KR20180094556A - 아로니아 열매 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

아로니아 열매 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아로니아 열매 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아로니아 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 및 이를 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어지는 분획물들 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 단기 기억력, 공간 기억력, 공간 인지능력 등 기억력과 인지능력을 향상시키거나, 베타 아밀로이드의 분비 및 응집 저해, 치매관련 단백질의 발현저해 또는 아세틸콜린에스테라제의 활성 저해 효과를 통해 부작용 없이 치매를 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

아로니아 열매 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for the improvement of memory and cognition ability, or prevention, delay, improvement or treatment of Alzheimer's disease comprising extract or fraction of Aronia Melanocarpa Elliott fruit}
본 발명은 아로니아 열매 추출물 또는 분획물을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 아로니아 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 및 이를 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 얻어지는 분획물들 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
이미 고령화 사회로 진입한 한국은 2017년 노인인구 비율이 14%를 차지하며 치매환자의 수도 급속히 증가하고 있다. 2060년에는 약 40%로 증가할 것으로 예상된다. 이러한 현실은 개인의 삶의 질을 저하시킬 뿐만 아니라 과다한 의료비 지출로 인한 국가 경쟁력 감소에 따라 커다란 사회·국가적 문제로까지 대두되고 있다.
치매(dementia)는 뇌의 위축과 신경세포의 감소 및 노인 반(senile plaque)의 출현으로 인한 뇌신경의 비가역적인 파괴가 원인이 되어 기억력과 언어장애, 행동장애 등의 다양한 후천적 인지기능 장애 증상을 수반하는 증후군을 일컫는다. 치매는 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease), 혈관성 치매 및 파킨슨 질환에 의한 퇴행성 질환, 갑상선 기능 감소증에 의한 대사성 질환, 뇌종양 또는 감염성 질환 등에 기인하는 기타 치매로 분류된다.
현재 치매 개선약물로서는 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE) 저해제인 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine) 및 리바스티그민(rivastigmine) 등이 임상에서 사용되고 있으나 치료효율이 낮고 부작용이 심하여 아직까지는 효과적인 치료제가 없는 실정이다.
알츠하이머 질환자의 뇌 조직에서는 신경세포 주위에서 생성되는 노인 반과 세포 내부에서 생성되는 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle)과 같은 병리학적 특징을 관찰할 수 있다. 신경섬유매듭(neurofibrillary tangle)은 tau 단백질의 과인산화에 의하여 형성되며, 노인 반은 세포 밖으로 분비된 Aβ(β-amyloid)가 신경세포 주변에서 응집되어 형성된다. 알츠하이머 질환은 가족형(familial type)과 산발형(sporadic type)으로 분류되며, 전체 질환의 90% 이상이 주로 65세 이상의 노인에게 나타나는 산발형이다. 가족형의 경우, APP(amyloid precursor protein) 및 프레세닐린(presenilin)등을 코딩하는 유전자의 돌연변이가 발명원인으로 알려져 있으며, 산발형의 경우, 그 원인이 노화 및 ApoE4 대립형질인 것으로 보고되었다. Aβ의 축적에 의한 노인 반은 가족형과 산발형 모두에서 공통적으로 나타나는 병리현상이다. Aβ는 베타 아밀로이드 전구 단백질인 APP(Amyloid precursor protein)가 2종류의 프로테아제(protease)에 의해 분해되어 생기는데, 아미노 말단을 절단하는 것이 베타-세크레타아제(β-secretase), 카르복시 말단을 절단하는 것이 감마-세크레타아제(γ-secretase)이다.
알츠하이머 질환 치료제 개발을 위한 표적 중 하나인 감마-세크레타아제(γ-secretase)는 PS(presenilin), nicastrin, anteria pharynx defective gene의 단백질 산물인 APH-1, 프레세닐린 인해서 유전자(presenilin enhancer gene)의 단백질 산물인 PEN-2 등으로 이루어진 복합 구조로 존재한다. 그러나 이 효소는 Notch1, APLP1, ErbB4, Jagged, CD44 등 많은 물질이 기질로 반응하므로 APP 특이적인 저해제를 개발해야 하는 문제점을 안고 있다.
자연계에 존재하는 식물체는 그 종류가 매우 다양할 뿐만 아니라 유용한 생리활성 성분을 함유하고 있는 경우가 많고, 이러한 식물체 유래 성분들은 인공적으로 합성 혹은 변형과정을 거쳐 생성되는 화합물에 비해 대체로 안정성이 우수하며, 자연계에 존재하는 물질이므로 자연분해가 가능하기 때문에 분해되거나 배출되지 않아 체내에 축적되는 문제가 적다. 따라서 본 발명자는 부작용 없이 효과적으로 치매를 예방, 지연 또는 치료할 수 있는 약제를 개발하고자 식물체로부터 치매에 효과적인 물질들을 탐색해 왔으며, 이러한 결과를 통해 대한민국 등록특허 제10-1194091호, 제10-1480899호와 같은 기술을 개발한 바 있다.
본 발명자는 계속해서 치매에 효과적이고 새로운 물질을 개발하기 위하여 다양한 연구를 시도하였으며, 이의 결과 아로니아 열매 추출물의 가능성을 발견하게 되었다. 기존에 아로니아를 이용한 연구가 있었으나 유효농도가 높은 등의 문제가 있어 이를 개선하고자 하였으며, 세부적이고 본격적인 연구를 통해 아로니아 열매의 추출물 또는 용매 분획물이 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료에 관련된 우수한 생리활성을 나타낼 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
대한민국 등록특허 제10-1194091호 대한민국 등록특허 제10-1480899호
따라서 본 발명의 주된 목적은 부작용이 없이 효과적으로 기억력 및 인지능력을 개선할 수 있고, 치매를 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 예방, 지연, 개선 또는 치료 효과를 낮은 농도에서도 효과적으로 나타낼 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 a) 아로니아(Aronia Melanocarpa Elliott) 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물; b) 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물을 헥산(hexane)과 물로 분획하여 얻어지는 헥산층 분획물; c) 상기 b)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 디클로로메탄(dichloromethane)과 물로 분획하여 얻어지는 디클로로메탄층 분획물; d) 상기 c)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 물로 분획하여 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물; e) 상기 d)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 부탄올(butanol)과 물로 분획하여 얻어지는 부탄올층 분획물; 및 f) 상기 e)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물; 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 a)의 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물은 동결건조하여 분말화한 아로니아 열매 동결건조분말 100g 당 25 내지 75%(v/v) 에탄올을 800 내지 1200ℓ의 비율로 사용하여 수득한 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 a) 아로니아(Aronia Melanocarpa Elliott) 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물; b) 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물을 헥산(hexane)과 물로 분획하여 얻어지는 헥산층 분획물; c) 상기 b)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 디클로로메탄(dichloromethane)과 물로 분획하여 얻어지는 디클로로메탄층 분획물; d) 상기 c)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 물로 분획하여 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물; e) 상기 d)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 부탄올(butanol)과 물로 분획하여 얻어지는 부탄올층 분획물; 및 f) 상기 e)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물; 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 기능성 식품 조성물에 있어서, 상기 a)의 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물은 동결건조하여 분말화한 아로니아 열매 동결건조분말 100g 당 25 내지 75%(v/v) 에탄올을 800 내지 1200ℓ의 비율로 사용하여 수득한 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 단기 기억력, 공간 기억력, 공간 인지능력 등 기억력과 인지능력을 향상시키거나, 베타 아밀로이드의 분비 및 응집 저해, 치매관련 단백질의 발현저해 또는 아세틸콜린에스테라제의 활성 저해 효과를 통해 부작용 없이 치매를 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 베타 아밀로이드(Aβ40 및 Aβ42) 분비 저해 활성 실험결과를 나타낸 것이다. CON : 대조군, H2O : 물 추출물 처리군, 30%EtOH : 30%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 50%EtOH : 50%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 70%EtOH : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 90%EtOH : 90%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 2은 본 발명의 아로니아 열매 추출물을 세포에 처리한 경우 sAPPα(치매 관련 단백질)의 발현양상을 나타낸 것이다. CON : 대조군, 70% EtOH : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 95% EtOH : 95%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 3는 본 발명의 아로니아 열매 추출물을 세포에 처리한 경우 APP(치매 관련 단백질)의 발현양상을 나타낸 것이다. CON : 대조군, H2O : 물 추출물 처리군, 30%EtOH : 30%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 50%EtOH : 50%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 70%EtOH : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 95%EtOH : 95%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 4는 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성 실험결과를 나타낸 것이다. C : 대조군, tac1 : 양성대조군(tacrine 처리), H2O : 물 추출물 처리군, 30%EtOH : 30%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 50%EtOH : 50%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 70%EtOH : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, 95%EtOH : 95%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 5는 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 베타 아밀로이드 응집 저해 활성 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ+DMSO : 대조군, Aβ+H2O : 물 추출물 처리군, Aβ+30%50 : 30%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, Aβ+50%50 : 50%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, Aβ+70%50 : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, Aβ+90%50 : 90%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 6은 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 단기 기억력 개선 효과 분석 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ- : 정상군, Aβ+ : 음성대조군(Aβ 처리), Aβ+Pg : 양성대조군(홍삼 추출물 처리), Aβ+AM : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 7은 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 공간 기억력 개선 효과 분석 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ- : 정상군, Aβ+ : 음성대조군(Aβ 처리), Aβ+Pg : 양성대조군(홍삼 추출물 처리), Aβ+AM : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 8 및 9는 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 공간 인지능력 개선 효과 분석 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ- : 정상군, Aβ+ : 음성대조군(Aβ 처리), Aβ+Pg : 양성대조군(홍삼 추출물 처리), Aβ+AM : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군. 도 11에서 초록색 점 부분은 마우스가 출발한 지점, 빨간색 점 부분은 마우스가 최종 도착한 지점, 빨간색 실선의 원 부분은 지지대 위치했던 곳을 나타낸다.
도 10 내지 13은 본 발명의 아로니아 열매 추출물을 투여한 마우스 뇌조직의 면역조직화학염색 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ+ : 음성대조군(Aβ 처리), Aβ+AM : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, Aβ+PG : 양성대조군(홍삼 추출물 처리).
도 14 내지 16은 본 발명의 아로니아 열매 추출물을 투여한 마우스 뇌의 ELISA 실험결과를 나타낸 것이다. Aβ- : 정상군, Aβ+ : 음성대조군(Aβ 처리), Aβ+PG : 양성대조군(홍삼 추출물 처리), Aβ+AM : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 17은 본 발명의 아로니아 열매 추출물의 베타 아밀로이드 응집 저해 활성을 TEM(Transmission electron microscopy, 투과전자현미경) 관찰을 통해 나타낸 것이다. Con : 음성대조군(Aβ 처리), Cur : 양성대조군(커큐민 처리), AM 50% : 50%(v/v) 에탄올 추출물 처리군, AM 70% : 70%(v/v) 에탄올 추출물 처리군.
도 18은 본 발명의 아로니아 열매 분획물의 아세틸콜린에스테라제 억제 활성을 나타낸 것이다. CON : 음성대조군, Hex : 헥산층 분획물 처리군, DI : 디클로로메탄층 분획물 처리군, EA : 에틸아세테이트층 분획물, BuOH : 부탄올층 분획물, DW : 물층 분획물, tac1 : 양성대조군(tacrine 처리).
본 발명의 조성물은 아로니아 열매를 특정한 방법으로 전처리하고 특정 조건으로 추출하여 수득한 추출물 및 이를 용매 분획하여 수득한 분획물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서는 추출 전 동결건조하여 분말화하는 전처리과정을 거치는데, 이러한 전처리과정에 따라 생리활성에서 큰 차이를 나타내는 것으로 판단된다.
본 발명에서는 상기 추출물의 제조를 위해 25 내지 75%(v/v)의 에탄올을 용매로 이용한다. 30, 50, 70, 90 또는 95%(v/v) 에탄올을 용매로 이용하여 추출한 추출물의 실험을 통해 30, 50 및 70%(v/v) 에탄올 추출물에서 우수한 활성이 나타났으나, 이를 기준으로 ±5% 까지는 유사한 활성이 나타날 것으로 판단된다. 보다 바람직하게는 70%(v/v)를 기준으로 ±5% 범위인 65 내지 75%(v/v) 에탄올을 이용하는 것이 좋다.
본 발명에서는 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하는 추출조건을 이용하는데, 이러한 추출조건에 따라서도 생리활성에 큰 차이가 나타나며 본 발명의 추출조건에 따르면 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료 효과가 우수한 추출물을 제조할 수 있다.
추출 이후에는 농축하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 감압농축하여 용매를 완전히 제거하고 동결건조하는 방법을 통해 최종 추출물을 수득하는 것이 상기와 같은 효과를 위해 바람직하다.
추출 시 용매의 양은 아로니아 열매 동결건조분말 100g 당 800 내지 1200ℓ의 비율로 사용하는 것이 상기와 같은 효과를 나타내는 추출물을 제조하기 위해 바람직하다.
본 발명에서 각 분획물은 서로 다른 용매를 사용한 당업계의 통상적인 분획방법으로 제조될 수 있다. 이때 상기와 같은 효과를 분획물을 보다 효과적으로 수득하기 위해 물 또는 물층 분획물에 대한 각 용매의 비율을 부피 기준 1 : 0.5 내지 1 : 2로 하고, 이들을 혼합한 다음 실온에서 10분내지 60분 정치하여 분획이 이루어지도록 하는 것이 바람직하다.
분획 이후에는 분획물에 포함된 용매의 제거과정을 거쳐 농축하는 것이 바람직하며, 동결건조 등의 방법으로 약제, 식품으로의 제조 및 보관을 용이하게 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 분획물 0.1 ~ 50중량%를 유효성분으로 함유할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 주성분인 상기 추출물 또는 분획물에 1종 또는 2종 이상의 약학적으로 허용가능한 통상적인 담체 및 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 약학적 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에는 상기 주요성분 이외에도 보조성분으로서 비타민 B, C, E나 베타카로틴, Ca, Mg, Zn 등의 미네랄 함유 화합물이나 레시틴 등의 인지질 또는 말톨, 아미노산 등의 화합물이 포함될 수 있으며, 이중에서도 비타민 C, E나 베타카로틴, 말톨 등 중에서 2 ∼ 3 성분을 혼합하여 사용하면 생체 활성효과를 상승 또는 보강할 수 있기 때문에 더욱 바람직하다.
또한 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여 매실, 레몬향, 파인애플향 또는 허브향과 같은 천연향료나 천연과즙, 클로르필린 (Chlorophyllin), 플라보노이드(Flavonoid) 등의 천연색소 및 감미성분인 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕 등과 구연산, 구연산나트륨 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물이 적용될 수 있는 개체는 척추동물이고, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 쥐, 생쥐, 토끼, 기니아피크, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 보다 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이며, 가장 바람직하게는 사람이다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여 시 피부외용 또는 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 경구투여용으로 사용하는 것이 좋다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하지만, 일일 투여량으로 상기 추출물 또는 분획물의 양을 기준으로 0.1 내지 10㎎/㎏인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 3 내지 9㎎/㎏인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 5 내지 6㎎/㎏인 것이 좋으며, 하루 1 ~ 6회 투여될 수 있다.
투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배로 할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양으로 하는 것이 좋고, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있으며, 바람직하게는 치매 예방, 치료효과를 나타내는 것으로 알려진 감태, 울금, 생강, 구기자, 오메가 3 지방산을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품 조성물은, 예를 들어, 츄잉껌, 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등의 각종 식품류, 청량 음료, 미네랄 워터, 알코올 음료 등의 음료 제품, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강기능성 식품류일 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 분획물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 위생)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 추출물 또는 분획물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 아로니아 열매 추출물 제조
순창에서 생산된 아로니아 열매를 생산자로부터 직접 구매하여 동결건조 후 분쇄하여 동결건조분말을 수득하였다. 이 동결건조분말 100g을 1.5ℓ 부피의 광구병(jar)에 넣고 1ℓ의 30 ~ 95%(v/v) 에탄올(HPLC 등급) 또는 물을 가하여 60℃에서 4시간 진탕 추출하였다. 추출을 통해 약 1.2ℓ의 추출액을 수득한 후, 추출액을 식히고 3M 여과지(pore size 0.25㎜)를 사용한 감압 여과를 2회 반복 실시하여 추출잔사를 제거하였다. 여과하여 수득한 여과액을 회전감압농축기를 사용하여 추출용매를 완전히 제거한 후 물이 조금 남은 상태에서 -80℃의 초저온 냉동고에 이틀 정도 냉동시킨 후 동결건조하여 약 15g의 추출물을 수득하였다.
실험예 1. Aβ 분비 저해활성
APPswe(human APP with the Swedish mutation) 세포를 사용하였다.
실험에 사용한 APPswe 세포주는 치매환자의 병리와 유사하게 Aβ42의 분비량이 정상세포에 비해 2배 이상 증가되어 있어 분비저해 활성을 검색하기에 용이하다.
APPswe 세포주로부터 분비되는 Aβ의 양을 측정하기 위해 sandwich ELISA를 실시하였다. 1 × 106 세포를 60㎜ dish에서 배양하여 serum-free DMEM으로 교환하고, 16시간이 경과한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 실시예 1의 추출용매별 아로니아 열매 추출물(이하, 'AM'이라 한다)을 10㎍/㎖, 50㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 상기 DMSO에 용해된 실시예 1의 AM은 DMSO에 50㎎/㎖의 농도로 용해시킨 것을 희석하여 사용하였다.
24시간 배양 후, 배양액을 PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride)의 존재 하에 회수하여 시료로 사용하였다. Aβ42의 분석에는 Affinity Purified Anti-Human Aβ(38-42) Rabbit IgG가, Aβ40의 분석에는 Affinity Purified Human Aβ(35-40)(1A10) Mouse IgG MoAb가 각각 코팅된 플레이트에 100㎕의 시료를 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시키고 7회 세척한 후, HRP(enzyme horseradish peroxidase) conjugation된 Aβ(11-28) 특이적 Affinity Purified Anti-Human Aβ(11-28) Mouse IgG MoAb를 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 9회 세척한 후 tetramethyl benzidine(TMB) 기질액을 넣고 실온에서 30분간 반응시킨 후 정지액인 1N H2SO4를 100㎕ 첨가하여 450㎚에서 Model 680 Microplate Reader(Bio-Rad, CA)를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
상기와 같이, APPswe 세포주에 AM을 각각 10㎍/㎖, 50㎍/㎖를 처리한 후 배양액으로 분비된 Aβ의 양을 sandwich ELISA 방법으로 측정하여 비교 정량한 결과를 도 1에 나타내었다. 음성 대조군(C)인 DMSO를 처리한 시료의 Aβ의 양을 100%로 하여 AM 처리 시 분비량을 백분율로 표시하였다. 도 1에서와 같이 아로니아 열매의 에탄올 추출물은 Aβ의 양을 대체로 농도 의존적이며 유의성 있게 감소시켰다. 특히 물 추출물과 90%(v/v) 에탄올 추출물에 비해 30 ~ 70%(v/v) 추출물의 Aβ 분비량의 감소 효과가 우수한 것으로 나타났다. APP의 대사에 관여하는 β-secretase 또는 γ-secretase의 활성이 저해될 경우 Aβ 분비가 감소된다. AM에 의한 Aβ 분비 감소효과도 이들 효소활성의 저해가 원인일 것으로 예측되어 BACE에 의한 APP의 대사체인 β-CTF와 α-secretase에 의한 대사체인 sAPPα의 단백질 양상을 분석함으로 β-secretase의 효소활성을 간접적으로 측정할 수 있었다.
실험예 2. 치매관련 단백질 저해 활성
단백질 분석은 Western blotting 방법에 의해 수행하였다. 1 × 106 APPswe 세포를 60㎜ dish에서 배양하고 24시간 후 DMSO 또는 실시예 1의 AM을 DMSO에 용해시켜 10, 50㎍/㎖의 농도로 처리하였다. 상기 DMSO에 용해된 실시예 1의 AM은 DMSO에 50㎎/㎖의 농도로 용해시킨 것을 희석하여 사용하였다. 37℃의 인큐베이터에서 overnight 배양한 다음 PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride) 존재 하에 배양액과 세포를 회수하였다. 세포의 경우 PBS(Phosphate buffered saline)로 세척한 다음 protease inhibitor(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가한 cell lysis buffer(150mM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.5% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 5mM EDTA)를 넣고 분쇄하여 시료로 사용하였다. 배양액과 세포분쇄물의 단백질 50㎍을 7%, 14% Tris-glycine SDS-PAGE 및 16.5% Tris-tricine SDS-PAGE로 분리한 후, sAPPα 특이적 항체 및 APP 특이적 항체를 이용하여 immunoblotting에 의해 sAPPα 및 APP의 단백질 양상을 검출하였다. 단백질 밴드를 Image J 분석 프로그램(NIH 제공)에 의해 정량하였으며 actin 밴드를 기준으로 보정하였다.
이의 결과 도 2 및 3에서와 같이, AM의 처리로 sAPPα 및 APP의 양이 감소하였다. APP는 α-secretase, β-secretase 및 γ-secretase 등에 의해 대사되어 Aβ를 비롯한 대사물질을 생성한다. Aβ는 oligomer를 형성하며 서로 응집하여 신경세포의 폐쇄를 유발함으로써 비가역적인 퇴행성 파괴를 일으킨다. 특히 치매 환자의 뇌 및 척수액에서 Aβ42가 정상인의 경우보다 많이 검출된다.
상기 실험예 1 및 2의 결과로부터 아로니아 열매의 에탄올 추출물이 치매의 예방, 지연, 개선 또는 치료에 효과적임을 알 수 있다. 특히 70%(v/v) 에탄올 추출물에서 그 효과가 우수한 것으로 나타났다.
실험예 3. 아세틸콜린에스테라제 저해활성
상기 실시예 1의 AM을 대상으로 치매약물의 표적 중의 하나인 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase, AChE) 저해활성실험을 수행하였다. 이는 신경반응과 기능에 가장 중요한 효소인 아세틸콜린에스테라제의 활성을 저해하는 것을 확인하는 실험이다. 96 well plate에 AM을 최종농도가 10, 50㎍/㎖이 되도록 희석용액(assay buffer)으로 희석한 뒤 30㎕씩 첨가한다. 그 다음 AChE 10㎕를 첨가한 뒤 마지막으로 120mM의 acetylcholine iodide와 DTNB가 포함된 반응혼합물 50㎕를 각각 더한 다음 37℃ 인큐베이터에서 20분간 반응시키고 fluorometer를 이용하여 570nm에서 측정하였다. 아세틸콜린에스테라제 억제제인 타크린(tacrine)을 양성대조군으로 사용하였다.
이의 결과, 도 4에서와 같이 30 ~ 70%(v/v) 에탄올 추출물에서 우수한 AChE 저해활성을 나타내었다.
실험예 4. Aβ 응집 저해활성
상기 실시예 1의 AM을 대상으로 Aβ 응집 저해활성을 조사하였다.
DMSO에 Aβ42가 용해된 Aβ42 용액을 PBS에 희석하고(20μM Aβ42), AM을 50㎍/㎖의 농도로 첨가하여 37℃에서 시간별로 반응시켰다. 반응액에 Thioflavine T(ThT) 용액(in PBS)(100nM)을 첨가하고 10초간 반응시킨 다음 TEKAN fluorometer를 이용하여 485nm(excitation) 및 535nm(emission)에서 ThT의 형광강도를 측정하였다.
이의 결과, 도 5에서와 같이 대조군(Aβ+DMSO)에 비해 30 ~ 90%(v/v) 에탄올 추출물에서 Aβ 응집 저해활성이 우수한 것으로 나타났다. 특히, 90%(v/v) 에탄올 추출물에 비해 30 ~ 70%(v/v) 에탄올 추출물에서 우수한 활성이 나타났다.
실험예 5. 기억력 및 인지능력 개선
실시예 1의 AM의 기억력 및 인지능력 개선 효과를 입증하기 위하여 동물 실험을 수행하였다. 동물 실험을 요약하면 다음 표 1과 같다.
실험물질 실험동물 섭취량 바이오마커 비고
AM ICR mice 5주령 500㎎/㎏ 1일 1회 경구투여 Passive avoidance test 단기작업기억 검사
Y-maze test 공간작업기억 검사
Morris water maze test 공간인지능력 검사
실험동물 : 생후 3주 된 수컷 ICR 생쥐를 (주)대한실험동물에서 구입하여 우석대학교 약학대학 실험동물실의 관리기준에 따라 수용하고 1주간 순화시킨 후, 건강한 것만을 선별하여 사용하였다.
시료의 투여 : 생쥐를 평균체중과 분산이 균질하도록 군(n=10)을 나누고 위약 및 AM(70% 에탄올 추출물)을 용매(물)에 녹여 경구 투여하였다. AM(500㎎/㎏)을 1회 200㎕ 투여한 후 행동실험을 수행하였으며, 양성대조군은 홍삼(100㎎/㎏)을 투여하였고, 음성대조군은 증류수 200㎕를 투여하였다.
Aβ42의 icv 투여에 의한 Aβ infarction 모델의 제조 : 생쥐를 마취한 후, 고정대에 고정하여 bregma 부분의 표피를 절개하였다. 특수 제작한 Hamilton 주사기로 Aβ42(10nmol)를 5㎕ 취하여 2.4㎜ 깊이에 auto injector(1㎕/sec)로 주사하여 행동실험의 모델로 사용하였다.
5-1. 단기작업 기억력 검사 : Passive-avoidance test
제미니 회피 시스템(회피학습상자)을 이용하여 수동회피 기억시험을 시행하였다. 첫째 날의 트레이닝 실험에는, 마우스를 밝은 박스에 넣고 10초 동안 순화(acclimation)시킨 후, 자동으로 문이 열리게 하여 어두운 박스로 이동하도록 하고, 어두운 박스로 이동하면 0.25mA의 전기 자극을 3초간 가하였다. 24시간 후의 테스트 실험에는 마우스를 밝은 박스에 10초 동안 순화시킨 후 문을 열어주어 어두운 박스로 이동하게 하였다. 이때 어두운 박스로 이동할 때까지 걸리는 시간을 측정하였다.
AM의 단기 기억력 개선효과를 Passive avoidance 방법으로 테스트한 결과, 도 6과 같이 양성대조군으로 사용한 홍삼과 함께 AM 또한 기억력 개선에 우수한 효과를 보였다.
5-2. 공간작업 기억력 검사 : Y-maze test
3개의 가지(길이 42㎝, 넓이 3㎝, 높이 12㎝, 각도 120도)로 구성된 Y-미로를 사용하였다. 각 가지를 A, B, C로 정한 후 한쪽 가지에 mouse를 조심스럽게 놓고 8분 동안 자유롭게 움직이게 한 다음 mouse가 들어간 가지를 기록하였다(꼬리까지 완전히 들어갔을 경우에 한하며, 갔던 가지에 다시 들어간 경우에도 기록). 세 개의 다른 가지에 차례로 들어간 경우 1점(실제 변경, actual alternation)씩 부여하였다.
AM의 공간작업 기억력 향상 효과를 테스트한 결과, 도 7과 같이 5일째 양성대조군으로 사용한 홍삼과 함께 AM 또한 공간작업 기억력 향상에 효과를 보였다.
5-3. 공간인지능력 검사 : Morris water maze test
원형수조를 준비하고 수온은 약 25℃에 맞췄다. 우유분말이나 식물성 염료를 물에 넣어 물이 혼탁해지도록 하고, 수면 밑 약 2㎝에 작은 탈출용 지지대(직경 약 11㎝)를 위치시켰다. 마우스는 시각정보를 이용해서 실험실 내의 단서를 찾아서 지지대가 위치한 곳을 찾아낸다. Video tracking system을 이용하여 수영경로를 기록하고 경로의 길이, 수영속도, 각 사분원에서 보낸 시간 및 여러 변수를 측정하였다. 실험동물이 지지대 위치를 빨리 찾아 갈수록 수영시간(통상 수영시간이 2분이 되도록 훈련)은 단축될 것이다(도 8 참조). 그리고 지지대를 없애면 사분원 중에서 지지대가 위치해 있던 곳(빨간색 실선의 원 부분)을 많이 지나칠 것이다(도 9 참조).
AM의 공간인지능력 개선 효과를 테스트한 결과, 도 8 및 9와 같이 AM은 양성대조군으로 사용한 홍삼 처리군과 비교하여 보다 우수하거나 유사한 활성을 보였다.
실험예 6. 조직학적 검사: 면역조직화학염색(Immunohistochemistry)
면역조직화학은 조직 내의 특정물질을 항원-항체 반응을 이용하여 특이적으로 검출하는 방법으로 염색표본을 장기간 보존할 수 있다는 장점이 있어 임상에서 광범위하게 이용되고 있는 방법이다.
면역조직화학 염색을 하기 전 검체를 준비하기 위해, 상기 실험예 5의 행동실험이 끝난 마우스를 안락사 시키고, 뇌조직을 적출하였다. 조직은 포름알데히드가 들어있는 고정액에서 일정기간 고정시킨 뒤, 냉동절편이나 고정액에 고정된 조직을 파라핀에 굳혀서 3~4㎛의 두께로 박절하여 Slide에 붙여놓았다. 부착된 조직에 1차 항체를 붙이기 전 붙이고자 하는 항체의 특성에 따른 Antigen 과정으로, 일반적으로 사용되는 Target anrigen retrieval solution과 Antigen retrieval 방법을 사용하였다. 이후 내인성 Peroxidase가 활성화 되지 않도록 하기 위하여 Peroxidase-blocking과정을 수행하고, 1차 항체(Aβ에 대한 항체)를 붙였다(4℃, overnight). 그 다음 1차 항체에 맞는 2차 항체를 붙이고, 그 뒤 발색을 위한 과정을 거쳤다.
이와 같은 면역조직염색을 통해 조직 내에 Aβ의 축적과 약물의 효능을 시각적으로 볼 수 있다.
동물실험 후 면역염색을 통해 각 후보약물의 효능을 살펴본 결과, 도 10 내지 13과 같이 AM이 Aβ의 축적을 효과적으로 억제하는 것으로 나타났다. 이는 AM이 기억력, 인지능력의 개선과 더불어 뇌에 Aβ의 축적을 억제한다는 것을 나타내는 결과이다.
실험예 7. Mouse Brain Elisa
상기 실험예 5의 행동실험이 끝난 마우스를 안락사 시키고, 뇌를 적출하여 Elisa를 실시하였다. 먼저, 적출한 뇌조직에 PBS 2910㎕과 PI 60㎕ 넣고 Homogenized 하였다. 균질액 300㎕에 88% Formic Acid를 3200㎕ 넣고 4℃에서 Rotation하였다. 그 후(overnight) UltraCentrifuge(300000, 1h)하여 Sup을 취해서 SB/Tris + PI 용액으로 Neutralization시켰다(pH 6 ~ 7). Elisa Vit에 200㎕ Seeding 하여 4℃에서 overnight하였다. 그 후 Vit의 내용물을 버리고 Elisa Wash Buffer를 100㎕씩 각 well에 넣고 washing한 뒤 차광하여 4℃에서 1시간 방치하였다. 그 후 TMB를 100㎕씩 넣고 차광, 상온에서 30분 경과 후 450㎛ 흡광도를 분석하였다. 분석이 끝난 뒤에는 Stop Soulution을 각 well에 100㎕씩 넣어주었다.
이의 결과는 도 14 내지 16과 같다.
실험예 8. Aβ aggregate 관찰
Aβ의 응집에 미치는 영향을 분석하고자 다음과 같이 Aβ 응집반응을 유도한 후 Transmission electron microscopy (TEM) 분석을 수행하였다.
PBS로 희석한 Aβ42(20μM)를 상온에서 20분 동안 반응시킨 후, AM(5.4㎍)과 양성대조군인 CUR(5.4μM)을 각각 5㎕씩 넣고 37℃에서 0, 3, 15시간 반응 시켰다.
반응이 종료된 시료 10㎕를 400mesh Copper grids(Formvar/carbon, Electron Microscopy science)에 올려놓고 건조시킨 후, Milli-Q water 5㎕로 두 번 세척하였다. Milli-Q water를 제거한 grid를 1% uranyl acetate 10㎕로 1분 동안 염색한 후, 상온에서 15분 건조하여 FEI G2 Spirit Twin microscope(Hitachi H-7650, Japan)로 이미지를 얻었다. 이때 각 시료 마다 3개 이상의 Aβ 응집체를 확보하였고, 이중 무작위로 3곳의 Aβ42 응집에 대한 저해활성을 측정하기 위해 TEM 분석을 실시하여 각각 3개 이상의 이미지를 얻었다.
도 17과 같이 음성대조군(Con)의 응집정도는 반응시간 3, 15시간 순으로 각각 증가하지만, AM 처리군은 이러한 응집정도가 크게 감소하는 것으로 나타났다. 한편 양성대조군인 CUR의 응집저해 효과와 비교해보면 AM과 유사한 양상으로 응집저해활성을 나타내었다.
실시예 2. 아로니아 열매 추출물의 분획물 제조
2-2. 헥산층 분획물
상기 실시예 1의 AM 중에서 70%(v/v) 에탄올 추출물을 3차 증류수 60㎖에 현탁한 다음 헥산(n-hexane) 50㎖을 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분간 정치한 다음 생성되는 상층의 헥산층을 수득하였다.
헥산층 분획액에서 감압 농축으로 헥산을 제거하여 분획물을 수득하였다.
2-3. 디클로로메탄층 분획물
상기 2-2에서 생성되는 하층의 수용액층 분획액에 디클로로메탄(dichloromethane) 50㎖을 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분간 정치한 다음 생성되는 하층의 디클로로메탄층을 수득하였다.
디클로로메탄층 분획액에서 감압 농축으로 디클로로메탄을 제거하여 분획물을 수득하였다.
2-4. 에틸아세테이트층 분획물
상기 2-3에서 생성되는 상층의 수용액층 분획액에 에틸아세테이트(ethyl acetate) 50㎖을 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분간 정치한 다음 생성되는 상층의 에틸아세테이트층을 수득하였다.
에틸아세테이트층 분획액에서 감압 농축으로 에틸아세테이트를 제거하여 분획물을 수득하였다.
2-5. 부탄올층 분획물
상기 2-4에서 생성되는 하층의 수용액층 분획액에 부탄올(n-butanol) 50㎖을 첨가하여 혼합하고 실온에서 30분간 정치한 다음 생성되는 상층의 부탄올층을 수득하였다.
부탄올층 분획액에서 감압 농축으로 부탄올을 제거하여 분획물을 수득하였다.
2-6. 물층 분획물
상기 2-5에서 생성되는 하층의 수용액층 분획액에서 감압 농축으로 물을 제거하여 분획물을 수득하였다.
실험예 9. 분획물의 아세틸콜린에스테라제 저해활성
상기 실시예 2의 분획물을 대상으로 실험예 3과 같은 방법으로 아세틸콜린에스테라제 저해활성실험을 수행하였다.
이의 결과, 도 18에서와 같이 부탄올층 분획물 및 물층 분획물에서 우수한 AChE 저해활성을 나타내었다.

Claims (4)

  1. a) 아로니아(Aronia Melanocarpa Elliott) 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물;
    b) 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물을 헥산(hexane)과 물로 분획하여 얻어지는 헥산층 분획물;
    c) 상기 b)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 디클로로메탄(dichloromethane)과 물로 분획하여 얻어지는 디클로로메탄층 분획물;
    d) 상기 c)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 물로 분획하여 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물;
    e) 상기 d)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 부탄올(butanol)과 물로 분획하여 얻어지는 부탄올층 분획물; 및
    f) 상기 e)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물; 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 a)의 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물은 동결건조하여 분말화한 아로니아 열매 동결건조분말 100g 당 25 내지 75%(v/v) 에탄올을 800 내지 1200ℓ의 비율로 사용하여 수득한 것임을 특징으로 하는 약학 조성물.
  3. a) 아로니아(Aronia Melanocarpa Elliott) 열매를 동결건조하여 분말화하고 25 내지 75%(v/v) 에탄올로 55 내지 65℃에서 3 내지 7시간 추출하고 농축하여 얻어지는 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물;
    b) 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물을 헥산(hexane)과 물로 분획하여 얻어지는 헥산층 분획물;
    c) 상기 b)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 디클로로메탄(dichloromethane)과 물로 분획하여 얻어지는 디클로로메탄층 분획물;
    d) 상기 c)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 에틸아세테이트(ethyl acetate)와 물로 분획하여 얻어지는 에틸아세테이트층 분획물;
    e) 상기 d)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물을 부탄올(butanol)과 물로 분획하여 얻어지는 부탄올층 분획물; 및
    f) 상기 e)의 분획으로 얻어지는 물층 분획물; 중에서 상기 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물, 부탄올층 분획물 및 물층 분획물로 이루어진 군 중에서 선택된 성분을 유효성분으로 함유하는 기억력 개선, 인지능력 개선, 또는 치매의 예방, 지연 또는 개선용 기능성 식품 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 a)의 25 내지 75%(v/v) 에탄올 추출물은 동결건조하여 분말화한 아로니아 열매 동결건조분말 100g 당 25 내지 75%(v/v) 에탄올을 800 내지 1200ℓ의 비율로 사용하여 수득한 것임을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물.
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