KR101962893B1 - 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 배양된 동충하초 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 갈색거저리 또는 번데기를 숙주로 하여 배양된 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 기능성 조성물과 동충하초 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 동충하초 추출물은 생체에 대한 독성은 없으면서 특히 암세포에 대해서만 특이적으로 독성을 나타내며 다량의 면역 증강 물질을 포함하고 있다. 본 발명에 따른 동충하초 추출물은 모두 천연 성분에서 유래한 것이기 때문에, 인체에 대한 부작용이 없이 혈액암의 치료 및/또는 예방을 위한 의약품 소재로서는 물론이고, 혈액암의 예방 또는 개선이나 면역 증강을 위한 건강기능식품의 소재로 활용될 수 있다.

Description

갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 배양된 동충하초 추출물을 포함하는 조성물 및 그 제조 방법{COMPOSITION OF COMPRISING VEGETABLE WORMS EXTRACT CULTURED USING MEALWORM OR PUPA AND PROCESS OF FABRICATION THE EXTRACT}
본 발명은 동충하초 추출물을 포함하는 기능성 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 갈색거저리 등을 이용하여 배양된 동충하초 추출물을 포함하는 기능성 조성물 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
동충하초(vegetable worms)는 겨울에는 숙주 곤충의 체내에 서식하면서 양분을 흡수하여 숙주를 죽이고 여름이 되면 숙주의 밖으로 곤봉 모양, 양 끝이 뾰족한 원기둥 모양, 주걱 모양 등의 자실체가 자라는 모습에서 명칭이 유래한다. 분류학상 동충하초는 자낭균강(Ascomycota), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Calvicipitaceae)에 속하며, 세계적으로 현재까지 약 800 여종이 알려져 있고, 이 중에서 국내에서 서식하여 분류된 것은 약 80여 종이다.
동충하초는 인삼, 녹용과 더불어 중국의 3대 보약 중 하나로, 불로장생 및 강장을 위한 비약으로 알려져 있으며, 노화 억제, 피로회복과 같은 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 동충하초를 이용한 연구가 많이 이루어지 있는데, 일례로, 대한민국특허 제10-0863449호는 유자, 상황버섯 및 동충하초를 포함하는 피부세포 노화억제용 기능성 화장품을 제안하고 있다. 하지만, 유전자원이 상대적으로 부족한 국내에서 서식하는 동충하초를 이용한 새로운 기능성 제품을 개발할 필요성은 여전히 존재한다.
본 발명의 목적은 천연자원을 이용하여 의학적 및/또는 식품공학적으로 유용한 조성물 및 그 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 배양한 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 갈색거저리는 유충 단계의 갈색거저리를 사용할 수 있으며, 상기 동충하초 추출물은 상기 배양된 동충하초의 자실체로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 배양한 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 개선용, 또는 면역 증강용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 접종원으로서 동충하초를 준비하는 단계; 갈색거저리 또는 번데기를 포함하는 배양 배지에 상기 준비된 동충하초를 접종하여 상기 동충하초를 배양하는 단계; 상기 배양 배지에서 배양된 상기 동충하초를 수확하여, 상기 수확된 동충하초로부터 동충하초 추출물을 얻는 단계를 포함하는 동충하초 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 새로운 식품 소재로 허가된 갈색거저리 또는 번데기를 활용한 동충하초 추출물이 혈액암에 대한 항암 활성 및 면역 증강 활성에 탁월한 효과가 있다는 점에 근거하고 있다.
본 발명의 일 실시형태에 따르면, 갈색거저리를 이용하여 동충하초와 같은 1차 가공품을 제조하고, 이를 2차 가공 식품원료로 사용한다면 소비자의 혐오감을 완화할 수 있는 고기능성 식품소재로 활용이 가능하고, 또 다른 중요한 자원곤충산업이 될 것이며, 이를 통해 개발된 건강기능식품 등은 각종 자원곤충의 산업화를 선도할 수 있을 것으로 기대된다.
천연 소재를 활용하여 제조된 동충하초 추출물은 다른 암세포에서는 아무런 독성이 없지만, 혈액암 세포에 대해서만 선택적인 독성을 나타낸다. 따라서 본 발명에 따라 제조될 수 있는 동충하초 추출물은 인체에 대한 부작용 없으며, 혈액암을 예방 또는 치료하기 위한 의약품 및/또는 혈액암을 예방 또는 개선하고/개선하거나 면역 증강을 위한 건강기능식품의 유효 성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 면역 증강 활성 및 혈액암에 대한 항암 활성을 가지는 동충하초 추출물을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 순서도이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 갈색거저리 유충을 이용하여 재배된 동충하초의 자실체를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 갈색거저리 유충과 현미를 이용하여 재배된 동충하초의 자실체를 보여주는 사진이다.
도 4는 본 발명의 다른 예시적인 실시예에 따라 누에 번데기를 이용하여 재배된 동충하초의 자실체를 보여주는 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물이 폐암세포주(A549)와 위암세포주(AGS)에 대한 독성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6c는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물이 혈액암세포주(HL-60)에 대한 독성을 나타내는 것을 보여주는 그래프이다. 도 6a는 HL-60 세포주에 대한 독성을 측정한 결과이고, 도 6b는 HL-60 세포주에 대한 세포사멸(apoptosis) 유도 효과를 측정한 결과이며, 도 6c는 HL-60 세포주에 대한 cell-cycle을 측정한 결과를 나타낸다.
도 7a 내지 도 7b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물을 함유하는 기능성 음료의 시간 경과에 따른 pH 변화와 산도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 8a 내지 도 8b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물을 함유하는 기능성 음료의 시간 경과에 따른 당도 변화와 탁도 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 9a와 도 9b는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 제조된 동충하초 추출물을 함유하는 기능성 음료에서 일반미생물과 대장균이 검출되지 않은 것을 보여주는 사진이다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 상세하게 설명한다.
[동충하초 추출물의 제조 방법]
본 발명에 따르면 갈색거저리 또는 번데기를 숙주로 사용한 동충하초 추출물이 혈액암에 대한 항암 활성 및/또는 면역 증강 활성을 가지고 있다는 것에 근거한다. 도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 면역 증강 활성 및 혈액암에 대한 항암 활성을 가지는 동충하초 추출물을 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 순서도이다. 도 1에 개략적으로 도시한 바와 같이, 본 발명의 동충하초 추출물을 제조하는 방법은 접종원으로 사용되는 동충하초 종균을 준비하는 단계(S110 단계)와, 접종 종균인 동충하초를 배양하기 위한 배양 배지를 준비하는 단계(S120 단계)와, 접종원으로 준비된 동충하초를 배양 배지에 접종하여 배양하는 단계(S130 단계)와, 배양된 동충하초를 생육, 재배하는 단계(S140 단계)와, 재배된 동충하초를 수확하고 수확된 동충하초를 추출하여 동충하초 추출물을 얻는 단계(S150 단계)를 포함한다.
접종원으로 사용된 동충하초를 준비하는 단계(S110 단계)에서 동충하초 종균을 얻을 수 있다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 접종원으로 사용될 수 있는 동충하초는 동충하초(Cordyceps sinensis), 번데기동충하초(C. militaris), 큰유충방망이동충하초(C. kyushuensis), 풍뎅이동충하초(C. scarabaeicola), 균핵동충하초(C. ophioglossoides), 매미다발동충하초(C. soborifera), 유충흙색다발동충하초(C. martialis), 백강균(Beauveria bassiana) 등을 사용할 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 이때, 동충하초의 자실체를 사용하여 동충하초 종균을 얻을 수 있다.
일례로, 생육 배지에 동충하초 균사 절편(대략 3 내지 10 mm 크기)을 접종하고, 5일 내지 15일 동안 20 내지 30℃의 온도에서 암-배양하는 방법으로 동충하초 종균을 얻을 수 있다. 동충하초 종균을 얻기 위해 사용될 수 있는 생육 배지는 감자 추출 배지(potato dextrose broth)는 물론이고, 그 외에도 현미 배지, 옥수수 배지, 보리쌀 배지, 대두박 배지, 밀 배지 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
배양 배지를 준비하는 단계(S120 단계)에서 배지에 갈색거저리 또는 번데기가 첨가될 수 있다. 갈색거저리(Tenebrino molitor, mealworm)는 곤충강, 초시목, 의보갑과, 분갑속에 속하는 곤충 종으로 속칭 '빵충'이라고도 한다. 거저리는 세계 각 지역에 분포하는 곤충으로 단백질뿐만 아니라 여러 종류의 아미노산, 불포화지방산, 및 무기질 등의 영양성분이 높아서 동물 단백사료로 이용가치가 높다.
갈색거저리의 자원화 이용 작업은 세계 여러 나라에서 시작하였는데 프랑스, 독일, 러시아 및 일본이 잇달아 참여하였으며, 인공사료, 인공생산 사육기술, 식용 및 약용 건강기능탐색 등에 대해 비교적 많은 보고가 있다. 특히 중국에서는 최근 인공사육에 성공하여 점점 전문화, 표준화, 고급가공의 방향으로 발전하고 있으며 식용자원으로 개발하고자 하는 시도가 이어지고 있다. 이러한 세계적인 추세에 발맞추어 식품의약품안전처는 최근 갈색거저리를 식품 소재로 허가한 바 있다.
그런데, 갈색거저리 애벌레(유충)를 식품으로 개발할 때, 소비자의 혐오감이 생길 수 있다는 단점이 있다. 본 발명에서는 갈색거저리의 대량생산과 관련해서, 갈색거저리를 이용한 동충하초의 1차 가공식품을 제조하고, 동충하초 추출물을 2차 가공식품의 원료로 활용하고자 하였다. 일례로, 본 발명에 따라 배지에 첨가될 수 있는 갈색거저리는 유충 단계의 갈색거저리일 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 한편, 번데기는 예를 들어 누에고치의 번데기를 사용할 수 있지만 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 또한, 필요한 경우에 곤충 이외에도 현미, 감자 추출물, 옥수수, 보리쌀, 대두박, 밀 및 이들의 조합으로 구성되는 영양원이 배지에 첨가될 수 있다.
일례로, 동충하초의 숙주로서 갈색거저리 유충을 사용하는 경우, 갈색거저리 유충과 이들 식물성 영양원은 대략 9:1 내지 7:3의 중량 비율로 배합될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되지 않는다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 갈색거저리 또는 번데기는 대략 50 내지 100 g/1000 ㎖(배양 용기)의 중량으로 배양 배지에 첨가될 수 있으며, 필요한 경우 대략 상대 습도 65~75% 조건에서 첨가될 수 있지만, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
이어서, 갈색거저리 또는 번데기가 첨가된 배양 배지에 위에서 준비된 동충하초 종균을 접종하여 동충하초를 배양한다(S130 단계). 전술한 단계에서 준비된 동충하초 종균은 대략 5 내지 20 ㎖/1000 ㎖(배양 용기)의 농도로 배양 배지에 접종될 수 있으며, 대략 20 내지 30℃, 300 내지 700 Lux 조건에서 10 내지 20일 동안 명-배양될 수 있다.
배양된 동충하초를 생육, 재배하는 단계(S140 단계)와 관련해서, 온도를 18~20℃, 습도를 90~95%로 조정하고 수일이 경과하면 자실체가 발생한다. 발생한 동충하초의 자실체를 20~22℃, 습도 89~85%로 조정하고 15~20일 동안 발생한 자실체를 생육, 재배하여 충분히 자란 동충하초 자실체를 얻을 수 있다.
재배된 동충하초의 자실체를 수확하고, 수확한 동충하초 추출물, 예를 들어 동충하초 자실체의 추출물을 얻는다(S150 단계). 추출 용매는 열수, 50% 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트 등의 극성용매와 헥산, 클로로포름 또는 디클로로메탄의 비극성용매와 같은 유기용매, 이들의 혼합용매일 수 있으며, 바람직하게는 50% 내지 100%의 메탄올, 에탄올 등의 탄소수 1 내지 4의 알코올, 더욱 바람직하게는 80% 내지 100% 에탄올일 수 있다.
추출 방법으로는 냉침추출법, 온침추출법 또는 열 추출법 등일 수 있으며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄 추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 필요한 경우, 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 재배된 동충하초 추출물을 얻기 위하여 건조된 동충하초를 적당한 크기(예를 들어 5 내지 20 mm)로 분쇄하여 추출 용기에 넣고 적절한 양(예를 들어 동충하초 대비 5 내지 20배)의 추출 용매를 첨가할 수 있으며, 추출 효율을 높이기 위하여 추출 과정을 수회 이상 반복하거나, 추출액을 여과하고 감압농축할 수 있다.
필요한 경우, 동충하초 추출물은 사용할 때까지 급속 냉동고(deep freezer)에 보관할 수 있다. 이때, 동충하초 추출물은 얻어진 추출액을 농축 및 동결건조하여 수분을 완전히 제거한 것일 수 있으며, 분말 상태로 사용하거나 분말을 증류수 또는 통상의 용매에 녹여 사용할 수 있다.
필요한 경우에 열수 또는 전술한 용매로 추출한 동충하초 추출물은 에탄올 수용액, 물, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 클로로포름과 에탄올 혼합액과 같은 분획 용매를 이용하여 분획될 수도 있다. 분획 과정은 4 ℃ 내지 120 ℃에서 수행될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
필요한 경우 동충하초 추출물 또는 분획 과정을 통하여 얻어진 분획물은 이후 여과하거나 농축 또는 건조과정을 수행하여 용매를 제거할 수 있으며, 여과, 농축 및 건조를 모두 수행할 수 있다. 구체적으로 여과는 여과지를 이용하거나 감압여과기를 이용할 수 있으며, 상기 농축은 감압 농축기, 일예로 회전 증발기를 이용하여 감압농축할 수 있으며, 상기 건조는 일예로 동결건조법으로 수행할 수 있다.
본 발명에 따라 얻어지는 동충하초 추출물은 면역 증강 성분인 베타글루칸(하기 실시예 4 참조), 코디세핀(cordycepin) 및 아데노신(adenosine)을 다량 함유하고 있어서(하기 실시예 5 참조), 면역 증강을 위한 유효 성분으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 동충하초 추출물은 다른 암세포에 대해서는 아무런 독성이 없는 반면에 혈액암 세포에 대해서만 세포사멸(apoptosis)을 유발한다(하기 실시예 6, 도 5a 이하 참조).
따라서 본 발명에 따라 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 배양, 재배된 동충하초 추출물은 혈액암에 대한 항암 및/또는 면역 강화를 위한 약학적 조성물 및/또는 건강기능식품의 유효 성분으로 사용될 수 있다. 일례로, 약학 조성물 또는 건강기능식품 중에 동충하초 추출물이 대략 0.01 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 함유될 수 있다.
일례로, 본 발명에 따라 얻어진 동충하초 추출물을 포함하는 기능성 음료의 경우에 저장 과정에서 pH, 산도, 당도 및 탁도가 일정하게 유지되며(도 7a 이하 참조), 미생물에 대한 항균 활성이 발휘되면서 음료의 품질이 유지된다(도 9a 이하 참조).
본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 재배된 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따라 제조된 동충하초 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable) 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
상기 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 동충하초 추출물을 유효 성분으로 단독으로 포함할 수 있고, 이외 제형, 사용방법 및 사용목적에 따라 추가성분 즉, 약학적으로 허용되거나 영양학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제 또는 부성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 동충하초 추출물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 동충하초 추출물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제와 같은 희석제 또는 부형제 등을 더욱 포함할 수 있으며, 경구 또는 비경구 모두 사용할 수 있다.
예를 들어, 동충하초 추출물을 포함하는 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유, 덱스트린, 칼슘카보네이드, 프로필렌글리콜, 리퀴드 파라핀, 생리식염수로 이루어진 군에서 선택된 1이상 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체, 부형제 또는 희석제 모두 사용가능하다.
경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 동충하초 추출액에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.
일례로, 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 갈색거저리 또는 번데기를 이용하여 재배된 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 개선, 또는 면역 증강을 위한 식품 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 식품 조성물의 예로는 식품, 식품첨가제, 음료 또는 음료첨가제를 들 수 있다.
본 발명의 동충하초 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있으며 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 구체적으로, 동충하초 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함하는 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
건강기능식품에는 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제를 포함할 수 있으며, 기능성 식품의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 본 발명의 동충하초 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 동충하초 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 동충하초 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 예를 들어, 건강 기능성 음료 조성물은 필수 성분으로서 동충하초 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물과 같은 식품 보조 첨가제 성분을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상술한 천연 탄수화물의 예는 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토오스, 수크로오스 등과 같은 디사카라이드; 덱스트린, 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드 등과 같은 통상적인 당은 물론이고, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제 또는 감미제로서 타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진)과 같은 천연 향미제/감미제; 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제/감미제 등을 사용할 수 있다.
그 외에도 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명에 따른 식품공학적 조성물 중에는 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 동충하초 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부, 바람직하게는 0.01 ~ 1.0 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 예시적인 실시예를 참조하면서 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
실시예 1 : 갈색거저리 유충을 이용한 동충하초 재배
접종원으로서 동충하초 종균을 다음과 같이 배양하여 준비하였다. 생육 배지인 감자추출배지(Potato dextrose broth; PDB) 100 mL을 사용하고, 121℃, 1.5 기압 조건에서 20분 동안 멸균 처리하였다. 6 ㎜ 크기의 동충하초 균사 절편 5개를 원균으로 PDB에 접종한 뒤, 10일 동안 25℃, 120 rpm의 조건에서 암-배양하여 접종원인 동충하초 종균을 준비하였다. 배지 용기로서 850 ㎖ 폴리프로필렌 배양병을 사용하였으며, 갈색거저리 유충 80 g을 수분 함량 65~75%에서 첨가하고, 121℃, 1.5 기압 조건에서 30분 동안 멸균 처리한 뒤, 무균실 상온에서 6시간 냉각하였다.
준비된 동충하초 종균을 포함하는 액체 접종원을 배양 용기 당 6 ㎖로 접종하고, 25℃, 500 Lux 조건에서 15일 동안 명-배양하였다. 18~20℃, 습도 90%, 광도 500 Lux 조건에서 5일이 경과하면 동충하초의 자실체가 발생하였다. 이어서, 20~22℃, 습도 85%, 광도 500 Lux의 조건에서 15~20일 동안 자실체를 생육, 재배하였다. 본 실시예에 따라 재배된 동충하초의 자실체를 도 2에 나타낸다.
실시예 2 : 갈색거저리 유충을 이용한 동충하초 재배
배지 용기에 갈색거저리 유충과 별도로 현미(갈색거저리 : 현미 = 8:2)를 첨가한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하였다. 본 실시예에 따라 재배된 동충하초의 자실체를 도 3에 나타낸다.
실시예 3 : 누에 번데기를 이용한 동충하초 재배
배지 용기에 갈색거저리 유충을 대신하여 누에 번데기를 첨가한 것을 제외하고 실시예 1의 절차를 반복하였다. 본 실시예에 따라 재배된 동충하초의 자실체를 도 4에 나타낸다.
실시예 4 : 베타글루칸 함량 분석
실시예 1 내지 실시예 3에서 재배된 동충하초 자실체에 대한 베타글루칸의 함량을 다음과 같이 분석하였다. 각각 재배된 동충하초 자실체의 Total glucan을 구한 후 α-glucan 량을 빼서 β-glucan으로 정량하였다. 먼저 total glucan은 실시예 1 내지 실시예 3에서 각각 재배된 동충하초 자실체 시료 0.1 g을 tube에 넣어 37% HCl 1.5 mL을 넣고 45분간 30℃ water bath에 넣어 분해하였다. 그 후 증류수 10 mL을 넣어 vortex하고, 100℃에서 2시간 incubation시켰다.
그 후 실온에서 식히면서 2 N KOH를 10 mL씩 넣고 200 mM Sodium acetate buffer로 100 mL로 양을 조절 한 후 충분히 mixing 하였다. 그 후 상등액 0.1 mL에 200 mM sodium acetate buffer에 녹인 exo-1,3-β-glucanase plus β-glucosidase 0.1 mL을 넣고, reagent blank는 acetate buffer 0.2 mL을 넣고, D-glucose standard는 D-glucose standard 0.1 mL와 acetate buffer 0.1 mL을 넣고 mixing 후 40℃에서 60분 동안 incubation 하였다.
Glucose oxidase/peroxidase mixture(GOPOD) 3 mL을 넣고 40℃에서 20분 동안 incubation 한 후, 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실시예에 따라 측정한 베타글루칸의 함량을 하기 표 1에 나타낸다. 실시예 1 내지 실시예 3에서 각각 재배된 동충하초 자실체에서 모두 베타글루칸이 검출되었으며, 특히 갈색거저리를 이용하여 재배된 동충하초의 자실체에서 베타글루칸 함량이 높게 측정되었다.
동충하초 자실체의 베타글루칸 함량
시료 베타글루칸
실시예 1 7.5±0.23
실시예 2 8.5±1.02
실시예 3 5.5±1.09
실시예 5 : Cordycepin 및 Adenosine 함량 분석
실시예 1 내지 실시예 3에서 각각 얻어진 동충하초 자실체 추출물을 대상으로 액체크로마토그래피/질량분석법(liquid chromatography/mass spectrometry, LC-MS)과 증기화광산란검출기(Evaporative Light Scattering Detector, ELSD)를 이용한 정량 분석 및 정성 분석을 수행하였다. 물 100%에서 acetonitrile 10%로 step gradient 용리방법을 이용해서 분석하였으며, single mass의 조건은 positive scan fragment 70으로 분석하였다. 분석조건은 표 2에 나타내었다. 정량은 각각의 standard curve를 통해서 정량화 하였다.
LC-MS 분석 조건
Item 조건
Instrument Agilent Technologies 1260 series HPLC
/Agilent Technologies 6130 Quadrupole
LC-MS / Agilent ELSD / Agilent Technologies 1260 Hip ALS(Agilent Technologies, USA)
Column Poroshell 120 (SB-C18 2.7 ㎛ x 150 mm, Agilent Technologies, USA)
Solvent 0% acetonitrile: 100% water → 10% acetonitrile
Column temp. 75℃
Wavelength UV 210, 260, 365 nm
Flow rate 1.0 mL/min.
Sample 농도 1000 ㎍/mL
Injection 부피 Sample 30 ㎕ / standard 1, 2, 3, 4, 5 ㎕
본 실시예에 따른 동충하초 추출물에 함유된 Cordycepin 및 Adenosine의 함량을 측정한 결과를 하기 표 3에 나타낸다. 동충하초 추출물의 경우 Adenosine은 특이적으로 갈색거저리를 이용한 동충하초에서만 주로 검출이 되었다. 번데기를 이용한 동충하초 추출물에서도 미량으로 검출 되었지만, 갈색거저리가 함유된 추출물에서는 모두 검출되었다. 상대적으로 cordycepin의 경우에는 자실체 부분에서는 번데기를 이용한 경우에 많은 함량을 나타내었지만, 자실체 외 부분에서는 갈색거저리를 이용한 것이 더욱 높게 함유했다. 자실체와 자실체외 부분을 합산할 경우 갈색거저리를 이용한 것이 조금 더 높게 cordycepin을 함유한다는 것을 확인 할 수 있었다.
동충하초 추출물의 adenosine 및 cordycepin 함량
시료 아데노신(㎍/125 ㎍) 총 코디세핀(㎍/125 ㎍)
실시예 1 1.53±0.52 16.19±0.11
실시예 2 1.53±0.91 8.97±0.92
실시예 3 N.D.* 12.52±0.84
*: not detected
실시예 6 : 동충하초 자실체의 세포 독성 및 혈액암에 대한 항암 효과 분석
세포배양에 필요한 배지 RPMI 1640과 배지에 첨가하여 항생제(antibiotic-antimycotic), FCS(fetal calf serum)는 K&J 제품을 사용하였고, sodium bicarbonate (NaHCO3), 2-ME(2-mercaptoethanol), sulfanilamide, N-1-naphthyl-ethylen-diamine은 Sigma(St.Louis, USA) 제품을 사용하였다. 세포는 페암세포주인 A549, 위암세포주인 AGS, 혈액암 세포주인 HL-60 세포를 사용하였다.
(1) 세포 독성 측정
폐암세포주인 A549, 위암세포주인 AGS, 혈액암세포주인 HL-60세포는 5x104 cells/well로 분주하고, 준비된 4가지 시료인 실시예 1의 갈색거저리를 이용하여 얻어진 동충하초 추출물, 실시예 2의 갈색거저리와 현미를 이용하여 얻어진 동충하초 추출물, 실시예 3의 누에초기 번데기를 이용하여 얻어진 동충하초 추출물을 각각 0.1, 1, 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 CO2 Incubator에서 배양하였다. 배양 후 상층액 100 ㎕를 제거하고, CCK-8 시약을 10 ㎕ 분주하고 2시간 CO2 Incubator에서 Incubation하였다. Microplate Reader기를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
본 실시예에 따라, 폐암세포주인 A549에 대한 세포 독성 측정 결과를 하기 표 4와 도 5a에, 위암세포주인 AGS에 대한 세포 독성 측정 결과를 하기 표 5와 도 5b에 각각 나타낸다.
표 4 및 표 5와, 도 5a 및 도 5b에 나타낸 바와 같이, A549 및 AGS에 대한 세포 독성 결과, 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻어진 동충하초 추출물은 폐암세포주 및 위암세포주에 대해서 독성을 발휘하지 않는 것을 확인하였다.
폐암세포주 A549에 대한 세포 독성 평가
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 1ㅁ0.00
0.1 0.97±0.02 0.94±0.01 0.92±0.04
1 0.98±0.02 0.99±0.00 0.95±0.01
10 0.98±0.00 0.92±0.02 0.93±0.00
위암세포주 AGS에 대한 세포 독성 평가
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 1±0.00
0.1 0.99±0.04 0.93±0.01 0.92±0.02
1 0.99±0.01 0.97±0.01 0.99±0.01
10 0.99±0.02 0.99±0.00 0.96±0.00
한편, 혈액암 세포주인 세포 독성 측정 결과를 하기 표 6과 도 6a에 각각 나타낸다. A549 세포 및 AGS 세포와 달리, 혈액암 세포주인 HL-60 세포에서 실시예 1 내지 실시예 3의 시료는 모두 세포 독성 효과가 있음을 확인하였다. 거저리의 경우 농도 의존적으로 세포 독성 효과를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 거저리와 현미를 배합한 시료의 경우 농도 의존적으로 세포 독성 효과를 나타냈고, 번데기를 이용한 시료의 1 ㎍/㎖에서 유효한 세포 독성 효과를 나타내었다.
혈액암 세포주 HL-60에 대한 세포 독성 평가
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 1±0.00
0.1 0.88±0.01 0.65±0.00 0.75±0.01
1 0.43±0.01 0.56±0.00 0.26±0.00
10 0.39±0.00 0.31±0.00 0.46±0.00
(2) 세포사멸 효과 평가
위에서 세포 독성이 확인된 혈액암 세포주인 HL-60 세포에 대하여 Annexin V/PI 염색을 통하여 세포사멸 정도를 측정하였다. 혈액암 세포주인 HL-60세포를 5x105 cells/well로 분주하고, 준비된 시료인 실시예 1 내지 실시예 3에서 얻은 동충하초 추출물을 0.1, 1, 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 CO2 Incubator에서 배양하였다. 세포를 수거하여 FITC(fluorescein Isothiocyanate)-Annexin V와 PI(propidium iodide)를 처리하여 유세포 분석기를 이용하여 apoptosis phenotype을 확인하였다. 측정 결과를 하기 표 7, 표 8과 도 6b에 나타낸다. 초기 세포사멸(Early apoptosis)은 갈색거저리, 갈색거저리와 현미를 이용하여 재배한 동충하초 시료에서 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였고, 번데기를 이용하여 재배한 동충하초 시료의 경우 1 ㎍/㎖의 농도에서 비교적 효과가 있음을 확인하였다. 또한 후기 세포사멸(Late apoptosis)의 경우에도 유사한 결과를 확인하였다.
혈액암 세포주 HL-60에 대한 초기 세포사멸 평가
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 0.05ㅁ0.07
0.1 0.95±0.07 0.95±0.21 1.20±0.00
1 4.10±0.42 0.80±0.00 5.75±0.35
10 10.50±1.27 9.95±2.33 5.90±0.85
혈액암 세포주 HL-60에 대한 후기 세포 사멸 평가
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 0.45±0.07
0.1 0.70±0.14 0.60±0.00 1.00±0.28
1 4.70±0.71 1.20±0.28 11.20±2.12
10 20.45±0.35 65.85±4.74 2.85±0.49
(3) cell cycle 분석
세포 독성이 확인된 혈액암 세포주인 HL-60 세포에 대한 세포 주기(cell cycle)를 분석하였다. 혈액암 세포주인 HL-60세포를 5x105 cells/well로 분주하고, 준비된 시료인 갈색거저리(실시예 1), 갈색거저리와 현미(실시예 2), 번데기(실시예 3)를 이용하여 각각 재배한 동충하초 추출물을 0.1, 1, 10 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 24시간 동안 CO2 Incubator에서 배양하였다. 세포를 수거하여 PI를 이용하여 cell cycle을 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 9와 도 6c에 각각 나타낸다. 세포사멸이 일어날 때 나타나는 변화인 세포주기 Sub G1기의 증가를 확인하였다. 실시예 1과 실시예 2에서 얻은 동충하초 추출물 시료의 경우, 농도 의존적으로 증가되는 것을 확인하였으며, 실시예 3에서 얻은 동충하초 추출물의 경우 1 ㎍/㎖의 농도에서 증가되는 것을 확인하였다.
혈액암 세포주 HL-60에 대한 세포 주기 중 subG1기 비율
농도(㎍/㎖) 컨트롤 실시예 1 실시예 2 실시예 3
- 6.10ㅁ0.00
0.1 6.80±1.56 8.70±0.85 22.20±0.99
1 54.80±0.71 13.25±0.49 66.45±0.21
10 52.90±1.27 89.80±0.99 5.65±0.28
실시예 7 : 기능성 음료 제조
건강기능식품으로의 활용성을 확인하기 위하여, 실시예 1에서 얻은 동충하초 추출물을 이용하여 음료를 제조하였다. 배지와 비가식 부위를 제거하여 선별하고, 얻어진 동충하초 자실체 건체를 세절하여 동충하초 100g과, 정제수 1.5L를 가하여 100℃ 이상에서 6시간 추출하여 동충하초 열수 추출물을 획득하였다. 동일한 조건으로 총 3회 반복한 추출액을 혼합한 후, buchner funnel과 Whatman No.2 filter paper를 이용하여 감압조건 하에서 여과하고 이물질을 제거한 후 총 4 L의 거저리 동충하초 열수 추출물을 제조하였다. 이어서, 하기 표 10의 배합 비율의 따라 기능성 음료를 제조하였다.
기능성 음료 성분 배합 비율
항목 비율(%)
동충하초 추출물 50
현미식초 2.5
배농축액 17
비타민 0.1
타우린 0.006
석류향 0.06
총합 100%
실시예 8 : 기능성 음료의 이화학적 특성 평가 및 품질 평가
(1) 이화학적 특성 평가
실시예 7에서 제조한 거저리를 이용하여 재배한 동충하초 추출물이 함유된 기능성 음료의 이화학적 특성을 알아보기 위하여 총산도, pH, 당도, 및 탁도를 분석한 결과이다. 측정 결과를 하기 표 11에 나타낸다. 시제품의 총-산도는 0.48±0.11%로 나타났으며 pH는 3.54±0.03로 나타났다. 그리고 당도 및 탁도는 각각 12.51±0.16, 0.25±0.04 로 나타났다.
기능성 음료의 이화학적 특성
item 기능성 음료
pH 3.54±0.23
산도(%) 0.48±0.11
당도(°Brix) 12.51±0.16
탁도 0.25±0.04
(2) 저장 기간 경과에 따른 품질 변화
실시예 7에서 제조한 기능성 음료의 온도별 저장 시 시간 경과에 따른 pH와 총산도의 변화를 측정하였다. 측정 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타낸다. 기능성 음료의 pHdhk 산도는 35℃와 45℃ 각각의 온도에서 기간이 경과하여도 큰 변화를 나타내지 않았다. 동일한 절차에 따라 기능성 음료의 온도별 저장 시 시간 경과에 따른 당도와 탁도의 변화를 측정하였다. 측정 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타낸다. 각각의 온도에서 음료의 당도는 기간이 지날수록 약간의 변화는 있었으나 최종적으로는 거의 변화하지 않는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 기능성 음료의 저장 중 미생물수 변화 측정
실시예 7에서 제조된 기능성 음료의 저장 온도에 따라 음료에 존재하는 일반미생물과 대장균의 개수를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 12, 도 9a 및 9b에 나타낸다.
기능성 음료의 저장 중 미생물 개수 변화
저장 조건 일반 미생물
(Log cfu/g)		 대장균
(Log cfu/g)
온도(℃) 기간(일)



35		 0 - -
5 - -
10 - -
15 - -
20 - -
25 - -
30 - -



45		 0 - -
5 - -
10 - -
15 - -
20 - -
25 - -
30 - -
일반미생물과 대장균은 35℃ 및 45℃ 저장 시 30일이 될 때까지 모두 검출되지 않았다. 미생물들이 생육하기 쉬운 온도임에도 불구하고 일반미생물과 대장균 모두 검출되지 않은 것을 미루어 볼 때, 살균력이 강하다고 알려진 식초에 항균효능이 있는 동충하초 추출물이 더해져 음료의 저장성 및 품질 향상에 도움을 준 것이라고 생각된다.
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예에 기초하여 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.

Claims (10)

  1. 번데기를 이용하여 배양한 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 동충하초는 동충하초(Cordyceps sinensis), 번데기동충하초(C. militaris), 큰유충방망이동충하초(C. kyushuensis), 풍뎅이동충하초(C. scarabaeicola), 균핵동충하초(C. ophioglossoides), 매미다발동충하초(C. soborifera), 유충흙색다발동충하초(C. martialis), 백강균(Beauveria bassiana)으로 구성되는 군에서 선택되는 약학 조성물.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 동충하초 추출물은 상기 배양된 동충하초의 자실체로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 번데기를 이용하여 배양한 동충하초 추출물을 유효 성분으로 함유하는 혈액암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 동충하초는 동충하초(Cordyceps sinensis), 번데기동충하초(C. militaris), 큰유충방망이동충하초(C. kyushuensis), 풍뎅이동충하초(C. scarabaeicola), 균핵동충하초(C. ophioglossoides), 매미다발동충하초(C. soborifera), 유충흙색다발동충하초(C. martialis), 백강균(Beauveria bassiana)으로 구성되는 군에서 선택되는 혈액암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 동충하초 추출물은 상기 배양된 동충하초의 자실체로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 혈액암 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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