KR102304605B1 - 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선 효과를 나타내는 약학 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 기억력 및 인지능력을 향상시킬 수 있으며, 아세틸콜린에스테라제 저해활성, 베타 아밀로이드의 생성 및 응집저해활성, 베타 아밀로이드 플라그 생성저해활성을 통해 부작용 없이 치매를 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선용 조성물{Composition for improvement of memory and cognition ability, prevention, delay, treatment or improvement of Alzheimer's disease, comprising extracts of Chionanthus retusa Lindl. ＆ Paxton leaf}

본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하여 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연, 치료 또는 개선 효과를 나타내는 약학 조성물 및 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.

이미 고령화 사회로 진입한 한국은 2018년 현재 노인인구 비율이 14.3%를 차지하며 치매환자의 수도 급속히 증가하고 있다. 2060년에는 약 40%로 증가할 것으로 예상된다. 이에 따라 치매환자의 수도 크게 증가할 것으로 예상된다. 이러한 현실은 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 국가 경쟁력 감소에 따라 커다란 사회 국가적 문제로 대두되고 있다.

치매(dementia)는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력과 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다. 치매는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 혈관성 치매 및 파킨슨 질환에 의한 퇴행성 질환, 갑상선 기능 감소증에 의한 대사성 질환, 뇌종양 또는 감염성 질환 등에 기인하는 기타 치매로 분류된다.

알츠하이머 질환은 치매의 가장 주요한 발병요인이며, 신경세포의 손실로 인한 중추신경계의 이상으로 인해 기억력 감퇴와 언어장애와 같은 지적능력의 상실에 이어 결국에는 죽음까지 이르게 하는 뇌의 퇴행성 신경질환이다.

아밀로이드전구단백질(Amyloid Precursor Protein; APP)로부터 생성되는 베타아밀로이드(β-amyloid; Aβ)는 알츠하이머의 주요한 병리학적 마커로 신경독성이 있어 치매를 유발한다고 알려져 있다. 치매환자들의 뇌를 살펴보면 신경세포인 뉴런의 손실과 함께 Aβ가 침착된 것을 볼 수 있다. 특히 기억과 인지능력을 담당하는 해마부위에 신경세포 손실과 Aβ 침착이 심한 것으로 나타난다. 또한 치매 환자는 정상에 비해 약 50% 정도 신경전달물질인 아세틸콜린(Acetylcholin; ACh)이 감소된 것을 나타낸다. 이는 ACh를 분해하는 효소인 아세틸콜린에스테라제(Acetylcholinesterase; AChE)의 비정상적인 농도 때문으로 보며, 실제로 치매환자에게서 정상인에 비해 AChE의 농도가 높게 나타난다.

따라서 Aβ 생산 및 응집의 저해, AChE의 저해가 알츠하이머 질환의 치료를 위한 잠재적 전략이 될 수 있다.

현재 치매 개선 약물로서는 아세틸콜린에스테라제의 저해제인 도네피질(donepezil), 갈란타민(galantamine) 및 리바스티크민(rivastigmine) 등이 임상에서 사용되고 있으나 치료효율이 낮고 부작용이 심하여 효과적인 치료제가 없는 실정이다.

이에 본 발명자는 부작용 없이 효과적으로 치매를 예방, 지연, 치료 또는 개선할 수 있는 약제를 개발하고자 식물체로부터 치매에 효과적인 물질들을 탐색해 왔으며, 이러한 결과를 통해 대한민국 등록특허 제10-1194091호, 제10-1480899호와 같은 기술을 개발한 바 있다.

본 발명자는 새롭고 치매에 보다 효과적인 물질을 개발하기 위하여 다양한 식물체를 대상으로 연구를 시도하였으며, 이들 중 이팝나무 잎이 가능성이 있음을 발견하게 되었다. 이를 바탕으로 보다 세부적이고 본격적인 연구를 통해 이팝나무 잎 추출물이 실험관 내(in vitro)에서 AChE 저해활성, Aβ 생성저해활성, Aβ 플라그 생성저해활성 및 Aβ 응집저해활성, 항산화 활성을 나타내었으며 더불어 동물실험 결과 기억력 및 인지능력을 향상시킬 수 있음을 발견하였다. 이를 통해 이팝나무 잎 추출물은 부작용 없이 치매를 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-1194091호 대한민국 등록특허 제10-1480899호

기억력 및 인지능력을 개선할 수 있으며, 부작용 없이 효과적으로 치매를 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있는 식물유래 물질을 함유하는 약학 조성물 및 기능성 식품 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 추출물은 이팝나무 잎의 10 내지 90%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 추출물은 이팝나무 잎의 건조물에 1 내지 20배 중량의 10 내지 90%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50 내지 90℃에서 1 내지 12시간 추출하여 수득한 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 추출물은 이팝나무 잎의 10 내지 90%(v/v) 에탄올 추출물인 것이 바람직하다.

본 발명의 기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 추출물은 이팝나무 잎의 건조물에 1 내지 20배 중량의 10 내지 90%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50 내지 90℃에서 1 내지 12시간 추출하여 수득한 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 기억력 및 인지능력을 향상시킬 수 있으며, 아세틸콜린에스테라제 저해활성, 베타 아밀로이드의 생성 및 응집저해활성, 베타 아밀로이드 플라그 생성저해활성을 통해 부작용 없이 치매를 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 아세틸콜린에스테라제(AChE) 저해활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. C, 음성대조군; 10 ~ 100, 농도(㎍/㎖)별 CRE 처리군; Tac 1μM, 양성대조군.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 Aβ 40(A) 및 42(B)의 분비 저해활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. C, 음성대조군; 1 ~ 100, 농도(㎍/㎖)별 CRE 처리군; B-SI 10μM, 양성대조군.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 Aβ 응집저해활성 실험 결과를 나타낸 것으로 50,000 배율의 TEM 사진이다. Aβ+DMSO, 음성대조군; Aβ+Cur, 양성대조군(커큐민 처리); Aβ+CRE, CRE 처리군.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 Aβ 응집저해활성 실험 결과를 나타낸 것으로 100,000 배율의 TEM 사진 및 이를 수치화하여 나타낸 그래프이다. Aβ+DMSO, 음성대조군; Aβ+Cur, 양성대조군(커큐민 처리); Aβ+CRE, CRE 처리군.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 ThT 분석을 통한 Aβ 응집저해활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. C, 음성대조군(DMSO 처리); Aβ+Cur, 양성대조군(커큐민 처리); Aβ+CRE, CRE 처리군.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 항산화활성 실험 결과를 나타낸 그래프이다. C, 음성대조군(DMSO 처리); 1 ~ 100 CRE, 농도(㎍/㎖)별 CRE 처리군; 1 ~ 100 Vit C, 농도(㎍/㎖)별 L-ascorbic acid 처리군(양성대조군).
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 단기기억력 개선효과 분석실험 결과를 나타낸 그래프이다. Aβ-, 정상군; Aβ+, 음성대조군; Aβ+CRE, CRE 투여군; Aβ+PG, 양성대조군.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 공간인지능력개선효과 분석 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 그래프 A, 지지대에 도착하는 거리를 측정한 그래프; 그래프 B, 지지대가 위치해 있던 곳을 통과하는 횟수를 측정한 그래프; 그래프 C, 지지대가 위치해 있던 곳을 처음 도달할 때의 시간을 측정한 그래프; Aβ-, 정상군; Aβ+, 음성대조군; Aβ+CRE, CRE 투여군; Aβ+PG, 양성대조군.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 뇌조직(cortex 영역) 내 Aβ 플라그 생성저해활성 실험 결과를 나타낸 그래프(C) 및 면역조직염색 현미경 사진(A, B)이다. Aβ-, 정상군; Aβ+, 음성대조군; Aβ+CRE, CRE 투여군; Aβ+PG, 양성대조군.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 추출물(CRE)의 뇌조직(hippocampus 영역) 내 Aβ 플라그 생성저해활성 실험 결과를 나타낸 그래프(C) 및 면역조직염색 현미경 사진(A, B)이다. Aβ-, 정상군; Aβ+, 음성대조군; Aβ+CRE, CRE 투여군; Aβ+PG, 양성대조군.

본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 추출물은 원재료로부터 용매를 사용하여 유효성분을 추출한 것을 의미한다.

이팝나무(학명 : Chionanthus retusa Lindl. & Paxton)는 물푸레나무목 물푸레나무과의 낙엽교목으로 본 발명에서는 잎 부위를 사용하며, 추출물 제조 시 잎을 건조 및 파쇄하여 추출원료로 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 상기 추출물의 제조를 위해 10 내지 90%(v/v)의 에탄올을 용매로 사용하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 30 내지 70%(v/v)의 에탄올, 더욱 바람직하게는 40 내지 60%(v/v)의 에탄올을 사용하는 것이 좋다. 또한 상기와 같은 용매의 양은 추출원료의 중량 기준 1 내지 20배로 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 5 내지 15배로 하는 것이 좋다. 추출온도는 50 내지 90℃가 바람직하며, 보다 바람직하게는 60 내지 80℃가 좋다. 추출시간은 1 내지 12시간이 바람직하며, 보다 바람직하게는 5 내지 7시간이 좋다. 이러한 추출조건에 따르면 상기 원재료로부터 본 발명에서 목적으로 하는 효과를 나타내는 성분을 효율적으로 추출할 수 있다.

본 발명의 추출물은 보다 바람직하게는 에탄올 추출 후 수득된 추출액을 감압가열농축한 다음 동결건조한 건조물의 형태인 것이 좋다.

이때 본 발명에서 기대하는 추출물의 효과가 충분히 발휘될 수 있도록 상기 감압가열농축은 50 내지 70℃, 진공도 100 내지 200torr의 조건 하에서 이루어지는 것이 바람직하며, 상기 동결건조는 -50 내지 -100℃에서 24 내지 48시간 이루어지는 것이 바람직하다.

본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 0.1 ~ 50중량%를 유효성분으로 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 주성분인 상기 추출물에 1종 또는 2종 이상의 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 약학적 제형으로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과의 결합뿐만 아니라 적당한 물질과 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에는 상기 주요성분 이외에도 보조성분으로서 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 아미노산 등의 화합물이 포함될 수 있으며, 이중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 ~ 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성효과를 상승 또는 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.

또한 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린 (Chlorophyllin), 플라보노이드(Flavonoid) 등의 천연색소 및 감미성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물이 적용될 수 있는 개체는 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 경구투여용으로 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하지만, 일일 투여량으로 상기 추출물의 양을 기준으로 0.1 내지 10㎎/㎏인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 내지 9㎎/㎏인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 5 내지 6㎎/㎏인 것이 좋으며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양으로 하는 것이 좋고, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 약학 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 기능성 식품은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.

본 발명의 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100중량부당 0.01 내지 0.04중량부, 바람직하게는 약 0.02 내지 0.03중량부 범위에서 선택하는 것이 바람직하다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이 밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 기능성 식품 100중량부당 0.01 내지 0.1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1. 추출물 제조

원재료인 이팝나무 잎을 건조하고 파쇄하여 추출물 제조에 사용하였다. 이팝나무 잎 파쇄물 중량(1㎏)을 기준으로 10배(10kg)에 달하는 50%(v/v) 에탄올을 첨가한 다음 70℃로 6시간 추출하고 1㎛ 공극 필터로 여과하여 추출액을 수득하였다. 이후 추출잔사에 다시 상기와 동일한 양(10kg)의 50%(v/v) 에탄올을 첨가하고 동일한 방법으로 추출 및 여과하여 추출액을 수득한 다음 먼저 수득한 추출액과 합했다.

두 번의 추출을 통해 수득한 추출액을 약 60℃, 진공도 약 145torr의 조건 하에서 감압 농축한 다음 동결건조기에서 약 -80℃로 36시간 동안 건조하였다. 이후 분쇄기로 분쇄하고 알루미늄 호일로 포장하여 이후의 실험에 사용하였다. 최종 제조된 추출물을 'CRE'라 명명하였다.

또한, 상기와 동일한 방법으로 추출물을 제조하되, 원재료로 홍삼만을 사용하여 추출물을 제조하고 이를 양성대조군으로 사용하였다.

실험예 1. 아세틸콜린에스테라제 저해활성 평가

신경반응과 기능에 가장 중요한 효소인 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE)에 대한 추출물의 영향을 확인하고자 하였다. CRE를 각각 농도별로 최종농도가 10, 50, 100㎍/㎖가 되도록 완충액으로 희석한 후, 희석한 추출물 30㎕, 0.3% acetylcholine esterase positive control 10㎕와 reaction mixture 50㎕을 96 well에 넣고, 37℃에서 20분간 반응시킨 후, 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 효소 활성 저해도를 계산하였다. 이때 양성 대조군으로 타크린(tacrin)을 1μM의 농도로 사용하였다.

이의 결과, 도 1과 같이 CRE는 농도 의존적으로 아세틸콜린에스테라제의 활성을 저해하는 것으로 나타났으며, IC50은 103.48㎍/㎖로 계산되었다.

실험예 2. Aβ 분비저해활성 평가

APPswe(human APP with the Swedish mutation) 세포를 사용하였다. 실험에 사용한 APPswe 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 Aβ42의 분비량이 정상세포에 비해 2배 이상 증가되어 있어 Aβ의 분비저해활성을 검색하기에 용이하다. APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA를 실시하였다. 1 × 10⁶ 세포를 60㎜ 접시에서 배양하여 serum-free DMEM으로 교환하고 16시간이 경과한 후, DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 CRE를 1, 10, 50, 100㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 양성대조군으로는 β-secretase inhibitor III(B-SI)(Calbiochem, Darmstadt, Germany) 10μM을 사용하였다. 이후 24시간 배양하고 배양액을 PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride)의 존재 하에서 회수하여 시료로 사용하였다.

이의 결과, 도 2과 같이 CRE는 농도 의존적으로 Aβ의 분비를 저해하는 것으로 나타났으며, Aβ40의 ED50은 78.94㎍/㎖, Aβ42의 ED50은 86.93㎍/㎖로 계산되었다.

실험예 3. Aβ 응집저해활성 평가(TEM 분석)

CRE가 Aβ의 응집에 미치는 영향을 분석하고자 다음과 같이 Aβ 응집반응을 유도한 후 Transmission electron microscopy(TEM) 분석을 수행하였다.

PBS로 희석한 Aβ42(20μM)를 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, CRE(10㎍/㎖)와 양성대조군인 커큐민(10μM)을 각각 5㎕씩 넣고 37℃에서 0, 5, 24시간 반응시켰다. 반응이 종료된 시료 10㎕를 400mesh Copper grids(Formvar/Carbon, Electron Microscopy Science)에 올려놓고 건조시킨 후, Milli-Q water 5㎕로 두 번 세척하였다. Milli-Q water를 제거한 grid를 1% uranyl acetate 10㎕로 1분 동안 염색한 후, 상온에서 15분 건조하여 FEI G2 Spirit Twin microscope(Hitachi H-7650, Japan)로 이미지를 얻었다. 이 때 각 시료 마다 3개 이상의 Aβ 응집체를 확보하였고, 이중 무작위로 3곳의 이미지를 선택하여 Image J2 (NIH)로 Aβ 응집정도를 정량하였다.

이의 결과, 도 3 및 4와 같이 CRE는 24시간 경과 시 음성대조군(Aβ+DMSO) 대비 46.5%의 우수한 Aβ 응집저해활성을 나타냈다. 양성대조군으로 사용한 커큐민은 같은 시간에서 29.58%의 저해활성을 나타냈다.

실험예 4. Aβ 응집저해활성 평가(ThT 분석)

또 다른 방법인 Thioflavine T(ThT) 분석법을 이용하여 CRE가 Aβ의 응집에 미치는 영향을 분석하였다.

PBS로 희석한 Aβ42(20μM)를 상온에서 15분 동안 반응시킨 후, CRE(10㎍/㎖)와 양성대조군인 커큐민(10μM)을 각각 5㎕씩 넣고 37℃에서 0, 5, 24시간 반응시켰다. 반응이 종료된 시료 10㎕와 ThT 1μM 용액 30㎕와 PBS 10㎕를 black 96 well에 넣은 뒤 ex: 485nm/ em: 535nm에서 형광흡광도를 측정하였다. 이때 얻은 흡광도값을 바탕으로 음성대조군을 기준으로 하여 응집정도를 정량하였다.

이의 결과, 도 5와 같이 CRE는 우수한 Aβ 응집저해활성을 나타냈다.

실험예 5. 항산화활성 평가

치매는 노화와 관련된 질병으로 노화는 산화스트레스와 밀접한 관련이 있다. 따라서 DPPH 라디칼 소거능 활성을 평가함으로서 CRE의 항산화활성을 확인하고자 하였다. CRE와 양성대조군(비타민 C; 아스코르빈산)을 최종농도가 1, 10, 50, 100㎍/㎖이 되도록 DMSO로 희석한 뒤, 각각 2.5㎕과 DPPH 용액 100μM 247.5㎕ 씩 96 well에 넣고 20분간 반응시킨 후, 415nm의 파장에서 흡광도를 측정하고, 산화활성 저해도를 계산하였다.

이의 결과, 도 6과 같이 CRE는 농도 의존적으로 우수한 항산화활성을 나타냈으며, IC50은 47.4㎍/㎖로 계산되었다.

실험예 6. 단기기억능력 검사(수동회피미로, passive avoid test)

CRE의 기억력 및 인지능력 개선 효과를 입증하기 위한 동물 실험을 요약하면 다음 표 1과 같다.

실험동물	ICR mice
실험약물	CRE
투여용량	500mg/kg
대조약물	홍삼추출물 100mg/kg
신경세포 손상 유발	β-Amyloid(1-42) 10nM
투여방법	당일 체중을 기준으로 체중 kg당 200㎕ 투여액량으로 하여 투여함 투여방법은 동물을 경배부 피부 고정법으로 고정 후 금속제 경구투여용 존대를 이용하여 위내에 직접주입

실험동물 : 생후 3주 된 수컷 ICR 생쥐를 (주)대한실험동물에서 구입하여 우석대학교 약학대학 실험동물실의 관리기준에 따라 수용하고 1주간 순화시킨 후, 건강한 것만을 선별하여 사용하였다.

시료의 투여 : 생쥐를 평균체중과 분산이 균질하도록 군(n=10)을 나누고, 위약 및 CRE를 용매(물)에 녹여 경구 투여하였다. CRE(500mg/kg)를 투여한 후 행동실험을 수행하였다. 양성대조군은 홍삼추출물(100㎎/㎏)을 투여하였고, 음성대조군은 증류수를 투여하였다.

베타 아밀로이드(β-Amyloid, Aβ) 42의 icv 투여에 의한 Aβ infarction 모델의 제조 : 생쥐를 마취한 후, 고정대에 고정하여 bregma 부분의 표피를 절개하였다. 특수 제작한 Hamilton 주사기로 Aβ42(25ng/㎖ in saline)를 5㎕ 취하여 2.4mm 깊이에 auto injector(1㎕/sec)로 주사하여 행동실험의 모델로 사용하였다.

단기작업기억 검사(passive avoidance test) : 제미니 회피 시스템(회피학습상자)을 이용하여 수동회피 기억시험을 수행하였다. 첫째 날의 트레이닝 실험에는 생쥐를 밝은 상자에 넣고 30초 동안 순화(acclimation)시킨 후, 자동으로 문이 열리게 하여 어두운 상자로 이동하도록 하고, 어두운 상자로 이동하면 0.8mA의 전기 자극을 3초간 가했다. 24시간 후의 테스트 실험에는 생쥐를 밝은 상자에 30초 동안 순화시킨 후 문을 열어주어 어두운 상자로 이동하게 하였다. 이때 전기 자극을 주지 않았으며, 어두운 상자로 이동할 때까지 걸리는 시간을 측정하였다.

이의 결과, 도 7과 같이 CRE는 기억력 개선에 우수한 효과를 보였다.

실험예 7. 공간인지능력 검사(수중미로 검사, morris water maze)

원형수조를 준비하고 수온은 약 25℃에 맞춘 다음 우유분말이나 식물성 염료를 물에 넣어 물이 혼탁해지도록 하고, 수면 밑 약 2cm 지점에 작은 탈출용 지지대(약 직경 11cm)를 위치시켰다. 생쥐는 시각정보를 이용해서 실험실 내의 단서를 찾아 지지대가 위치한 곳을 찾아낸다. Video tracking system을 이용하여 수영경로를 기록하고 경로의 길이, 수영속도, 각 사분원에서 보낸 시간 및 여러 변수를 측정하였다. 실험동물이 지지대 위치를 빨리 찾아 갈수록 수영시간(통상 수영시간이 2분이 되도록 훈련)은 단축될 것이다. 그리고 지지대를 없애면 사분원 중에서 지지대가 위치해 있던 곳에서의 수영시간이 늘어날 것이다. 마지막으로 깃발로 표시된 지지대를 이용한 실험을 하면 감각운동능력을 평가할 수 있다.

상기 실험예 6과 같이 CRE, 홍삼추출물, 베타 아밀로이드 등이 처리된 생쥐를 대상으로 수중미로 검사를 실시한 결과, 도 8과 같이 CRE는 인지능력 개선에 우수한 효과를 보였다.

실험예 8. 뇌조직 내 Aβ 플라그의 생성저해활성 평가

상기 실험예 6 및 7의 동물실험을 수행한 후 생쥐의 뇌조직을 취하고 Aβ에 대한 항체를 이용하여 면역조직염색을 수행하였다.

이의 결과, 도 9 및 10과 같이 CRE는 뇌조직 내 Aβ 플라그의 생성저해활성이 우수한 것으로 나타났다.

Claims (6)

1. 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 치매의 예방, 지연 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 이팝나무 잎의 10 내지 90%(v/v) 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 2항에 있어서,
   상기 추출물은 이팝나무 잎의 건조물에 1 내지 20배 중량의 10 내지 90%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50 내지 90℃에서 1 내지 12시간 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는 조성물.
4. 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 치매 예방, 지연 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 추출물은 이팝나무 잎의 10 내지 90%(v/v) 에탄올 추출물인 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 5항에 있어서,
   상기 추출물은 이팝나무 잎의 건조물에 1 내지 20배 중량의 10 내지 90%(v/v) 에탄올을 첨가하고 50 내지 90℃에서 1 내지 12시간 추출하여 수득한 것임을 특징으로 하는 조성물.
   

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