KR20160017457A - 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이팝나무 잎 추출물은 전자공여능(EDA; electron donating ability) 측정 실험SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정 실험실험, 아질산염 소거능(Nitrite scavenging ability) 측정크산틴 옥시다제 저해활성 (Xanthine oxidase inhibition ability) 측정 실험 등의 항산화 효과측정 실험(실험예 1); 콜라게나제 (Collagenase) 저해 활성실험, 엘라스타제 (Elastase) 저해 활성 등의 피부노화에 대한 영향측정 실험(실험예 2) 등을 통하여 피부 노화 관련 퇴행성 질환, 특히, 주름살 등의 피부노화에 탁월한 억제 효능이 있음을 확인하여 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물, 건강기능식품 또는 건강보조식품으로 유용하다.

Description

이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료용 조성물 {a composition comprising an leaf extract of Chionanthus retusus L. as an active ingredient for preventing or treating aging-involved degenerative disease}

본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

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본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

일상생활에서 섭취하는 각종식품 특히, 생체내의 유해성과 부작용이 적을 것으로 생각되어지는 일반 채소류와 동양의학에서 주로 이용되고 있는 한방생약자원으로부터 기능성약리 물질을 찾으려는 연구가 활발히 이루어지고 있다(Perry LM. (1990) In medicinal plants of east and southeast asia, attributed properties and uses. The Mit Press London, p. 431 ; Nguyen MT, Awale S, Tezuka Y, Tran QL, Watanabe H, Kadota S. (2004) Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants. Biol. Pharm. Bull., 27 : 1414-1421.). 국내에서도 오래전부터 사용되어온 한약자원은 치료 또는 예방의 용도로 이용되어 왔으나, 그 효능에 대해서는 과학적 근거를 명확히 제시하지 못하여 이에 대한 활용도가 상대적으로 낮은 편이다. 그러나 경제가 발전하고 소득이 증대됨에 따라 건강에 대한 관심이 높아지면서 한방생약자원의 활용과 약용식물의 관심 및 재배가 점차 증가하는 추세에 있다.

최근 생활환경과 식생활 패턴의 변화 등으로 현대인들은 여러 가지 만성질환 및 성인병의 발생 위험이 증가되고 있으며, 생의학 과학(biomedical science) 분야에서는 노화를 포함한 다양한 질병에 자유 라디칼(free radical)이 주원인 중 하나로 주목받고 있다. 자유 라디칼은 강한 산화력으로 생명체에 치명적인 산소 독성을 일으키며, 동맥경화, 당뇨병, 뇌졸중, 자가면역질환, 암 등과 같은 각종 질병과 DNA합성 억제 등의 심각한 생리적 장애를 일으킨다(Fridorich I. (1978) The biological activity of oxygen radicals. Science, 201 : 875-881; Imlay IA, Limm S. (1986) DNA damage and oxygen radical toxicity. Science, 240 : 1302-1309.; Ames BN, Shigenaga MK, Hagen TM. (1993) Oxidants antioxidants and the degenerative disease of aging. Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 90 : 7915-7922.). 특히 생체막의 불포화 지방산을 산화시켜 지질과산화물의 축적과 조직의 과산화적 손상을 초래함으로써 생체기능의 저하 및 노화, 성인병을 유발하는 것으로 보고되어 있다(Chance B, Sies H, Boveris, A. (1979) Hydroperoxide metabolism in mammalian organs. Physiol. Rev., 59 : 527-605 ; McCord JM. (1987) Oxygen-derived radicals; a link between repercussion injury and inflammation. Fed. Proc., 46 : 2402-2406.). 그러므로 생체내의 자유 라디칼 생성을 저해시키고, 질병 예방을 목적으로 생리활성이 많이 함유된 것으로 생각되는 생약자원을 탐색하고 이를 연구 개발하는 것이 매우 중요하다.

이팝나무(Chionanthus retusa L_{INDLEY ET} P_AXTON)는 물푸레나무과(Oleaceae)에 속하는 다년생 낙엽교목으로 이명으로는 육도목(六道木), 류수수(流茱樹), 다엽수(茶葉樹), 우근자(牛筋子), 조금자(鳥金子), 니암나무, 뻣나무 등으로도 불리운다. 이팝나무라는 식물명은 4～5월에 개화하는 꽃이 쌀밥과 같다 하여 이팝나무라고 명명하게 되었다고 하며, 잎은 대생으로 타원형, 난형, 또는 도란형이며 엽저는 둔하며 잎자루가 길다. 타원형의 열매는 9～10월에 성숙되며 흑벽색을 띤다. 예로부터 민간에서는 이팝나무 종자를 설사를 멈추는 지사작용(止瀉作用), 위장을 튼튼하게 하는 건위(健胃) 효능이 있어 강장제나 지사제로 사용하였으며, 해열 및 중풍 등의 치료제로도 사용하였다(이창복. (1999) 대한식물도감. 향문사. 616.; 김태경. (1996) 한국의 자원식물. 서울대학교출판부. 255.). 또한 이팝나무의 어린잎은 나물로 식용하였으며, 차(茶)로 마시기도 하였다. 최근에는 이팝나무가 가로수 및 조경용으로도 많이 식재되고 있다.

그러나 상기 문헌의 어디에도 이팝나무 잎 추출물을 이용한 노화 관련 퇴행성 질환에 대한 치료효능에 대한 내용이 개시되거나 교시된 바는 없다.

이에, 본 발명자들은 본 연구자는 이팝나무 잎 추출물을 대상으로 전자공여능(EDA; electron donating ability) 측정 실험SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정 실험아질산염 소거능(Nitrite scavenging ability) 측정크산틴 옥시다제 저해활성 (Xanthine oxidase inhibition ability) 측정 등의 항산화 효과측정실험(실험예 1); 콜라게나제 (Collagenase) 저해 활성 엘라스타제 (Elastase) 저해 활성 등의 피부노화에 대한 영향측정 실험(실험예 2) 등을 통하여 노화 관련 퇴행성 질환, 특히, 주름살 등의 피부노화에 탁월한 억제 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 상기 이팝나무 잎은 가공처리 또는 비가공처리된 잎을 포함한다.

본원에서 정의되는 가공처리는 통상적으로 당업계에 잘 알려진 차를 제조하는 공정, 즉, 덖는 공정을 포함하며, 구체적으로는, 음건한 재료를 덖기, 비비기, 및 식히기 단계를 1 내지 10회, 바람직하게는 1 내지 5회, 반복실시하는 가공처리 공정을 포함한다.

구체적으로 상기 덖기, 비비기, 및 식히기 단계는 100 내지 300℃, 바람직하게는 150 내지 180℃의 반응온도에서 약 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 15분 동안 덖는 과정을 10회 내지 200회, 바람직하게 20회 내지 100회 반복적으로 덖는 단계; 약 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 비비는 비비기 단계; 및 약 10분 내지 120분, 바람직하게는 10분 내지 60분 동안 상온에서 식히기 단계를 1차로 수행하고; 60 내지 200℃, 바람직하게는 80 내지 180℃의 반응온도에서 약 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 15분 동안 덖는 과정을 10회 내지 200회, 바람직하게 20회 내지 100회 반복적으로; 약 1분 내지 60분, 바람직하게는 5분 내지 20분 동안 비비는 비비기 단계; 및 약 10분 내지 120분, 바람직하게는 10분 내지 60분 동안 상온에서 식히기 단계를 2차 내지 10차, 바람직하게는 2차 내지 5차로 반복 수행함을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 상기 추출물은 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는, 물 또는 물 및 에탄올 추출물에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 "노화 관련 퇴행성 질환”는 주름살, 기미 등의 피부노화, 동맥경화, 당뇨병, 뇌졸중, 자가면역질환, 암, 바람직하게는 주름살, 기미 등의 피부노화를 포함한다.

이하, 구체적으로 본 발명의 이팝나무 잎 추출물을 수득하는 제조방법을 설명한다.

예를 들어, 본 발명의 이팝나무 잎 추출물은 음건한 이팝나무 잎 또는 통상적으로 당업계에 잘 알려진 차를 제조하는 공정, 즉, 덖는 공정을 포함하며, 구체적으로는, 음건한 이팝나무 잎 재료를 덖기, 비비기, 및 식히기 단계를 1 내지 10회, 바람직하게는 1 내지 5회, 반복실시하는 가공처리 공정을 거친 이팝나무 잎을 세척 및 건조시킨 후, 시료 부피의 약 1배 내지 30배, 바람직하게는 약 5배 내지 25배 (v/v) 부피의 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로, 바람직하게는 물 또는 물 및 에탄올 혼합용매, 보다 바람직하게는 물을 추출용매로 하여, 약 10 내지 120℃, 바람직하게는 20 내지 110℃의 반응온도에서 약 30분 내지 6일, 바람직하게는 1시간 내지 48시간 동안 상온 추출법, 가열추출법, 초음파 추출법, 환류 추출법 등의 통상적인 추출방법, 바람직하게는 환류 추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과하여 감압 농축하는 제 3단계; 상기 농축된 추출물을 약 -50℃ 내지 -30℃에서 약 24 내지 72시간 동결 건조하는 제 4단계의 제조방법을 포함하는 단계를 통하여 본 발명의 추출물을 수득가능하다.

따라서 본 발명은 상기의 제조방법 및 상기 제조방법으로 얻어진 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 대상으로 전자공여능(EDA; electron donating ability) 측정 실험SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정 실험아질산염 소거능(Nitrite scavenging ability) 측정크산틴 옥시다제 저해활성 (Xanthine oxidase inhibition ability) 측정 등의 항산화 효과측정실험(실험예 1); 콜라게나제 (Collagenase) 저해 활성 엘라스타제( Elastase) 저해 활성 등의 피부노화에 대한 영향측정 실험(실험예 2) 등을 통하여 노화 관련 퇴행성 질환, 특히, 주름살 등의 피부노화에 탁월한 억제 효능이 있음을 확인하여 노화 관련 퇴행성 질환의 치료 및 예방에 유용함을 확인하였다.

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 생약 추출물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 추출물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 그러므로 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 및 직장, 또는 정맥 등의 방법을 통하여 투여 할 수 있다.

또한 본 발명은 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 건강기능식품은 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 정제물을 0.01 내지 95%, 바람직하게는 1 내지 80% 중량백분율로 포함한다.

또한, 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 위한 목적으로 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품으로 제조 및 가공이 가능하다.

또한, 본 발명은 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품 또는 식품첨가물을 제공한다.

또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 추출물이 포함된 기능성 식품으로는 빵, 떡류, 건과류, 캔디류, 초콜릿류, 츄잉껌, 쨈류와 같은 과자류 아이스크림류, 빙과류, 아이스크림 분말류와 같은 아이스크림 제품류 우유류, 저지방 우유류, 유당분해우유, 가공유류, 산양유, 발효유류, 버터유류, 농축유류, 유크림류, 버터유, 자연치즈, 가공치즈, 분유류, 유청류와 같은 유가공품류 식육가공품, 알가공품, 햄버거와 같은 식육제품류 어묵, 햄, 소세지, 베이컨 등의 어육가공품과 같은 어육제품류 라면류, 건면류, 생면류, 유탕면류, 호화건먼류, 개량숙면류, 냉동면류, 파스타류와 같은 면류 과실음료, 채소류음료, 탄산음료, 두유류, 요구르트 등의 유산균음료, 혼합음료와 같은 음료 간장, 된장, 고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 식초, 소스류, 토마토케첩, 카레, 드레싱과 같은 조미식품 마가린, 쇼트닝 및 피자를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 정제물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, (예를 들어, 포도당, 과당 등); 디사카라이드, (예를 들어 말토스, 슈크로스 등); 및 폴리사카라이드, (예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등)과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖ 당 일반적으로 약 1~20g, 바람직하게는 약 5~12g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명의 추출물은 목적 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖ 을 기준으로 0.02 내지 5g, 바람직하게는 0.3 내지 1g 의 비율로 가할 수 있다.

상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 정제물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.

본 발명에 따른 이팝나무 잎 추출물은 전자공여능(EDA; electron donating ability) 측정 실험SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정 실험실험, 아질산염 소거능(Nitrite scavenging ability) 측정크산틴 옥시다제 저해활성 (Xanthine oxidase inhibition ability) 측정 실험 등의 항산화 효과측정 실험(실험예 1); 콜라게나제 (Collagenase) 저해 활성실험, 엘라스타제( Elastase) 저해 활성 등의 피부노화에 대한 영향측정 실험(실험예 2) 등을 통하여 피부 노화 관련 퇴행성 질환, 특히, 주름살 등의 피부노화에 탁월한 억제 효능이 있음을 확인하여 피부 노화 관련 퇴행성 질환의 개선 및 예방에 활용될 수 있다.

도 1: 본 발명의 가공잎 추출물의 제조 공정을 나타내는 그래프이며;
도 2: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출 수율을 나타내는 그래프이며;
도 3: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량 변화를 나타내는 그래프이며;
도 4: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량 변화를 나타내는 그래프이며;
도 5: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 수용성 단백질 함량변화를 나타내는 그래프이며;
도 6: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 환원당 함량변화를 나타내는 그래프이며;
도 7: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 전자공여능에 미치는 영향을 나타낸 도이며;
도 8: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 SOD 유사활성능을 나타낸 도이며;
도 9: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 아질산염 소거능 (pH 1.2)을 나타낸 도이며;
도 10: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 아질산염 소거능(pH 3.0)을 나타낸 도이며;
도 11: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 크산틴옥시다제 저해활성을 나타낸 도이며;
도 12: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 콜라게나제 저해활성을 나타낸 도이며;
도 13: 본 발명의 덖음 횟수에 따른 이팝나무 추출물의 엘라스타제 저해활성을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의하여 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 잎 추출물의 제조(도 1 참조)

하기와 같이 이팝나무(Chionanthus retusus L.)의 잎을 대상으로 비가공 또는 가공처리하여 추출물을 제조하였다.

1-1. 실험 재료

본 실험 재료인 이팝나무(Chionanthus retusus L.)의 잎은 2014년 4-5월경에 경북 경산시와 자인면 일대에서 20∼50mm 이내의 엽병을 포함한 이팝나무 잎을 채취하였다.

1-2. 이팝나무 잎의 덖기

채취된 이팝나무 잎은 이물질 제거를 위하여 흐르는 물에 세척한 후 물기를 제거하고 4-6시간 동안 음건하였으며, 이를 1 회차는 150∼180℃에서 약 10분 동안 40∼50회 덖고, 약 10분간 비비기를 한 약 30분 동안 상온에서 식혔다. 그리고 25회차까지는 100∼150℃의 조건에서 약 10분 동안 40∼50회 덖고, 약 10분간 비비기를 한 후 약 30분 동안 상온에서 식히기 등 일련의 차제조 공정를 1∼5회 실시하여 건조하였으며 이를 본 실험의 재료로 사용하였다.

1-3. 추출물 제조

이팝나무는 채집된 비가공 잎과 1회, 3회, 및 5회 덖은 이팝나무 잎 4종류를 환류 냉각관을 부착시킨 둥근 플라스크에 시료 당 10배(40g/400mL)에 해당하는 증류수와 70% 에탄올(ethyl alcohol)을 넣고 물 추출물(WE; water extract)은 80℃의 조건에서 추출하였으며, 에탄올 추출물 (EE; ethanol extract)은 60℃의 조건하에서 환류 추출장치(C-WB-6, Changshin, Korea)를 이용하여 3시간씩 3회 반복 추출하였다.

4종류의 이팝나무 잎 추출물은 여과지(filter paper, Whatman No 2, Kent, England)로 여과한 후, 감압회전농축기(rotatory vacuum evaporator, Eyela 400 series, Japan)를 이용하여 1/50배로 농축 한 후 -35℃의 조건에서 동결건조(FD 5510 SPT, Ilshin Korea)하여 분말로 제조하였으며, 추출물은 일정농도로 증류수나 80% 에탄올에 희석하여 이팝나무 어린잎 생체와 1회, 3회, 5회 덖은 이팝나무 잎의 생리활성을 측정하기 위한 시료액으로 사용하였다.

여기에서, 어린잎 생체와 1회, 3회, 5회 덖은 이팝나무 잎 물추출물들을 각각 WE-NR. WE-R1, WE-R3, 및 WE-R5라 각각 지칭하고, 이들의 에탄올 추출물들을 각각 EE-NR. EE-R1, EE-R3, 및 EE-R5라 각각 지칭하였다.

1-4. 추출수율

이팝나무 잎의 생체와 1회, 3회, 5회 덖은 이팝나무 잎 추출물을 시료 당 10배에 해당하는 증류수와 70% 에탄올로 추출 후 농축하고 동결건조 한 각 추출물의 고형분 수율을 측정한 결과는 표 1 및 도 2에 나타내었다.

이팝나무 잎은 5회 덖은 잎의 70% ethanol을 용매로 추출시 6.10%로 가장 수율이 높았으며, 덖지 않은 생체 물 출물이 1.81%로 가장 낮은 수율을 나타내었다. 물보다는 에탄올을 용매로 추출한 경우가 좀더 많은 고형분이 추출된 것으로 분석되었으며, 이팝나무 잎을 덖는 횟수가 증가할수록 수율 또한 증가하였다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출 수율

Sample	Extract Yield(%)
	WE1 )	EE2 )
No roast(fresh leaf)	1.81	2.12
Roast - 1 time	4.35	5.12
Roast - 3 time	4.88	5.76
Roast - 5 time	4.96	6.10
1)WE : Water Extract using reflux extraction at the 80℃ temperature condition. 2)EE : 70% ethanol Extract using reflux extraction at the 60℃ temperature condition.

<실험예 1> 성분 함량 분석실험

상기 실시예 시료의 성분함량을 확인하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

1-1. 총 폴리페놀 화합물(Total polyphenol compounds) 함량

각 추출물의 동결 건조된 시료는 1 mg/mL의 농도로 증류수에 희석하여 문헌(A.O.A.C. (2005) Official method of analysis. 18th ed., Association of official analytical chemists. Washington DC USA 45 : 21-22.)에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 측정하였다.

시약( Folin-ciocalteu's phenol reagent, 2011J1032, Junsei chemical, Japan) 0.2 mL를 첨가하여 혼합한 후 3분간 실온에서 방치한 다음, Sodium carbonate(Na₂CO₃) 포화용액 0.4 mL를 가하여 혼합하였다. 여기에 증류수를 1.4 mL 가하고 실온에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV/VIS 광학기기(spectrophotometer, Mecasys Optizen POP, Korea)를 사용하여 725 nm에서 흡광도를 측정하였다. 총 폴리페놀 화합물은 탄닌산(tannic acid, SZBB2500V, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 를 이용하여 최종농도가 0, 31.25, 62.5, 125, 250 μg/mL가 되도록 취하여 위와 같은 방법으로 725nm에서 흡광도를 측정한 후, 표준곡선으로부터 이팝나무 어린 잎 추출물의 총 폴리페놀 화합물 함량을 구하였다.

이팝나무 잎의 덖음 횟수에 따른 폴리페놀 화합물 함량을 상기한 바와 같이 측정한 결과, 표 2 및 도 3에 나타낸 것과 같이 이팝나무 잎을 5회 덖은 후 물을 용매로 추출한 WE-R5 추출물이 고형분 1g 당 96.81 mg을 함유하였으며 덖지 않은 EE-NR이 33.96 mg/g을 함유하였다. 모든 추출물은 물을 용매로 추출시 에탄올 추출물보다 많은 폴리페놀 화합물이 추출되었으며, 특히 덖지 않은 WE-NR(81.79 mg/g)은 EE-NR(33.96 mg/g)보다 2.4배 많은 폴리페놀을 함유하였다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 총 폴리페놀 함량

Sample	Total polyphenol compound content(mg/g)
	WE	EE
No roast(fresh leaf)	81.79±0.62d1 )	33.96±0.36d
Roast - 1 time	84.39±1.19c	52.63±0.85c
Roast - 3 time	90.08±1.91b	63.80±1.72b
Roast - 5 time	96.81±1.80a	79.59±1.21a
1)Values represent the mean±SD(n=3) and mean with different superscripts within the row are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan’ multiple range test

1-2. 총 플라보노이드 화합물(Total flavonoid compounds) 함량

동결건조하여 분말화 된 이팝나무 잎 시료에 대한 플라보노이드 정량은 문헌 (Nieva Moreno MI, Isla MI, Sampietro AR, Vattuone MA. (2000) Comparison of the free radical-scavenging activity of propolis from several regions of Argentina. J Ethnopharmacol 71 : 109-114.)에 기재된 방법을 변형하여 하기와 같이 측정하였다.

각 농도별 시료 추출액 0.1 mL에 10% aluminum nitrate(237973, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 0.1 mL와 1 M potassium acetate, 68H0147, SZBB2500V, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 0.1 mL 그리고 80% ethanol 4.7 mL를 가하여 25℃에서 40분간 반응시킨 후 광학기기(spectrophotometer, Mecasys Optizen POP, Korea)를 사용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이팝나무 잎의 플라보노이드 화합물 정량은 퀘르세틴(quercetin, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)를 이용하여 최종농도가 0, 10, 25, 50, 100, 250, 500 μg/mL가 되도록 취하여 위와 동일한 방법으로 측정한 검량선으로부터 산출하여 이팝나무 덖음 횟수에 따른 각 추출물의 플라보노이드 화합물 함량을 나타내었다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 플라보노이드 화합물 함량은 표 3 및 도 4에 나타낸 것과 같이 5회 덖은 후 에탄올을 용매로 추출한 EE-R5 추출물이 가장 많은 160.72 mg/g을 함유하였으며, 모든 추출물은 덖음 횟수가 증가할수록 플라보노이드 화합물 함량이 증가하였다. 그리고 물 추출물보다는 에탄올 추출물이 좀 더 많은 플라보노이드 화합물이 함유된 것으로 나타났다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 총 플라보노이드 함량

Sample	Total flavonoid compound content(mg/g)
	WE	EE
No roast(fresh leaf)	34.29±0.40d1 )	93.95±2.36d
Roast - 1 time	117.38±0.85c	122.41±0.85c
Roast - 3 time	131.46±1.34b	135.40±1.39b
Roast - 5 time	146.51±0.68a	160.72±1.07a
1)Values represent the mean±SD(n=3) and mean with different superscripts within the row are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan’ multiple range test

1-3. 수용성 단백질(Soluble protein) 함량

이팝나무 잎 추출물에 함유된 수용성 단백질 함량은 문헌 (Lowry OH, Roserbrough NJ, Farr AL, Randall RJ. (1951) Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 : 265-275)에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 측정하였다.

이팝나무 잎을 추출하여 분말화된 시료 1 g을 일정농도로 희석한 시료 0.2 mL를 시험관에 취하고 혼합시약 A:B=50:1, A; 2% Na₂CO₃(S4132, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) in 0.1N NaOH(C11411, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA), B; 1% C₄H₄KNaO₆(217255, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) in 0.5% CuSO₄5H₂0(03221, DC chenmical, Korea))을 1mL 첨가하여 30℃에서 10분간 반응시켰다. 여기에 0.1mL 시약(Folin-ciocalteu's phenol reagent, 2011J1032, Junsei chemical, Japan)를 첨가, 다시 실온에서 30분간 반응시킨 후, 광학기기(spectrophotometer, Mecasys Optizen POP, Korea)를 사용하여 750 nm에서 흡광도를 측정하였다. 우 혈청 알부민(Bovine serum albumin, 67H1573, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)으로 검량선을 작성하여 단백질의 함량을 산출하고 이를 이팝나무 잎의 단백질 함량으로 나타내었다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 수용성 단백질 함량은 표 4 및 도 5에 나타내었다. 1회 덖은 후 물을 용매로 추출한 WE-R1이 60.76 mg/g의 수용성 단백질을 함유하였으며, 3회 덖은 WE-R3은 59.19 mg/g으로 유사한 함량을 나타내었다. 에탄올 추출물은 물 추출물보다는 낮은 수용성 단백질을 함유하였으며, 덖음 횟수가 증가할수록 함량이 낮아졌다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 수용성 단백질 함량

Sample	Soluble protein compound(mg/g)
	WE	EE
No roast(fresh leaf)	57.39±0.72ab1 )	54.76±0.91a
Roast - 1 time	60.76±0.59a	48.60±0.27b
Roast - 3 time	59.19±1.12a	42.09±0.41c
Roast - 5 time	52.22±1.91c	33.50±0.46d
1)Values represent the mean±SD(n=3) and mean with different superscripts within the row are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan’ multiple range test

1-4. 환원당(Reducing sugar) 함량

이팝나무 잎 시료를 일정농도로 희석하여 문헌(Nelson N. (1944) A photometric adaption of the somogyi method for determination of glucose. J Biol Chem. 153 : 375-380)에 기재된 방법에 따라 하기와 같이 측정하였다.

시료액 1 mL에 혼합시약A : B=25 : 1, A; d₃H₂0 1 L in anhydrous Na₂HPO₄(RES20908-A7, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 25 g, C₄H₄O₆KNa 4H₂0(4590, Duksan chemical, Korea) 25g, Na₂HCO₃(S5761, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 20 g, anhydrous Na₂SO₄(239313, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 200 g, B; d₃H₂0 200 mL in CuSO₄ 5H₂O(03221, Duksan chemical, Korea) 30g, Concentrate H₂SO₄(339741, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 4 drop)을 0.5 mL 첨가하여 20분간 가열한 후 냉각하여 C액 total 500 mL 37℃보관/1 day-(NH₄)6Mo₇O₂₄ 4H₂O(D4U511, Duksan chemical, Korea) 25 g in d ₃H₂0 450 mL including, concentrate H₂SO₄(339741, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 21 mL + Na₂HAsO₄ 7H₂O(051712, Samchun, Korea) 3 g in d₃H₂0 25 mL)을 1 mL 첨가하여 실온에서 반응시킨 다음, d₃H₂0 5mL를 혼합하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

환원당 함량은 포도당(glucose, 041K0184, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)로 위와 동일한 방법으로 측정하여 검량선을 작성하고 이를 이팝나무 잎의 각 추출물에 함유된 환원당 함량을 산출하였다.

이팝나무 잎의 각 추출물에 함유된 환원당 함량을 산출한 결과는 표 5 및 도 6에 나타낸 것과 같이 이팝나무 잎 추출물은 덖지 않은 WE-NR에서 259.85 mg/g으로 가장 많은 환원당을 함유하였으며, 다음으로 에탄올을 용매로 5회 덖은 EE-R5 추출물이 202.59 mg/g을 함유하였으며, 덖지 않은 EE-NR이 194.44 mg/g의 환원당을 함유하였다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 환원당 함량

Sample	Reducing sugar compound(mg/g)
	WE	EE
No roast(fresh leaf)	259.85±4.17a1 )	194.44±1.26b
Roast - 1 time	171.36±3.67bc	170.76±4.58d
Roast - 3 time	175.71±4.17b	179.34±2.47c
Roast - 5 time	176.46±0.70b	202.59±1.21a
1)Values represent the mean±SD(n=3) and mean with different superscripts within the row are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan’ multiple range test

< 실험예 2> 항산화 효과

상기 실시예 시료들의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 하기와 같은 다양한 실험을 수행하였다.

2-1. 전자공여능 ( EDA ; electron donating ability ) 측정 실험

상기 실시예 시료들의 전자공여능에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같은 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다.(Blois MS. (1958) Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature, 181 : 1199-1200.).

각 이팝나무 잎 추출물의 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)에 대한 수소공여 효과로 측정하였다. 일정 농도의 시료 2 mL에 0.2 mM DPPH용액(085K1471, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA, 99% ethanol에 용해)을 1 mL 가하고 혼합하여 37℃에서 30분간 반응시켰다. 이 반응액을 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며 전자공여능은 시료 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

DPPH에 대한 이팝나무잎 추출물의 전자공여능은 표 6 및 도 7에 나타낸 것과 같이 1,000 ug/mL의 농도에서 WE-R5가 94.56%로 가장 우수한 전자공여활성을 나타내었으며, 덖지 않은 WE-NR도 94.09%로 유의적 차이가 없었다(p<0.05). 물 추출물은 모든 추출물이 100 ug/mL의 농도에서 70% 이상의 활성을 나타내었으며, 특히 5회 덖은 WE-R5는 88.93%의 전자공여능을 나타내었으며, 300 ug/mL의 농도에서도 92% 이상의 활성을 나타내었다. 그러나 에탄올을 용매로 추출한 이팝나무 추출물은 1회와 3회 덖은 경우 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 88.46%와 89.59%의 활성을 나타내었으며, 5회 덖은 EE-R5는 84.25%로 덖지 않은 EE-NR(86.43%)보다 낮은 활성을 나타내었다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 전자공여능

Sample1 )	Concentration(ug/mL)
	100	300	500	1,000
WE-NR	76.51±1.35bD2 )	89.61±0.91bC	93.03±0.50aB	94.09±0.10aA
WE-R1	71.64±1.62dD	80.98±0.94cC	87.94±0.41cB	91.78±0.30bA
WE-R3	73.36±1.50cD	87.85±0.18cC	90.85±0.38bB	91.41±0.11bA
WE-R5	88.93±0.65aD	92.08±0.39aC	92.89±0.39aB	94.56±0.54aA
EE-NR	58.47±1.48cD	73.73±1.06cC	81.43±0.80cB	86.43±0.80bA
EE-R1	64.99±1.22bD	75.79±0.61bC	83.50±1.21abB	88.46±0.71aA
EE-R3	68.96±1.23aD	78.84±1.06aC	85.19±0.77aB	89.59±0.47aA
EE-R5	59.54±1.24cD	73.86±0.82cC	78.95±0.72dB	84.25±0.62cA
1)WE-NR is water extract of C. retusus fresh leaves. WE-R1 is water extract of C. retusus 1 time roasting leaves. WE-R3 is water extract of C. retusus 3 time roasting leaves. WE-R5 is water extract of C. retusus 5 time roasting leaves. EE-NR is 70% ethanol extract of C. retusus fresh leaves. EE-R1 is 70% ethanol extract of C. retusus 1 time roasting leaves. EE-R3 is 70% ethanol extract of C. retusus 3 time roasting leaves. EE-R5 is 70% ethanol extract of C. retusus 5 time roasting leaves. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

2-2. SOD 유사활성(Superoxide dismutase-like activity) 측정 실험

상기 실시예 시료들의 SOD 유사활성에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같은 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다.(Marklund S, Marklund G. (1975) Involvement of superoxide amino radical in the oxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur. J. Biochem., 47 : 468-474.)

각각의 이팝나무 잎 추출물의 SOD 유사활성은 Marklund와 Marklund(1975)의 방법에 따라 유해 환원 산소종을 과산화수소(H₂O₂)로 전환시키는 반응을 촉매하는 피로갈롤(pyrogallol)의 산화된 양을 측정하여 SOD 유사활성으로 나타내었다.

일정 농도의 시료 0.2 mL에 pH 8.5로 보정한 tris-HCl buffer(72H5639, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA, 50 mM tris [hydroxymethyl] amino-methane＋10 mM EDTA, pH 8.5) 2.6 mL와 7.2 mM pyrogallol(10323HB, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA), 0.2 mL를 첨가하여 25℃에서 10분간 반응 후, 1 N HCl 0.1 mL를 가하여 반응을 정지시켰다. 반응액 중 산화된 피로갈롤의 양은 420 nm에서 흡광도를 측정하여 시료 첨가 전·후의 흡광도의 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

이팝나무 잎 덖은 횟수에 따른 각 시료의 추출물에 대한 SOD 유사활성능의 실험결과는 5회 덖은 이팝나무 물 추출물인 WE-R5의 1,000 ug/mL의 농도에서 16.32%로 가장 우수한 활성을 나타내었으나 덖지 않은 이팝나무 잎은 SOD 유사활성이 없었으며, 1회 덖은 이팝나무 추출물에서도 100 ug/mL의 농도에서는 활성이 나타나지 않았다(표 7 및 도 8). 에탄올 보다는 물 추출물이 더 우수한 SOD 유사활성을 나타내었으며, 3회 덖은 물 추출물이 5회 덖은 에탄올 추출물보다 약간 더 높은 활성을 나타내어 물을 용매로 추출하는 것이 더 나은 추출방법으로 사료된다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 SOD 유사활성능

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1,000
WE-NR	-	-	-	-
WE-R1	-	4.04±0.78cC2 )	7.17±0.78cAB	8.07±0.90cA
WE-R3	5.04±0.51bD	8.30±0.93bC	11.41±0.68abB	13.78±0.89bA
WE-R5	7.72±0.40aD	10.61±0.85aC	12.63±0.79aB	16.32±0.46aA
EE-NR	-	-	-	-
EE-R1	-	2.40±0.96cC	4.49±0.73cB	6.89±0.73cA
EE-R3	4.43±0.53bD	6.88±0.90bC	9.33±1.32abB	12.08±0.95abA
EE-R5	6.13±0.56aD	8.74±0.56aC	10.99±1.39aB	13.60±1.28aA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 6. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

2-3. 아질산염 소거능(Nitrite scavenging ability) 측정

상기 실시예 시료들의 아질산염(NaNO₂) 소거능에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같은 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Kato H, Lee IE, Chuyen NV, Kim SB, Hayase F. (1987) Inhibition of nitrosamine formation by nondialyzable melanoidins. Agric. Biol. Chem. 51: 1333-1338).

1 mM의 NaNO ₂ 용액 2 mL에 일정 농도의 실시예 추출물을 첨가하고, 여기에 0.1 N HC (pH 1.2)과 0.2 M citrate buffer를 사용하여 반응용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 6.0으로 조정한 다음, 반응용액의 부피를 10 mL로 하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 각각 1 mL씩 취하였다. 여기에 2% 아세트산(acetic acid)을 5 mL를 첨가하고, 그리스 시약 (griess reagent) A:B=1:1, A; 1% sulfanilic acid(8L1411, Junsei chemical, Japan) in 30% acetic acid, B; 1% naphthylamine(124K0573, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) in 30% acetic acid) 0.4 mL 첨가하여 혼합한 후, 실온에서 15분간 반응시켰다. 반응시킨 시료를 520 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 그리스 시약 대신 증류수 0.4 mL를 가하여 위와 동일한 방법으로 측정하여 시료의 첨가구와 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.

이팝나무 추출물을 농도와 pH의 조건에 따라 아질산염 소거능을 측정한 결과를 표 8-10 및 도 9 내지 10에 나타낸 것과 같이 이팝나무 잎은 1,000 ug/mL의 농도에서 WE-R1이 74.53%로 가장 우수한 전자공여활성을 나타내었으며, 덖지 않은 WE-NR도 69.41%로 높은 활성을 나타내었다. 에탄올을 용매로 추출한 이팝나무 잎 추출물도 1회 덖은 EE-R1이 68.54%로 가장 우수한 전자공여능을 나타내었고, 덖지 않은 EE-NR에서도 66.73%의 활성으로 유의적 차이가 없었다(p<0.05).

물 추출물은 모든 추출물이 100 ug/mL의 농도에서 70% 이상의 활성을 나타내었으며, 특히 5회 덖은 WE-R5는 88.93%의 전자공여능을 나타내었으며, 300 ug/mL의 농도에서도 92% 이상의 활성을 나타내었다. 그러나 에탄올을 용매로 추출한 이팝나무 추출물은 1회와 3회 덖은 경우 1,000 ug/mL의 농도에서 각각 88.46%와 89.59%의 활성을 나타내었으며, 5회 덖은 EE-R5는 84.25%로 덖지 않은 EE-NR(86.43%)보다 낮은 활성을 나타내었다. 이팝나무 잎의 덖은 횟수에 따른 추출물은 pH 1.2 조건에서 가장 높은 소거활성이 나타났으며, 시료의 농도가 증가함에 따라 아질산염 소거효과도 증가하였다. 이상의 결과 pH가 높아질수록 아질산염 소거능이 감소한다는 기존의 결과와도 일치하여(Kim et al., 2001; Lee et al., 2005) 위내의 낮은 pH 조건하에서도 효과적으로 nitrosamine을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 그러므로 이팝나무 잎과 덖은 횟수에 따른 추출물은 아질산염 소거효과가 우수하며 아질산 및 아민이 함유된 제품과 같이 섭취하거나 가공한다면 nitrosamine 생성 억제 및 항산화 효과도 기대할 수 있을 것으로 생각된다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 아질산염 소거능 (pH 1.2)

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1000
WE-NR	14.28±0.80aD2 )	31.99±0.55bC	44.49±0.58bB	69.41±0.96bA
WE-R1	15.62±0.99aD	33.27±0.42aC	47.21±0.90aB	74.53±0.63aA
WE-R3	11.82±0.67bD	25.97±1.59cC	37.21±0.19cB	60.21±1.45cA
WE-R5	7.94±1.34cD	22.18±0.54dC	30.39±0.71dB	58.66±0.93cA
EE-NR	9.01±1.88aD	21.14±0.55aC	38.02±0.79aB	66.73±2.01abA
EE-R1	9.93±0.82aD	18.29±1.25bC	37.77±1.10aB	68.54±0.37aA
EE-R3	9.26±0.79aD	18.69±0.79bC	30.73±1.65bB	63.52±0.54cA
EE-R5	8.66±1.02abD	18.89±0.50bC	27.78±0.14cB	50.32±0.12dA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 6. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 아질산염 소거능(pH 3.0)

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1000
WE-NR	7.43±0.64aD2 )	15.28±1.18bC	25.96±0.37bB	40.29±1.70bA
WE-R1	8.67±0.96aD	17.68±0.54aC	28.04±1.01aB	43.19±0.96aA
WE-R3	5.99±0.54bD	14.46±0.52cC	22.15±0.85cB	40.96±0.26bA
WE-R5	3.95±0.77cD	9.11±0.80dC	18.36±0.96dB	36.58±0.86cA
EE-NR	5.91±0.17bD	11.66±1.38aC	16.89±0.68bB	24.49±0.61bA
EE-R1	4.70±0.43cD	8.71±1.46bC	18.44±0.60aB	27.43±0.85aA
EE-R3	7.72±0.34aD	8.05±0.44bC	16.11±1.17bB	25.17±0.89bA
EE-R5	5.62±0.49bD	6.71±0.62cC	14.30±1.09cB	18.71±0.54cA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 6. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 아질산염 소거능(pH 6.0)

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1000
WE-NR	2.84±0.34aD2 )	4.86±0.66aC	8.31±0.34aB	11.58±0.84aA
WE-R1	1.61±0.67bD	3.65±0.29bC	8.08±0.91aB	11.96±0.88aA
WE-R3	1.32±0.16bD	3.35±0.25bC	5.38±0.96bB	8.46±0.53bA
WE-R5	1.06±0.26cD	3.23±0.79bC	4.29±0.68bcB	7.53±0.44cA
EE-NR	0.58±0.09cD	1.32±0.09cC	3.65±0.48cB	7.08±0.60bA
EE-R1	1.25±0.69abD	3.28±0.84aC	7.07±0.71aB	8.60±0.55aA
EE-R3	1.19±0.74aD	2.90±0.34aBC	5.34±0.55bB	7.38±0.55bA
EE-R5	1.80±0.44aD	2.68±0.39bC	4.73±1.15bcB	6.78±0.28bcA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 6. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

2-4. 크산틴 옥시다제 저해활성 (Xanthine oxidase inhibition ability) 측정

상기 실시예 시료들의 크산틴 옥시다제 저해활성을 측정하기 위하여, 하기와 같은 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Stirpe F, Corte ED. (1969) The regulation of rat liver xanthine oxidase. J. Biol. Chem., 244 : 3855-3861.)

각 시료용액 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL에 크산틴(xanthine, 052K5307, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 2 mM을 녹인 기질액 0.2 mL를 첨가하였다. 여기에 크산틴 옥시다제 (110M7004, 0.2 U/mL, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 0.1 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 1N HCl 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨 후, 반응액 중에 생성된 우릭산(uric acid)를 흡광도 292 nm에서 측정하였다. 추출물에 대한 크산틴 옥시다제 저해 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었으며, 대조군으로 추출물 대신 아스코르브산(094K0114, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)을 추출물과 동일한 농도로 첨가하여 위와 동일한 방법으로 크산틴 옥시다제 저해활성을 측정하였다.

표 11 및 도 11은 이팝나무 잎 추출물에 대한 크산틴 옥시다제 저해 활성을 백분율(%)로 나타낸 결과로 이팝나무 잎 추출물은 EE-R1(90.24%)>WE-R1(85.03%)>EE-R3(80.00%)>WE-NR(78.13%)의 순으로 크산틴 옥시다제 저해율을 나타내었으며, 모든 추출물은 농도가 증가함에 따라 유의적으로 증가하였다. 물보다는 에탄올을 용매로 추출 시 좀 더 우수한 소거율을 나타내었고, 1회 덖은 이팝나무 잎이 가장 높은 활성을 나타내었다.

덖음 횟수에 따른 추출물의 농도에 따른 크산틴 옥시다제 저해활성

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1,000
WE-NR	14.58±3.61bD1 )	37.50±3.13bC	51.04±4.77bB	78.13±3.12bA
WE-R1	27.21±4.25aD	46.91±2.04aC	59.86±3.12aB	85.03±2.36aA
WE-R3	13.98±1.86bD	34.41±1.86cC	46.24±3.72cB	73.12±1.86cA
WE-R5	6.67±2.31cD	21.33±4.62dC	34.67±4.62dB	58.67±2.31dA
EE-NR	13.82±2.82cD	38.89±5.56cC	53.70±3.21cB	75.93±3.21bcA
EE-R1	23.58±2.82aD	51.22±4.22aC	62.60±3.73aB	90.24±2.44aA
EE-R3	18.67±2.31bD	45.33±2.31bC	57.33±2.31bB	80.00±4.00bA
EE-R5	9.88±2.14dD	18.52±3.70dC	28.40±2.14dB	54.32±2.14dA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 6. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

<실험예 3> 피부노화에 대한 영향실험

상기 실시예 시료들의 피부노화에 대한 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 다양한 실험을 수행하였다.

3-1. 콜라게나제 ( Collagenase ) 저해 활성

피부의 주름형성과 밀접한 관련이 있는 콜라게나제(collagenase) 저해효과는 하기와 같은 문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (WE, Heindrich HG. (1963) Zur quantitativen bestimmung der kollagenase. Hoppe-seyler's Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 333 : 149-151).

4mM의 CaCl₂를 첨가한 0.1M의 Tris-HCl buffer(pH 7.5)에 4-phenylazobenzyloxycarbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg(BC13H3755V, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA, 0.3mg/mL)를 녹인 기질액 0.25 mL와 일정농도로 희석한 시료액 0.1 mL를 혼합한 후 콜라게나제(collagenase, 0.2mg/mL, C0130, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 0.15 mL를 첨가하여 실온에서 20분간 반응하였다. 여기에 6%의 시트르산(citric acid, 251275, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA,) 0.5mL를 가하여 반응을 정지시킨 후 에틸아세테이트(ethyl acetate) 1.5mL를 넣고 혼합하여 상등액만을 취해 320nm에서 흡광도를 측정하였다. 콜라게나제 저해율은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었다.

이에 덖음 횟수가 상이한 이팝나무 잎의 물과 에탄올 추출물에 대한 콜라게나제 저해율을 측정한 결과 이팝나무 잎의 EE-R3(38.65%)>EE-R1(37.06%)>WE-R5(36.81%)의 순으로 물보다는 에탄올 추출물이 좀더 우수한 콜라게나제 저해율을 나타내었다. 물 추출물은 덖음 횟수가 증가함에 따라 저해율이 증가하였으나 3회와 5회 덖은 이팝나무 추출물간에는 유의적 차이가 없었으며, 에탄올 추출물에서도 1회와 3회 추출물간의 콜라게나제 저해율의 유의적 차이가 없었다(p<0.05). (표 12 및 도 12)

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 콜라게나제 저해활성

Sample1 )	Concentration(ug/mL)
	100	300	500	1,000
WE-NR	4.73±0.30cD2 )	9.46±0.80bC	16.46±0.91bcB	27.85±2.89bA
WE-R1	7.55±1.25aD	10.53±1.96bC	18.08±1.09bB	29.72±2.06bA
WE-R3	8.97±1.13aD	16.81±2.02aC	23.65±0.99aB	34.19±3.08aA
WE-R5	8.21±1.19aD	16.90±2.61aC	24.80±3.23aB	36.81±2.24aA
EE-NR	5.67±2.34aD	10.33±2.29bcC	18.67±1.04bB	31.83±1.44bcA
EE-R1	3.89±1.15aD	12.35±1.26abC	21.32±2.00aB	37.06±1.44aA
EE-R3	3.91±1.95aD	14.08±1.69aC	22.69±2.12aB	38.65±1.78aA
EE-R5	4.92±1.02aD	12.99±2.66abC	19.69±2.13abB	33.86±1.18bA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 8. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

3-2. 엘라스타제( Elastase) 저해 활성

피부의 주름형성과 밀접한 관련이 있는 엘라스타제( Elastase) 저해효과는 하기와 같은 문헌에 기재된 Cannell 등.(1988)의 방법을 응용하여 하기와 같이 실험하였다 (Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM, Walker JM. (1988) Results of a large scale screen of microalage for the production of protease inhibitiors. Planta Medica. 54 : 10-14)

일정농도로 희석한 시료 0.5 mL에 50mM의 Tris-HCl buffer(pH 8.6)에 녹인 돼지 췌장 판크레아제 엘라스타제(porcine pancrease elastase, 2.5U/mL, E7885, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) 0.5mL와 N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanilide(0.5mg/mL, SLBD6245, Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA)를 녹인 기질액 1mL를 첨가하여 25℃에서 20분간 반응 후 기질로부터 생성되는 p-nitroanilide의 생성량을 405nm에서 측정하였다. 이를 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 표시하여 엘라스타제 저해율로 나타내었다.

엘라스타제는 동물 결합조직의 불용성 탄성섬유 단백질인 엘라스틴(elastin)을 분해시키는 효소로서(Tsukahara et al., 2006) 피부세포 기저층의 망상 구조를 끊어 탄력성과 윤택성을 감소시키는 주된 원인이 되어 엘라스타제 작용을 저해하는 것은 피부 주름을 개선하고 피부 노화를 지연시킬 수 있다. 이에 Cannell et al.(1988)의 방법에 따라 이팝나무 잎 추출물에 대한 엘라스타제 저해 활성을 측정한 결과, 이팝나무 잎을 1회 덖은 시료의 물 추출물(38.17%)과 에탄올 추출물(30.00%)이 가장 우수한 활성을 나타내었으며, 그 다음으로 덖지 않은 이팝나무 잎 추출물과 3회, 5회 덖은 순으로 엘라스타제 저해율을 나타내었다. 에탄올 보다는 물을 용매로 추출한 경우 좀더 우수한 활성을 나타내었으며, 덖지 않은 것과 3회 덖은 추출물은 엘라스타제 저해율에 유의적 차이가 없었다.

덖음 횟수에 따른 이팝나무 잎 추출물의 엘라스타제 저해활성

Sample1 )	Concentration(ug/ml)
	100	300	500	1,000
WE-NR	6.17±1.07aD	12.35±2.83abC	22.84±2.83bB	30.86±1.07bA
WE-R1	5.91±0.93aD	14.52±1.61aC	26.88±2.46aB	38.17±0.93aA
WE-R3	2.87±1.00bD	11.49±1.00bC	20.69±1.72bB	29.31±1.72bA
WE-R5	-	8.08±0.87cC	16.16±1.75cB	23.74±2.31cA
EE-NR	4.52±0.98bD	9.04±0.98bC	12.99±2.59cB	25.99±1.96bA
EE-R1	6.11±0.96aD	12.78±1.92aC	19.44±0.96aB	30.00±1.67aA
EE-R3	3.89±1.92bD	13.89±0.96aC	18.89±1.92aB	23.89±0.96bcA
EE-R5	2.90±1.26bcD	12.32±3.32aC	16.67±2.51abB	19.57±2.17dA
1)The abbreviations of introductory remarks are the same as in Table 8. 2)Value with different small and capital letters in superscripts within the same column and rows are significantly different at p<0.05 by ANOVA and Duncan's multiple range test.

3-3. 통계처리

본 실험결과는 독립적으로 3회 이상 반복 실시하여 실험결과를 평균±표준편차로 나타내었다. 실험군 간의 유의성을 검정하기 위하여 프로그램(SPSS 19.0 for windows program)을 이용하여 ANOVA test를 실시한 후 유의성이 있는 경우, p<0.05 수준에서 시험법(Duncan's multiple range test)를 실시하였다.

상기에 본 발명의 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

WE-NR ------------------------------------------------- 20 mg

유당 ------------------------------------------------- 100 mg

탈크 -------------------------------------------------= 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

WE-R1 ------------------------------------------------- 10 mg

옥수수전분 ------------------------------------------- 100 mg

유당 ------------------------------------------------- 100 mg

스테아린산 마그네슘 ------------------------------------ 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

WE-R3 ------------------------------------------------- 10 mg

결정성 셀룰로오스 -------------------------------------- 3 mg

락토오스 -------------------------------------------- 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 -------------------------------- 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제

WE-R5 ------------------------------------------------- 10 mg

만니톨 ----------------------------------------------- 180 mg

주사용 멸균 증류수 ---------------------------------- 2974 mg

Na2HPO4,12H2O ----------------------------------------- 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

EE-NR ------------------------------------------------- 20 mg

이성화당 ----------------------------------------------- 10 g

만니톨 -------------------------------------------------- 5 g

정제수 ------------------------------------------------- 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

EE-R1 ---------------------------------------------- 1000 ㎎

비타민 혼합물 ----------------------------------------- 적량

비타민 A 아세테이트 ---------------------------------- 70 ㎍

비타민 E -------------------------------------------- 1.0 ㎎

비타민 B1 ------------------------------------------ 0.13 ㎎

비타민 B2 ------------------------------------------ 0.15 ㎎

비타민 B6 ------------------------------------------- 0.5 ㎎

비타민 B12 ------------------------------------------ 0.2 ㎍

비타민 C --------------------------------------------- 10 ㎎

비오틴 ----------------------------------------------- 10 ㎍

니코틴산아미드 -------------------------------------- 1.7 ㎎

엽산 ------------------------------------------------- 50 ㎍

판토텐산 칼슘 --------------------------------------- 0.5 ㎎

무기질 혼합물 ----------------------------------------- 적량

황산제1철 ------------------------------------------ 1.75 ㎎

산화아연 ------------------------------------------- 0.82 ㎎

탄산마그네슘 --------------------------------------- 25.3 ㎎

제1인산칼륨 ------------------------------------------ 15 ㎎

제2인산칼슘 ------------------------------------------ 55 ㎎

구연산칼륨 -------------------------------------------- 90 ㎎

탄산칼슘 --------------------------------------------- 100 ㎎

염화마그네슘 ---------------------------------------- 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

EE-R3 ----------------------------------------------- 1000 ㎎

구연산 ---------------------------------------------- 1000 ㎎

올리고당 ---------------------------------------------- 100 g

매실농축액 ---------------------------------------------- 2 g

타우린 -------------------------------------------------- 1 g

정제수를 가하여 --------------------------------- 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (11)

1. 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 이팝나무 잎은 가공처리 또는 비가공처리된 잎인 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 주정, 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 약학 조성물.
4. 제 2항에 있어서,
   상기 가공처리는 음건한 재료를 덖기, 비비기, 및 식히기 단계를 1 내지 10회 반복실시하는 가공처리 공정을 포함함을 특징으로 하는 약학조성물.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 노화 관련 퇴행성 질환은 주름살, 기미 등의 피부노화, 동맥경화, 당뇨병, 뇌졸중, 자가면역질환 또는 암임을 특징으로 하는 약학조성물.
6. 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 포함하는 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 또는 개선을 위한 건강기능식품.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 건강기능식품은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 등의 약학 투여형태 또는 티백제, 침출차, 건강 음료 등의 형태인 건강기능식품.
8. 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강보조식품.
9. 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품.
10. 노화 관련 퇴행성 질환의 예방 및 개선효과를 갖는 이팝나무 잎 추출물을 유효성분으로 함유하는 식품첨가물.
11. 음건한 이팝나무 잎 또는 음건한 이팝나무 잎 재료를 덖기, 비비기 및 식히기 단계를 1 내지 10회 반복실시하는 가공처리 공정을 거친 이팝나무 잎을 세척 및 건조시킨 후, 시료 부피의 1배 내지 30배(v/v) 부피의 물, 주정, C₁ 내지 C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매를 추출용매로 하여, 10 내지 120℃의 반응온도에서 30분 내지 6일 동안 상온 추출법, 가열추출법, 초음파 추출법, 또는 환류 추출법으로 1 내지 10회 반복 추출하는 제 2단계; 상기 단계에서 수득한 추출액을 여과하여 감압 농축하는 제 3단계; 상기 농축된 추출물을 -50℃ 내지 -30℃에서 24 내지 72시간 동결 건조하는 제 4단계의 제조방법을 포함하는 단계를 포함하는 제 1항의 이팝나무 잎 추출물의 제조방법.

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