KR101725979B1 - 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선을 위한 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선을 위한 조성물에 관한 것이다. 특히, 몰약의 수지를 추출한 후에 여과 증발시킨 후 제조된 추출물을 유효성분으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 Y-미로 시험, 수동 회피 시험 및 Akt와 ERK의 인산화 활성 시험을 통해 단기적 기억력 개선 효과 및 장기적 기억력 개선 효과를 보유하고 있음이 입증되었다.

Description

몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선을 위한 조성물{A COMPOSITION OF MYRRH EXTRACTS FOR TREATING MEMORY IMPAIRMENT}
본 발명은 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선을 위한 조성물에 관한 것이다. 특히, 몰약의 수지를 추출한 후에 여과 증발시킨 후 제조된 추출물을 유효성분으로 한다.
본 발명에 따른 조성물은 Y-미로 시험, 수동 회피 시험 및 Akt와 ERK의 인산화 활성 시험을 통해 단기적 기억력 개선 효과 및 장기적 기억력 개선 효과를 보유하고 있음이 입증되었다.
의학의 발달로 평균 수명이 증가되는 현대 사회에서 알츠하이머 치매를 비롯한 만성 퇴행성 뇌질환의 발병률은 급격히 증가하고 있다. 우리나라 65세 이상 고령인구의 급격한 증가와 더불어 치매의 유병률 또한 가파르게 증가하여 2027년에는 100만명, 2050년에는 212만명에 이를 것으로 전망된다.
치매와 같은 퇴행성 뇌질환에서 나타나는 기억력과 인지 능력, 지각 능력의 감퇴는 사회 생활 자체를 불가능하게 할 수 있다. 또한, 인지 기능과 기억력은 학습량이 많은 청소년에게도 주요 관심의 대상이 되고 있다.
기억력과 인지 능력 저하의 중요한 원인 중의 하나는 콜린성 신경세포 퇴화에 의한 acetylcholine의 부족이다. 이러한 현상은 acetylcholine 분해효소인 acetylcholinesterase(AChE)의 활성증가로 더욱 심화된다. 따라서 그 동안 tacrine, donepezil, galantamine, rivastigmine 등의 AChE 억제제가 알츠하이머 질환의 치료제로 개발되어 왔다.
또한, 기억 기능과 관련된 분자 신호 전달 경로 중 하나는 세포 외 신호 조절 키나아제 (ERK)이다. ERK1/2는 세포 외 신호로부터 전송되는 세포내 신호를 책임지고 있다. ERK 활성화는, 시냅틱 가소성 및 기억력에 기초가 되는 세포 메카니즘으로서의 장기적 강화작용(LTP)에 필수적이다. 또한, Akt는 학습과 기억에 관여하는 다른 시그널링 분자이다. Akt의 활성화는 해마의 장기적 강화작용을 유도하는데 필수적이고, Akt가 억제되면 수동회피 시험 등에서의 기억력 손상을 의미한다.
하지만 아직 뇌세포 손상을 억제하거나 직접 뇌세포를 재생시키는 약물이 개발되지 않았기 때문에, 효과적이면서도 안전한 기억력 및 인지기능 개선제를 개발하는 것은 치매 환자의 증상 호전뿐만 아니라 정상인의 치매 예방 차원에서도 중요하다.
합성 약품을 이용한 기억력 개선제 개발에는 한계가 있을 뿐만 아니라 부작용도 존재한다. 따라서, 최근 천연물을 이용한 기억력 및 인지기능 개선제의 개발이 주목받고 있다.
몰약(Myrrh)은 몰약수(沒藥樹) Commiphora myrrha Engler 또는 합지수(哈地樹) Commiphora molmol Engler(감람나무과 Burseraceae)에서 얻은 고무수지로서, 엷은 황색에서 어두운 갈색의 고르지 않은 덩어리이며, 방향성의 냄새가 있고 맛은 쓰며 약간 떫고 맵다. 몰약은 고대 이집트의 미라제작에 방부제로 사용된 이래 지금까지 오랫동안 향료와 의약용으로 사용되고 있다.
몰약은 항염 진통 효과, 항암 효과, 지질 강하 효과, 항미생물 활성 등의 효능을 보유하고 있다고 보고되어 왔다.
몰약은 30-60%의 water-soluble gum과 25-40%의 alcohol-soluble resins, 3-8 %의 essential oil로 구성되어 있다. 주요 성분으로는 furanoelemanes, furanoeudesmanes, furanogermancranes 등의 furanosesquiterpene이 있다.
선행특허문헌을 살펴보면, 대한미국 등록특허공보 제10-1601860호에는 용안육, 단삼 및 천마를 유효성분으로 함유하는 알쯔하이머 예방 또는 치료용 조성물이 기재되어 있다. 또한 상세한 설명 [0025]식별항목에는 혈행개선용으로 몰약이 추가될 수 있다고 기재되어 있다. 그러나 이 문헌에서의 몰약은 기억력 개선 증진으로 사용된 것이 아니라 혈행개선용으로 추가될 수 있다는 정도의 기재사항이므로 본 발명과는 관련성이 적다고 하겠다.
대한민국 등록특허공보 제10-1601860호 (2016.03.09 공고)
본 발명은 천연물을 이용함으로써 부작용없이 기억력 감퇴를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 단기적 기억력 개선효과와 장기적 기억력 개선 효과를 보유하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하여 기억력 감퇴를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 조성물은, 천연물을 이용함으로써 부작용없이 기억력 감퇴를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 단기적 기억력 개선 효과 및 장기적 기억력 개선 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은, Y-미로 시험과 수동회피 시험을 통해서 입증된 기억력 개선 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 조성물은, Akt 및 ERK 인산화를 활성화시켜 장기적으로 기억력을 개선할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
도 1a 및 도 1b는 도 1a 및 도 1b는 AEM의 Y-미로 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2a 및 도 2b는 AEM의 수동회피 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3a 내지 도 3c는 해마에서의 Akt 및 ERK 1/2의 인산화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 해마에서의 Akt 및 ERK 1/2의 인산화에 대한 면역조직학적 분석결과를 나타내는 사진이다.
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
제조예 1. 기억력 감퇴를 예방, 개선 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물
본 발명에서 사용되는 '기억력 감퇴'이라는 용어는 신경 세포 퇴화에 따른 기억력, 인지능력 및 지각능력의 감퇴를 총칭하는 것으로 사용되었음을 밝힌다.
본 발명의 제조예로서 기억력 감퇴를 예방, 개선 도는 치료할 수 있는 약학적 조성물의 제조법은 다음과 같다.
1) 몰약 수지의 추출물을 제조한다.
몰약의 수지를 뜨거운 물로 추출한 후에 여과액을 감압하에 증발시켜 추출물을 제조한다. 일 예로, 몰약 수지 500g을 3시간 동안 뜨거운 물 (10 L)로 추출한 후, 여과액을 감압하에 증발시켜 잔여 추출물(residue) 188g을 생성한다.
2) 상기 추출물을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제조한다.
약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가하여 약제학적 단위 투여형 제형으로 제조한다.
여기에서, 담체, 부형제, 희석제로는 토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
또한 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 포함하는 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한 상기 약제학적 투여 형태는 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 경구 투여를 위한 고형 제제에는 상기 혼합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분은 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
상기 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다.
상기 비 수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 제조예에 따른 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 연령, 성별, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 제조예에 따른 염증, 통증 및 가래의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.
제조예 2. 기억력 감퇴를 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물
1) 몰약 수지의 추출물을 제조한다.
몰약의 수지를 뜨거운 물로 추출한 후에 여과액을 감압하에 증발시켜 추출물을 제조한다. 일 예로, 몰약 수지 500g을 3시간 동안 뜨거운 물 (10 L)로 추출한 후, 여과액을 감압하에 증발시켜 잔여 추출물(residue) 188g을 생성한다.
2) 상기 추출물을 유효성분으로 하는 식품 조성물을 제조한다.
본 발명에 따른 식품 조성물을 이용한 건강기능식품은, 기능성 음료, 각종 식품류, 건강보조식품, 차, 과자류, 껌, 차, 비타민 복합제 등과 같이 다양한 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐 등의 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 염증, 통증 및 가래의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 조성물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강 음료 조성물은 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율의 필수 성분으로서 자초를 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리통 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 일긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 채소 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하지는 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
실험 준비. Y-미로 시험 및 수동회피 시험의 재료 및 방법
[실험시약] (-)-스코폴라민 하이드로브로마이드(스코폴라민)과 9-아미노 -1,2,3,4- 테트라히드로아크리딘 히드로클로라이드 하이드레이트(타크린)는 시그마(Sigma, 미국)로부터 구입하였다. 스코폴라민 및 타크린(tacrine)은 동물에 투여하기 위해 0.9 % 식염수 용액에 용해하였다.
[추출물 준비] 몰약의 수지(resin)는 동경 제약(한국)에서 구입했다. 이 물질의 바우처 표본 (HP-2014-12)은 한풍제약의 식물 표본실에 기탁했다. 몰약의 수지 500g을 3시간 동안 뜨거운 물 (10 L)로 추출한 후, 여과액을 감압하에 증발시켜 잔여물(residue) 188g을 생성했다. 이 잔여물을 AEM이라 호칭하고, 동물에 투여하기 위하여 0.9 % 식염수 용액에 용해하였다.
[실험동물] 25~30g 무게의 6주령 수컷 ICR 마우스를 준비하였다.(오리엔트, 대한민국) 케이지 당 6마리를 수용하여, 온도 20±3℃, 12/12 시간의 light/dark 싸이클로 일주일간 적응시켰다. 실험동물은 사료와 물을 제한 없이 공급 받았다. 실험은 원광대의 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실시하였다.
[Y-미로 시험(Y-maze task)]
마우스에 AEM (62.5, 125 및 250 ㎎ / ㎏) 또는 타크린(tacrine) (10 ㎎ / ㎏)을 경구투여하였고, 30분후에 스코폴라민( 1 ㎎ / ㎏, 복강 내) 또는 비히클을 주사하였다.
Y-미로 시험에 이용되는 기구(정도비앤피, 대한민국)는 3개의 가지로 구성되어 있으며 각 가지(arm)의 길이는 40 cm, 넓이는 3 cm, 높이는 12 cm이고 세 팔의 각도는 각 120도였다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 마우스를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 마우스가 들어간 가지를 기록하였다. 이때 꼬리까지 완전히 들어갔을 경우만을 기록하였으며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록하였다. 세 개의 서로 다른 가지에 차례로 들어간 경우(ABC, CAB, BCA; 실제 변경, actual alternation) 1점씩을 부여하였다. 변경 행동력(alternation behavior)은 3가지 모두에 차례로 들어가는 것으로 정의되며, 다음의 수학식에 의해 계산하였다.
자발적 변경률(spontaneous alternation)(%)=실제변경(actual alternation)/최고변경(maximum alternation=총 출입수 - 2)x100
[수동회피 시험(passive avoidance task)]
약물 투여는 Y-미로 시험에서와 같은 방법으로 실시하였다. Scopolamine 투여 30분 후, 마우스를 조명을 비춘 밝은 쪽 방에 놓고 10초간 탐색시킨 후 길로틴문(guillotin door)을 열어 어두운 방으로 들어갈 수 있게 하였다. 각 방의 구획은 20x20x20 cm의 공간(정도비앤피)이다. 이때 길로틴문이 열린 후 60초 이내에 어두운 방으로 들어가지 않는 마우스는 실험에서 제외시켰다.
길로틴문이 열린 후 마우스가 어두운 방으로 들어갈 때까지의 시간을 측정하였으며 이를 학습 시험(acquisition trial)이라고 정의하였다. 일단 마우스가 어두운 쪽으로 들어가면 길로틴문이 닫히고 0.5 mA의 전기 자극을 3초 동안 grid 바닥을 통해 흐르게 하였으며 마우스가 이를 기억하도록 하였다.
학습 시험(acquisition trial)이 끝난 지 24시간 후에 장기기억에 미치는 HPM의 효과를 확인하고자 정체 시험(retention trial)을 시행하였다. 10초의 탐색시간 후 길로틴문이 열리고 어두운 방으로 마우스의 4발이 다 들어가는데 걸리는 시간(latency time; 머무름 시간)을 300초까지 측정하였다. 어두운 방으로 가는데 걸리는 시간이 길수록 쥐의 학습과 기억이 좋음을 나타낸다.
[통계처리] 모든 데이터는 평균 ± SEM으로 표현하였다 모든 실험 결과는 one-way analysis of variance(ANOVA)를 이용하여 통계처리 하였고, 다중분석을 위하여 Tukey's test를 사후검정으로 실시하여 95 % 신뢰 수준에서 유의성 검정을 실시하였다.(p<0.05)
실험예 1. Y-미로 시험 분석
도 1a 및 도 1b는 AEM의 Y-미로 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
먼저 Y-미로 시험을 이용하여 단기 기억 기능에 미치는 AEM의 효과를 평가 하였다. 스코폴라민 (1 ㎎ / ㎏, 복강 내)은 상당히 자발적 교대(spontaneous alternation)의 비율을 감소시켰다. 스코폴라민으로 유도된 단기 기억력 감소는 용량 의존적으로 AEM (125 및 250 ㎎ / ㎏)에 의해서 개선되었다. 특히, 대조군인 tacrine(10 mg/kg)군보다 높았음을 알 수 있다.
반면 각 구역으로 들어가는 총 횟수 를 나타내는 total entry에서는 변화가 없는 것으로 보아 AEM에 의해 유도되는 spontaneous alternation의 증가는 마우스의 활동성 변화에 의한 것이 아님을 알 수 있었다.
실험예 2. 수동회피 시험 분석
도 2a 및 도 2b는 AEM의 수동회피 시험 결과를 나타내는 그래프이다.
수동회피 시험을 실시하여 장기 기억 능력에 미치는 영향을 확인하였다.
모든 실험군에서 학습 시험(acquisition trial) 시의 latency time에는 큰 차이가 없었다. Scopolamine(1 mg/kg, i.p.)의 투여에 의해 정체 시험(retention trial) 시의 latency time이 대조군에 비해 유의적으로 감소하였는데(p<0.01), 이는 학습 시험(acquisition trial) 시의 전기 자극을 기억하지 못함을 의미하여 기억력 감퇴모델이 잘 만들어졌다고 볼 수 있다.
스코폴라민으로 유도된 장기 기억력 감소는 용량 의존적으로 AEM (62.5, 125 및 250 ㎎ / ㎏)에 의해서 개선되었다.
실험예 3. 해마에서의 Akt 및 ERK 1/2의 인산화 분석
도 3a 내지 도 3c는 해마에서의 Akt 및 ERK 1/2의 인산화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 4는 면역 조직학적 분석을 나타내는 사진이다.
기억력을 개선시키는 AEM의 효과를 분자 메커니즘에서 규명하기 위해, 마우스 해마의 용해물에서의 Akt 및 ERK1/2의 인산화를 조사했다. 웨스턴 블롯 분석은 명확하게 스코폴라민이 세린 473 사이트에서 Akt 인산화를 감소시키고, 스레오닌 202 사이트 및 티로신 204 사이트에서 ERK1/2의 인산화를 감소시킨 것을 나타냈다.
AEM (125 및 250 ㎎ / ㎏)은 Akt의 인산화 감소를 충분히 반전시켰고, AEM (250 mg / kg)은 ERK1/2의 인산화를 충분히 회복시켰다.
조직학적 분석 사진을 살펴보면, 스코폴라민이 해마의 CA3 지역에서의 인산화된 ERK의 면역반응성을 감소시켰지만, 이 감소는 AEM 투여를 통해 회복되었음을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
    상기 몰약 추출물은,
    몰약 수지를 추출한 추출물이고,
    ICR 마우스 6주령 경구투여 기준으로 62.5~250 mg/kg 농도로 포함되며,
    Y-미로 시험, 수동회피 시험 및 Akt와 ERK의 인산화 시험을 통해서 단기적 및 장기적 기억력 개선 효능을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, 기억력 개선을 위한 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 몰약 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물로서,
    상기 몰약 추출물은,
    몰약 수지를 추출한 추출물이고,
    ICR 마우스 6주령 경구투여 기준으로 62.5~250 mg/kg 농도로 포함되며,
    Y-미로 시험, 수동회피 시험 및 Akt와 ERK의 인산화 시험을 통해서 단기적 및 장기적 기억력 개선 효능을 보유하고 있는 것을 특징으로 하는, 기억력 개선을 위한 식품 조성물.
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