KR20190092167A - 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 등을 나타낸다. 이에 따라, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia) 등의 퇴행성 신경질환에 효과가 있다.
본 발명에 따른 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 등을 나타낸다. 이에 따라, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia) 등의 퇴행성 신경질환에 효과가 있다.
Description
본 발명은 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
침향은 침향나무의 수지가 침착된 것으로 심재부위에서 굳어 만들어진 목재이다. 이는 과거 한의학에서 수승화강(水昇火降)하는 약리적 효능으로 정신을 맑게 해주고 화를 가라앉힘으로써 진정 작용을 하며 위를 따뜻하게 하고 정기를 보하기 위해 처방되어져 왔다.
한편, 인구 고령화와 고도의 산업발전 및 식습관의 서구화에 따라 뇌졸중, 심/뇌혈관성 질환 그리고 알츠하이머성 치매와 같은 퇴행성 뇌 질환의 발병률이 매년 급격히 증가하고 있다. 특히 알츠하이머 병 (Alzheimer's disease)은 전 세계 5천만 명의 유병률을 나타낼 정도로 사회의학적으로 중요한 이슈 중 하나이다.
노인성 치매를 비롯한 퇴행성 뇌 질환은 뇌 신경세포의 퇴화가 주된 특징으로 나타나는 질병인데, 특히 해마는 뇌 인지력, 지남력, 기억력과 같은 중추기능을 담당하는 영역으로 이의 신경세포 사멸은 상기 기능의 저하 및 관련 질병의 진행을 촉진시킨다. 또한 이 해마영역은 타 뇌의 영역에 비해 구조적 퇴화가 빠르게 진행되는 것으로 잘 알려져 있으며, 65세 이상 노인의 뇌 PET 단층촬영이나 MRI 자기공명장치 촬영을 통해서도 측뇌실 (lateral ventricle)에 인접한 해마의 위축은 매우 현저한 병리적 특징이다.
이 해마영역의 위축이나 뇌 신경세포의 퇴화를 일으키는 주된 원인은 특히 현대사회에 이르러 발생빈도가 높은 스트레스로 여겨진다. 만성 스트레스는 스트레스성 내분비계의 기능이상, 면역계의 기능저하 및 염증반응, 신경전달물질계 및 산화-항산화 체계의 불균형 등의 병리적 상태에 깊게 관여한다. 또한 Tau protein의 과도한 인산화나 beta-amyloid peptide와 같은 노인반 (senile plaque)의 침착이 스트레스에 의해 더욱 악화된다. 특히 뇌의 발달이나 중추적 기능이 작용하기 위해서는 관련 신경전달물질의 분비 및 전달이 균형을 이루어야 하는데, 이 항상성의 불균형이 뇌 신경세포의 사멸이나 신경아교세포의 기능장애를 유도한다.
대표적 뇌 신경전달물질의 불균형 형태는 흥분성 신경전달물질인 glutamate의 과도한 증가인데, 시냅스 간극에서 과도하게 증가된 glutamate의 농도는 신경세포의 대사성 수용기 (metabotropic receptor) 또는 이온성 수용기 (ionotropic receptor)를 통해 세포 내 calcium overload를 유도하고, 이는 mitochondrial ROS 과생성 및 caspase3 또는 calpain 의존적으로 apoptotic signal을 나타낸다. 더불어 신경세포에 인접한 astrocyte와 microglia cell의 EAAT (excitatory amino acid transporter)에 의해 유입되어 과활성을 일으키고, 결국 NF-κB nucleic translocation을 경로로 IL-1β, TNF-α, iNOS, nitric oxide와 같은 염증성 인자를 분비하여 신경세포의 사멸에 기여한다. 이와 같이 흥분성 신경전달물질 과분비에 따른 신경세포 흥분독성과 미세아교세포의 과활성은 만성 스트레스로 기인하는 뇌 기능의 활성저하, 퇴행성 신경질환 및 중추신경계 질환의 발병 형태와 매우 유사하다.
최근, 침향 추출물의 골 대사성 질환에 대한 치료 효과에 대해서는 보고된 바 있으나, 신경 퇴행성 질환에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과는 보고된 바가 없다.
본 발명자들은 화학적 합성 의약보다 인체에 대한 부작용이 적고, 용이하게 제조 및 섭취할 수 있는 천연물 유래의 유효성분을 포함하는 퇴행성 신경질환의 개선, 예방 또는 치료용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 이에, 세포실험을 통해 침향 추출물의 분획물의 해마 신경세포 보호효과, 해마의 조직학적 산화 손상 억제효과 효과 등을 객관적으로 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따른 침향 분획물은 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 등이 우수하므로, 퇴행성 신경질환의 개선, 예방 또는 치료를 위해 유용하게 이용될 수 있다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 침향은 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물은 아킬라리아 카시아나(A. khasiana), 아킬라리아 아피쿠리나(A. apiculina), 아킬라리아 블리로닐(A. blillonil), 아킬라리아 바네온시스(A. baneonsis), 아킬라리아 브라키안타(A. brachyantha), 아킬라리아 컨밍이아나(A. cunmingiana), 아킬라리아 필라리아(A. filaria), 아킬라리아 그란디플로라(A. grandiflora), 아킬라리아 힐라타(A. hilata), 아킬라리아 마이크로카파(A. microcapa), 아킬라리아 로스트라타(A. rostrata), 아킬라리아 아갈로차(A. agallocha), 아킬라리아 말라센시스(A. malaccensis), 아킬라리아 시넨시스(A. sinensis) 또는 아킬라리아 크라사나(A. crassna)인 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 침향 추출물은 침향을 물, C1 내지 C3 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 1차 추출한 추출물을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 2차 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 침향 추출물은 침향을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 추출한 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 침향 추출물은 침향의 메틸렌클로라이드 추출물일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 분획물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다:
a) 침향 또는 침향 에탄올 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 수득한 여과액을 100%(v/v) 메탄올 수용액에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 수득한 여과액을 증류수, 및 아세토니트릴 또는 메탄올 용매를 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리하는 단계.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 c) 단계에서는, 상기 b) 단계에서 수득한 10 ㎕의 여과액을 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 고속 액체 액체크로마토그래피(HPLC)에 통과시켜 280 nm 파장에서 측정한 결과, 변동계수 0.024%로, 머무름 시간(retention time) 28.52분에 피크를 가지는 분획물(E 분획물)을 분리하였으며,
상기 컬럼의 이동상은, 용매로 증류수와 아세토니트릴을 사용하되, 0~0.01 분에서 30%(v/v) 아세토니트릴, 0.01-10 분에서 0.01-40%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 10-15 분에서 40-50%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 15-30 분에서 50-60%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 30-40 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴, 40-50 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴을 사용하고, 유속을 1 mL/min으로 한 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 비극성 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)이 충전된 비극성 컬럼일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm, 내경이 1.8 내지 5mm이고, 상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의하여 유도되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 퇴행성 신경질환은 글루타메이트에 의해 유발된 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 하기 특성 중 하나 이상을 가질 수 있다:
1) 신경세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제;
2) 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제;
3) 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준의 감소;
4) 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제; 및
5) 신경세포의 DNA 분절 저해.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 항산화 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물의 제형이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구용 제형일 수 있다.
또한, 본 발명은 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 등을 나타낸다. 이에 따라, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia) 등의 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 침향의 약학적 유효성을 나타내는 분획물을 탐색하는 과정으로, 소수성 또는 친수성 용매에 따른 추출 및 분획물을 분리하는 과정을 모식화한 것이다.
도 2는 침향 메틸렌클로라이드 추출물의 HPLC 지문분석 결과이다.
도 3은 용매별 침향 추출물의 흥분성 신경전달물질 (glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 침향 메틸렌클로라이드 추출물에서 분리한 임의의 5가지 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 5a은 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)의 세포흥분독성에 대하여 세포사멸을 억제하는 것을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6a은 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서 ROS 수준을 DCFH-DA 세포화학형광기법으로 평가한 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제효능을 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제 효능을 나타내는 그래프이다.
도 7a는 침향 E 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell) 사멸을 유세포 분석기(FACs)로 평가한 실험에서, 본 발명의 침향 E 분획물이 Annexin V/PI 신호를 억제함에 따라 세포 사멸이 억제되는 것을 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 실험에서, 사멸된 세포의 수를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
도 8a는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 DNA fragmentation 수준을 Hoechst33528 형광 현미경으로 평가한 실험으로, 침향 E 분획물이 신경세포의 사멸을 억제한다는 것을 나타내는 사진이고, 도 8b는 상기 실험에서, 신경세포 DNA의 분절(fragmentation) 정도를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
도 9는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 세포사멸기전을 웨스턴블랏 기법을 이용하여 평가한 실험에서, 침향 E 분획물이 ERK의 인산화를 방지하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 10은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 항산화 작용을 하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 12a은 침향 E 분획물이 마우스 미세아교신경세포주(BV2 cell)에서 Lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 Nitric oxide(NO)의 증가를 억제한다는 것을 나타내는 그래프이고, 도 12b는 상기 실험에서 나타낸 결과에 대한 단백질 정량값을 나타낸 그래프이다.
도 2는 침향 메틸렌클로라이드 추출물의 HPLC 지문분석 결과이다.
도 3은 용매별 침향 추출물의 흥분성 신경전달물질 (glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 침향 메틸렌클로라이드 추출물에서 분리한 임의의 5가지 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 5a은 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)의 세포흥분독성에 대하여 세포사멸을 억제하는 것을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 6a은 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서 ROS 수준을 DCFH-DA 세포화학형광기법으로 평가한 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제효능을 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제 효능을 나타내는 그래프이다.
도 7a는 침향 E 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell) 사멸을 유세포 분석기(FACs)로 평가한 실험에서, 본 발명의 침향 E 분획물이 Annexin V/PI 신호를 억제함에 따라 세포 사멸이 억제되는 것을 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 실험에서, 사멸된 세포의 수를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
도 8a는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 DNA fragmentation 수준을 Hoechst33528 형광 현미경으로 평가한 실험으로, 침향 E 분획물이 신경세포의 사멸을 억제한다는 것을 나타내는 사진이고, 도 8b는 상기 실험에서, 신경세포 DNA의 분절(fragmentation) 정도를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
도 9는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 세포사멸기전을 웨스턴블랏 기법을 이용하여 평가한 실험에서, 침향 E 분획물이 ERK의 인산화를 방지하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 10은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 항산화 작용을 하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 12a은 침향 E 분획물이 마우스 미세아교신경세포주(BV2 cell)에서 Lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 Nitric oxide(NO)의 증가를 억제한다는 것을 나타내는 그래프이고, 도 12b는 상기 실험에서 나타낸 결과에 대한 단백질 정량값을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 침향의 퇴행성 신경질환에 대한 개선, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 주요 약리활성 성분을 동정하고자, 글루타메이트 또는 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS) 처리한 뇌 해마 신경세포를 Ethylene acetate, methylene chloride, methanol, ethanol 등을 비롯한 각종 유기용매를 이용하여 추출한 침향 추출물로 실험하였다. 그 결과, methylene chloride 추출물(이하 MC)이 가장 유효하였다. 상기 MC 추출물을 HPLC를 이용하여 지문분석한 결과, 5가지의 분획물의 HPLC peak를 확인하였다. Preperative LC 기기를 이용하여 상기 5가지의 분획물(A, B, C, D, E)을 분리한 뒤 신경세포 흥분독성에 대한 억제효과를 평가한 결과, E 분획물에서 현저한 유효성이 관찰되었다. 따라서 침향의 뇌 중추신경계 질환을 개선하는 약리활성은 E 분획물이 핵심적인 역할을 하는 것으로 유추할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 침향은 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물로부터 유래된 것을 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물은 아킬라리아 카시아나(A. khasiana), 아킬라리아 아피쿠리나(A. apiculina), 아킬라리아 블리로닐(A. blillonil), 아킬라리아 바네온시스(A. baneonsis), 아킬라리아 브라키안타(A. brachyantha), 아킬라리아 컨밍이아나(A. cunmingiana), 아킬라리아 필라리아(A. filaria), 아킬라리아 그란디플로라(A. grandiflora), 아킬라리아 힐라타(A. hilata), 아킬라리아 마이크로카파(A. microcapa), 아킬라리아 로스트라타(A. rostrata), 아킬라리아 아갈로차(A. agallocha), 아킬라리아 말라센시스(A. malaccensis), 아킬라리아 시넨시스(A. sinensis) 또는 아킬라리아 크라사나(A. crassna) 등의 줄기 또는 뿌리, 바람직하게는 수지가 침착된 줄기 또는 뿌리를 사용할 수 있다.
또한, 상기 침향 추출물은 침향을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 추출한 추출물일 수 있고, 상기 용매로 바람직한 것은 메틸렌클로라이드이다.
상기 침향 추출물은 통상의 방법에 따라, 침향을 냉수 추출, 열수 추출, 유기용매 추출 또는 증류 등의 방법으로 추출한 다음, 수득한 추출액을 그대로 사용하거나, 감압 농축 또는 동결 건조함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에서 침향 추출물은 침향을 상기 용매로 추출하여 수득한 물질 그 자체를 의미할 뿐만 아니라, 상기 추출하여 수득된 물질을 균주를 사용하여 발효시키거나, 에테르 등의 유기 용매로 더욱 분별 추출한 것 등을 의미할 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 침향 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 선별하여 적절한 크기로 다듬어진 침향 또는 침향 분말을 중량 기준으로 약 1 내지 80배 분량, 바람직하게는 30 내지 50 분량의 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 사용하여, 예를 들어 5 내지 100 ℃, 바람직하게는 상온에서 약 1 내지 100 시간, 바람직하게는 10 내지 40 시간 동안 교반 추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 추출한다. 수득한 추출액은 그대로 사용하거나, 이를 여과, 농축 또는 건조하여 침향 추출물을 얻을 수 있다. 필요한 경우, 상기 추출물을 물 또는 저급 알콜, 에테르 등의 유기 용매로 더 분획하여 사용할 수 있다.
또한, 상기 침향 추출물은 침향을 물, C1 내지 C3 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 1차 추출한 추출물을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 2차 추출한 추출물일 수 있으며, 상기 C1 내지 C3 알코올은 에탄올, 메탄올 또는 프로판올인 것이 바람직하다. 본 발명의 1차 추출의 용매로서 가장 바람직한 것은 20 내지 50 %(w/v)의 에탄올이다.
구체적으로, 상기 침향 추출물은 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 선별하여 적절한 크기로 다듬어진 침향 또는 침향 분말을 중량 기준으로 약 1 내지 50배 분량의 물, 에탄올, 메탄올 등과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여, 예를 들어 5 내지 100 ℃에서 약 1 내지 100 시간 동안 교반 추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 1차 추출한다. 수득한 1차 추출액은 그대로 사용하거나, 이를 여과, 농축 또는 건조하여 사용할 수 있고, 동결건조하여 분말 형태로 이용하는 것이 바람직하다. 상기 1차 추출물이 분말 형태인 경우에는 1차 추출물을 중량 기준으로 약 5 내지 400 배 분량, 바람직하게는 150 내지 250 배 분량의 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 사용하여, 예를 들어 5 내지 100 ℃, 바람직하게는 상온에서 약 1 내지 100 시간, 바람직하게는 10 내지 40 시간 동안 교반 추출, 열탕 추출, 냉침 추출, 환류 추출 또는 초음파 추출 등의 방법으로 추출한다. 수득한 추출액은 그대로 사용하거나, 이를 여과, 농축 또는 건조하여 침향 추출물을 얻을 수 있다.
본 발명에서 이용되는 침향 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기 침향 추출물의 분획물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다:
a) 침향 또는 침향 에탄올 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 수득한 여과액을 100%(v/v) 메탄올 수용액에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 수득한 여과액을 증류수, 및 아세토니트릴 또는 메탄올 용매를 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리하는 단계.
상기 c) 단계에서는, 상기 b) 단계에서 수득한 10 ㎕의 여과액을 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 고속 액체 액체크로마토그래피(HPLC)에 통과시켜 280 nm 파장에서 측정한 결과, 변동계수 0.024%로, 머무름 시간(retention time) 28.52분에 피크를 가지는 분획물을 분리할 수 있다.
상기 비극성 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)이 충전된 비극성 컬럼일 수 있고, 바람직하게는 옥타데실실란(C18)일 수 있다.
또한, 상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm, 내경이 1.8 내지 5mm이고, 상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛일 수 있다.
또한, 본 발명의 바람직한 일 실시예에서 상기 c) 단계에서는, 상기 컬럼의 이동상으로 증류수와 아세토니트릴을 사용하되, 0~0.01 분에서 30%(v/v) 아세토니트릴, 0.01-10 분에서 0.01-40%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 10-15 분에서 40-50%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 15-30 분에서 50-60%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 30-40 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴, 40-50 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴을 사용하고, 유속을 1 mL/min으로 한 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 '유효성분으로 포함하는'이란 침향 분획물의 효능 또는 활성을 달성하는데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 발명의 조성물은 천연식물재료인 침향의 추출물로부터 분리한 분획물을 유효성분으로 포함하는 것이므로 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없다.
인체 내에는 SOD(superoxide dismutase), catalase, 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소와 글루타치온(glutathione), 요산(uric acid) 등의 여러 가지 비효소적 항산화 물질이 있어 활성산소의 축적이나 해로운 산화작용을 막아주게 된다. 그 중 글루타치온 과산화효소(glutathione peroxidase)는 GSH를 생산하여 우리 몸의 균형을 이루어주게 되는데 [Murphy T. H., et al., Neuron. 2, 1547-1558], 이때 GSH는 글라이신(glycine), 글루타메이트(glutamate) 및 시스테인(cysteine)의 세 가지 아미노산이 결합된 단백질로 간과 세포에서 활성산소 및 각종 독성물질을 제거하여 세포손상을 방지하고 면역력을 높이는 역할을 한다 [Shin A. Y., et al., J. Neurosci. 2006, 26, 10514-10523; Milatovic D., et al., Toxicol. Appl. Pharm. 2009, 240, 219-225]. 이러한 GSH를 이루고 있는 아미노산 중 글루타메이트(glutamate)는 중추신경계 시냅스의 15 ~ 20 %를 차지하는 중심적인 흥분성 신경전달물질로 작용하지만, 뇌 속의 과다한 축적은 체내의 항산화 시스템의 기능을 저하시킴으로 인해 산화계와 항산화계의 불균형을 초래하여 신경을 과도하게 흥분시킴으로 인해 흥분독성(excitotoxicity)을 야기하게 된다 [Kim M. H., et al., J. Neurosci. 2008, 28, 10852-10863; Penugonda S., et al., Toxicol. Appl. Pharm. 2006, 216, 197-205; Federico H., et al., J. Neurochem. 2007, 100, 736-746]. 흥분독성은 세포의 사멸을 일으키게 되어 알츠하이머병, 파킨슨병과 같은 여러 퇴행성 신경질환을 유발하게 된다 [Choi B. H., et al., J. Cell. Sci. 2005, 119, 1329-1340; Lim C. S., et al., Biol. Pharm. Bull. 2006, 29, 1212-1216].
본 발명에 따른 침향 분획물은 상기 글루타메이트에 의해 유발되는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 침향 분획물은 신경세포의 보호 작용을 한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 침향 분획물은 신경세포의 사멸을 억제하여 신경세포의 보호 작용을 한다. 상기 신경세포의 보호 작용은 대개 뇌 신경세포의 보호 작용이다. 뇌 신경세포 보호란, 대사성 원인, 독성 원인, 신경 독성원인 및 물리, 화학적 원인 등에 의해 초래되는 신경 세포 또는 신경 조직의 손상을 경감 또는 개선하거나 이러한 손상을 입은 신경 세포를 보호 또는 회복하는 작용을 의미한다. 특히, 본 발명의 침향 분획물은 글루타메이트로 유발된 뇌 신경세포의 흥분독성으로부터 신경세포를 보호하는 작용을 한다.
본 명세서에서, 용어 '뇌 신경 세포'는 뇌, 해마, 뇌간 및 척수를 구성하는 뉴런, 신경 교세포(미세아교세포, 성상교세포), 신경지지 세포, 글리아 및 슈만 세포 등을 의미한다. 이러한 본 발명의 조성물에 의한 뇌 신경 세포 보호는 다양한 기전을 통하여 이루어질 수 있으며, 예컨대, 신경 세포의 세포 사멸을 억제하여 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명의 침향 분획물은 하기 실험예에 나타낸 바와 같이, 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 중에서 하나 이상의 특성을 나타낸다.
또한, 본 발명의 침향 분획물은 활성화된 미세아교세포(microglia)를 억제하거나 활성화된 미세아교세포가 분비하는 염증유발 물질들의 생성을 억제하는 효과가 있다.
신경교세포 중 미세아교세포(microglia)는 중추신경계 신경교세포의 10-12%를 차지하는 세포로서 1932년 리오 오르테가(Rio-Hortega)의 형태학적인 연구와 조직염색 방법에 의해 처음으로 보고되었다. 미세아교세포(microglia)는 조직내에서 변성된 뉴런(neuron)과 이물질 등을 잡아먹는 작용을 하여 물질의 운반과 파괴, 제거 및 병적 대사 물질의 청소 등중요한 역할을 하여 일반적으로 중추신경계에 존재하는 대식세포(macrophage)로 여겨진다.
또한, 중추신경계를 구성하는 신경세포(neuron)와 다른 신경교세포들(astrocytes, oligodendrocytes)과 구별되는 특징적인 세포표면 항원을 발현하고, 탐식작용 등 대식세포와 유사한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 미세아교세포는 발생과정 중에 이들세포의 전구 세포로 여겨지는 단핵구세포(monocyte)들이 중추신경계에 들어와 분화한 것으로 알려져 있는데, 중추신경계내에서 미생물 감염이나 외상이 있을 경우 이에 대한 일차적인 방어 작용을 수행하며, 이때 감염 장소로 이동하거나 국소적인 증식을 통해 감염미생물을 탐식하고 손상된 신경세포들의 잔유 물질들을 소화하게 된다.
미세아교세포는 중추신경계에서 자기방어라는 본래의 기능을 수행하지만, 방어목적으로 생산된 TNF(tumor necrosis factor)-α, 인터류킨(interleukin)(IL)-1β, 반응성 산소 (ROS) 혹은 질소 화합물 등의 염증 유발 물질들이 과다하게 분비되거나 세포 자체가 활성화된 상태로 오래 지속될 경우 신경 조직 손상이라는 심각한 부작용을 초래하게 된다.
최근, 알츠하이머(Alzheimer), 파킨슨병(Parkinson) 등의 퇴행성 신경질환뿐 아니라 외상 및 허혈 상태에 따른 신경세포 손상에도 이러한 미세아교세포의 과민 활성화가 관련되어있다는 연구 보고가 나오고 있으며[Microglia as mediators of inflammatory and degenerative diseases. Gonzalez-Scarano, F and Baltuch, G.
Annu. Rev. Neurosci. 22:219-40 (1999)], 이들 활성화된 미세아교세포를 억제하거나 활성화된 미세아교세포가 분비하는 염증유발 물질들의 작용을 막는 치료법이 개발되고 있다.
즉, 미세아교세포의 활성화로 대변되는 신경염증반응이 다양한 신경조직손상에 있어서 중요한 병리적 역할을 수행하며, 궁극적으로 이러한 미세아교세포의 염증 활성화를 저해함으로써 신경조직손상 억제방안을 모색할 수 있고, 임상적으로 적용할 수 있는 퇴행성 신경질환 예방 및 치료제의 개발이 가능할 것이다.
따라서, 본 발명의 조성물은 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 명세서에서, 상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의하여 유도된 것이거나, 글루타메이트에 의해 유발된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명은 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물 총 중량에 대하여 상기 분획물을 0.02 내지 80 중량%, 바람직하게는 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합 뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 혼합물 등을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우진지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 분획물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 가장 바람직하게는 50 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 침향 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 퇴행성 신경질환을 예방 또는 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 분획물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 분획물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농 제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 의미한다.
본 발명의 조성물을 건강음료로 사용할 경우, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로텐스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100g 당 일반적으로 약 0.01~0.04g, 바람직하게는 약 0.02~0.03g 이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 박에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물은 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않으며, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있음은 당업자에게 자명한 것이다.
실시예
실시예
1.
침향
분획물
분리
1-1. 시료조제
침향(Aquilariae Lignum)은 식품의약품안전처의 승인을 받은 herbal pharmaceutical company(Dae Han Bio Pharm Inc., Gyeonggi-do, Korea)로부터 수득한 분말상 침향을 사용하였다.
먼저, 분말 침향 10g을 30% 에탄올 200mL로 실온(25℃)에서 72시간 동안 교반추출 하였다. 교반 후 원심분리기(5000rpm 30min)에서 침전물을 가라앉힌 후 상층액은 300 메쉬의 필터페이퍼(fillter paper: Advantac, Tokyo Roshi Kaisah, Tokyo, Japan) 50mm로 여과하고, 여과된 액체(fillterate)는 순환식 증발기에서 농축한 후 동결건조 하였다. 최종 추출물의 수율은 6.42% (W/W) 이었으며, 이후 사용을 위해 -80℃에 보관하였다.
1-2.
침향의
methylene
chloride
추출물로부터
분획물의
분리(
Aquilariae
Lignum
methylene
chloride
extract
&
separation
of
fraction
layer
)
상기 1-1에서 제조한 침향 추출물 분말 5g을 200g의 메틸렌클로라이드(methylene chloride)와 혼합한 후 상온에서 24시간 동안 교반하여 용매 추출하였다. 상기 침향의 메틸렌클로라이드 추출물을 0.2 μm의 나일론 필터로 여과하고, 메틸렌클로라이드로 2번 세척한 뒤 여과액을 수집하였다. 수집한 여과액을 다시 100mL의 증류수에 용해시킨 후, 수용액층은 제거하고, 메틸렌클로라이드층은 황산나트륨으로 건조시켰다. 회전농축기로 휘발성분을 제거하여 황색의 농축액(메틸렌클로라이드 추출물) 0.62g을 획득하였다.
상기 메틸렌클로라이드 추출물 1mg을 1mL의 100% 메탄올에 용해시킨 뒤 0.2 μm의 나일론 필터로 여과하였다. 그리고 10μL의 여과액을 C18 컬럼을 이용한 HPLC 분석기기에 주입하여 지문분석을 실시하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
이때, 컬럼 유동률은 1mL/min이고, 이동상 조건은 (A) 증류수와 (B) 아세토니트릴을 이용하여 다음과 같이 실시하였다: 0 to 0.01 min, 30 % B (등용매 용리); 0.01 to 10 min, 0.01 to 40 % B (선형 기울기 용리); 10 to 15 min, 40 to 50 % B (선형 기울기 용리); 15 to 30 min, 50 to 60 % B (선형 기울기 용리); 30 to 40 min, 100 % B (선형 기울기 용리); and 40 to 50 min (등용매 용리). 이것을 UV 검출기로 검출하였다. 그 결과 총 280 nm UV 파장에서 5개의 메인 피크가 변동계수 0.024%로, 머무름 시간(retention time) 8.13 분(A 분획물), 13.80 분(B 분획물), 17.70 분(C 분획물), 20.92 분(D 분획물) 및 28.52 분(E 분획물)에 검출되었다.
또한, 상기 메틸렌클로라이드 추출물의 활성성분을 동정하기 위한 단계로 먼저 분취 액체크로마토그래피(preparative LC(이하 prep. LC))를 이용하여, 상기 주요 5개(A, B, C, D 및 E 분획물)의 HPLC 피크들 중 가장 유효성이 뛰어난 E 분획물을 분리하고자 하였다.
이를 위하여, 먼저 75mg의 메틸렌클로라이드 추출물을 1.5mL의 메탄올에 용해시켜 0.2 μm의 나일론 필터로 여과하였다. 그리고 상기 여과액 2000μL를 prep. LC 기기에 주입하였다. 이때, 컬럼 유동률은 30 mL/min으로 하고, 이동상 조건은 (A) 증류수와 (B) 메탄올을 이용하여 다음과 같이 실시하였다: 0 to 0.01 min, 50 % B (등용매 용리); 0.01 to 10 min, 0.01 to 55 % B (선형 기울기 용리); 10 to 15 min, 55 to 65 % B (선형 기울기 용리); 15 to 30 min, 65 to 75 % B (선형 기울기 용리); 30 to 40 min, 100 % B (선형 기울기 용리); and 40 to 50 min (등용매 용리). 이것은 광다이오드 어레이 검출기에서 190-700nm의 파장으로 검출하였다. 그리고, 회전 농축기로 휘발성분을 제거한 뒤 황색의 E 분획물 2.2mg을 획득하였다.
실험예
실험예
1. 용매별
침향
추출물의
세포흥분독성에 대한 세포사멸 억제효능
마우스 해마 세포주(HT-22 cell)을 이용하여 평가하였으며 배지는 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% (v/v) penicillin을 함유한 DMEM을 사용하였고, 배양은 37℃, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기를 사용하였다. 시료의 안전성 농도 범위에서 시험을 실행하기 위해 세포독성은 Rochem 등의 방법을 변형하여 WST-8과 LDH를 측정하였다. 96 wells plate에 4 X 103 cells/well의 세포를 분주한 후 12 시간동안 배양하였다. 이후 침향의 메틸렌클로라이드(MC), 에틸아세테이트(EA), 레스트(Rest) 추출물 각각을 25㎍/㎖의 최종농도로 분주하고 재배양을 2시간 동안 하였다. 이후 최종농도 글루타메이트 20mM를 처리하여 20 시간 후 세포사멸을 유도하였다. 각 용매추출물의 세포사멸 억제효과를 평가하기 위해 WST-8 용액 20μL을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 배양한 뒤, UV spectrometer 450nm의 흡광도로 측정하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 용매별 추출물의 흥분성 신경전달물질 (glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
도 3을 살펴보면, 메틸렌클로라이드(MC) 추출물이 신경세포독성에 의한 세포사멸(아팝토시스) 억제 효과가 가장 뛰어난 것을 알 수 있다.
실험예
2.
침향
A~E
분획물의
세포흥분독성에 대한 세포사멸 억제효능
마우스 해마 세포주(HT-22 cell)을 이용하여 평가하였으며 배지는 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% (v/v) penicillin을 함유한 DMEM을 사용하였고, 배양은 37℃, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기를 사용하였다. 시료의 안전성 농도 범위에서 시험을 실행하기 위해 세포독성은 Rochem 등의 방법을 변형하여 WST-8과 LDH를 측정하였다. 96 wells plate에 4 X 103 cells/well의 세포를 분주한 후 12 시간동안 배양하였다. 이후 A~E 분획물을 각각 10 ㎍/㎖의 최종농도로 분주하고 재배양을 2시간 동안 하였다. 이후 최종농도 글루타메이트 20mM를 처리하여 20 시간 후 세포사멸을 유도하였다. 각 분획물의 세포사멸 억제효과를 평가하기 위해 WST-8 용액 20μL을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 배양한 뒤, UV spectrometer 450nm의 흡광도로 측정하였다. 또한 세포사멸시 유리되는 LDH의 활성을 측정하기 위해 배양 상층액을 이용하여 시약과 37℃에서 15분간 반응하고 440nm 흡광도로 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4는 침향 메틸렌클로라이드 추출물에서 분리한 임의의 5가지 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마신경세포주 (HT-22 cell) 세포흥분독성 사멸에 대한 보호효과를 나타내는 그래프이다.
상기 도 4를 보면, 침향 E 분획물이 신경세포독성에 대한 세포사멸(아팝토시스) 억제 효과가 가장 뛰어났다.
실험예
3.
침향
E
분획물의
세포흥분독성에 대한 농도별 세포사멸 억제효능
마우스 해마 세포주 (HT-22 cell)을 이용하여 평가하였으며 배지는 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% (v/v) penicillin, 함유한 DMEM을 사용하였고, 배양은 37℃, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기를 사용하였다. 시료의 안전성 농도 범위에서 시험을 실행하기 위해 세포독성은 Rochem 등의 방법을 변형하여 WST-8과 LDH를 측정하였다. 96 wells plate에 4 X 103 cells/well의 세포를 분주한 후 12 시간동안 배양하였다. 이후 침향 E 분획물을 1.25, 2.5, 5㎍/㎖의 최종농도로 분주하고 재배양을 2시간 동안 하였다. 이후 최종농도 Glutamate 20mM를 처리하여 20 시간 후 세포사멸을 유도하였다. E 분획물의 세포사멸 억제효과를 평가하기 위해 WST-8 용액 20μL을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 배양한 뒤, UV spectrometer 450nm의 흡광도로 측정하였다. 또한 세포사멸시 유리되는 LDH의 활성을 측정하기 위해 배양 상층액을 이용하여 시약과 37℃에서 15분간 반응하고 440nm 흡광도로 측정하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5a은 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)의 세포흥분독성에 대하여 세포사멸을 억제하는 것을 나타내는 그래프이고, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 의한 침향 E 분획물이 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
실험예
4.
침향
E
분획물의
세포흥분독성에 의한
ROS
생성 억제 효능
HT-22 세포를 4 X 103 cells/well으로 6 well plate에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. E 분획물 5μg/mL 농도로 2시간 처리한 후 세포흥분독성을 glutamate 20mM 처리하여 유도하였다. 6시간 배양 후, DCFH-DA 시약을 10μM 처리하고 37℃에서 30분간 반응한 뒤 ROS 수준을 형광현미경으로 관찰하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6a은 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서 ROS 수준을 DCFH-DA 세포화학형광기법으로 평가한 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제효능을 나타내는 사진이고, 도 6b는 상기 실험에서, 침향 E 분획물의 ROS 생성 억제 효능을 나타내는 그래프이다.
실험예
5.
침향
E
분획물의
세포흥분독성에 의한 세포 사멸(
apoptosis
) 억제 효능
HT-22 세포를 5 X 104 cells/mL으로 100Φ Dish에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. E 분획물 5μg/mL 농도로 2시간 처리한 후 세포흥분독성을 glutamate 20mM 처리하여 유도하였다. 10시간 배양 후, 원심분리기 (1300rpm, 3min)에서 cell을 모은 후 1X Annexin V binding buffer 500μL를 첨가하여 녹이고 얼음에 보관한다. Annexin V 1μL 와 PI 0.5μL 처리하여 유세포 분석기(FACs)를 이용해 HT-22 세포의 사멸을 확인하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7a는 침향 E 분획물의 흥분성 신경전달물질(glutamate)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell) 사멸을 유세포 분석기(FACs)로 평가한 실험에서, 본 발명의 침향 E 분획물이 Annexin V/PI 신호를 억제함에 따라 세포 사멸이 억제되는 것을 나타내는 그래프이고, 도 7b는 상기 실험에서, 사멸된 세포의 수를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
실험예
6.
침향
E
분획물의
세포흥분독성에 의한
DNA
fragmentation
억제 효능
HT-22 세포를 4 X 103 cells/well으로 6 well plate에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. E 분획물 5μg/mL 농도로 2시간 처리한 후 세포흥분독성을 glutamate 20mM 처리하여 유도하였다. 8시간 배양 후, 4% paraformaldehyde로 세포고정 후 Hoechst33528 시약을 10μM, PI 10μg/mL 농도로 처리하여 HT-22 세포 DNA fragmentation을 확인하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8a는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 DNA fragmentation 수준을 Hoechst33528 형광 현미경으로 평가한 실험으로, 침향 E 분획물이 신경세포의 사멸을 억제한다는 것을 나타내는 사진이고, 도 8b는 상기 실험에서, 신경세포 DNA의 분절(fragmentation) 정도를 정량화하여 나타내는 그래프이다.
실험예
7.
침향
E
분획물의
세포흥분독성에 의한 세포 내
세포사멸기전
HT-22 세포를 5 X 104 cells/mL으로 100Φ Dish에 분주하여 12시간 동안 배양하였다. 침향 E 분획물을 5μg/mL 농도로 2시간 처리한 후 세포흥분독성을 glutamate 20mM 처리하여 유도하였다. 상기 세포를 8 시간 배양 후, ERK의 단백질 발현과 인산화 정도를 웨스턴 블랏 기법을 이용하여 평가하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9는 glutamate로 유도된 HT-22 cell에서의 세포사멸기전을 웨스턴블랏 기법을 이용하여 평가한 실험에서, 침향 E 분획물이 ERK의 인산화를 방지하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
실험예
8.
침향
E
분획물의
신경세포 산화 손상에 대한
생존률
마우스 해마 세포주 (HT-22 cell)을 이용하여 평가하였으며 배지는 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% (v/v) penicillin, 함유한 DMEM을 사용하였고, 배양은 37℃, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기를 사용하였다. 시료의 안전성 농도 범위에서 시험을 실행하기 위해 세포독성은 Rochem 등의 방법을 변형하여 WST-8과 LDH를 측정하였다. 96 wells plate에 4 X 103 cells/well의 세포를 분주한 후 12 시간동안 배양하였다. 이후 침향 E 분획물을 5㎍/㎖의 최종농도로 분주하고 재배양을 2시간 동안 하였다. 이후 최종농도 glutamate 20mM를 처리하여 20 시간 후 세포사멸을 유도하였다. E 분획물의 세포사멸 억제효과를 평가하기 위해 WST-8 용액 20μL을 첨가하고 37℃에서 1시간 30분 배양한 뒤, UV spectrometer 450nm의 흡광도로 측정하였다. 또한 세포사멸 시 유리되는 LDH의 활성을 측정하기 위해 배양 상층액을 이용하여 시약과 37℃에서 15분간 반응하고 440nm 흡광도로 측정하였다. 그 결과는 도 10 및 11에 나타내었다.
도 10은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 항산화 작용을 하여 세포사멸을 억제한다는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 침향 E 분획물이 Hydrogen peroxide(H2O2)로 유도된 마우스 해마 신경세포주(HT-22 cell)에서 Lactate dehydrogenase(LDH)의 세포 외 유출을 억제하는 것을 나타내는 그래프이다.
실험예
9.
침향
E
분획물의
신경세포 염증 반응에 대한
NO
생성 억제
마우스 미세아교세포주 (BV2 cell)을 이용하여 평가하였으며 배지는 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS), 1% (v/v) penicillin, 함유한 DMEM을 사용하였고, 배양은 37℃, 5% CO2, 95% humid air로 조절된 배양기를 사용하였다. NO assay는 griess 시약을 이용하여 측정하였고, 이의 단백질 1mg당 농도를 정량하기 위해 Bradford 시약을 이용하여 측정한 단백질 정량값으로 보정하였다. 96 wells plate에 4 × 104 cells/well의 세포를 분주한 후 12 시간동안 배양하였다. 이후 E 분획물을 5㎍/㎖의 최종농도로 분주하고 재배양을 2시간 동안 하였다. 이후 최종농도 LPS 1㎍/mL을 처리하여 24 시간 후 미세아교세포의 과활성을 유도하였다. 과활성 시 유리되는 NO의 농도를 측정하기 위해 배양 상층액을 griess 시약과 37℃에서 30분간 반응하고 540nm 흡광도로 측정하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다.
도 12a은 침향 E 분획물이 마우스 미세아교신경세포주(BV2 cell)에서 Lipopolysaccharide(LPS)로 유도된 Nitric oxide(NO)의 증가를 억제한다는 것을 나타내는 그래프이고, 도 12b는 상기 실험에서 나타낸 결과에 대한 단백질 정량값을 나타낸 그래프이다.
상기 실험예들을 통해, 본 발명에 따른 침향 분획물이 항산화 작용, 신경세포의 아팝토시스(apoptosis) 억제 작용, 뇌신경 스트레스 저해 및 신경세포 보호 작용, 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제 작용, 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준 감소 작용, 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제 작용 및 신경세포의 DNA 분절 저해 작용 등을 나타내는 것을 구체적으로 확인할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 침향 분획물은 해마 신경세포의 흥분독성을 억제하고, 뇌 산화 손상에 의한 세포사멸을 억제하며, 미세아교세포의 염증반응을 저하시키는 등 신경세포 보호 효과가 탁월하므로, 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료에 우수한 효과가 기대된다.
이에 따라, 본 발명의 침향 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 신경세포 손상 및 사멸에 따른 퇴행성 신경 질환, 특히 중추신경계 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (17)
- 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 침향은 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제2항에 있어서,
상기 아킬라리아(Aquilaria) 속 식물은 아킬라리아 카시아나(A. khasiana), 아킬라리아 아피쿠리나(A. apiculina), 아킬라리아 블리로닐(A. blillonil), 아킬라리아 바네온시스(A. baneonsis), 아킬라리아 브라키안타(A. brachyantha), 아킬라리아 컨밍이아나(A. cunmingiana), 아킬라리아 필라리아(A. filaria), 아킬라리아 그란디플로라(A. grandiflora), 아킬라리아 힐라타(A. hilata), 아킬라리아 마이크로카파(A. microcapa), 아킬라리아 로스트라타(A. rostrata), 아킬라리아 아갈로차(A. agallocha), 아킬라리아 말라센시스(A. malaccensis), 아킬라리아 시넨시스(A. sinensis) 또는 아킬라리아 크라사나(A. crassna)인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 침향 추출물이 침향을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 침향 추출물이 침향의 메틸렌클로라이드 추출물인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 침향 추출물이 침향을 물, C1 내지 C3 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 1차 추출한 추출물을 클로로포름, 에테르 또는 메틸렌클로라이드를 용매로 하여 2차 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - `제1항에 있어서, 상기 분획물은 다음 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
a) 침향 또는 침향 에탄올 추출물을 메틸렌클로라이드에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계;
b) 상기 a) 단계에서 수득한 여과액을 100%(v/v) 메탄올에 용해시킨 후 여과한 여과액을 수득하는 단계; 및
c) 상기 b) 단계에서 수득한 여과액을 증류수, 및 아세토니트릴 또는 메탄올 용매를 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 분리하는 단계. - 제7항에 있어서, 상기 c) 단계에서는
상기 b) 단계에서 수득한 10 ㎕의 여과액을 고정상으로서 비극성 컬럼을 갖는 고속 액체 액체크로마토그래피(HPLC)에 통과시켜 280 nm 파장에서 측정한 결과, 변동계수 0.024%로, 머무름 시간(retention time) 28.52분에 피크를 나타내는 분획물을 분리하였으며,
상기 컬럼의 이동상은, 증류수와 아세토니트릴을 사용하되, 0~0.01 분에서 30%(v/v) 아세토니트릴, 0.01-10 분에서 0.01-40%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 10-15 분에서 40-50%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 15-30 분에서 50-60%(v/v) 아세토니트릴의 구배, 30-40 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴, 40-50 분에서 100%(v/v) 아세토니트릴을 사용하고, 유속을 1 mL/min으로 한 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 비극성 컬럼은 옥타데실실란(C18), 도데실실란(C12) 또는 옥타실란(C8)이 충전된 비극성 컬럼인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 컬럼은 길이가 3 내지 30cm, 내경이 1.8 내지 5mm이고,
상기 컬럼에 충전된 입자의 직경이 1.5 내지 5㎛인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 분획물이 하기 특성 중 하나 이상을 가지는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물:
1) 신경세포의 아팝토시스(apoptosis)를 억제;
2) 신경세포의 활성산소종(reactive oxygen species:ROS) 생성 억제;
3) 세포외 신호조절인산화효소(ERK; extracellular signal-regulated kinases)의 인산화 수준의 감소;
4) 신경세포의 일산화질소(NO)의 생성 억제; 및
5) 신경세포의 DNA 분절 저해. - 제1항에 있어서,
상기 분획물은 항산화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 루게릭병(Lou Gehrig disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 다발성 경화증(Multiple sclerosis), 뇌졸중(stroke), 혈전증(thrombosis), 색전증(embolism), 두부손상(head trauma), 뇌순환대사장애, 뇌 기능혼수 또는 치매(dementia)인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 지질다당류(lipopolysaccharide, LPS)에 의하여 유도되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 퇴행성 신경질환은 글루타메이트에 의해 유발된 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물의 제형이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼 및 시럽으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경구용 제형인 것을 특징으로 하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
Priority Applications (2)
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| KR1020180011625A KR102050966B1 (ko) | 2018-01-30 | 2018-01-30 | 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| KR20220077706A (ko) * | 2020-12-02 | 2022-06-09 | 대전대학교 산학협력단 | 침향 추출물의 분획물을 유효성분으로 포함하는 뇌 신경정신장애에 대한 예방, 개선 또는 치료용 조성물 |
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| KR20130102273A (ko) | 2012-03-07 | 2013-09-17 | 주식회사 퓨리바이오 | 침향 추출물을 유효성분으로 함유하는 골 대사성 질환의 예방 및 치료용 조성물 |
| JP2017537146A (ja) * | 2014-11-06 | 2017-12-14 | 孫広▲エ▼ | 沈香原液及びその製造方法と用途 |
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2018
- 2018-01-30 KR KR1020180011625A patent/KR102050966B1/ko active IP Right Grant
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