KR102103423B1 - 프루누스 세라소이데스 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에서는 프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화 및 뇌신경 보호효과가 있음이 밝혀지며, 이를 토대로 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다. 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은, 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는, 뇌신경 보호용 조성물에 관한 것이다.
뇌졸중(腦卒中, stroke)은 뇌의 기능에 부분적 또는 전체적으로 급속한 장애가 발생하여 상당 기간 이상 지속되는 것으로, 뇌혈관의 병 이외에 다른 원인을 찾을 수 없는 경우를 말한다. 한의학에서는 뇌졸중을 ‘중풍(中風)’ 또는 ‘풍(風)’으로도 지칭하는데, 중풍은 뇌졸중에 포함되지 않는 질환도 포함하고 있어 일치하는 개념은 아니다. 뇌졸중은 뇌경색(허혈성 뇌졸중)과 뇌혈관의 파열로 인해 뇌 조직 내부로 혈액이 유출되어 발생하는 뇌출혈(출혈성 뇌졸중)을 모두 포함하는 용어이다.
뇌조직은 평상시 많은 양의 혈류를 공급받고 있으나, 다양한 원인으로 인하여 뇌혈관이 막히는 경우가 발생하여 뇌에 공급되는 혈액량이 감소하면 뇌조직이 기능을 제대로 하지 못하게 된다. 뇌혈류 감소가 일정 시간 이상 지속되면 뇌조직이 괴사되는데, 뇌조직이 괴사되어 회복 불가능한 상태에 이른 것을 뇌경색(cerebral infarction)이라고 한다. 뇌경색(cerebral infarction)에는 뇌혈전증과 뇌색전증이 있다. 혈전증(血栓症)은 혈관의 국소에서 혈액이 굳어져서 혈관을 막는 것을 말하며, 혈전이 생기면 그 혈관의 영역은 혈류가 두절되며, 다른 곳으로부터의 부혈행로에 의한 보상이 충분하지 않으면 그 부위의 뇌조직은 사멸된다. 색전증은 심장 속에 생긴 혈전이 혈류에 의하여 말초(末梢)로 운반되어 말초의 혈관이 막히는 것을 말하며, 색전에 의하여 혈관이 막히면 그 부분의 뇌조직은 사멸한다. 일반적으로 색전이 혈전에 비해 융해되기 쉽고, 혈류가 다시 흐르게 되는 경우가 많은 것으로 알려져 있다.
뇌의 퇴행성 질환(degenerative disease)에는 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 윌슨병(Wilson disease), 파킨슨병(Parkinson disease) 등이 있는데 공통적으로 미만성 뇌위축(diffuse brain atrophy)을 나타낸다. 대뇌피질을 침범하는 퇴행성 질환에는 알츠하이머병과 픽병 등이 있는데 주된 증상은 치매(dementia)이다.
치매는 그 자체가 하나의 질환을 의미하는 것은 아니고, 여러 가지 원인에 의한 뇌손상에 의해 기억력을 위시한 여러 인지기능의 장애가 생겨 예전 수준의 일상생활을 유지할 수 없는 상태를 의미하는 포괄적인 용어이다. 치매는 일단 정상적으로 성숙한 뇌가 후천적인 외상이나 질병 등 외인에 의하여 손상 또는 파괴되어 전반적으로 지능, 학습, 언어 등의 인지기능과 고등 정신기능이 떨어지는 복합적인 증상을 말한다. 치매의 원인 중 가장 흔한 것은 알츠하이머병(AD; Alzheimer's dementia)으로 약 50-60%를 차지하고, 그 다음으로는 혈관성 치매(VaD; Vascular dementia)가 20-30%를 차지하며, 나머지 10-30%는 기타 원인에 의한 치매이다. 혈관성 치매는 뇌경색 또는 뇌출혈 등의 뇌혈관질환으로 뇌혈관이 막히거나 좁아져 발생한다.
뇌의 퇴행성 질환에 적용하는 약제로는 타크린(Tacrine)과 같은 아세틸콜린 분해효소 억제제(acetylcholinesterase-inhibiting drugs), 활성산소에 의한 뇌 세포의 파괴를 억제하는 비타민 E, 셀레질린(selegiline)과 같은 항산화제 등이 있다. 그러나 지금까지 개발된 약제들은 효능이 충분하지 않으며 상당 수 부작용을 수반하는 것으로 알려져 있다.
또한, 위와 같은 퇴행성 질환까지는 아니더라도 기억력 및 집중력 감퇴를 호소하는 일반인이 늘고 있다. 따라서 부작용은 없거나 최소화하면서 뇌의 기능과 기억력을 개선시킬 수 있는 약물이 요구되고 있다.
뉴로글로빈(Neuroglobin, Ngb)은 neuron에서 발견된 globin의 subtype으로 신경세포내의 O2를 감지하고 결합하여 운반하는 기능을 가지고 있으며, 활성산소종(ROS)의 scavenge 에 관여한다. Ngb가 신경재생을 촉진시킴이 보고된 바 있으며, 신경분화의 매우 초기단계에서 발현되며 미토콘드리아 기능과 ATP 생성을 보존함으로써 신경재생을 촉진시킬 수 있음이 확인되었다. 또한, Ngb는 정상 생리조건에서 뇌조직에 산소 운반기능을 통하여 세포호홉에서 중요한 역할을 담당하지만 뇌손상 시에는 내인적인 신경보호작용을 나타내며 이에 대한 작용기전으로 G-protein coupled receptor의 신호 형질도입(signal transduction)에 관여하며, 미토콘드리아에서 cytochrome C의 전자 전달에 의해 세포자멸(apoptosis), 세포의 생존(cell survival)을 조절하는 것으로 알려져 있다. Ngb는 특히 뇌신경세포에 선택적으로 높게 발현되며 내인성 신경보호인자일 뿐 아니라 신경재생 촉진기능도 동시에 지니므로 알츠하이머나 뇌졸중에 대하여 보호적인 역할을 하는 것으로 보고되었다(Greenberg et al., 2008) (Yu et al., 2013B). 이러한 Ngb는 약물학적으로 조절이 가능한 표적이므로 약물을 통한 Ngb 신호 증진은 뇌보호 치료에 매우 효과적이고 유용할 것으로 기대된다(Jin et al., 2011).
한편, 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)는 장미과(Rosaceae) 살구속(Prunus)의 식물로서 본 발명에서 실험에 사용한 프루누스 세라소이데스는 해외생물소재허브센터로부터 분양받은 것이다. 프루누스 세라소이데스는 wild Himalayan cherry 또는 sour cherry로도 불린다. 북부 인도 Himachal Pradesh 지방에서 히말라야 산맥, 중국 남서부, Burma 지방, 태국 등지에 서식 하는 것으로 알려져 있다. 프루누스 세라소이데스 식물 가지의 수용성 추출물은 유산(abortion)을 막는 용도로 인도에서 사용된다고 보고되었다(Kirtkar, K.R et al., 1975). 프루누스 세라소이데스가 flavonoid, steroids, terpene 등을 함유하는 것은 기존 연구에 의해 밝혀져 있다. Flavone 계열로서 glucogenkwanin을 함유하며 flavanone으로서 naringenin을 함유하며 Isoflavonoid 로서 genistein과 prunetin을 함유한다. Steroid와 terpene 으로서 β-sitosterol 과 ursoric asid 등이 있다. 프루누스 세라소이데스로부터 동정된 성분들에 대한 연구로서 naringenin, prunetin, β-sitosterol, ursolic acid 에 대한 연구들이 있다(Kim S et al., 2013) (Tsutsui T et al., 2003) (Touillaud MS et al., 2005) (Gu G et al., 2012).
Khan AA, Mao XO, Banwait S, DerMardirossian CM, Bokoch GM, Jin K, Greenberg DA.; Regulation of hypoxic neuronal death signaling by neuroglobin; FASEBJ. 2008 Jun;22(6):1737-47.
Yu Z, Poppe JL, Wang X.; Mitochondrial mechanisms of neuroglobin's neuroprotection; Oxid Med Cell Longev. 2013;2013:756989.
Jin K, Mao XO, Xie L, John V, Greenberg DA.; Pharmacological induction of neuroglobin expression; Pharmacology. 2011;87(1-2):81-4.
Kirtkar KR, Basu BD.; Indian Medicinal Plants, M/s Periodicals, New Delhi, 1975;2:959.
Kim S, Park TI.; Naringenin: a partial agonist on estrogen receptor in T47D-KBluc breast cancer cells; Int J Clin Exp Med. 2013 Oct 25;6(10):890-9.
Tsutsui T, Tamura Y, Yagi E, Someya H, Hori I, Metzler M, Barrett JC.; Cell-transforming activity and mutagenicity of 5 phytoestrogens in cultured mammalian cells; Int J Cancer. 2003 Jun 20;105(3):312-20.
Touillaud MS, Pillow PC, Jakovljevic J, Bondy ML, Singletary SE, Li D, Chang S.; Effect of dietary intake of phytoestrogens on estrogen receptor status in premenopausal women with breast cancer; Nutr Cancer. 2005;51(2):162-9.
Gu G, Barone I, Gelsomino L, Giordano C, Bonofiglio D, Statti G, Menichini F, Catalano S, Ando S.; Oldenlandia diffusa extracts exert antiproliferative and apoptotic effects on human breast cancer cells through ERα/Sp1-mediated p53 activation; J Cell Physiol. 2012 Oct;227(10):3363-72.
본 발명은 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호 효과가 있는 뇌신경 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 및 분획물에 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한 뇌신경 보호 효과가 있음을 밝히고, 이를 토대로 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 신경보호 효능을 나타낸다는 것은 본 발명에서 처음 발견된 것으로, 본 발명에서는 프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해 신경보호효능을 나타낸다는 것을 증명한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는,
프루누스 세라소이데스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민의 치료 및 예방; 뇌손상 보호; 뇌기능 개선; 뇌신경세포 보호 중 하나 이상을 위한 뇌신경 보호용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명에서는,
프루누스 세라소이데스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통해, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민의 개선 및 예방; 뇌손상 보호; 뇌기능 개선; 뇌신경세포 보호 중 하나 이상을 위한 뇌신경 보호용 식품 조성물을 제공한다.
상기 조성물에서 프루누스 세라소이데스 추출물은 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것이다.
상기 식품 조성물에서 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다. 또한, 상기 식품은 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서는 프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화, 이를 통한 뇌신경 보호효과가 있음을 규명하였다. 본 발명은 이러한 결과를 토대로, 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다.
도 1은 Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 SKNSH 세포에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험한 결과로, 프루누스 세라소이데스 추출물에 의한 Ngb 유전자 전사활성 증가를 보여주고 있다.
도 2는 Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 N2a 세포에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험한 결과로, 프루누스 세라소이데스 추출물에 의한 Ngb 유전자 전사활성 증가를 보여주고 있다.
도 3은 Vehicle(0.1% DMSO), 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리한 N2a 세포에서 Ngb 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과로, 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-7 ~ 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 유의적으로 증가시키는 결과를 보여주고 있다.
도 5는 시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 분획물의 신경보호효과를 확인한 결과로, 프루누스 세라소이데스 분획물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도 및 세포 독성도를 효과적으로 개선시키는 결과를 보여주고 있다.
도 6은 생쥐 뇌졸중모델에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 뇌졸중에 의한 뇌경색을 감소시키는지를 실험한 결과로, 중뇌동맥 45분 폐색, 24시간의 재관류 후에 뇌경색의 크기를 측정한 결과이다.
도 7은 난소를 적출한 female rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 5주 동안 경구 투여한 후 확인한 뇌조직에서의 E2-반응성 Ngb 단백질량 발현 변화 결과이다.
도 8은 난소적출한 rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 경구투여하여 혈중 지질 및 당대사 변화를 측정한 결과이다.
도 9는 난소적출한 rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 경구투여하여 혈중 간수치 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 프루누스 세라소이데스 추출물이 우울 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가한 결과로, (A)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 십자형 높은 미로 실험 결과이며, (B)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (C)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 rotarod 실험 결과이다.
도 11은 프루누스 세라소이데스 추출물이 우울 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가한 결과로, (A)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (B)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (C)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 강제수영실험 결과이며, (D)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 꼬리매달기 실험 결과이다.
도 2는 Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 N2a 세포에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험한 결과로, 프루누스 세라소이데스 추출물에 의한 Ngb 유전자 전사활성 증가를 보여주고 있다.
도 3은 Vehicle(0.1% DMSO), 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리한 N2a 세포에서 Ngb 유전자 발현을 확인한 결과이다.
도 4는 시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과로, 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-7 ~ 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 유의적으로 증가시키는 결과를 보여주고 있다.
도 5는 시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 분획물의 신경보호효과를 확인한 결과로, 프루누스 세라소이데스 분획물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도 및 세포 독성도를 효과적으로 개선시키는 결과를 보여주고 있다.
도 6은 생쥐 뇌졸중모델에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 뇌졸중에 의한 뇌경색을 감소시키는지를 실험한 결과로, 중뇌동맥 45분 폐색, 24시간의 재관류 후에 뇌경색의 크기를 측정한 결과이다.
도 7은 난소를 적출한 female rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 5주 동안 경구 투여한 후 확인한 뇌조직에서의 E2-반응성 Ngb 단백질량 발현 변화 결과이다.
도 8은 난소적출한 rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 경구투여하여 혈중 지질 및 당대사 변화를 측정한 결과이다.
도 9는 난소적출한 rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 경구투여하여 혈중 간수치 변화를 측정한 결과이다.
도 10은 프루누스 세라소이데스 추출물이 우울 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가한 결과로, (A)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 십자형 높은 미로 실험 결과이며, (B)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (C)는 2주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 rotarod 실험 결과이다.
도 11은 프루누스 세라소이데스 추출물이 우울 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가한 결과로, (A)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (B)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 개방장 시험 결과이며, (C)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 강제수영실험 결과이며, (D)는 4주 동안 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여한 후 꼬리매달기 실험 결과이다.
본 발명에서는 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 및 이의 분획물에 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한 뇌신경 보호 효과가 있음을 밝힌다. 또한, 본 발명에서는 이러한 결과를 토대로 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides)의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하는, 뇌신경 보호용 조성물을 제공한다.
프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물
본 발명에서 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides) 추출물은, 바람직하게는 물, 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 유기용매를 사용하여 10~80℃에서 추출하여 얻을 수 있다. 더욱 바람직하게는 프루누스 세라소이데스에 추출용매를 가하여 추출하는 단계; 추출물을 여과하는 단계; 여과물을 감압 농축하는 단계; 및 필요에 따라 농축물을 건조하는 단계를 포함하는 방법으로 얻을 수 있다. 또한 이렇게 얻어진 추출물로부터 분획물을 얻을 수 있다. 각각의 단계를 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다.
1) 추출하는 단계
프루누스 세라소이데스의 수피, 목부, 잎의 혼합물에 추출용매를 가하여 추출한다. 이때 추출용매로는 물, 알코올 또는 탄소수 1 내지 4의 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 물 또는 탄소수 1 내지 3의 저급 알코올 사용한다. 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용한다. 추출용매는 건조된 프루누스 세라소이데스 분량의 1 내지 20배를 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 5 내지 15배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, 속실렛(soxhlet) 추출, 환류 추출, 초음파발생장치를 이용한 초음파 추출, 자동 추출기 등의 방법을 이용할 수 있다. 추출 온도는 바람직하게는 10~80℃이고, 더욱 바람직하게는 20℃~70℃이며, 가장 바람직하게는 30℃~60℃이다. 추출시간은 한정되지는 않으나, 초음파 추출의 경우 바람직하게는 50 ℃에서 2~4일간 추출하며, 자동 추출기를 사용할 경우에는 20±5 분간 추출한다. 자동 추출기로는, 예를 들어, ASE300 가속화 추출기(DIONEX Corporation) 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에서는 95% 이상의 메탄올을 사용하여 50℃에서 2~4일간 초음파 추출한다. 또 다른 바람직한 실시예로서, ASE300 가속화 추출기(DIONEX Corporation)를 사용할 경우 N2 가스를 사용하여 50 ℃, 1500 psi에서 20분간 추출한다.
2) 여과하는 단계
다공성(多孔性) 여과재를 사용하여 상기 단계에서 얻은 추출물을 여과한다. 여과는 고형분, 이물질 등을 걸러내기 위한 것으로 이러한 용도에 적합한 여과재라면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 여과지, 유리여과기, 유리섬유, 면, 솜, 나일론, 다공성 금속, 금속섬유 등이 사용될 수 있다.
3) 감압 농축하는 단계
여과 후 오래방치하면 침전물이 생길 수 있으므로 바로 농축하는 것이 바람직하다. 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 회전증발기 등을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지는 않는다. 완전히 감압 농축한 후 그대로 바이알 등에 넣고 감압 밀봉하거나 아래의 건조단계를 더 거친 후 밀봉, 보관할 수 있다.
4) 건조하는 단계
농축 후 필요에 따라 건조단계를 더 추가할 수 있다. 건조 방법은 특별히 한정되지는 않으나, 바람직하게는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 동결건조하는 등의 방법을 이용할 수 있다.
5) 분획물을 얻는 단계
분획물은 상기와 같은 방법으로 줄기와 잎에 대해 각각 추출물을 얻은 후 얻어진 추출물을 메탄올 용매로 용출되는 개방형 컬럼에 적용하여 얻었다. 줄기 추출물과 잎 추출물에 대해 각각 16개 분획 및 15개 분획을 얻었다.
유효성 확인
본 발명에서는, 유전자 리포터 평가시험(Neuroglobin 반응성 유전자 전사실험), 세포내 내재 호르몬 반응성 표적 유전자의 전사활성에 대한 효과 평가, 저산소 유발(Oxygen glucose deprivation, OGD)에서의 세포 독성 및 생존도를 통한 신경보호작용 평가, 중뇌동맥폐색 수술(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)을 통한 생체 허혈성 뇌졸중 모델에서의 신경보호 효과 평가, 난소적출술(Ovariectomy, OVX)을 받은 동물모델에서의 Ngb 단백질 발현량 변화를 통한 신경보호 효과 평가, 난소적출술(Ovariectomy, OVX)을 받은 동물모델에서의 혈중 대사 마커와 간수치에 미치는 효과 평가, 추출물을 투여 받은 동물모델에서의 행동학적 신경 보호에 미치는 효과 평가를 실시하였다.
이러한 실험을 통해 본 발명에서는, 프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 뉴로글로빈(Ngb) 활성화, 신경보호효과, 뇌경색크기 감소를 통한 뇌보호 효과, Ngb의 발현양 증가를 통한 뇌보호 효과, 중성지방 수치와 간수치 개선에 효과, 우울, 불안 및 운동성에 대한 신경행동학적 증상 개선 효과가 있음을 밝혔다. 프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물이 신경보호 효능을 나타낸다는 것이나 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 나타낸다는 것은 본 발명에서 처음 발견되고 증명된 것이다.
또한, 본 발명에서는 프루누스 세라소이데스 추출물의 급성 독성 실험을 통해 안전성을 확인하였다.
이러한 실험결과를 토대로, 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은, 뉴로글로빈(Ngb) 활성화를 통한, 뇌졸중, 뇌경색, 혈전증, 뇌 퇴행성 질환, 혈관성 치매, 기억력 감퇴, 단기 기억장애, 집중장애, 불안, 신경과민 등의 치료, 개선 및 예방, 뇌손상 보호, 뇌기능 개선, 뇌신경세포 보호를 위한 약학적 조성물 또는 식품 조성물로 이용될 수 있다.
또한, 최근에는 신경세포에서 Ngb와 여성호르몬 수용체(ER)와의 신호연관성이 보고되고 있다. 에스트로겐 유도성 뉴로글로빈의 작용이 De Marinis 그룹에 의하여 신경세포에서 처음 보고된 이후(De Marinis, Ascenzi et al. 2010), 신경세포(SKNBE, NT2)에서 에스트로겐-estrogen receptor(ER)α 결합에 의한 Ngb의 발현 증가가 보고되었으며(Guglielmotto, Reineri et al. 2016), ERβ를 경유하는 p38 MAPK 신호매개에 의한 Ngb 유도증가가 밝혀졌다(De Marinis, Marino et al. 2011). 또한 ERβ의 작용기전으로서 미토콘드리아 호홉촉진 작용이 최근에 보고되고 있어(Ponnusamy, Tran et al. 2016), 미토콘드리아에서 Ngb와 ERβ의 상호작용에 대한 가능성이 매우 높을 것으로 예측된다. Bioinformatics 정보에 의하면 Ngb는 주로 뇌의 특정부위(locus coeruleus, occipital cortex, lobe amygdala), 경동맥, 심장근육세포에서 발현이 높을 것으로 평가되므로(Guglielmotto, Reineri et al. 2016), Ngb는 여성의 뇌, 심혈관질환 연구를 위하여 매우 직접적인 치료 타겟임을 확인할 수 있고, 특히 페경기 여성의 뇌 및 심혈관질환 연구에서 매우 효과적이고 민감한 타겟이 될 수 있다고 예측된다. 따라서 본 발명의 뇌신경 보호용 조성물은 여성, 특히 갱년기 여성의 뇌신경 보호에 특히 적합하게 이용될 수 있으며, 뇌신경과 관련한 갱년기 증상의 완화에도 이용될 수 있다.
약학적 조성물
본 발명의 뇌신경 보호용 약학적 조성물은 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 이밖에 다른 약학적 활성 성분이나 활성 혼합물을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (Witepsol), 마크로골, 트윈 (Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 상기 프루누스 세라소이데스 추출물을 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg 으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (Intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다.
식품 조성물
본 발명의 뇌신경 보호용 식품 조성물은 상기 프루누스 세라소이데스(Prunus cerasoides) 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 포함한다.
상기 식품 조성물은 총 중량 중에 상기 유효성분을 0.0001 내지 20 중량%로 포함한다.
상기 식품은 특히 건강기능식품을 포함한다. 본 발명에서 정의되는 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다. 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 다양한 식품 또는 음료 등에 기능성 성분을 첨가한 형태의 식품 조성물이 될 수 있다. 상기 식품은, 예를 들어, 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 가질 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 필수 성분으로 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 식품이나 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등의 다양한 성분을 추가로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 그리고 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 그리고 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 식품 조성물 전체 중량 중 0 내지 약 20 중량%의 범위에서 선택되는 것이 좋다.
이하 구체적인 실험예 및 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나 이들 실험예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
프루누스 세라소이데스 추출물 및 분획물의 제조
추출용매로 메탄올 99.9%를 사용하였으며, 초음파 추출기(BRANSON사)를 사용하였다.
그늘에서 잘 말린 프루누스 세라소이데스 시료의 수피, 목부, 잎의 혼합물 200g에 대해 메탄올 1.5L를 사용하여 50 ℃에서 3 일간 추출하였다. {(초음파 분쇄 15 분, 장소 2 시간)×10 회/ 일} × 3 일.
추출 후 탈지 된 면봉 깔때기를 통해 고형 물질을 걸러 냈다. 여과 후 오래방치하면 침전물이 생기므로 바로 여액을 45℃에서 완전히 감압 농축하였다. 감압 농축된 시료를 바이알에 밀봉하여 저온실 (-4 ℃)에 보관하면서 실험에 사용하였다.
또한, 상기와 같은 방법으로 줄기와 잎에 대해 각각 추출물을 얻은 후 얻어진 줄기 추출물과 잎 추출물을 메탄올 용매로 용출되는 개방형 컬럼에 적용하여 각각 16개 분획 및 15개 분획을 얻었다. 이 분획물들을 실험에 사용하였다.
실험방법
1. 유전자 리포터 평가시험: Neuroglobin(Ngb) 반응성 유전자 전사실험
Ngb-luciferase assay를 위해서 Ngb gene을 과발현시키고 promoter plasmid를 통해 형질주입시킨 human neuroblastoma(신경아세포종) 세포주(SKNSH)와 mouse neuroblastoma cell(N2a)을 이용했다. Seeding할 때에 세포를 10% FBS DMEM 배지에서 배양하며, 3 × 104 cells/well의 농도로 96-well plate에 seeding 했다. 세포가 약 45-50% confluency에 도달했을 때 2% FBS DMEM 배지로 갈아주었다. Ngb-luciferase assay의 경우 세포가 약 80% confluency에 도달했을 때 약처리를 진행하며 negative control군으로서 0.1% Dimethyl Sulfoxide(DMSO)와 다양한 농도의 프루누스 세라소이데스(DMSO에 용해된 stock solution)를 배지에 희석시킨 후 배양세포에 처리했다. 24시간 배양 후 세포 배양을 종료하고 Passive Lysis Buffer(Promega, USA)를 이용하여 수용성 세포추출물을 얻었다. 여기에 존재하는 luciferase의 활성도는 Luciferase Assay System(Promega; luciferase의 기질 및 반응 완충액 포함)과 Luminometer(ELISA reader, Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 정량적으로 측정했다. 시험물질이 나타내는 유전자 활성도는 negative control(0.1% DMSO)이 나타내는 활성도를 100%로 정하여 그 상대적인 활성정도를 나타내어 최종 비교 평가했다.
2. 세포내 내재 호르몬 반응성 표적 유전자의 전사활성에 대한 효과 평가
Mouse neuroblastoma cell(N2a)에 vehicle(0.1% DMSO), 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리한 후 Trizol을 이용하여 mRNA를 추출했다. iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad) 또는 superscript Ⅱ reverse transcriptase kit(Invitrogen) 또는 ReverTra Ace® qPCR RT Master Mix with gDNA Remover(TOYOBO)를 이용하여 일정량의 mRNA (0.5-1μg)를 역전사 반응하여 cDNA를 얻었다. cDNA, 표적 유전자의 cDNA를 인식할 수 있는 한 쌍의 프라이머와 PCR SYBR green kit(Qiagen) 시약을 이용하여 실시간(real-time) PCR을 수행하여 해당 유전자의 발현 량을 정량적으로 측정했다. 여러 단계의 반응에 대한 기술적인 실수를 보완하기 위하여 housekeeping 유전자인 GAPDH에 대한 발현 량을 동시에 측정하며, 이 유전자의 발현 량과 표적유전자의 발현 량의 비를 최종적인 정량 분석에 사용했다.
GAPDH를 인식하는 프라이머는 forward 5‘-CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC 그리고 reverse 5’-TGAGCGATGTGGCTCGGCT이다. 신경보호성의 표적유전자로서 human Ngb(hNgb)의 발현도를 측정하였다. Real-time RT PCR 반응을 위해서 hNgb를 인식하는 primer는 forward 5’-TGGAAGACCTGTCCTTCACTG 그리고 reverse 5’-GAGCAGAGACTCACCCACTG이다. Real-time PCR은 약 40 cycle (95°C; 15초, 60°C; 60초)로 수행하였다. 각각의 유전자 발현 곡선을 logarithm으로 표현한 후 threshold cycle(CT) 값을 수학적으로 얻었다. 이 값을 2-△△CT 대입하여 얻어진 값이 특정 유전자의 상대적인 발현량을 나타낸다. 특정유전자의 발현량을 house keeping 유전자의 발현량으로 나눈 값을 해당 유전자 발현량에 대한 최종값으로서 선택하여 vehicle과 시험물질의 처리값을 상대적으로 비교하였다.
3. 저산소유발(oxygen glucose deprivation,
OGD
)에서의 세포 독성 및
생존도를
통해 신경보호작용 평가
Mouse neuroblastoma cell(N2a)과 primary cortical neuron cell을 산소를 고갈시킨 anerobic chamber(PlasLabs)에 넣어 각각 8시간, 3시간의 OGD를 실시했다. Primary cortical neuron cell의 경우, 14 - 16일 임신 쥐의 태아에서 분리해낸 cortex에서 현미경을 이용하여 neuron의 pure layer 층을 얻고 15분간 trypsin 처리하고 horse serum을 넣은 후 원심분리하여 growth medium을 이용해 cortical neuron으로 분리하였다. 24well plate를 poly-D-lysine으로 코팅하여 primary neuron을 seeding하고, 2-3일에 한번씩 2%의 B-27이 첨가된 neurobasal medium으로 교체하였다. 세포는 37℃ in 95% air/ 5% CO2가 포함된 incubator에서 6-7일간 배양한 후 약물을 처리하였다. OGD 유발용액은 NaCl(110mM), KCl(5mM), CaCl2(1.8mM), NaHCO3(44mM), MgSO4(0.8mM)을 포함하며 glucose와 혈장이 포함되지 않았고 pH는 7.4를 유지했다. Primary cortical neuron cell의 경우, OGD 유발 하루 전날, 1% B-27이 첨가된 neurobasal medium에 vehicle(0.1% DMSO), 프루누스 세라소이데스 추출물과 분획물을 처리하였다. 세포배양 plate의 well을 1회 세척하고 약물을 처리한 neurobasal medium을 세포에 처리하였으며 24시간 후, plate의 well을 1회 세척하고 OGD 용액을 처리하여 90% 질소, 5% 수소와 5% 이산화탄소의 혼합가스를 30분 이상 통과시켜서 bubbling 용액 내에 산소를 완전히 제거하였다. N2a cell의 경우, 세포배양 plate의 well을 1회 세척하고 약물을 처리한 OGD 용액을 세포에 처리한 직후 90% 질소, 5% 수소와 5% 이산화탄소의 혼합가스를 30분 이상 통과시켜서 bubbling 용액 내에 산소를 완전히 제거하였다. 일정 시간 후 primary cortical neuron cell의 경우 2% B-27이 첨가된 neurobasal medium, N2a cell의 경우 glucose와 혈장이 포함된 DMEM을 처리하고 incubator로 옮겨 24시간동안 reperfusion하여 경시적 변화를 WST assay kit(Dojindo)와 LDH assay kit(Biovision)를 통해 확인했다. 24시간의 reperfusion 후 plate의 well에서 media를 취하여 WST assay를 수행, 450nm의 흡광도 측정값을 통해 세포 생존도를 평가하거나 LDH assay를 수행, 490nm와 600nm의 흡광도 측정값을 통해 세포 독성도를 평가하였다. 시험물질이 나타내는 세포 생존도 및 독성도는 vehicle(0.1% DMSO)이 나타내는 생존도 및 독성도를 100%로 정하여 그 상대적인 활성도를 나타내어 최종 비교 평가했다.
4.
중뇌동맥폐색
수술(middle cerebral artery occlusion,
MCAO
)을 통한 생체 허혈성 뇌졸중모델에서의 신경보호 효과 평가
뇌혈관 폐색과 재관류에 의한 뇌조직의 산화적 손상에서의 신경보호효과를 평가하기 위해 mouse MCAO 수술을 실시하여 뇌졸중 모델을 구축했다. 10주령 female CD1 mouse의 정중경부를 절개하여 외경동맥(external carotid artery, ECA)을 노출시킨 후, 나일론 봉합사를 외경동맥을 통해 내경동맥(internal carotid artery, ICA)으로 삽입하여 중대뇌동맥(middle cerebral artery, MCA)을 폐색시켰다. 45분 후 나일론 봉합사를 제거하여 혈류를 회복시켜 ischemia/reperfusion damage를 유발하여 일과성 국소허혈 모델이 제작되었음을 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC) 염색을 통하여 확인했다.
실험동물을 vehicle(0.9% Nacl solution, saline) 그룹과 프루누스 세라소이데스(250 mg/kg) 추출물 그룹으로 나누었다. MCAO 수술이 진행되기 전 두 그룹의 약물투여를 24시간 간격으로 4주 동안 복강내주사로 진행했으며 투여 후 MCAO 수술을 실시, 하루 뒤 쥐의 뇌조직을 얻어 뇌경색크기를 측정했다. 시험물질이 나타내는 뇌경색크기의 변화는 vehicle(0.9% Nacl solution, saline)그룹이 나타내는 뇌경색크기를 기준으로 하여 상대적인 뇌경색크기 변화를 측정하여 최종 비교 평가했다.
5. 난소적출술(ovariectomy,
OVX
)을 받은 동물모델에서의
Ngb
단백질 발현량 변화를 통한 신경보호 효과 평가
난소를 적출한 랫트에 약물을 경구투여하여 뇌조직에서의 Ngb 단백질 발현 변화에 미치는 효과를 연구하였다. 폐경기 여성의 뇌 보호 효과를 확인하기 위하여 9주령 female SD rat의 ovary를 ectomy 하여 폐경기 여성과 유사한 호르몬 환경을 만들었다. 8주령 female SD rat을 구입하고 1주간 적응기간을 두었다. rat를 isoflurane으로 마취를 하고, 마취상태에서 복부를 절개해서 난소를 적출하였다. 난소 적출 후, 진통제인 ketoprofen 0.2 mg/kg을 투여하였고 수술이 끝나면 케이지에 3마리씩 넣어 2주 동안의 회복기 및 혈중에스트로겐 wash-out을 거쳤다. 실험결과에 영향을 주지 않도록 phytoestrogen이 제한된 사료(Harlan 2020X Teklad Global Soy Protein-Free Extruded Rodent Diet)를 투여하였다. 회복기를 거친 rat을 Sham (no OVX), OVX control, 저농도 프루누스 세라소이데스 추출물 투여군, 고농도 프루누스 세라소이데스 추출물 투여군으로 군당 9-10마리가 되도록 나누었다. 5주 동안 Sham (no OVX), OVX control군에는 조제사료를, 저농도 추출물 투여군에는 식물추출물 250 mg/kg을, 고농도 추출물 투여군에는 식물추출물 500 mg/kg을 배합한 조제사료를 배급했다. 이때, rat의 1마리당 20-25g의 먹이를 배급하여 정량의 성분이 제공될 수 있도록 하고, 매주 체중을 측정하여 Rat의 체중변화를 관찰하였다. 5주간의 경구투여가 끝나면 24시간 동안 금식을 시킨 후, isoflurane으로 마취하여 희생시키고 뇌 조직을 적출하여 단백질을 분리하였다. 쥐의 뇌 조직에 프로테아제 저해제(protease inhibitor) 및 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitor)를 넣은 lysis buffer를 가해 단백질을 분리하고 추출한 단백질을 BCA 법으로 정량하여 50μg 씩 7.5% SDS-PAGE gel 에 80V에서 2시간 전기영동하였다. 전기영동 후 25V에서 3시간 PVDF membrane에 transfer한 다음 탈지우유(skim milk)를 녹인 인산완충생리식염수(phosphate buffered saline, PBS)로 RT에서 1시간 blocking 하고 primary 및 secondary antibody와 반응시켜 ECL 용액으로 확인하였다. 이때 primary antibody는 Ngb(RD181043050, BIOVENDER)를 1:1000 비율로 희석하여 사용했다. 실험상의 오류에 의한 단백질 양의 차이를 보정하기 위해 β-actin을 사용하였다.
6. 난소적출술(ovariectomy,
OVX
)을 받은 동물모델에서의 혈중 대사
마커와
간수치에
미치는 효과 연구
앞의 실험방법에서 사용한 것과 동일하게 난소적출된 rat에 추출물을 경구투여하여 혈중 대사 마커 및 간수치의 변화에 미치는 효과를 연구하였다. 5주간의 경구투여가 끝나면 24시간동안 금식을 시킨 후, isoflurane로 마취하여 심장에서 4~5 ml 정도 혈액샘플을 채취하였다. 채취한 혈액 샘플을 3500 rpm (15분, 4℃) 으로 원심분리하여 혈장 샘플을 얻은 후, 4℃에 보관하고, 1-2일 내에 분석 기관에 의뢰하여 혈액 내 lipid profile을 분석했다.
7.
약물을 투여 받은
동물모델에서의 행동학적 신경 보호에 미치는 효과 연구
약물을 복강내주사하여 우울증 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화를 평가하였다. 10주령 female C57bL/6 mouse와 10개월령 female C57bL/6 mouse를 vehicle(0.9% Nacl solution, saline), 프루누스 세라소이데스(250 mg/kg) 추출물 투여군으로 나누었다. 총 4 그룹의 약물투여는 24시간 간격으로 4주 동안 복강내주사로 진행했으며 2주와 4주 투여 후, 개방장 시험, 십자형 높은 미로, 꼬리 매달기 실험, 강제수영실험, rotarod 등의 행동실험을 실시하였다. 행동실험이 진행되는 동안 녹화를 하여 실험 후, 동영상을 분석 및 평가하였고 시험물질이 나타내는 행동학적 변화는 vehicle(0.9% Nacl solution, saline) 투여군이 나타내는 행동학적 수치를 기준으로 하여 상대적인 행동학적 변화를 분석, 최종 비교 평가하였다.
8. 추출물의
단회
투여 급성 독성 실험을 통한 안전성 효과 평가
식물 추출물의 임상 적용 가능성을 높이기 위해 단회 투여 급성 독성실험을 수행하였다. 10주령 female CD1 mouse를 이용하였고 투여 24h 전부터 절식시켰다. vehicle(1% CMC in saline), 추출물 250mg/ kg, 500mg/ kg, 1000mg/ kg 용량을 단회경구투여 하여 체중변화, 행동 관찰 및 사망률을 측정하였다. 총 2주간 실험하였으며 투여 volume은 5μl/g 이내로 하였다.
결과
1.
프루누스
세라소이데스
추출물의
Ngb
반응 유전자를 통한
SKNSH
세포와
N2a
세포내
전사 활성 분석
Ngb-luc plasmid를 transfection 시킨 SKNSH와 N2a 세포에서 프루누스 세라소이데스 추출물이 Ngb 유전자 전사 활성을 변화시키는지 실험하였고 결과는 도 1 및 2와 같다. 프루누스 세라소이데스 추출물을 5 x 10-6 g/ml ~ 5 x 10-5 g/ml 농도로 SKNSH 세포에 처리했을 때, 모든 농도에서 통계적으로 유의하게 vehicle에 비해 Ngb 유전자의 전사 활성을 약 1.4배 ~ 1.6배 증가시켰다(** p < 0.01)(도 1). 프루누스 세라소이데스 추출물을 5 x 10-6 g/ml ~ 5 x 10-5 g/ml 농도로 N2a 세포에 처리해주었을 때, 5 x 10-5 g/ml 농도에서 통계적으로 유의하게 Ngb 유전자의 전사 활성을 약 1.4배 증가시켰다 (*** p < 0.001, ** p < 0.01)(도 2). 본 실험결과를 통하여 유전자의 전사 작용 시 프루누스 세라소이데스 추출물이 5 x 10-5 g/㎖의 농도에서 Ngb 전사 활성을 유도함을 알 수 있었으며 추출물이 두 가지 세포종에 대해서 Vehicle(Veh)보다 높은 Ngb 전사 활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
2.
프루누스
세라소이데스
추출물의
N2a
세포에서의
Ngb
유전자 발현 유도
Vehicle(0.1% DMSO), 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리한 N2a 세포에서 Ngb 유전자 발현을 확인하였다. 결과는 도 3과 같다. 프루누스 세라소이데스 추출물을 N2a 세포에 10-7 g/ml ~ 10-6 g/ml 농도로 처리해주었을 때, 10-6g/ml 농도에서 Ngb 유전자의 발현이 유의하게 약 2배 증가하였다(도 3). 이러한 실험 결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물이 Ngb 유전자 발현을 유도시키는 것으로 확인되었다.
3.
프루누스
세라소이데스
추출물과
분획물의
저산소유발 세포에 대한 신경보호효과
시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 추출물의 신경보호효과를 확인한 결과, N2a 세포에 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리해준 경우 저산소배양 조건의 10-7 ~ 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 유의적으로 증가시켰고, primary cortical neuron 세포에 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리해준 경우 저산소 배양 조건의 10-6 g/ml 농도에서 세포 생존도를 약 2배 증가시켰다(도 4).
시험관 저산소증 모델에서의 프루누스 세라소이데스 분획물의 신경보호효과를 확인한 결과, primary cortical neuron 세포에 프루누스 세라소이데스 분획물을 처리해준 경우 저산소 배양조건의 10-5 g/ml 농도에서 줄기 분획물 3, 5, 6, 10, 11, 12, 14, 16과 잎 분획물 6, 7, 8, 9, 11, 14가 유의성 있게 세포 독성을 10 - 30% 감소시켰다(도 5). 본 실험 결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물과 분획물이 저산소 배양 상태에서의 세포 생존도의 증가와 독성도 감소에 효과가 있음을 확인 할 수 있었으며, 신경보호효과가 우수한 것으로 평가되었다(도 4, 5).
4.
프루누스
세라소이데스의
뇌경색크기 감소를 통한
뇌보호
효과
프루누스 세라소이데스 추출물이 뇌졸중에 의한 뇌경색 감소와 같은 뇌 보호 작용을 나타내는지 확인하기 위해 female CD1 mouse에 4주간 복강내주사로 약물 투여를 하였다. 중뇌동맥 45분 폐색, 24시간의 재관류 후에 뇌경색의 크기를 측정함으로서 뇌보호 효과를 확인하였다. 결과는 도 6과 같다. vehicle 그룹과 비교하여 프루누스 세라소이데스 추출물 그룹은 뇌경색의 크기를 약 80%정도 감소시켰다(도 6). 이러한 실험결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물의 장기적인 약물투여가 뇌졸중유발상태에서 뇌경색크기 감소를 통한 뇌보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
5. 난소적출로 유발한 폐경에서
프루누스
세라소이데스
추출물의
Ngb
단백질
발현양에
따른 신경보호효과
프루누스 세라소이데스 추출물이 폐경기 여성의 뇌 보호 작용을 나타내는지 확인하기 위하여 난소를 적출한 female rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 5주 동안 경구 투여하여 뇌조직에서의 E2-반응성 Ngb 단백질량 발현 변화를 확인했다. 결과는 도 7과 같다. Sham operate 군과 비교하여 OVX 군에서 Ngb 단백질량의 감소가 나타났으나 프루누스 세라소이데스 추출물을 처리한 투여군의 뇌조직에서는 Ngb 단백질량의 증가가 농도 의존적으로 나타남을 확인하였다(도 7). 이러한 실험결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물의 장기적인 경구투여가 폐경기 여성의 호르몬 결핍상태에서 뇌조직내의 Ngb의 발현양을 증가를 통한 뇌보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
6. 난소적출로 유발한 폐경에서
프루누스
세라소이데스
추출물의 혈중 대사
마커
및
간수치
변화에 미치는 효과
난소적출한 rat에 프루누스 세라소이데스 추출물을 경구투여하여 혈중 대사 마커와 간수치 변화에 미치는 효과를 연구하였다. 실험을 수행한 5주 동안의 경구투여 후, 24시간 금식을 시키고 심장에서 혈액샘플을 채취하여 지질대사 인자(lipid profile)를 분석하였다. 결과는 도 8 및 9과 같다. 지질대사(Lipid) 및 당대사(glucose) 변화를 측정한 결과, 중성지방(triglyceride)의 경우 프루누스 세라소이데스 추출물을 250mg/kg, 500mg/kg을 투여한 군과 Ovx군을 비교했을 때, Sham, E2 투여군과 비슷한 수준으로 중성지방이 줄어든 것을 관찰할 수 있었다(도 8). 간대사효소인 ALP, AST, ALP 수치를 분석한 결과, 프루누스 세라소이데스 추출물 500mg/kg을 투여한 군과 control군을 비교했을 때, 프루누스 세라소이데스 추출물 500mg/kg을 투여한 군이 Sham, E2 투여군과 비슷한 수준으로 ALP, AST, ALP 수치가 줄어든 것을 확인할 수 있었다(도 9). 이러한 실험결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물은 체내 중성지방 수치와 간수치 개선에 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
7.
프루누스
세라소이데스
추출물에 의한 행동학적 신경보호효과
폐경 이후 뇌기능 저하 개선 효과를 확인하기 위해 프루누스 세라소이데스 추출물을 암컷 생쥐에 투여하였을 때, 우울 및 불안, 운동성, 인지기능을 포함한 신경행동학적 변화에 미치는 효과를 평가하였다. 10주령 정상 암컷생쥐그룹과 10개월령 노령 암컷생쥐그룹으로 나누어 프루누스 세라소이데스 추출물을 복강내주사한 뒤, 2주와 4주에 각각 행동실험을 진행하였고 연령에 따른 행동개선 효과를 확인하였다. 결과는 도 10 및 도 11과 같다. 2주간의 프루누스 세라소이데스 추출물 투여 결과, 프루누스 세라소이데스 추출물 투여받은 노령군이 vehicle 투여군과 비교하여 십자형 높은 미로 실험에서 폐쇄된 공간으로 드나든 횟수가 줄어듦을 확인할 수 있었고, 개방장 시험에서는 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여받은 모든 연령군에서 vehicle 투여군에 비해 구석진 공간으로 가는 횟수가 줄어들어 불안성 개선효과를 확인할 수 있었다. 또한, 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여받은 노령군은 rotarod 실험에서 떨어질 때까지의 시간이 vehicle 투여군에 비해 증가하였으므로 운동성의 개선을 확인할 수 있었다(도 10).
4주간의 프루누스 세라소이데스 추출물 투여 결과, 개방장 시험에서는 노령의 프루누스 세라소이데스 추출물 투여군이 vehicle 투여군에 비해 움직인 총 거리가 증가했고 구석진 공간으로 가는 횟수가 줄어들어 불안성 개선효과를 확인할 수 있었다. 강제수영실험에서는 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여받은 모든 연령군에서 vehicle 투여군에 비해 많은 움직임을 보인 시간이 증가하였고, 꼬리 매달기 실험에서는 노령의 프루누스 세라소이데스 추출물 투여군이 vehicle 투여군에 비해 움직임을 보인 시간이 증가하였으므로, 우울 개선효과를 확인할 수 있었다. 또한 프루누스 세라소이데스 추출물을 투여받은 노령군은 rotarod 실험에서 떨어질 때까지의 시간이 vehicle 투여군에 비해 증가하였으므로 운동성의 개선을 확인할 수 있었다(도 11). 이러한 실험결과를 통해 프루누스 세라소이데스 추출물은 폐경기 증후군과 관련이 깊은 우울, 불안 및 운동성에 대한 신경행동학적 증상의 개선에 효과가 있으며 폐경 후 뇌기능 저하에 대한 개선효과가 있는 것을 확인하였다.
8.
프루누스
세라소이데스
추출물에 대한
단회
투여 급성 독성 안전성 효과
프루누스 세라소이데스 추출물의 생체 내 독성을 평가하기 위하여 단회 투여 급성 독성 실험을 수행하였다. female CD1 mouse를 네 그룹으로 나누어 vehicle (1% CMC saline), 프루누스 세라소이데스 추출물 250 mg/kg, 500 mg/kg, 1000 mg/kg 용량으로 경구 투여하였고 2주간 사망률, 체중 변화 및 행동을 관찰하였다. 결과는 아래 표 1과 같다. 투여 직후 동물의 움직임이 감소하였으나 24시간 이후 정상적인 행동을 보였으며 사료와 물 섭취도 정상적으로 관찰되었다. 총 2주간의 실험 기간 동안 사망률은 vehicle 군을 포함하여 모든 군에서 0%였으며 각 군 간의 체중 변화도 비슷한 수준으로 나타났다. 최대용량 1000 mg/kg 경구 투여 용량에도 급성독성이 나타나지 않았으므로 안전성이 높다고 평가된다(표 1).
[표 1]
프루누스
세라소이데스
추출물에 의한 급성 독성 평가
Claims (6)
- 프루누스 세라소이데스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뇌경색의 치료 또는 예방을 위한 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 프루누스 세라소이데스 추출물은 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것인 약학적 조성물. - 프루누스 세라소이데스 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 하며,
뇌경색의 개선 또는 예방; 또는 산소-포도당 결핍에 의한 세포 독성에 대한 보호를 위한 식품 조성물. - 제3항에 있어서,
상기 프루누스 세라소이데스 추출물은 메탄올 또는 에탄올을 추출용매로 사용하여 30℃~60℃에서 2~4일간 초음파 추출하여 얻은 것인 식품 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 중 어느 하나의 형태를 갖는 건강기능식품인 식품 조성물. - 제3항 또는 제4항에 있어서,
상기 식품은 음료, 분말음료, 고형물, 츄잉검, 차, 비타민 복합제, 식품 첨가제 중 어느 하나의 형태를 갖는 식품 조성물.
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| 김소담, 숙명여자대학교 석사학위논문, 2017 |
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