為具有顯著性差異；*： P＜0.05對比控制組(細胞存活率)及APAP組(AST及ALT濃度)。

第3A至3O圖是依據本揭示內容的一實施方式所繪示的長條圖，說明特定菌株組合於不同條件下(含接種菌數、發酵時間、枸杞培養基濃度等)進行發酵後，測得發酵後菌數的結果，其中GJ為枸杞培養基(枸杞液)。

第4圖是依據本揭示內容的一實施方式所繪示的長條圖，說明枸杞發酵物(菌數相當於1×10 ⁵至1×10 ⁸CFU/毫升)來處理Hep3B細胞48小時後，測得細胞存活率的結果，其中 Lm為腸膜明串珠菌、 Lg為格氏乳酸桿菌、 Pa為乳酸片球菌，以及 Lf為發酵乳酸桿菌。實驗數據是以平均值±標準差呈現。

第5A至5C圖是依據本揭示內容的一實施方式所繪示的長條圖，說明利用10毫莫耳體積濃度之APAP與利用特定菌株組合發酵所得之枸杞發酵物共同處理Hep3B細胞48小時後，測得細胞存活率(第5A圖)、AST濃度(第5B圖)及ALT濃度(第5C圖)的結果。實驗數據是以平均值±標準差呈現， P＜0.05視為具有顯著性差異；*： P＜0.05對比控制組(細胞存活率)及APAP組(AST及ALT濃度)。

第6A至6G圖是依據本揭示內容的一實施方式所得之結果，說明利用特定乳酸菌組合物( Lm+ Lg+ Lf)發酵所得之枸杞發酵物對於APAP所引發之小鼠肝損傷的治療功效。第6A至6B圖：在特定時間點上分別測得小鼠血清中的AST濃度(第6A圖)、ALT濃度(第6B圖)的結果。第6C圖：肝組織染色圖說明特定治療後的小鼠肝組織病理變化的結果；箭頭指出細胞壞死(necrosis)及發炎(inflammation)的區域(200×放大倍率)。第6D至6G圖：在特定治療後的小鼠麩胱甘肽(Glutathione，GSH)(第6D圖)、麩胱甘肽過氧化酶(Glutathione peroxidase，GPx)(第6E圖)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)(第6F圖)，以及觸酶(Catalase，CAT)(第6G圖)的結果。FLGJ(fermentation liquid of Goji)-L：低劑量之枸杞發酵液、FLGJ-M：中劑量之枸杞發酵液、FLGJ-H：高劑量之枸杞發酵液、NAC：N-乙醯半胱胺酸(N-acetylcysteine)、BT：甜菜鹼(betaine)。 P＜0.05視為具有顯著性差異；*： P＜0.05對比控制組；#： P＜0.05對比APAP組。

Claims (10)

1. 一種枸杞發酵物的製備方法，包含： (a)   將一枸杞溶於一溶劑中，以得到一枸杞溶液； (b)   將一乳酸菌組合物加至步驟(a)之枸杞溶液中；以及 (c)   將步驟(b)的混合物進行發酵，以得到該枸杞發酵物； 其中， 該乳酸菌組合物是由發酵乳酸桿菌( Lactobacillus fermentum)、格氏乳酸桿菌( Lactobacillus gasseri)、腸膜明串珠菌( Leuconostoc mesenteroides)，以及乳酸片球菌( Pediococcus acidilactici)中的至少兩種菌種所組成。
2. 如請求項1所述之製備方法，其中該乳酸菌組合物是由各組成菌種以等菌數比例配製而成。
3. 如請求項1所述之製備方法，其中該枸杞是非洲枸杞( Lycium afrum)、寧夏枸杞( Lycium barbarum)、中華枸杞( Lycium chinense)、新疆枸杞( Lycium dasystemum)、濱藜葉枸杞( Lycium halimifolium)、西北枸杞( Lycium potaninii)、黑果枸杞( Lycium ruthenicum)、阿拉伯枸杞( Lycium shawii)、土庫曼枸杞( Lycium turcomanicum)，或其組合。
4. 如請求項3所述之製備方法，其中該枸杞是寧夏枸杞，或中華枸杞。
5. 如請求項1所述之製備方法，其中在步驟(a)中，該溶劑是水，且該枸杞溶液包含5至10％(重量比)之該枸杞。
6. 如請求項1所述之製備方法，其中在步驟(b)中，是將10 ⁵至10 ⁷菌落生成單位(colony forming unit，CFU)/毫升之該乳酸菌組合物加至該枸杞溶液中。
7. 如請求項1所述之製備方法，其中在步驟(c)中，是將該混合物置於35°C發酵24小時。
8. 一種枸杞發酵物，其中是利用如請求項1所述之製備方法製備而成。
9. 一種如請求項8所述之枸杞發酵物於製備一藥物之用途，其中該藥物係用以預防及/或治療一個體之肝疾病(liver disease)。
10. 如請求項9所述之用途，其中該肝疾病為酒精性肝疾病(alcoholic liver disease，ALD)、藥物性肝疾病(drug-induced liver disease)、感染性肝疾病(infectious liver disease)、非酒精性脂肪肝疾病(non-alcoholic liver disease，NALD)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化(Liver fibrosis，LF)，或肝硬化(Liver cirrhosis)。

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