KR100944042B1 - 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 상기 수목추출액은, 신갈나무 목재 칩을 5 ~ 20배 부피의 물에 넣은 후, 10 ~ 48시간 함침 처리하고 탈수시키는 공정; 상기 탈수된 목재 칩을 열판 체스트기로 70 ~ 150℃, 30분 ~ 3시간 동안 가열하는 공정; 상기 가열된 목재 칩과 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시킨 후 처리시간 0.1 ~ 1시간, 처리온도 120 ~ 300℃, 압력 10 ~ 40kgf/㎠에서 연화하는 공정; 상기 연화된 목재 칩을 대기중에 방출하여 팽창된 목재 칩을 얻는 공정; 상기 팽창된 목재 칩을 50 ~ 200℃의 열수추출기에서 5 ~ 20배 부피의 물에 넣어 0.1 ~ 3시간 동안 약리성분을 추출하는 공정; 및 상기 약리성분을 분리, 정제, 감압 농축하는 공정;를 포함하는 공정으로부터 수득된다. 본 발명에 따른 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액은 저비용으로 제조되고, 유해물질을 분비하지 않으며, 약리효과가 우수한 장점이 있다.

플라보노이드, 페놀성화합물, 유기산, 항동맥경화, 항종양활성, 면역증강, 항당뇨성, 항산화성, 수목추출액, 참나무류

Description

항당뇨 활성을 갖는 수목추출액{Woody plant extract with antidiabetic activity}

본 발명은 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 수목추출액이 참나무류의 목재 칩을 연화, 팽창, 분리, 정제, 감압 농축하여 동맥경화, 간암, 또는 당뇨병에 약리작용을 하는 약리성분을 갖는 수목추출액을 추출하는 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액에 관한 것이다.

혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells, VSMC)의 증식과 이주능은 동맥경화와 동맥벽손상후 혈관협착(intimal thickening, stenosis)발생의 주요요인이다(Ross, 1986). 혈관조직 중간층(media)에 존재하는 VSMC는 낮은 세포분열능을 가지지만, 동맥경화나 혈관벽 손상 개시단계에서 혈관평활근세포(aortic smooth muscle cells)는 여러가지 성장인자들의 협조로 증식단계로 들어가 혈관비대를 유발시킨다(Chamley-Campbell, et al., 1979; Schwartz et al., 1992; Ross, 1993). 그러나, VSMC의 복제와 이주는 세포주위의 세포외기질의 리모델링과 분해를 필요로한다(Matrisian, 1990 Sasaguri et al., 1994). VSMC는 collagens, elastin, 그리고 proteoglycans을 포함한 세포외기질성분들을 합성한다(Galis et al., 1994; Strauss et al., 1994). 세포외기질의 축적과 분해에서 불균형은 혈관벽 손상 이후 진행되는 혈관내피조직이 두꺼워지는 현상을 유발시킨다(Strauss et al., 1994). VSMC침윤과 이주기전의 이해가 평활근세포이주와 혈관벽 두꺼워짐 현상을 특징으로하는 동맥경화를 예방하고 치료하는데 중요한 요소이다.

MMP들은 zinc-의존성 endoproteinase일종으로 세포외기질(extracellular matrix, ECM)을 분해한다(Kleiner et al., 1999). MMP는 interstitial collagenases (MMP-1), type IV collagenases 또는 gelatinases (MMP-2, MMP-9), 그리고 stromelysins (MMP-3)으로 구성된다(Woessner, 1991 Chung et al., 2004a). 이들 MMP중에서, gelatinase는 collagen인 천연기저막을 분해하며, MMP-2/MMP-9의 발현은 동맥경화병변을 유발한다(Newby and Zaltsman, 2000). 최근의 in vivo 연구결과, MMP-9가 VSMC 이주와 증식을 통하여 동맥병변 유발에 결정적임이 알려져 있다(Galis et al., 2002). 또한 MMP-9의 기본 활성은 매우 낮지만 TNF-α(Tumor Necrosis Factor alpha)에 의해 동맥평활근세포가 그 생성을 유도한다(Galis et al., 1994; Moon et al., 2003a; Cho et al., 2000).

세포의 내인성 MMP inhibitor들은 tissue inhibitors of metalloproteinase (TIMPs)로 알려져 있으며 matrix형성과 파괴균형을 유지시킨다(Brew et al., 2000). 그러므로 합성 MMP 억제제들 (예, BB94 batimastat과 BB2516 marimastat)들이 개발된 바 있다. BB94는 collagen 유사구조를 가지며, MMP 효소 분자의 활성부위에 있는 Zn이온을 착염시키는 활성을 가지므로 불활성형의 효소를 만들게 된다 (Mandal et al., 2003). 이러한 MMP저해제들이 지난 몇년간 개발되어 rheumatoid arthritis, cancer invasion 및 cardiovascular diseases등 여러 질병의 세포외기질 리모델링에 중요하게 연구되고 있다. 그결과 합성MMP inhibitor들은 손상된 rat 동맥에서 상처치유활성이 있음이 알려졌다(Zempo et al., 1996; Bendeck et al., 1996).

동맥중간층에서 분리한 동맥평활근세포의 이주능을 줄이기 위해(Kenagy et al., 1996), 그리고 배양된 토끼 동맥평활근세포의 세포증식억제와 탐식세포조절능을 억제하기 위하여 MMP-9 inhibitor들이 고안되었다(Fitzgerald et al., 1999). 또한 일부 천연물들이 동맥경화억제에 사용되고 있으며(Heber, 2001), 전통한약자원들이 동맥경화치료에 쓰이고 있다(Yoshie et al., 2001; Kim et al., 2003). 수목추출액중 목초액은 한방에서 혈관질환에 사용되지만 동맥경화억제기전이 해명되지 않았다.

수목추출액은 페놀계화합물을 함유하며 간세포보호능, 적혈구 산화방지 등 그 기능이 알려져 있다. 그리고, acetylcholinesterse 저해활성과 항염증활성이 있다. 이러한 연구에도 불구하고 아직 혈관계증식억제연구는 없다. 특히 사람의 동맥평활근세포의 이주능을 억제하는 활성은 보고된 바 없다.

항동맥경화제제들이 녹차의 polyphenols, resveratrol, limonene, 마늘의 organosulfur 성분에서 보고된 바 있다(Kaegi, 1998). 특히 녹차의 polyphenol과 그 성분인 epigallocatechin gallate는 MMP-9활성을 억제한다(Demeule et al., 2000; Ha et al., 2004a; Ha et al., 2004b; Ha et al., 2004c; Chung et al., 2004b). 동맥경화치료의 핵심이 평활근세포의 이주능억제와 MMP-9활성억제임을 알려진 감안할 때 MMP-9억제활성과 이주억제활성을 갖는 천연한방제제 개발은 동맥경화예방 치료의 지름길이다 (Chung et al., 2004b; Ha et al., 2004a; Ha et al., 2004c).

한편, 암의 전이(metastasis)는 초기종양으로부터 암세포가 신체의 다른 부위로 전파되는 과정으로 악성 종양의 가장 큰 특징이라 할 수 있다. 최근 암 연구 보고에서 암의 전이로 인한 사망은 암 관련환자 사망의 약 90%를 차지하며, 바로 암의 전이가 암환자 사망의 중요한 원인임을 역설하였다. 지난 수년간의 종양세포에 확산에 대한 집중적인 연구는 암 전이 과정의 분자적인 기작에 대한 적지 않은 이해를 가져왔다. 암의 전이는 암세포와 암세포 주위와의 복잡한 상호작용으로 발생한다. 암세포 주위는 암세포가 정상적으로는 통과할 수 없는 지지구조체인 세포외기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane)으로 되어 있다. 암세포는 이러한 세포외 장벽을 극복하기 위하여 ECM과 기저막을 분해할 수 있는 다양한 종류의 proteinase를 생산, 분비하는데, 그 중에서도 특히 matrix metalloproteinase(MMP)가 중요한 역할을 담당한다. 정상적인 생리적 환경에서의 MMP들은 tissue inhibitors of metalloproteinases(TIMP)라는 내생 MMP 저해제에 의하여 엄격하게 조절된다. 그러나 암의 증식, 침윤(invasion), 전이 과정 중에는 MMP 와 TIMP 간의 평형이 무너지고 과다한 MMP가 분비된다. 따라서 MMP 저해제는 암의 침윤과 전이를 효과적으로 막을 수 있는 새로운 표적으로 기대되어 많은 암 연구자들이 새로운 개념의 항암 치료제로서 MMP 저해제 개발에 연구를 집중하고 있다.

현재 많은 연구자들에 의해 MMP에 대한 저분자의 선택적 저해제의 탐색 및 합성 design의 연구가 활발히 진행되고 있으며, 화학적으로 합성된 저해제와 천연물로부터 분리된 저해제의 전 임상 또는 임상 실험의 결과는 MMP 저해제가 암의 치료에 있어서 새롭고 유망한 치료제가 될 수 있음을 보여주고 있다. 그러나 기존의 peptide 구조의 부분적인 변형에 관한 것인 합성 저해제의 경우, 이들의 제한된 생체이용성(bioavailabilty), 짧은 반감기(half-life), 효소 선택성의 결여, 수용액에서 낮은 용해도 등의 적지 않은 문제점들이 있다. MMP의 중요한 생리적 활성에 비추어 볼 때 특정 MMP에 대해 선택성이 떨어지는 강력한 저해제의 지속적인 투여는 심각한 부작용을 야기할 것으로 예상할 수 있다. 또한, 식물이나 미생물 등의 천연물로부터 몇 종류의 MMP 저해제가 탐색되어 개발과정 중에 있지만, 효소 저해활성의 빈약함과, 강한 세포 독성 때문에 치료약으로 개발되기까지는 많은 문제점이 있다.

Type IV collagenase(gelatinaes)인 MMP-2와 MMP-9는 암의 전이와 밀접한 관련이 있다. 암의 전이에 가장 큰 장벽인 ECM과 기저막의 주된 성분은 type IV collagen인데, MMP-2와 MMP-9는 catalytic domain 내에 gelatin과 collagen에 대해 친화성이 있는 fibronectin-like domain을 포함하고 있으며, type IV collagen에 대하여 기질 특이성을 갖고 있다. 뿐만 아니라 인간 암세포주 배양과 실험 동물모델에서 MMP-2와 MMP-9가 암의 전이와 연관되었다고 입증되었으므로, 이를 분비하는 세포주를 이용하여 MMP 저해제를 탐색하는 전략이 효과적이다. Type IV collagenase를 분비하는 세포주 탐색을 위해 HT1080, C32TG, HepG2 T98G, MIA-PaCa2, UAcc62, U937, G361 등 다양한 종양 세포주를 이용하여 무혈청 배지에 TPA와 TGF-β1등의 첨가에 따른 type IV collagenase의 유도정도를 확인한다. Gellatinase의 효소 활성측량법으로는 방사능 동위원소가 표지된 gelatin(3H-acetylated gelatin)이나 광합성 peptide(fluorogenic MMP-2/MMP-9 sustrate, DNP-Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg-OH)를 이용하여 분해산물의 방사능량이나 형광량을 측량하는 방법과, 활성 단백질 전기영동법을 이용한 gelatin zymography가 있다. 이들 중 gelatin zymography가 비교적 간편하고, 적은 시료량으로 효소활성을 측량이 가능하다. 또한 대략적인 분자량을 알 수 있기 때문에 분비되는 MMP를 동정할 수 있음으로 편리하다.

최근, 생약의 약리활성을 이용한 암의 치료 및 예방이 중요시되고 있다. 예를 들어, 대나무잎에서 추출한 다당류는 사르코마-180 (Sarcoma-180)이 이식된 생쥐의 복강암에 효과적인데(Ikekawa, T.등 (1968) Gann 59: 155-157), 이러한 종양억제 약리활성은 간접적인 숙주를 매개로 한 면역증강효과에 기인하며, 특히 담자균류 세포벽에 존재하는 다당류의 활성이 중요한 것으로 알려져 있다(Tanaka, T. 등 (1965) Gann, 56: 529-536; Hamuro, J. 등 (1978) Cancer Res., 38: 3080-3085; Maeda, Y. 및 Chihara, G., (1971) Nature, 229: 634-635; Komatsu, N. 등 (1969) Gann. 60: 137-144; Oh, G. T. 등 (1992) Arch. Pharm. Res., 15: 379-381).

이러한 약리활성을 가지는 식물은 숙주방어활성 (host-defense activity)과 탐식세포 (macrophage)활성을 촉진하므로써 면역증강 (immuno-potentiating)과 항종양활성 (anti-tumoral activity)을 나타내는 것으로 평가된다. 또한, 면역계 활성화와 항종양에 대하여 임상적으로 효과가 인정되는 약물은 소수에 불과하므로 현재까지 항종양에 유효한 약물탐색이 많은 연구자에 의해 이루어지고 있다.

그와 같은 약리활성을 가진 것으로 수목추출액이 있고, 이 수목추출액은 건조한 약재이다. 비록 다른 약재와의 복합처방에 한정되어 있을지라도, 과거 한방약재로서 청열해독에 주로 사용되어 왔으며 특히, 인체 질환 염증질환 및 암의 치료에 효과적임이 알려져 있다. 그러나 생리활성에 대한 연구는 거의 없다.

Glucokinase와 hexokinase는 간과 췌장에서 인슐린에 의한 혈당이용을 증대시키며 혈당농도를 감지하여 인슐린분비를 조절하는 효소로서 인슐린 비의존성 당뇨병(non-insulin dependent diabetes mellitus, NIDDM)의 병인과 밀접한 관계가 있는 효소이다. 그리고, Cytokine interleukin-1β (IL-1β)는 췌장 도세포에서 인슐린 분비와 β-cell에 대한 세포 독성을 조절하여 장기간 노출시,인슐린 분비와 생합성을 저해하며 β-cell을 파괴하여 β-cell손상을 초래하여 인슐린 의존성 당뇨병(Insulin dependent diabetes mellitus, IDDM)을 유발한다.

당대사와 인슐린 분비조절에 관여하는 효소인 glucokinase는 췌장의 β-cell에서 대사 과정에 필요한 glucose 인산화 효소로, glucose를 glucose-6-phosphate (G-6-P)로 인산화시켜 glycogen을 합성시켜 간의 포도당 합성을 조절한다. 또한, 췌장의 glucokinase는 혈당에 의해 효소 활성이 변화하며, hexokinase는 혈중 당을 조직내로 흡수하여 G-6-P로 바꾸어 주어 일정한 동적 평형 상태를 유지시켜 준다. 한편, cytokine의 일종인 interleukin-1β (IL-1β)는 염증 질환시 췌장의 β-cell에 손상을 주어 인슐린 의존형 당뇨병을 동시에 유발시키는데, IL-1β의 과잉 발현이 췌장에서의 glucose 산화에 영향을 준다.

또한, 목초액 유기물을 사용하여 항암 활성을 나타내는 암치료 및 예방, 항균 및 항산화 효과를 갖는 목초액 유기물(한국 특허등록 제733982호)에 관한 기술이 기재되어 있다. 그러나, 상기 목초액 유기물은 탄화공정으로 제조되므로 유해물질을 함유하고 있어 인체에 유해한 문제점이 있다.

본 발명은 상기 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로서 유해물질을 유발하지 않고, 사람동맥유래 평활근세포의 사이토카인 TNF-α 유발 이주활성 억제효과 및 MMP-9 억제활성을 갖고, B-임파구 자극활성 및 항종양활성을 갖고, IL-1β로 유발된 당뇨병에서 포도당 인산화 효소인 glucokinase 및 hexokinase 활성이 있는 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액을 제공하는 데 그 목적이 있다.

본 발명의 상기 목적은 신갈나무 목재 칩을 5 ~ 20배 부피의 물에 넣은 후, 10 ~ 48시간 함침 처리하고 탈수시키는 공정; 상기 탈수된 목재 칩을 열판 체스트기로 70 ~ 150℃, 30분 ~ 3시간 동안 가열하는 공정; 상기 가열된 목재 칩과 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시킨 후 처리시간 0.1 ~ 1시간, 처리온도 120 ~ 300℃, 압력 10 ~ 40kgf/㎠에서 연화하는 공정; 상기 연화된 목재 칩을 대기중에 방출하여 팽창된 목재 칩을 얻는 공정; 상기 팽창된 목재 칩을 50 ~ 200℃의 열수추출기에서 5 ~ 20배 부피의 물에 넣어 0.1 ~ 3시간 동안 약리성분을 추출하는 공정; 및 상기 약리성분을 분리, 정제, 감압 농축하는 공정;를 포함하는 공정으로부터 수득한 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액을 제조함으로써 달성할 수 있다.

본 발명은 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액에 있어서, 상기 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성 및 면역증강 활성을 갖는 수목추출액은, 신갈나무 목재 칩을 5 ~ 20배 부피의 물에 넣은 후, 10 ~ 48시간 함침 처리하고 탈수시키는 공정; 상기 탈수된 목재 칩을 열판 체스트기로 70 ~ 150℃, 30분 ~ 3시간 동안 가열하는 공정; 상기 가열된 목재 칩과 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시킨 후 처리시간 0.1 ~ 1시간, 처리온도 120 ~ 300℃, 압력 10 ~ 40kgf/㎠에서 연화하는 공정; 상기 연화된 목재 칩을 대기중에 방출하여 팽창된 목재 칩을 얻는 공정; 상기 팽창된 목재 칩을 50 ~ 200℃의 열수추출기에서 5 ~ 20배 부피의 물에 넣어 0.1 ~ 3시간 동안 약리성분을 추출하는 공정; 및 상기 약리성분을 분리, 정제, 감압 농축하는 공정;을 포함하는 공정으로부터 수득한다.

구체적으로, 본 발명의 상기 공정에 의해 수득된 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액은, 사람 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells, VSMC)에서 IC₅₀이 500㎍/ml 이상으로 독성이 적으며, MMP-9 활성을 농도 의존적으로 억제하고(IC₅₀: 24㎍/ml), matrigel precoated transwell chamber에서 동맥평활근 세포의 이주를 억제하여, 항동맥경화 치료예방제로 작용한다. 또한, 본 발명의 수목추출액은 사르코마 180 고형종양을 이식한 쥐에서 2ml/100g 투여로 항종양활성을 나타내고, 암유발물질을 투여한 쥐에게 본 발명의 수목추출액을 투여하면 과산화물분해효소 활성이 14% 이상 증가하는 항산화성을 나타내고, 항체생성능이 강한 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 면역활성 100%에 비해 본 발명의 수목추출액은 투여하였을 때 89%의 면역활성을 나타낸다. 그리고, cytokine interleukin-1β로 유발된 당뇨성 쥐에게 본 발명의 수목추출액을 투여하였을 때 인슐린 분비가 감소하여 당뇨병 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 독성이 전혀 없으므로 건강보조식품으로도 널리 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 탈수 공정 전에, 상기 참나무류 목재를 벌채하여 수피를 제거하는 박피작업을 한 후, 칩제조기로 잘라 목재 칩을 제조하는 전처리 공정을 더 포함한다.

그리고, 상기 약리성분 분리 공정은 상기 추출 공정에서 생성된 잔사와 여액을 원심분리기를 사용하여 분리한 후, 여과지를 이용하여 감압 여과하여 잔사를 제거하는 공정을 더 포함한다.

상기 약리성분 정제 공정은 상기 분리 공정에서 얻어진 수목추출액을 에탄올:물의 9:1 부피비 혼합용제를 사용하여 겔크로마토그래피에서 정제하는 공정을 더 포함한다.

상기 약리성분 감압 농축하는 공정은 상기 정제 공정에서 얻어진 수목추출액을 30 ~ 80℃에서 감압 농축하는 공정을 더 포함한다.

도 1은 본 발명에 따른 수목추출액의 제조 공정도이다. 도 1과 같이, 참나무 류를 벌채하여 껍질을 벗기는 박피처리를 한다.

상기 박피처리 공정은 칼, 증기, 열탕, 또는 기계적인 박피를 사용할 수 있다. 그리고, 수산화나트륨, 또는 수산화나트륨과 탄산나트륨의 혼합액에 짧은 시간 담갔다가 즉시 수세하는 알칼리박피를 할 수 있고, 염산 또는 황산용액에 짧은 시간 담갔다가 즉시 수세하는 산 박피를 할 수 있고, 산알칼리 겸용 박피를 할 수 있다.

상기 박피공정 후, 칩 제조기에 의해 가로×세로×높이가 2cm×2cm×0.2cm인 크기로 자르는 chopping 공정을 한다.

상기 chopping 공정한 후, 상기 칩을 대형용기에 5 ~ 20배 부피의 물을 넣고 10 ~ 48시간 담그는 함침공정을 하여 목재 세포벽과 공극을 충분히 팽윤시킨다.

상기 함침공정 후, 상기 칩의 물을 탈수기로 탈수시킨다.

상기 탈수처리공정 후, 상기 칩을 열판 체스트기로 70 ~ 150℃에서, 30분 ~ 3시간 동안 가열한다. 상기 가열처리공정은 상기 가열된 목재 칩내의 폴리페놀 등의 페놀성 화합물의 함량을 증가시키고, 상대적으로 탄수화물의 함량을 저하시키는 공정이다.

상기 가열처리공정 후, 상기 전 처리된 목재 칩을 밀폐된 용기 내에 수증기와 함께 강제 투입하여 포화상태를 유지시킨다. 상기 포화상태를 0.1 ~ 1시간, 120 ~ 300℃, 10 ~ 40kgf/㎠ 압력하에서 연화한 후, 순간적으로 대기 중에 방출하여 팽창된 목재 칩을 얻는 증자처리공정을 한다.

상기 증자처리공정 후, 상기 팽창된 목재 칩을 50 ~ 200℃의 열수추출기에서 5 ~ 20배 부피의 물에 넣어 0.1 ~ 3시간 동안 약리성분을 추출하는 열수처리공정을 한다.

상기 열수처리공정 후, 상기 약리성분이 추출된 목재 칩을 원심분리를 이용하여 잔사와 여액으로 분리하는 원심분리공정을 한다.

상기 원심분리공정 후, 여과지를 이용하여 감압 여과하여 잔사를 제거하는 여과처리공정을 한다.

상기 여과처리공정 후, 상기 여액을 회수하여 정제하지 않은 조수목추출액을 얻는 여액회수처리공정을 한다.

상기 여액회수처리공정 후, 상기 조수목추출액을 Sephadex G-500이 충진된 칼럼에서 에탄올과 물 혼합용액을 사용하여 정제하여 수목추출액을 얻는 정제처리공정을 한다.

상기 정제처리공정 후, 상기 정제처리된 수목추출액을 30 ~ 80℃에서 감압하여 7 ~ 20배 농축시키는 감압농축공정을 한다.

상기 감압농축공정 후, 상기 수목추출액을 액체크로마토그래피, 가스크로마토그래피-질량분석법을 포함한 기기분석으로 성분분석을 한다.

상기 성분분석 후, 최종적으로 상기 성분분석된 수목추출액을 회수한다.

이때, 상기 수목추출액의 약리성분은 탄수화물류인 Arabinose, Xylose, Mannose, Galactose, 또는 Glucose, 페놀성화합물류인 Lignin, Tannin, 또는 Flavonoid, 유기산류인 Acetic acid, Uronic acid, Levulinic acid, Ferulic acid, Cinnamic acid, 또는 Vanillic acid, 또는 휘발성분류인 Furfural, Fugenol, Propanone, 또는 Isoeugenol 중 적어도 하나 이상을 포함한다.

하기 표1에 상기 약리성분의 추출함량이 기재되어 있다.

성분종류			함량(%)
탄수화물류		Arabinose	0.82
		Xylose	5.40
		Mannose	0.66
		Galactose	0.42
		Glucose	12.7
페놀성화합물류		Lignin	2.6
		Tannin	0.4
		Flavonoid	1.2
유기산류		Acetic acid	1.46
		Uronic acid	0.51
		Levulinic acid	0.54
		Ferulic acid	0.21
		Cinnamic acid	0.10
		Vanillic acid	0.16
휘발성분류		Furfural	미량
		Fugenol	미량
		Propanone	미량
		Isoeugenol	미량

상기 약리성분은 단독 또는 복합적으로 사용되어 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성의 약리작용을 한다.

설탕을 제외한 탄수화물류는 생리활성물질이고, 에너지 대사 물질로서, 영양 균형이 제대로 이루어지도록 하여, 영양의 과소나 과다에 의한 암 확장을 감소시킨다.

폴리페놀류인 상기 페놀성화합물류는 산화를 방지하는 작용, 즉 항산화 기능을 갖고 있다. 또한, 폴리페놀류는 콜레스테롤이 소화관으로 흡수되는 것을 막아주기 때문에 혈중 콜레스테롤의 수치를 낮게 해주는 작용도 한다. 그중 여러 플라보노이드 성분들은 몸안의 면역세포를 활성화시키고, 모세혈관투과억제, 항알러지, 진경, 혈압강하, 살충, 항균, 간세포보호, 항산화작용등이 있으며, 항바이러스, 혈당강하, 항암작용이 있다.

상기 유기산류는 혈액순환을 원활히 하고, 고혈압, 당뇨, 동맥경화 등 성인병을 예방하는 효과가 있다.

상기 휘발성분류는 암세포 성장을 억제하고, 고혈압에 효과가 있고, 간기능을 활성화하는 효과가 있다.

또한, 본 발명은 상기 공정에 의해 수득된 수목추출액을 유효성분으로 함유하는 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 또는 항산화성을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 수목추출액은 사르코마 180 고형종양을 이식한 쥐에서 항종양활성을 나타낸다.

또한, 사람의 간세포에 투여했을 경우, 세포 독성은 거의 일어나지 않는다. 그러나, 사람 간암세포에 투여했을 때에는 간암세포에 대해 강한 선택적 독성을 나타낸다. 그러므로, 암전이 및 암화를 억제하는 능력이 있다.

그리고, 암유발물질을 투여한 쥐에게 본 발명의 수목추출액을 투여하면 과산화물분해효소 활성이 증가하는 항산화성을 나타낸다.

본 발명의 수목추출액은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다. 즉, 본 발명의 수목추출액은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 생약 수목추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

상기 수목추출액의 유효용량은 50 ~ 1000mg/kg 이고, 바람직하기로는 200 ~ 500mg/kg 이며, 하루 1 ~ 3 회 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 수목추출액 중에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 하는 기능성 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 공정에 의해 수득된 수목추출액을 유효성분으로 함유하는 항당뇨 활성, 항동맥경화 활성, 또는 면역증강 활성을 갖는 약제학적 조성물을 제공한다.

Cytokine interleukin-1β로 유발된 당뇨성 쥐에게 본 발명의 수목추출액을 투여하였을 때 인슐린 분비가 감소하여 당뇨병 치료제로 사용될 수 있다.

IL-1β 유발 실험적 당뇨쥐는 체중과 공복시의 glucose 및 insulin 분비가 증가되나, 상기 수목추출액 투여로 공복시의 insulin분비가 감소하고 체중과 공복시의 혈당은 유의성은 없으나 정상쥐에 비하여 감소한다. 그러나, IL-1β 유발 실험적 당뇨쥐는 혈당수치가 정상쥐에 비하여 증가되며, 수목추출액 투여로 혈당수치가 현저히 감소하고, Insulin치의 상승과 분비지연도 수목추출액 투여후 정상쥐와 유사하다. 한편, 혈중 glucokinase와 hexokinase의 활성은 IL-1β주사에 의해 현저히 감소되나, 수목추출액 투여로 유의성 있게 상승된다. 즉, 수목추출액은 IL-1β로 유발된 실험적 당뇨병에서 포도당인산화 효소인 glucokinase와 hexokinase의 활성을 증가시킨다.

그리고, 사람 동맥평활근 세포에서 IC₅₀이 500㎍/ml 이상으로 독성이 적으며, MMP-9 활성을 농도 의존적으로 억제하고(IC₅₀: 24㎍/ml), matrigel precoated transwell chamber에서 혈관평활근세포(vascular smooth muscle cells, VSMC)의 이주를 억제하여, 항동맥경화 치료예방제로 작용한다.

혈관평활근세포 vascular smooth muscle cells (VSMC)의 이주능과 matrix metalloproteinases (MMPs) 생성능은 동맥경화의 중요한 원인이므로, 본 발명의 수목추출액을 TNF-α로 유발된 사람동맥평활근세포 (HASMC)에 투여하면, 상기 세포의 이주능, MMP-9 활성에 대한 억제 효과가 있으므로 항동맥경화제로 사용할 수 있다.

또한, 항체생성능이 강한 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS) 면역활성 100%에 비해 본 발명의 수목추출액은 투여하였을 때 89%의 면역활성을 나타낸다.

본 발명의 수목추출액은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

상기 의약품제제의 내용는 상기 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 또는 항산화성을 갖는 약제학적 조성물의 기재를 원용한다.

또한, 본 발명은 수목추출액을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강보조식품을 제공한다.

상기 수목추출액의 약리성분은 상기 기재를 원용한다.

상기 수목추출액은 당뇨병, 암, 동맥경화, 또는 노화 등을 예방하는 효과가 있으므로, 차, 음료, 건강보조식품으로 사용가능하다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 항동맥경화 활성, 항종양 활성, 암전이 및 암화억제 활성, 면역증강 활성 및 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액은 탄화공정을 사용하지 않아 유해물질을 포함하지 않고, 생리활성효과, 항암효과, 항동 맥경화효과, 항산화효과, 항당뇨효과를 나타내므로 안전하다. 또한, 본 발명의 수목추출액은, 간단한 제조공정에 의해 경제적인 비용으로 제조할 수 있으며, 제약원료로도 사용될 수 있다. 또한, 장기간에 걸친 본 발명의 수목추출액을 투여하더라도 부작용이 적어 치료효과가 배가되는 장점이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 동맥경화억제 효과

1) 동맥평활근 세포 배양

사람 동맥평활근 세포 (HASMC)를 mooth muscle cell growth medium-2: 10% FBS, 2ng/ml human basic fibroblast growth factor, 0.5 ng/ml human epidermal growth factor, 50 μg/ml gentamicin, 50 μg/ml amphotericin-B, 5 μg/ml bovine insulin 방법으로 배양(Moon et al., 2003b)하였다. 모든 실험에는 초대 passage HASMC를 80 ~ 90% confluence로 배양, serum starvation (0.1% FBS)에서 보존하였다.

2) 생약추출

건조 수목추출액 500 g을 세절하여, 50 mM PBS (pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4 ℃, 15,000 xg에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 시료 5g을 취하여 10배의 MeOH을 가하여 70℃에서 3시간 동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 감압농축 후 정량하여 실험에 사용하였다.

3) 세포증식 특정(XTT 특정)

세포독성 검사는 HASMC에서 XTT kit (XTT II, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany)(Ha et al., 2004c)로 측정하였다. 세포를 96-well culture plate에서 2시간 동안 1 × 104 cells/well DMEM로 키우고 수목추출액을 다른 농도로 (0, 10, 50, 100, 250, 500 and 1000 g/ml) 3실험군으로 나누어 처리하였다. 72시간 후에 50 l의 XTT환원용액 (sodium 3'-[1-(phenyl-aminocarbonyl)-3,4-tetrazolium]-bis(4-methoxy-6-nitro) benzenesulfonic acid hydrate N-methyl dibenzopyrazine methyl sulfate; 50:1로 본합)을 첨가하였다. 4시간 후에 490 nm에서 ELISA plate reader로 XTT와 함께 incubator에서 측정하였다(37°C, 5% CO2 + 95% air). 실험은 3회씩 독립적으로 실시하였다. 결과는 mean SE로 표시하였다.

4) 이주능 시험

Matrigel migration assay를 사용하였다(Chung et al., 2004b; Ha et al., 2004c). Matrigel-코팅된 filter inserts (8 m 공삭크기)를 Bcton-Dickinson (NJ, USA).사의 24-well invasion chambers에 고정 후, HASMC (5 × 104 cells/well)세 포를 일정 키운 뒤, TNF-α처리 HASMC를 24시간 배양 후 여러농도로 (0, 50, 100, 250 and 500 g/ml) 처리하였다. 500 l의 배양액을 invasion chamber에 첨가하였다. TNF-α 처리하지 않은 세포는 대조군으로 사용하였다. Matrigel invasion chamber를 37°C, 24시간, 5% CO₂에서 보온하였다.

5) 수목추출액의 MMP-9 젤라틴젤 zymography측정

건조 수목추출액 구성약재를 세절하여, 50 mM PBS (pH 7.2)용액에서 분쇄한 뒤, 4 ℃, 15,000 xg에서 20분간 원심분리하였다. 그 후 시료 5g을 취하여 10배량의 MeOH을 가하여 70℃에서 3시간 동안 가온 침출하여 여과(동양여지 No. 1)하고 여액을 모아 MMP-9저해실험에 사용하였다. MMP-9 활성은 (Demeule et al., 2000; Chung et al., 2004b; Ha et al., 2004a)방법으로 실시하였다. 수목추출액은 농도별로 ( 0, 1, 10, 50, 100, 500, 1000 g/ml) 실시하였다.

6) Densitometric 및 통계분석

MMP-9활성의 자이모그람 Gel-Print System (Core Bio Corp., Seoul, KOREA)로 측정 수치는 meansSEfh 표시하였다.

7) 수목추출액의 사람 동맥평활근 세포 (HASMC)에 대한 독성

수목추출액의 사람 동맥평활근 세포 (HASMC)에 대한 독성은 킷트를 사용하여 HASMC cells (5 × 104 cells/well)를 24시간 동안 96-well microplates로 수목추출액 농도 (0, 50, 100, 200, and 500 ul/ml)에서 측정하였다. 도 2와 같이, 농도의존적으로 세포독성이 인정되었다. 수목추출액은 사람 동맥평활근 세포 (HASMC)에 대해 (IC₅₀ > 500 ul/ml)농도로 독성을 나타내어 독성이 미약하여 인체에 해가 없는 것으로 나타났다.

8) 수목추출액의 농도 의존적인 MMP-9 저해활성

수목추출액의 MMP-9 억제 활성을 검토한 결과, 도 3에 나타내었듯이, 농도의존적으로 MMP-9 활성을 억제하였다(IC₅₀: 24 g/ml). 수목추출액은 이 이상의 농도에서도 MMP-9 활성을 강력하게 저해하여 세포독성은 미약하면서 MMP-9 활성은 강하게 저해하였다.

Zymography는 HASMC cells에 TNF-α와 수목추출액 (0, 10, 20, 50 ul/ml)를 첨가하여 측정하였다. 활성의 densitometric intensity를 측정하였다.

9) 수목추출액의 사람 동맥평활근 세포 이주능에 미치는 영향

사람 동맥평활근 세포를 조건배지에 세포수 (5 x 104 cells/200 ul)로 조정하여 matrigel invasion chamber에서 여러 농도의 수목추출액 (0, 20, 50, 100, 200 ug/ml)을 첨가하여 24시간 동안 37C, 5% CO₂에서 보온하였다. 도 4에 나타내었듯이, 필타안으로 침윤한 세포수가 수목추출액에 농도의존적으로 크게 감소하였 다(IC₅₀ =22 ug/ml). 이러한 결과는 수목추출액이 사람 동맥평활근 세포의 침윤-이주능을 효과적으로 억제함을 나타낸다.

수목추출액의 사람동맥평활근세포에 대한 독성을 XTT방법으로 검토한 결과, IC₅₀ = 90 ug/ml에서 약한 세포독성을 나타내었다. gelatin zymography법으로 이들 수목추출액 분획에 대한 matrix metalloproteinase (MMP)-9 활성에 대한 억제도를 검토한 결과, TNF-α처리 HASMC는 세포이주 활성이 관여하는 MMP-9을 분비하였으며 수목추출액은 이 효소를 강하게 억제하였다. 수목추출액은 농도의존적으로 MMP-9활성을 억제하였으며 Matrigel migration방법에서 농도 의존적으로 TNF-유발 HASMC세포이주를 억제하였다(IC₅₀ = 65 ug/ml). 이러한 결과는 수목추출액이 TNF-α유발 HASMC세포의 이주억제활성을 가진 항동맥경화 활성을 가짐을 알 수 있었다.

실시예 2 항종양활성 효과

1) 수목추출액의 사람정상 간세포주(Chang)에 대한 세포독성

사람의 간세포(Chang, 5×103)를 각각 96well microplate에 well당 198㎕씩 분주한 후 MTT assay를 실시하였던 바, 도 5와 같이, 세포 독성이 없거나 낮은 것으로 나타났다

도 5는 정상간세포주의 독성을 나타내며, 화살표는 apoptosis 유발 약간의 세포독성을 나타낸다.

2) 수목추출액의 사람 간암세포(Hep 3B)에 대한 세포독성

사람의 간암세포(Hep3B, 5×103)를 각각 96well microplate에 well당 198㎕씩 분주한 후, 세포독성을 검사한 결과, 도 6과 같이, 간암세포에는 강한 선택적인 독성을 나타내었다.

도 6은 간암세포주에 대한 독성을 나타내며, 화살표는 apoptosis유발 강한 세포독성을 나타낸다.

3) 항종양활성의 검정

수목추출액에 있는 다당류의 항암작용을 다음 방법으로 검정하였다. 생후 4주된 ICR계 생쥐에 사르코마 (Sarcoma) 180세포를 (0.1 ml, 7 x 106 세포) 쥐의 우측 서혜부 피하에 이식하였다. 실험표본 물질은 PBS에 적당한 농도로 용해시켜 고압멸균한 뒤 내부복막 가까이에 종양이식한 후, 24시간 이후부터 10일동안 매일 주사 (2 mg/100 g)하였다. 모든 쥐들을 5주간 관찰한 후 종양의 성장에 미치는 영향를 알아보기 위해, 쥐를 죽이고 종양을 절제하여 무게를 측정하므로써 다음의 식으로부터 종양의 성장억제비율을 구하였다.

억제율 (%) = 100 (A-B)/A

A는 대조군의 종양무게의 평균값이며 B는 실험군의 종양무게의 평균값이다. 완전한 퇴행은 실험쥐 숫자에 대한 완전한 퇴행을 보이는 쥐숫자의 비율이다.

그 결과 하기 표 2에서와 같이, 사르코마 180 고형종양을 이식한 쥐에서 항 종양활성이 2 ml/100 g 투여로 44.7%의 종양억제율을 나타내었다.

수목추출액의 사르코마 (Sarcoma)-180에 대한 종양억제효과

분획 투여 종양무게 억제율 종양생쥐에서 (mg/100 g x 10일간) 완전한 억제갯수

대조군 2.0 12.04±1.55 - 0/10

조수목추출액 2.0 6.65±1.52 44.7 1/10

4) 수목추출액의 탐식세포 자극활성 (macrophage-stimulating activity)

열수 수목추출액의 복강 및 구강식이를 위해 PBS에 녹인 뒤 투여하였다. 구강식이를 위해서 강제로 섭취하게 하였으며, PEC 분리와 비장의 탐식세포 활성을 위해 적출하였다. 비장의 탐식세포(Splenic macrophage) 분리는 조직을 부드럽게 부순 뒤 Tris완충액-염화 암모늄 용액으로 조직을 단일 세포화시키고, 세포 추출기 (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, USA)을 통과시켜 수행하였다. 잔존세포는 HBSS를 완벽하게 세척하고, RPMI배지 (10 % 가열불활성화 소태아혈청, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 함유, RPMI-FCS)로 재희석하였다. 희석된 세포는 플라스틱용기에, 배양된 탐식세포는 RPMI-FCS-HEPES에 부착시키도록 만들었다.

PEC는 수목추출액을 복강 및 구강 섭취후에 5 ml의 Hank의 균형용액 (HBSS)으로 말초동공으로부터 분리하고, 원심분리하여 세포덩어리를 HBSS로 두 번 세척한 후 HBSS (25 mM-HEPES(-2-hydroxyethyl-peperazine-N-2-ethane sulfonic acid 함유) 1 ml에 녹였다. 이렇게 얻은 PEC는 F-300 세포측정기 (Medical Electronics, Kobe, Japan)를 사용하여 그 수를 측정하였다.

PEC의 탐식활성의 측정은 형광 마이크로파티클 (microparticle)에서 배양하여 측정한다. 즉, PEC (1 x 105)를 원심분리하고 100 μl의 HBSS-HEPES에 재희석 한 뒤, HBSS-HEPES로 100배 희석시킨 훌루오레스브라이트 카복실레이트 마이크로스피어즈(Fluoresbrite carboxylate microspheres, 2.0 μm; Polyscience, Warrington, PA, USA)를 20 μl를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 배양액에 2 ml의 냉PBS (3 mM ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt; EDTA-PBS함유)를 첨가하여 반응을 정지시킨후 세포덩어리를 모아 EPICS-프로파일 II 훌로우시토미터 (EPICS-Profile II flow-cytometer, Coulter, Hialeah, FL, USA)를 이용하여 탐식활성을 측정하였다. 화학 루미네센스 활성측정은 F-300 마이크로셀 (microcell)측정기를 사용하여 PEC와 비장의 탐식세포 밀도가 4 x 105/ml이 되도록 트리판 블루 (Trypan Blue)염색으로 세포수를 세고 RPMI-FCS-HEPES로 조정한 뒤, 500 μl의 세포용액을 20 μl의 0.2 % 루미놀 (luminol, 5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazine-dione, Sigma, Co., USA)이 함유된 폴리스티렌 큐벳에 옮겼다. 각각의 큐벳을 부드럽게 섞은 뒤 15분 후에 루미노미터 (luminometer, Multi-biolumat LB9505; Berthold, Wildbad, Germany)를 사용하여 측정하였다. 활성은 15분동안의 총활성으로 나타내었다.

비장의 탐식세포 활성에 대한 효과를 측정하기 위하여, 수목추출액을 10마리의 생쥐복강내에 투여하여 이중 3마리에서 비장의 탐식세포를 투여후 3, 6, 18일째에 분리하여 일시적인 화학 루미네센스를 측정하였다 (표 3). 수목추출액 투여 생쥐에서의 화학 루미네센스가 대조군보다 증가하였다.

수목추출액의 비장 탐식세포의 화학 루미네센스 활성

Count (x 10-5)

처리일수 대조군 (PBS) 수목추출액 처리군

대조군 1.0 1.02

수목추출액 1.61 2.11

3마리 생쥐의 복강내에 10 mg 를 투여한 뒤 3,6,18일째에 적출된 비장의 탐식세포의 화학루미네센스활성을 측정하였다. 대조군은 PBS처리군.

그리고, 생쥐 당 5 mg씩 수목추출액을 투여한 생쥐의 PEC가 가장 높은 화학 루미네센스를 나타내었다. 이들 생쥐에서 비장의 탐식세포의 생성은 투여량 의존적임이 확인되었다. 수목추출액의 B세포자극활성을 다클론 항체생성 세포를 C57BL/6XC3H 생쥐에서 측정한 결과 5 mg 투여에서 가장 높았으며 (표 4), B-세포자극활성을 나타내었다.

수목추출액의 B-임파구 자극활성

투여량 (ul) 상대활성a)

LPS 2.0 100

조수목추출액b) 2.0 11

대조군c) - 1

a) 대조군으로서 LPS처리군을 100%로 하였다. b) 수목추출액처리군. c) 무처리군

5) 수목추출액의 독성 및 혈중누출효소에 대한 영향

상기에서 추출된 열수 수목추출액을 임상적으로 사용하려면 독성이 없어야 하므로, 독성검사와 간세포계 효소에 미치는 영향을 검토하였다. 무처리군의 정상랫트 (1군 5마리)에 대한 열수추출 다당류의 복강내 투여시의 치사량을 구하고자 하였으나, 5일동안 950 ug/kg이하 투여시에 사망을 일으키지 않았다. 또한 950 ug/kg을 복강내 투여시, 24시간 후의 S-GOT, S-GPT, S-Alp에 어떠한 영향도 미치지 않았다 (표 5)

조수목추출액의 독성 및 혈중누출효소에 대한 영향

활성(%)

투여량(ul/kg) 시간(h) S-GOTa S-GPT S-Alp

정상군(무처리군) 100 100 100

수목추출액 500 1 101.4±8.1 100.6±6.2 98.3±5.2

6 98.7±5.2 105.3±5.3 101.5±3.3

12 99.4±7.5 105.3±3.7 109.5±9.6

24 103.2±6.3 96.5±7.3 103.3±8.6

수목추출액 1000 1 102.2±3.3 101.2±4.8 100.5±8.6

6 99.3±7.3 109.3±8.8 105.8±12.1

12 104.7±10.2 105.2±7.4 98.6±8.7

24 98.4±8.7 106.4±8.1 105.2±9.4

a 각각의 수치는 5마리씩 3회 반복실험의 결과이다 (±S.E).

본 실험에서는 gelatin zymogaphy를 약간 변형하여 MMP 저해제 탐색에 이용하였다. 먼저 acrylamide 젤 제조시 기질인 gelatin을 1.0㎎/㎖첨가한 분리 젤을 만들어 SK-Hep1세포 혈청 배양액을 SDS시료 완충용액(4% SDS, 125mM Tris-Cl(pH 6.8), 10% glycerol)으로 전기영동한 후 Triton X-100이 포함된 50mM Tris-HCl(pH 7.5) 완충용액으로 30분간 2회 세척하여 SDS를 제거한 후 zymography 용 incubation 완충용액(50mM Tris-HCl(pH7.5), 10mM CaCl2, 0.01% NaN3)으로 20분간 다시 세척하였다. 용매 수목추출액과 zymography 용 incubation 완충용액을 혼합하여 37℃에서 20시간 배양한 다음 gel을 2.5% Gel을 0.1% Coomasie brillient blue로 염색시킨 후 탈색하여 gelatin 분해능이 현저하게 저하된 것을 MMP 저해제 활성이 있는 것으로 판단하였다.

실시예 3 면역증강활성 효과

1) 수목추출액의 B-임파구 자극활성

수목추출액의 모든 분획에 대한 B-임파구 자극활성을 검토하기 위해 실험동물은 암컷의 생쥐 (C57BL/6XC3H) F1 (B6C3F1)을 구입하여 17 ~ 22g 중량이 될 때 비장적출실험에 이용하였다. 양(sheep)의 적혈구(sRBC)는 한국배지주식회사(서울)에서 구입하였고 기니아피그 보체와 RPMI 1640배지는 Gibco BRL (Grand Island, NY, USA)사 제품을, 리포폴리사카라이드 (Lipopolysaccharide, LPS)는 시그마사 제품을 사용하였다. 임파구의 시험관내 활성화 및 항체생성세포수 (AFC) 검정은 다음과 같다. 비장세포를 RPMI 1640배지 (10 % 소태아혈청함유)에서 배양하여 세포수를 5 x 106 cells/ml로 조정한 후, 웰당 0.5 ml씩 (처리군당 4개씩) 48-웰의 플레이트 (Costar사 제품)에 옮긴 후, 시료 또는 LPS (25 μg/ml, 시그마)를 첨가하였다. 시험관내 자극을 위하여 플레이트를 37C의 Bellco (Bellco Biotech., Vineland, NJ, USA) 스테인레스철 조직배양기에서 흔들어 가면서 배양하였다.

항체생성은 배양 2일 뒤에 측정하며 TNP (trinitrophenyl)-합텐 처리된 sRBC에 대한 AFC를 Jerne 플라크검정법으로 측정하고 세포수는 헤마시토미터 (hemacytometer)를 사용하였다. 이때 항체생성 세포수를 활성치로 나타내고 비활성은 다음과 같이 나타내었다. 즉, 일반적으로 항체생성능이 강한 대조군으로 사용되는 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide; LPS) 25 ug/ml를 대조군으로 처리 하였을때를 기준으로 분획 Fr.-1 1mg 투여시의 활성을 1로 하여 보정하였다. 비활성 = LPS 25 ug/ml 을 처리할 때 나타나는 항체생성치로서 분획 Fr.-1의 경우 1.03 mg에 해당한다. LPS의 활성이 거의 25 ug/ml농도에서 포화되므로 이 양을 대조군으로 사용하였다. 수목추출액의 모든 분획 2 mg씩 B-임파구 자극활성을 C57BL/6XC3H 생쥐에서 다클론 항체생성으로 검정한 결과, 특히 분획 Fr.-2가 가장 강한 B-임파구 자극활성을 나타내었다 (표 6).

수목추출액의 B-임파구 자극활성 검정

분획(Fr.-2) 투여량(mg) 비활성a)

조수목추출액 2.0 2

대조군 - 1

a) 대조군 LPS 25 ug처리시의 활성을 100 %로 하였다.

2) 수목추출액의 B-임파구 자극 활성의 LPS군과 비교 검정

수목추출액을 각각의 시료 0.1 mg/ml에 대한 면역자극 검정을 한 결과, 대조군인 LPS군의 89% 활성을 나타내었다 (표 7).

수목추출액의 B-임파구 자극활성

분획 투여량(mg) 비활성

LPSa) 2.0 100

수목추출액 2.0 89

a) 대조군 LPS의 활성을 100%로 하였다.

실시예 4 항산화성(노화방지) 효과

열수 수목추출액의 모든 분획에 대한 항산화성 유무를 확인하기 위해서 실험동물은 일본 Air Logistics사의 4주령 B6C3F1 숫컷 생쥐로 한국 바이오 제노믹스사를 통하여 구입하여 다섯 군(1군 10마리)으로 나누어서 실험을 하였다. 제1군(이하, 1군)은 정상군으로 물과 사료만으로 사육하였다. 제2군(이하, 2군)은 생쥐당 17.5mg/Kg 의 비율로 DEN(N,N-diethylnitrosoamine)을 주 2회씩 8주간 복강 주사하였고[Kolaja, K. L., Xu, Y., Walborg, E. F., Jr., Stevenson, D. E. and Klaunig, J. E. (1998) J. Toxicol. Environ. Health A 53: 479-492] 이후에 12주를 더 사육한 다음에 경추 탈구법으로 도살하여 생화학적 검사를 실시하는데 이용하였다. 제3군(이하, 3군)은 처음부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여(500 ppm) 사료와 함께 사육하였고, 제4군(이하, 4군)은 DEN을 8주간 복강 주사한 후에 9주부터 열수 수목추출액을 물에 희석하여 사료와 함께 사육하였다. 제5군(이하, 5군)은 DEN을 복강 주사하면서 열수 수목추출액과 사료로 사육하는 군으로 분류하여 실험하였다.

Glutathione peroxidase는 생체내에서 생성되는 과산화수소를 물로 바꿔주는 과정에 관여하는 효소이며, Glutathione peroxidase의 활성도는 이 효소에 의해 생성된 oxidized glutathione(GSSG)이 glutatione reductase에 의해 glutathione(GSH)으로 되어 일정 수준의 GSH를 유지할 때, NADPH가 산화되는 것을 측정하는 방법으로 그 검정 방법은 다음과 같다. 0.1 mM EDTA를 함유하는 0.1 mM 인산염 완충용액(pH 7.0) 0.5 ml와 glutathione reductase 0.1 ml(0.24 unit), 10 mM GSH 0.1 ml 그리고 시료 0.1 ml를 혼합하였다. 이 혼합용액에 1.5 mM NADPH 용액 0.1 ml를 넣고 12 mM cumene hydroperoxide 0.1 ml를 가하여 340 nm에서 5분간 흡광도의 감소를 측정하였다. 1분동안에 1μM의 NADPH를 산화시키는 효소의 양을 1 unit로 하였다.

암 유발 물질을 투여하지 않은 군들(1군과 3군)간의 비교에서 열수 수목추출액의 투여군에서 과산화물분해효소의 활성이 29% 이상 증가함을 나타내었다, 또한 암 유발 물질의 투여군들간(2군, 4군 그리고 5군)의 비교에서도 열수 수목추출액의 투여군(4군과 5군)에서 과산화물분해효소의 활성이 유의적으로 증가하였다(표 8).

수목추출액의 과산화물분해효소에 대한 영향

Group(군) unit/ mg protein ( % 활성)

정상군(1 군) 1.018 ± 0.063 (100)

대조군(2 군)-암유발물질 투여군 0.871 ± 0.074 (85.53)

(3 군)-암유발물질 투여하지 않은 군 1.315 ± 0.148 (129.15)

(4 군)-암유발물질 투여군 0.980 ± 0.111 (96.30)

(5 군)-암유발물질 투여군 1.168 ± 0.100 (114.87)

실시예 5 면역성 Cytokine interleukin -1β로 유발된 당뇨병 쥐의 췌장 glucokinase 및 hexokinase 활성에 대 한 수목추출액의 효과

1) 동물 준비

수컷쥐는 생후 3주째에 (체중 12-18 g) 한국실험동물 사업실에서 분양 받았다. 모든 쥐들은 10마리씩 나누어 플라스틱 cage에 수용하고 물과 음식을 자유롭게 섭취할 수 있도록 충분히 공급하였다. 실험기간 동안 사육 환경은 실온에서, 습도는 60%, 명암주기는 12시간 간격으로 유지하였다.

2) 시약 준비

모든 일반적인 시약들은 주로 Sigma Co. 및 Wako Pure Chemicals Co. (Tokyo, Japan) 제품의 특급품을 구입하여 사용하였다. 면역 및 활성 시약은 일본의 Daiichi Co.와 Boehrinher Mannheim Biochemicals Co.에서 구입하였다. Cytokine인 Interleukin-1β (IL-1β)는 BS사의 재조합 마우스 IL-1β를 사용하였다.

3) 검액의 조제

수목추출액 500 g을 증류수로 추출, 여과하여 그 용액을 동결 건조한 후 분말화시킨뒤 필요에 따라 증류수에 녹여 검액으로 사용하였다.

4) 당뇨병의 유도 및 검액의 투여

실험 동물은 정상군, IL-1β처리 당뇨군 (이하 대조군이라 함), IL-1β처리 당뇨유발 후 수목추출액 처리군(이하 수목추출액 처리군이라 함)으로 각 군에 20마리씩 배정하여 실험에 사용하였다. 대조군과 수목추출액 처리군은 IL-1β (50 μg/마리)를 쥐 복강내 3일간에 걸쳐 3회 주사하였다. 수목추출액 처리군은 IL-1β주사 후 수목추출액 농축액을 0.2 mg/20 g씩 1일 2회 2주간 경구로 투여하였으며, 대조군은 증류수를 2주간 경구 투여하였다.

5) 시료 수집 및 전 처리

반복적으로 혈당을 측정하고자 할 때는 heparin 처리 모세관으로 안구하 정맥에서 혈액을 약 200 μl 뽑아 사용하였다. 쥐들은 decapitation 방법으로 희생시킨 후 혈액을 eppendorf tube에 받아 30분간 세워둔 후 microcentrifuge로 10분간 15000 rpm에서 원심분리하였다. 혈청은 바로 50 μl씩 분주하여 보관하였고 혈청 인슐린 분석시 사용하였다. 췌장 조직은 적출하여 차가운 식염수에 세척한 후 흡습지로 물기를 제거한 후 중량을 측정하였다. 췌장 조직은 곧바로 10배의 50 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0)을 가하여 Homogenizer로 균질화하고 4℃, 100,000×g에서 1시간 동안 초원심 분리하여 cytosol 분획을 얻었다. 이 중 일부를 냉동 보관하거나 효소 활성 측정과 단백질 함량 분석에 이용하였다.

6) 혈당 및 혈청 인슐린 정량

혈당은 Glucose oxidase법으로 측정하였고 인슐린은 mouse insulin assay kit (Daiichi radioisotope Labs, Tokyo, Japan, #20008)을 사용하거나 당뇨 자동 분석기기로 측정하였다.

7) Glucokinase와 hexokinase 활성 측정

Glucokinase와 hexokinase 활성 측정은 다음과 같이 측정하였다. 반응 완충용액 50 mM sodium phosphate 완충액(pH 7.0), 5 mM MgCl2, 5 mM ATP. 0.2 unit Glucose-6-phosphate dehydrogenase 1.0 ml에 (A) 100 mM Glucose, (B) 0.1 mM Glucose, (C) 100 mM N-acetylglucosamine 100 μl씩과 조직 추출물 100 μl, 증류수 300 μl를 각각 넣어 반응시켰다. 반응후 분광 광도계를 사용하여 340 nm에서 분당 흡광도 변화를 측정한 다음 (A)-(B)=glucokinase 활성, (B)-(C)=hexokinase 활성으로 계산하였다. 동시에 보다 정확하게 하기 위해서 D-[U-14C]glucose (1900-1920 dpm/nmol)로부터 생성되는 D-[U-14C]glucose-6-phosphate 양을 측정하였다(ㄴStanley et al., 1984)

8) 단백질의 정량

단백질의 정량은 Lowry 방법(Lowry et al., 1951)을 사용하였으며 비활성도 측정에 사용하였다. 한편, 실험 결과의 유의성 검정은 Student's t-test를 이용하여 상호비교하여 관찰하였으며, 검정시 P값이 0.05 미만일 때를 통계적으로 유의하다고 보았다.

9) 결과 및 고찰 - 체중, 혈당, 인슐린 분비의 변화

IL-1β (50 μg/마리)를 마우스 복강내 3일간에 걸쳐 3회 주사하고 1일,10일, 20일 3회에 걸쳐 정상군, 대조군 및 수목추출액 처리군의 체중 변화를 관찰하였다. 그 결과 IL-1β를 주사한 대조군의 체중 증가가 가장 심하였으며 다음으로 수목추출액 처리군에서 증가가 인정되었다. 그 중 1주일 후의 체중 변화를 표 9에 나타냈다. 정상군의 체중이 13.3 g이지만 alloxan주사 대조군은 23.2 g을 나타내어 체중증가가 보였으며 alloxan주사후 수목추출액 처리군은 17.5 g으로 체중감소를 보였다. 한편, 혈청 인슐린농도는 정상군이 27.8 nU/ml이며, IL-1β주사대조군은 75.4 nU/ml로 인슐린 분비가 증가하였으며, IL-1β주사 후 수목추출액 처리군에서는 45.6 nU/ml로 인슐린 분비가 대조군에 비하여 감소되었다(표 9).

정상군, 대조군, 수목추출액 처리군의 처리결과

	정상군	대조군	수목추출액 처리군
체중	13.3±1.6	23.2±3.4*	17.5±2.6
Diet intake(g/day)	2.4±0.24	3.4±0.8	3.1±0.5
Serum glucose(mg/l)
feed	145.4±13.5	237.6±28.6	182.3±21.3
fast	53.5±4.7	187.5±32.3*	137.6±35.5#
Plasma insulin(nU/ml)
feed	45.4±4.6	111.2±12.4	78.9±8.0
fast	27.8±4.6	75.4±6.7*	45.6±7.4

Values are mean ± S.E. for 20 animals.

* : significantly different from normal mice at P<0.05 by t-test.

# : significantly different from control mice at P<0.05 by t-test.

먼저, 실험 동물에 IL-1β을 주사한 다음 1일, 10일, 20일의 각 실험군의 특성을 살펴보았는데 20일의 각 실험군의 특성은 IL-1β주사후 10일의 특징과 별다른 변화가 없었다. 여기에서 주사 후 10일의 특성을 살펴보면, 각 실험군의 식이 섭취량에 있어서 대조군의 식이 섭취량이 정상군에 비하여 유의성 있게 증가되었으며, 수목추출액 투여군에서는 대조군에 비하여 식이 섭취가 감소하였으나 유의성은 없었다. 체중에 있어서는 정상군의 13.3±1.6 g에 비하여 IL-1β으로 당뇨가 유발된 대조군은 1주일 후 23.2±3.4 g으로 유의하게는 증가하였으며, IL-1β주사 후 수목추출액을 투여한 실험군의 경우는 17.5±1.6 g으로 감소하였다. 또한, 공복시의 혈청 중 glucose와 insulin 양이 대조군에서는 정상군에 비하여 모두 유의성 있는 증가를 나타내었으며, 수목추출액 투여군에서는 당뇨병으로 증가된 insulin 양을 유의성 있게 감소시키는 것으로 나타나 당뇨병에 효과가 있음을 시사하였다. 이러한 결과는 비만한 상태에서는 인슐린이 과다 분비된다는 것을 다시 입증한 것이며, 당뇨병이 있는 경우 비만의 발생 빈도가 정상인에 비하여 약 2배 정도 높으며, 체중이 표준보다 증가할수록 당뇨병의 빈도가 높다는 보고와 관련시켜 볼 때 의미하는 바가 크다고 여겨진다.

수목추출액이 혈당 상승에 대하여 어떠한 작용을 나타내는 지를 검토하기 위하여 정상군, 대조군 및 수목추출액 처리군에 glucose를 복강내 주사한 다음 시간별 혈당과 혈청 인슐린 분비 변화를 관찰하였다. 혈당은 정상군에서 glucose가 주사되자마자 증가하여 30분 후 최고치를 나타내다 주사 후 1시간부터 점차 감소하기 시작하여 정상치 수준으로 회복되었으며, 혈청 인슐린도 glucose 주사 후부터 분비되기 시작하여 30분에 최고치를 나타낸 후 점차 정상화하는 경향을 보였다. 그러나 IL-1β으로 당뇨가 유발된 대조군은 기저치의 혈당 자체가 정상군보다 유의성 있게 높았으며 주사 후 30분에 최고치를 기록한 후 점차 감소하였으나 10시간 이후에도 여전히 유의성 있게 혈당이 증가되어 있었다. 혈청 중의 인슐린치는 당부하 이전에 이미 정상군보다 유의성 있게 높았으며, glucose 주사 후 1.5시간 이후에나 인슐린 분비가 최고를 나타내어 초기 인슐린 분비에 심각한 장해가 있음을 시사하였고, 10시간 이후에도 여전히 당부하 이전보다 인슐린 분비가 약 2배 정도 증가되어 있었다. 그 반면, 수목추출액 투여군은 기저치의 혈당과 인슐린치 자체가 대조군보다 현저히 낮았으며 glucose 주사 30분 후 혈당과 인슐린치가 최고에 달한 후 시간이 경과함에 따라 전체적으로 정상군보다는 높지만 대조군에 비해 현저하게 그 수치가 감소하는 것으로 나타나, 당뇨병으로 인하여 높아진 혈당을 정상화하는데 수목추출액이 효과적임을 알 수 있었다.

이상의 결과를 종합하면, 수목추출액은 IL-1β으로 유발된 당뇨병 마우스에서 glucose 인산화 효소인 glucokinase와 hexokinase의 활성을 증가시켜 당뇨병의 치료에 효과가 있을 것으로 여겨진다.

또한, IL-1β주사에 의해 체중과 공복시의 glucose 및 insulin 분비가 증가되었으나, 수목추출액 투여에 의해 공복시의 insulin 분비가 유의성 있게 감소하였으며 체중과 공복시의 glucose는 유의성은 없었으나 대조군에 비하여 감소하였다.

그리고, IL-1β주사에 의해 혈청 중 glucose치가 정상군에 비하여 현저하게 증가되었으나 수목추출액 투여에 의해 현저히 감소되었다. Insulin 치의 상승과 분비 지연도 수목추출액 투여군에서는 정상군과 유사한 경향을 보였다. 이상의 결과로, 수목추출액은 IL-1β로 유발된 당뇨병에서 glucose 인산화 효소인 glucokinase와 hexokinase의 활성을 증가시키는 것으로 나타나 당뇨병의 치료에 현저한 효과가 있었다.

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이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 수목추출액의 제조 공정도이다.

도 2는 본 발명에 따른 수목추출액의 사람 동맥평활근 세푸증식에 미치는 영향을 나타낸 도면이다.

도 3은 본 발명에 따른 TNF-α 처리 사람 동맥평활근 세포에서 수목추출액 분획의 MMP-9 활성에 대한 효과를 나타낸 도면이다.

도 4는 본 발명에 따른 사람 동맥평활근 세포 이주능시험을 나타낸 도면이다.

도 5는 본 발명에 따른 정상간세포주에 대한 수목추출액 독성을 나타낸 도면이다.

도 6은 본 발명에 따른 간암세포주에 대한 수목추출액 독성을 나타낸 도면이다.

Claims (9)

1. 신갈나무 목재 칩을 5 ~ 20배 부피의 물에 넣은 후, 10 ~ 48시간 함침 처리하고 탈수시키는 공정;

   상기 탈수된 목재 칩을 열판 체스트기로 70 ~ 150℃, 30분 ~ 3시간 동안 가열하는 공정;

   상기 가열된 목재 칩과 수증기를 밀폐된 용기 내에 넣고 포화 상태를 유지시킨 후 처리시간 0.1 ~ 1시간, 처리온도 120 ~ 300℃, 압력 10 ~ 40kgf/㎠에서 연화하는 공정;

   상기 연화된 목재 칩을 대기중에 방출하여 팽창된 목재 칩을 얻는 공정;

   상기 팽창된 목재 칩을 50 ~ 200℃의 열수추출기에서 5 ~ 20배 부피의 물에 넣어 0.1 ~ 3시간 동안 약리성분을 추출하는 공정; 및

   상기 약리성분을 분리, 정제, 감압 농축하는 공정;을 포함하는 공정으로부터 수득한 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액.
2. 제1항에 있어서, 상기 탈수 공정 전에, 상기 신갈나무 목재를 벌채하여 수피를 제거하는 박피작업을 한 후, 칩제조기로 잘라 목재 칩을 제조하는 전처리 공정을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액.
3. 제1항에 있어서, 상기 약리성분의 분리 공정은 상기 추출 공정에서 생성된 잔사와 여액을 원심분리기를 사용하여 분리한 후, 여과지를 이용하여 감압 여과하여 잔사를 제거하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액.
4. 제1항에 있어서, 상기 약리성분의 정제 공정은 상기 분리 공정에서 얻어진 수목추출액을 에탄올:물의 9:1 부피비 혼합용제를 사용하여 겔크로마토그래피에서 정제하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액.
5. 제1항에 있어서, 상기 약리성분의 감압 농축하는 공정은 상기 정제 공정에서 얻어진 수목추출액을 30 ~ 80℃에서 감압 농축하는 것을 특징으로 하는 항당뇨 활성을 갖는 수목추출액.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 수목추출액을 유효성분으로 함유하는 당뇨병 치료용 조성물.
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