BRPI0609608A2

BRPI0609608A2 - uso de compostos de lignano

Info

Publication number: BRPI0609608A2
Application number: BRPI0609608-5A
Authority: BR
Inventors: Jae-Kwan Hwang; Jung-Soo Han; Chol-Seung Lim; Daqing Jin; Sun-Hee Lee; Kyu-Lee Han
Original assignee: Amicogen Inc
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2010-04-20
Also published as: US20080275111A1; CA2601808C; WO2006104369A1; CA2601808A1; JP2008534582A; AU2006229533B2; EP1863473A1; EP1863473A4; CN101151029A; KR20060104640A; AU2006229533A1; RU2354370C1; JP4909984B2; KR100679306B1

Abstract

USO DE COMPOSTOS DE LIGNANO. A presente invenção refere-se ao novo uso de compostos de lignano representados pela Fórmula 1. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença cerebral, compreendendo um composto de lignano representado pela Fórmula 1 ou um extrato de Myristica fragrans como um ingrediente ativo, assim como o método e uso para tratar ou prevenir uma doença cerebral usando o composto de lignano. O composto de lignano representado pela Fórmula 1 tem os efeitos de antioxidação, proteção de célula cerebral e antiinflamaçáo. Conseqúentemente, o dito composto de lignano será altamente útil para tratar ou prevenir uma doença cerebral.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DECOMPOSTOS DE LIGNANO".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se ao uso de compostos de lignano.Mais particularmente, a presente invenção refere-se a uma composição far-macêutica para o tratamento ou prevenção de doenças cerebrais, compre-endendo compostos de lignano ou o extrato de Myristica fragrans, um méto-do para o tratamento ou prevenção de doença cerebral usando o mesmo, eo uso do mesmo.

Antecedentes da Invenção

Como um aumento da expectativa de vida do ser humano e umaprogressão para uma sociedade em envelhecimento, doenças cerebrais taiscomo apoplexia cerebral, demência e doença de Parkinson são aumentadas.As doenças cerebrais caracterizam que a morte ou a degeneraçao de certascélulas cerebrais é progredida temporariamente ou durante muito tempo.Porque as células cerebrais mortas não são restituídas, a morte da célulacerebral leva a dano mortal da função cerebral. Especialmente, a não con-clusão da função cerebral acompanhando a fragilidade progressiva da fun-ção cognitiva, função sensorial, função de movimento e função corporal totalresulta em mudanças de características e comportamento, assim pacientesdefrontarão-se com a situação de que eles não podem controlar a si mes-mos. Os fatores principais da morte da célula cerebral incluem toxicidadeoxidativa por estresses oxidativos, toxicidade excitatória e apoptose, e cadaum deles causa morte celular através da via de transdução de sinal específi-ca, respectivamente.

Particularmente, em pacientes que sofrem de apoplexia cerebral,dano cerebral, demência tipo Alzheimer e doença de Parkinson, é sugeridoque um fator principal de morte da célula cerebral é o dano oxidativo de pro-teínas, ácidos nucléicos e lipídeos depois do acúmulo de espécies de oxigê-nio reativo. Especialmente, o estresse oxidativo por radicais livres foi relata-do ser um fator principal de morte celular ocorrido em cada tecido de umcorpo, e também foi sugerido ser um mecanismo principal de morte celularem doenças cerebrais (Schapira, A. H., Curr. Opin. Neurol., 9(4):260-264,1996). As evidências de que os radicais livres são associados com a mortede células neuronais na doença cerebral inclui o aumento da formação deespécies de oxigênio reativo depois de isquemia e efeitos inibitórios de mor-te de célula neuronal isquêmica por antioxidantes (Flamm, E. S. era/., Stroke9(5): 445-447, 1978; Chan, P. H., J. Neurotrauma 9 Suppl. 2:S417-423,1992), aumento de Fe2+ no estriado da doença de Huntington (Dexter,, E. T.era/., Ann. Neurol., 32 Suppl.:S94-100, 1992), a formação de radicais livrespor beta-amilóide mostrada na doença de Alzheimer (Richardson J. S. et aí.,Ann. N. Y. Acad. Sei., 777:362-367, 1996), mutação pontual no gene SOD-1de Cu/Zn em esclerose lateral amiotrófica (ALS) (Rosen, D. R. et ai, Nature,362(6415):59-62, 1993), etc.

Adicionalmente, o glutamato, um neurotransmissor excitatório,funciona como um neurotransmissor em um estado normal. Entretanto, oglutamato causa a morte de célula neuronal quando ele é super-expressadodevido a várias razões. A hiperatividade dos receptores de glutamato taiscomo NMDA, AMPA e receptores cainato também são conhecidos como umfator principal de morte de célula neuronal (Choi D. W. Neuron, 1:623-634,1988). Foi descoberto que a toxicidade neuronal por glutamato é associadacom a morte de célula neuronal em ALS. Isto foi sustentado que o distúrbiode glutamato sintetase, distúrbio de proteínas de transporte de glutamato eaumento de proteínas do receptor de glutamato em pacientes com ALS sãoencontrados (Rothstein, J. D. Clin. Neurosci., 3(6):348-359, 1995; Shaw, P.J. era/., J. Neurol., 244:Suppl 2 S3-14, 1997).

Além disso, a apoptose como um outro fator da morte da célulacerebral foi relatada. A apoptose é um tipo principal da morte celular mostra-da em isquemia, dano cerebral, dano vertebral, demência tipo Alzheimer edoença de Parkinson (Smale et ai, Exp. Neurol., 133:225-230, 1995; Crowet al, Nat. Med., 3:73-76, 1997).

Estes relatos mostram que a morte da célula cerebral por toxici-dade oxidativa, toxicidade excitatória e apoptose são fatores principais devárias doenças cerebrais, e assim o desenvolvimento de medicamentos quetratam as doenças cerebrais tem focado na inibição da toxicidade oxidativa etoxicidade excitatória e/ou inibição da apoptose de célula cerebral.

Entretanto, o lignano refere-se a um grupo de compostos natu-rais onde n-fenilpropanos são ligados pelo sítio (3 de cadeias laterais de n-propila e é amplamente distribuído na natureza. Houve estudos nas váriasatividades fisiológicas do lignano, tais como redução da glicose sangüínea,atividade anticâncer, antiasmática e de alvejamento. Por exemplo, foi relata-do que os lignanos isolados do gergelim, tais como sesamina, episesamina,sesaminol, sesamolina e episesaminol, têm efeitos antiinflamatórios (Publi-cação de Patente Coreana Aberta à inspeção pública N2 1997-7001043), ecompostos de lignano isolados de Magnoliae fios podem ser usados comoagentes antiasmáticos (Patente Coreana N2 0263439). Além disso, o mace-lignano é um composto de lignano típico encontrado em Myristica fragrans(Tuchinda P. et ai, Phytochemistry, 59: 169-173, 2002), e foi relatado tervárias atividades, tais como a ativação de caspase-3 que induz a apoptose(Park B.Y. et ai, Biol. Pharm. Buli., 27(8): 1305-1307,2004), e atividade anti-bacteriana. Entretanto, ainda não existe nenhum relato no uso de compostosde lignano, incluindo macelignano como agentes de tratamento de doençacerebral.

Descrição detalhada da invenção

Problema Técnico

Conseqüentemente, os presentes inventores conduziram umainvestigação a longo prazo para encontrar um composto naturalmente deri-vado capaz de tratar atividade de tratamento de doença cerebral e, como umresultado, descobriram que um composto de lignano isolado e purificado deum extrato de Myristica fragrans mostra efeitos excelentes para tratar e pre-venir uma doença cerebral, do mesmo modo concluindo a presente inven-ção.

É um objetivo da presente invenção fornecer o novo uso do ex-trato de Myristica fragrans ou compostos de lignano isolados e purificados domesmo para tratar ou prevenir uma doença cerebral.Solução Técnica

Para obter o objetivo acima mencionado, em um aspecto, a pre-sente invenção fornece uma composição farmacêutica para tratar ou preve-nir uma doença cerebral, compreendendo um composto de lignano repre-sentado pela Fórmula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmocomo um ingrediente ativo:

[Fórmula I]

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em que Ri e R2 são todos independentemente um grupo alcóxi C1-5 ou umgrupo hidroxila, e R3 é

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Em um outro aspecto, a presente invenção fornece um métodopara tratar ou prevenir uma doença cerebral, compreendendo administrar aum paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um com-posto de lignano representado pela Fórmula I.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para inibir uma morte da célula cerebral, compreendendo administrara um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de umcomposto de lignano representado pela Fórmula I.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece o usode um composto de lignano representado pela Fórmula I para a produção deuma agente de tratamento de doença cerebral.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de umcomposto de lignano representado pela Fórmula I para a produção de uminibidor de morte da célula cerebral.Em um outro aspecto, a presente invenção fornece uma compo-sição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doença cerebral, compreen-dendo um extrato aquoso ou de solvente orgânico Ci-C6 de Myristica fra-grans como um ingrediente ativo.

Em aspecto adicional, a presente invenção fornece um métodopara tratar ou prevenir uma doença cerebral, compreendendo administrar aum paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um extra-to aquoso ou de solvente orgânico d-C6 de Myristica fragrans.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece ummétodo para inibir uma morte da célula cerebral, compreendendo administrara um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de um ex-trato aquoso ou de solvente orgânico d-C6 de Myristica fragrans.

Ainda em um outro aspecto, a presente invenção fornece o usode um extrato aquoso ou de solvente orgânico CrC6 de Myristica fragranspara a produção de uma agente de tratamento de doença cerebral.

Em um outro aspecto, a presente invenção fornece o uso de umextrato aquoso ou de solvente orgânico d-C6 de Myristica fragrans para aprodução de um inibidor de morte da célula cerebral.

Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quan- tidade do composto de lignano inventivo ou extrato de Myristica fragrans,que pode inibir eficazmente a morte da célula cerebral e tratar e/ou preveniruma doença cerebral quando sendo administrado a um paciente.

Também, como usado aqui, o termo "paciente" abrange mamífe-ros, particularmente animais incluindo seres humanos. O paciente pode ser um paciente em necessidade de tratamento.

Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhe.

A presente invenção é caracterizada por fornecer o novo uso deum extrato de Myristica fragrans e um composto de lignano isolado e purifi-cado do mesmo.

O composto de lignano de acordo com a presente invenção érepresentado pela Fórmula I:

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[Fórmula I]<formula>formula see original document page 7</formula>

em que Ri e R2 são independentemente um grupo alcóxi C1-5 ou um grupohidroxila,

e R3 é

<formula>formula see original document page 7</formula>

Na presente invenção, o composto de lignano preferível podeser macelignano da Fórmula Química I, isto é, [(8R,8'S)-7-(3,4-metilenodioxifenil)-7'-(4-hidróxi-3-metoxifenil)-8,8'-dimetilbutano)], em que Rié um grupo metóxi, R2 é um grupo hidroxila, e R3 é

<formula>formula see original document page 7</formula>

O composto de lignano de acordo com a presente invenção po-de ser usado na forma de um sal, e preferivelmente um sal farmaceutica-mente aceitável. Preferivelmente, o sal é o sal de adição de ácido formadopor um ácido livre farmaceuticamente aceitável. O ácido livre usado na pre-sente invenção pode ser ácidos orgânicos e ácidos inorgânicos. Os ácidosorgânicos incluem, mas não são limitados a, ácido cítrico, ácido acético, áci-do láctico, ácido tartárico, ácido maléico, ácido fumárico, ácido fórmico, ácidopropiônico, ácido oxálico, ácido trifluoroacético, ácido benzóico, ácido glicô-nico, ácido m-sulfônico, ácido glicólico, ácido succínico, ácido 4-toluenos-sulfônico, ácido glutâmico e ácido aspártico. Também, os ácidos inorgânicosincluem, mas não são limitados a, ácido clorídrico, ácido brômico, ácido sul-fúrico e ácido fosfórico.

O composto de lignano da presente invenção pode ser obtido deuma planta ou parte de uma planta de acordo com qualquer método conven-cional para extrair e isolar a substância. Caules, raízes ou folhas são ade-quadamente desidratados e macerados ou apenas desidratados de modo aobter o extrato desejado, que depois é purificado usando qualquer métodode purificação convencional conhecido a uma pessoa versada na técnica.Além disso, compostos sintéticos ou seus derivados correspondendo aocomposto de lignano representado pela Fórmula I no geral são substânciascomercialmente disponíveis ou eles podem ser quimicamente fabricadosusando qualquer método sintético conhecido.

O composto de lignano da presente invenção representado pelaFórmula I pode ser isolado e purificado de Myristica fragnance Houtt (JungYun Lee era/., Kor. J. Pharmacogn. 21(4):270-273, 1990). Preferivelmente,ele pode ser isolado e purificado de noz moscada ou arila. A noz moscadarefere-se à fruta madura de Myristica fragnance ou uma semente contida nafruta. Além disso, o composto de lignano da presente invenção também po-de ser isolado e purificado do óleo obtido espremendo-se a noz moscada.Também, ele pode ser isolado e purificado de Myristica argentea Warb, umoutro membro da família Myristicaceae (Filleur, F. et ai, Natural Product Let-ters, 16: 1-7, 2002). Além disso, ele também pode ser isolado e purificado deMachilus thunbergii (Park B.Y. et ai, Biol. Pharm. Buli., 27(8): 1305-1307,2004), e Leucas áspera (Sadhu, S.K. et ai, Chem. Pharm. Buli., 51(9):595-598, 2003).

Um solvente de extração para isolar o composto de lignano dapresente invenção pode ser água ou um solvente orgânico CrC6. Os exem-pios preferidos do solvente de extração podem incluir água purificada, meta-nol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, acetona, éter, benzeno, clorofór-mio, acetato de etila, cloreto de metileno, hexano, cicloexano, éter de petró-leo e similares, que podem ser usados sozinhos ou uma mistura dos mes-mos. Mais preferivelmente, metanol ou hexano podem ser usados. O isola-mento e purificação do composto de lignano da presente invenção do extratode Myristica fragnance podem ser realizados, por exemplo, por cromatogra-fia em coluna e cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), acondi-cionado com várias resinas sintéticas, tais como sílica-gel ou alumina ativa-da, ou uma combinação dos mesmos. Entretanto, o método para extrair, eisolar e purificar o ingrediente ativo não precisa ser limitado a estas técnicasde cromatografia.

Como tal, o composto de lignano da presente invenção pode serusado na forma de um composto puramente isolado e purificado ou na formade um extrato contendo o composto. Por exemplo, como descrito acima, ocomposto de lignano da presente invenção pode ser usado na forma de umextrato da semente, fruta ou arila de Myristica fragnance, ou na forma deóleo obtido espremendo-se a semente de Myristica fragnance. Como descri-to acima, o extrato pode ser obtido extraindo-se Myristica fragnance comágua ou um solvente orgânico Ci-C6. Preferivelmente, o extrato pode ser umextrato da semente de Myristica fragnance, isto é, um extrato de noz mosca-da.

As espécies de oxigênio reativo, uma substância que causa atoxicidade oxidativa in vivo, induz a peroxidação de lipídeo que é um compo-nente de uma membrana celular, do mesmo modo destruindo a bioproteçãoe sistema de transferência de sinal da membrana celular, e também induzdano oxidativo de DNA, destruição de um eritrócito e peroxidação de proteí-na, do mesmo modo diminuindo a função de várias enzimas in vivo. Atravésdelas, as espécies de oxigênio reativo são conhecidas causar várias doen-ças tais como câncer, doenças cerebrais incluindo apoplexia cerebral e do-ença de Parkinson, cardiopatia, isquemia, arteriosclerose, doença de pele,doença gástrica, inflamação, reumatismo e doença autoimune, assim comoenvelhecimento. É sugerido que as espécies de oxigênio reativo sejam umfator principal da doença de Alzheimer (Maccioni et aí., Arch. Med. Res.,32:367-281, 2001). Portanto, em um exemplo da presente invenção, a inibi-ção da produção de espécies de oxigênio reativo pelo composto de lignanoda presente invenção foi investigada. Como um resultado, foi mostrado queo composto de lignano da presente invenção inibiu a produção das espéciesde oxigênio reativo causada por glutamato em uma linhagem de célula HT22derivada do hipocampo no cérebro assim como por BSO (sulfóxido de butio-nina) no neurônio cultivado do hipocampo em uma maneira dependente daconcentração (Vide as figuras 7 e 8).

A peroxidação de lipídeo é um índice que mostra o dano cere-bral por estresses oxidativos (Sewerynek et ai, Neuroscience Letter,195:203-205, 1995). O peróxido de hidrogênio é dissociado em água e oxi-gênio. Neste processo, um radical livre de hidroxila é produzido. O radicallivre causa dano ao DNA, carbonilação de proteína e peroxidação de lipídeo.

Portanto, em um outro exemplo da presente invenção, a inibição da peroxi-dação de lipídeo mediada por peróxido de hidrogênio pelo composto de lig-nano da presente invenção foi investigada. Como um resultado, foi mostradoque o composto de lignano da presente invenção inibiu a peroxidação delipídeo em uma maneira dependente da concentração (Vide a figura 9).

Em um outro exemplo da presente invenção, foi investigado se ocomposto de lignano da presente invenção mostrou citotoxicidade propria-mente dita. Como um resultado, foi mostrado que o composto de lignano dapresente invenção não mostrou citotoxicidade mesmo em uma concentraçãode 10 uM (Vide a figura 10).

Uma outra razão para a morte da célula cerebral é a apoptosepor intermédio de glutamato como um neurotransmissor excitatório e seureceptor (Olney, J. W., Int Rev. Neurobiol., 27:337-362, 1985). Portanto, emum outro exemplo da presente invenção, foi investigado se o composto delignano da presente invenção inibiu a apoptose de célula cerebral induzidapelo glutamato. Como um resultado, foi mostrado que a apoptose de célulacerebral induzida pelo glutamato foi inibida pelo composto de lignano da pre-sente invenção em uma maneira dependente da concentração (Vide a figura11).

Adicionalmente, a evidência epidemiológica de que medicamen-tos antiinflamatórios não esteroidais tais como ibuprofeno retardaram o pro-gresso da doença de Alzheimer foi relatada (McGeer e McGeer, Exp. Geron-tol., 33:371-378, 1998). Particularmente, foi mostrado que a administraçãode ibuprofeno em um camundongo tendo uma doença de Alzheimer aparen-te retardou o progresso da doença (Lim et ai, J. Neurosci., 20"5709-5714,2000). Portanto, um composto tendo a atividade antiinflamatória assim comoatividade antioxidativa é altamente eficaz no tratamento e prevenção de do-ença cerebral. Conseqüentemente, em um outro exemplo da presente in-venção, a atividade antiinflamatória do composto de lignano da presente in-venção foi investigada tratando-se uma microglia como uma célula imunecerebral com LPS (lipopolissacarídeo). Como um resultado, foi mostrado queo composto de lignano da presente invenção reduziu significantemente aexpressão e produção de vários mediadores imunes tais como IL-6, TNF-a,NO, iNOS e COX-2 induzidos por LPS (Vide as figuras 12 a 15).

Como mencionado acima, o composto de lignano da presenteinvenção tem um efeito antioxidativo excelente inibindo a peroxidação delipídeo e produção de espécies de oxigênio reativo, um efeito de proteção decélula cerebral excelente inibindo a apoptose de uma célula cerebral, e umefeito antiinflamatório excelente. Portanto, a presente invenção fornece umacomposição farmacêutica para o tratamento e prevenção de uma doençacerebral compreendendo o composto de lignano representado pela fórmula Iou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como ingredientes ativos.

Adicionalmente, a presente invenção fornece uma composição farmacêuticapara o tratamento e prevenção de uma doença cerebral compreendendo oextrato de Myrística fragnance. A preparação do extrato de Myristica frag-nance é descrita acima.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um método e usopara o tratamento e prevenção de uma doença cerebral compreendendoadministrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade efi-caz do composto de lignano representado pela fórmula I ou do extrato deMyristica fragnance.

Adicionalmente, a presente invenção fornece um método e usopara a inibição de uma morte da célula cerebral compreendendo administrara um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz do com-posto de lignano representado pela fórmula I ou do extrato de Myristica fragnance.

A composição da presente invenção pode ser administrada emuma maneira oral ou parenteral e usada na forma de formulações de fárma-co comuns quando da administração clínica. As formulações de medicamen-to comuns podem ser preparadas usando diluentes ou excipientes tais comoenchedores, espessantes, aglutinantes, agentes umectantes, desintegrantese tensoativos. As formulações sólidas para a administração oral incluemcomprimidos, pílulas, pós, grânulos e cápsulas, e são preparadas combinan-do-se o composto de lignano ou o extrato de Myristica fragnance com pelomenos um excipiente, por exemplo, amido, carbonato de cálcio, sacarose,lactose ou gelatina. Também, exceto o excipiente simples, o lubrificante talcomo estearato de magnésio ou talco pode ser usado. Exemplos de formu-lações líquidas para a administração oral incluem suspensões, preparaçõeslíquidas, emulsões e xaropes. As formulações líquidas podem compreenderum diluente simples tal como água, parafina líquida, e vários excipientes, porexemplo, umectantes, adoçantes, agentes aromáticos e conservantes. Osexemplos de formulações farmacêuticas para a administração parenteralincluem soluções aquosas esterilizadas, soluções não aquosas, suspensões,emulsões, preparações secas por congelamento, ungüentos e cremes. Assoluções e suspensões não aquosas podem ser preparadas usando propile-no glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tais como óleo de oliva, e ésteresinjetáveis tais como etiloleato.Também, a composição da presente invenção pode ser adminis-trada por vias parenterais, incluindo injeção subcutânea, intravenosa, intra-muscular ou intraperitoneal. Para a administração parenteral, o composto delignano representado pela Fórmula I ou o extrato de Myristica fragnance po-dem ser misturados com um estabilizador ou tampão em água para prepararuma solução ou suspensão, que depois pode ser formulada como uma for-ma de dosagem unitária de ampolas ou frascos. As unidades de dosagempodem conter, por exemplo, 1, 2, 3, ou 4 vezes de uma dose individual ou1/2, 1/3 ou 1/4 vezes de uma dose individual. Preferivelmente, uma doseindividual contém a quantidade de um medicamento eficaz que é administra-da em uma dosagem e que usualmente corresponde a um inteiro, um meio,um terço ou um quarto de uma dose diária.

O composto de lignano da presente invenção representado pelaFórmula I ou o extrato de Myristica fragnance podem ser administrados emuma dosagem eficaz de 0,1 a 50 mg/kg, e preferivelmente 1 a 10 mg/kg, 1 a3 vezes por dia. A dosagem do composto de lignano representado pela Fór-mula I ou do extrato de Myristica fragnance pode variar dependendo, porexemplo, do peso corporal, idade, sexo, condição de saúde, dieta, tempo deadministração, método de administração, taxa de excreção e severidade dadoença para um certo paciente.

O composto de lignano da presente invenção foi testado quantoà toxicidade em administração oral aos ratos, e como um resultado, foi ob-servado que a dose letal a 50% (LD50) foi de mais do que 2.000 mg/kg (Da-dos não são mostrados).

O termo "doença cerebral" à qual a composição farmacêutica dapresente invenção é aplicável refere-se a uma doença originada da morte oudegeneração de células cerebrais causadas por estresses oxidativos poroxidação de lipídeo, espécies de oxigênio reativo e/ou radicais livres; toxici-dade excitatória por glutamato; e/ou apoptose. Os exemplos da doença ce-rebral incluem, por exemplo, doença cerebral degenerativa tal como demên-cia, deficiência cognitiva suave, doença de Parkinson e doença de Hunting-ton, doença cerebral isquêmica tal como apoplexia cerebral e doença cere-bral convulsiva tal como epilepsia. Em particular, as doenças cerebrais po-dem incluir, mas não são limitadas a, demência, doença de Parkinson, apo-plexia cerebral, doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, doençade Pick, esclerose lateral amiotrófica (ALS), complexo de Parkinson-ALS-demência, doença de Wilson, paralisia supranuclear progressiva, deficiênciacognitiva suave e epilepsia, em que a demência inclui todas de demênciasenil, demência tipo Alzheimer, demência vascular, demência alcoólica edemência talâmica.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 mostra um processo de isolar um composto de lignanode Myristica fragrans.

A figura 2 mostra o espetro de 13C-RMN do composto de lignanoda presente invenção.

A figura 3 mostra o espectro de 1H-RMN do composto de lignanoda presente invenção.

A figura 4 mostra o espectro de 1H-1H COSY do composto delignano da presente invenção.

A figura 5 mostra o espectro de 1H-13C HMBC do composto delignano da presente invenção.

A figura 6 mostra o espectro de massa El do composto de ligna-no da presente invenção.

A figura 7 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção na produção de espécies de oxigênio reati-vo por glutamato em uma célula HT-22.

A figura 8 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção na produção de espécies de oxigênio reati-vo por BSO em uma célula de hipocampo cultivada.

A figura 9 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção na peroxidação de lipídeo do tecido cere-bral causada por peróxido de hidrogênio para várias concentrações.

A figura 10 é o gráfico que mostra o efeito de citotoxicidade docomposto de lignano da presente invenção.A figura 11 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção na apoptose induzida por glutamato paravárias concentrações.

A figura 12 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do composto de lignano da presente invenção em IL-6 em uma microglia cultivada do cé-rebro.

A figura 13 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção em TNF-a em uma microglia cultivada docérebro.

A figura 14 é o gráfico que mostra o efeito inibitório do compostode lignano da presente invenção em NO em uma microglia cultivada do cé-rebro.

A figura 15 mostra os resultados para o efeito inibitório do com-posto de lignano da presente invenção na expressão de proteínas iNOS eCOX-2 induzidas por LPS em uma microglia cultivada do cérebro.

A: um resultado da análise de Western blotting; eB: um gráfico quantitativamente que mostra o efeito inibitório docomposto de lignano da presente invenção na expressão das proteínas i-NOS e COX-2.

A figura 16 mostra os resultados da análise de LC/EM usandomacelignano da presente invenção.

Melhor Modo para Realizar a Invenção

Em seguida, a presente invenção será descrita em detalhe pelosexemplos. Deve ser entendido, entretanto, que estes exemplos são parapropósito ilustrativo apenas e não são intencionados a limitar o escopo dapresente invenção.

Isolamento e purificação do composto de lignano de Myristicafragrans

<1-1> Isolamento e purificação do composto de lignano

A 100 g (peso seco) de noz moscada seca e esmagada, 400 mlde 75% em vol. de metanol foram adicionados, e a solução foi deixada re-pousar na temperatura ambiente durante 2 dias. A solução depois foi filtradaatravés de papel de filtro Whatman Ne 2. A etapa de filtração foi repetida du-as vezes. O filtrado de metanol foi concentrado sob vácuo e liofilizado parapreparar 7 g de um extrato de metanol bruto de noz moscada. O extrato demetanol bruto foi fracionado seqüencialmente com acetato de etila, butanol eágua para obter 4,2 g de uma fração de acetato de etila. A fração de acetatode etila foi eluída por cromatografia em coluna de sílica-gel (Merck Kieselgel66; 70 a 230 malhas) com um solvente misto de hexano e acetato de etila(10:1 v/v) para obter 1,0 g de fração III. O solvente foi completamente remo-vido com um evaporador rotativo a vácuo para preparar um extrato bruto denoz moscada. A fração III depois foi eluída por cromatografia em coluna desílica-gel (Merck Kieselgel 66; 70 a 230 malhas) com um solvente misto dehexano e acetato de etila (20:1 v/v) para obter 0,52 g de fração lll-B. A fra-ção lll-B depois foi eluída por cromatografia em coluna Rp-18 (Merck LiC-hroprep; 25 a 40 um) com 80% de metanol para obter 0,5 g de fração decomposto única lll-B-2. Este processo de isolamento foi mostrado na figura 1.

<1-2> Análise da estrutura

Para determinar a estrutura da fração de composto única isoladalll-B-2, o espectro de 1H-RMN e espectro de 13C-RMN foram analisados a600 MHz e 150 MHz, respectivamente, em solvente DMSO. Os resultadosforam mostrados nas figuras 2 e 3, respectivamente. Para determinar a cor-relação 1H-1H e a correlação 1H-13C na base dos resultados as análises deespectro de 13C-RMN e 1H-RMN, o espectro de 1H-1H COSY e espectro de1H-13C HMBC foram analisados. Os resultados foram mostrados nas figuras4 e 5, respectivamente. Os resultados das análises de espectro de 1H-RMN,13C-RMN, 1H-1H COSY e 1H-13C HMBC foram coletivamente analisadas e osresultados foram mostrados na Tabela 1 abaixo.[Tabela 11

<table>table see original document page 17</column></row><table>

<1-3> Análise de massa

Os resultados da análise de El/MS para a análise de massa docomposto único isolado acima lll-B-2 foram mostrados na figura 6. Na análi-se de El/MS, [M]+ foi observado a m/z 328, indicando que o composto isola-do tem um peso molecular de 328 dálton e uma fórmula molecular deC20H24O4.

<1-4> Medição de rotação óptica

A rotação óptica foi medida dissolvendo-se 20 mg do compostoúnico isolado acima lll-B-2 em 2 ml de clorofórmio(CHCI3), e analisando comum polarímetro automático (APIII-589, Rodulph, NJ, USA). Como um resul-tado, a rotação óptica ([a]D) foi +4,0 (CHCI3, c=1,0).

Os resultados das análises de 1H-RMN, 13C-RMN, 1H-1H COSY,1H-13C HMBC, El/MS e [a]D foram analisados comparativamente com os re-sultados de estudo previamente relatados (Woo, W.S. etal., Phytochemistry,26: 1542-1543, 1987). Como um resultado, foi descoberto que o compostoisolado único foi o macelignano representado pela Fórmula Química I:[Fórmula Química I]

<formula>formula see original document page 18</formula>

Examinação de efeito inibitório de espécies de oxigênio reativode composto de lignano da presente invenção

Uma linhagem de célula HT-22 (obtida de Dr. David Schubert)derivada do hipocampo que desempenha uma parte na memória do cérebro foi tratada com 5 mM de glutamato e 5 uM do composto de lignano da pre-sente invenção simultaneamente durante 8 horas. Como um controle, a li-nhagem de célula HT-22 não foi tratada com o composto de lignano da pre-sente invenção. A linhagem de célula tratada HT-22 depois foi tratada comCM-H2DCFDA (derivado de clorometila de diacetato de diclorodiidrofluores-ceína, Molecular Probes) para analisar a produção de espécies de oxigênioreativo. Como um resultado, mostrado na figura 7, o composto de lignano dapresente invenção inibiu a produção de espécies de oxigênio reativo induzi-da por glutamato. Adicionalmente, no controle que não foi tratado com glu-tamato, o composto de lignano da presente invenção significantemente inibiua produção de espécies de oxigênio reativo ocorrida naturalmente em umacélula.

Depois, o efeito antioxidante do composto de lignano da presen-te invenção no neurônio do hipocampo cultivado em tecido foi analisado.Para esta análise, o hipocampo de um feto extraído de um camundongoprenhe (18 dias) foi cultivado em meio neurobasal (Gibco BRL) contendosuplementos de B-27 e 2 mM de L-glutamina durante 10 dias. Para induzir oestresse oxidativo ao neurônio do hipocampo cultivado em tecido, ele foi tra-tado com 1 mM de BSO durante 8 horas. Aqui, o neurônio do hipocampocultivado em tecido também foi tratado com cada concentração (0,1, 0,5 e 1uM) do composto de lignano da presente invenção simultaneamente paraanalisar o efeito inibitório de espécies de oxigênio reativo do composto delignano da presente invenção. O controle não foi tratado com BSO. Depois, aquantidade de espécies de oxigênio reativo produzidas foi medida por ummétodo conhecido na técnica (Jung, Y. S., Biochem Biophys Res Commun.,320(3):789-94, 2004) usando 10 uM de DCFDA (sondas moleculares). Comoum resultado, mostrado na figura 8, o composto de lignano da presente in-venção inibiu a produção de espécies de oxigênio reativo no neurônio dohipocampo cultivado em tecido no nível similar como o controle.

Examinação do efeito inibitório de peroxidação de lipídeo do composto delignano da presente invenção

Depois da anestesia de um rato, o tecido do rato foi borrifado comsolução salina fisiológica a 0,9% contendo EDTA. O cérebro depois foi extraí-do do rato e lavado com Tris-HCI 20 mM gelado (pH 7,4). Depois de removera água, o peso do cérebro foi medido. O cérebro foi misturado com 0,1 g/mlde Tris-HCI 20 mM gelado (pH 7,4) e homogeneizado. O cérebro homogenei-zado foi centrifugado e o sobrenadante foi coletado. 40 ul do sobrenadanteforam misturados com 40 mM de peróxido de hidrogênio para induzir a pero-xidação de lipídeo. Simultaneamente, concentrações diferentes (0,5, 1, 5 e 10uM) dos compostos de lignano isolados do exemplo 1 foram adicionadas nosobrenadante, respectivamente. Depois da incubação do sobrenadante emágua (37°C) durante 30 a 60 minutos, 162,5 ul de solução R1 (kit de ensaio deperoxidação de lipídeo, Cat. N- 437634, Calbiochem) e 37,5 ul de solução R2(kit de ensaio de peroxidação de lipídeo, Cat. N- 437634, Calbiochem) foramadicionados no sobrenadante cultivado, e o sobrenadante foi incubado ainda a 45°C durante 40 minutos. Depois, a absorbância do meio incubado foi me-dida a 586 nm para quantificar a peroxidação de lipídeo.

Como um resultado, mostrado na figura 9, foi observado que aperoxidação de lipídeo induzida por peróxido de hidrogênio foi inibida de-pendentemente da dose pelo composto de lignano da presente invenção.Especialmente, 10 uM do composto de lignano da presente invenção inibi-ram a peroxidação de lipídeo no nível similar como o controle em que a pe-roxidação de lipídeo não foi induzida por peróxido de hidrogênio.

Examinação do efeito de citotoxicidade do composto de lignano da presenteinvenção

De modo a examinar o efeito de citotoxicidade do macelignanopropriamente dito, uma linhagem de célula HT-22 derivada do hipocampo foitratada com macelignano em concentrações (1, 5 e 10 uM) durante 24 ho-ras. Como um resultado, mostrado na figura 10, o macelignano da presenteinvenção não induziu a citotoxicidade em até 10 uM.

Examinação do efeito inibitório de apoptose de célula cerebral do compostode lignano da presente invenção

Uma linhagem de célula HT-22 derivada do hipocampo foi trata-da com 5 mM de glutamato durante 24 horas para induzir a apoptose. Comoum controle, a linhagem de célula HT-22 não foi tratada com glutamato. De-pois, a linhagem de célula HT-22 foi tratada com o composto de lignano dapresente invenção em concentrações (1, 2, 5 e 10 uM) durante 24 horas. Amorte celular foi analisada com WST-1 (Roche). Como um resultado, mos-trado na figura 11, foi observado que o composto de lignano da presenteinvenção inibiu dependentemente da dose a apoptose de célula cerebral in-duzida por glutamato.<Exemplo 6>

Examinacão do efeito antiinflamatório do composto de lianano da presenteinvenção

<6-1> efeito inibitório de citocina pró-inflamatória

A microglia é a única célula originada do mesoderma no sistemanervoso central, e é significantemente aumentada quando uma reação deinflamação é ocorrida no tecido cerebral (Streit, W. J. Prog. Neurobiol.,57:563-581, 1999). Quando a microglia é ativada por LPS, ela sintetiza esecreta várias citocinas pró-inflamatórias tais como IL-1, IL-6 e TNF-a (Chen,S. Neurobiol. Aging, 17:781-787, 1996). Portanto, de modo a examinar o e-feito antiinflamatório do composto de lignano da presente invenção, o efeitodo composto de lignano da presente invenção na produção de IL-6 e TNF-ana microglia ativada. Primeiro, apenas o neocórtex foi isolado do cérebro dorato de 1 dia de idade. Depois, uma mistura de microglia-astroglia foi prepa-rada de acordo com um método conhecido na técnica (Kim, H. Y. et ai, J.Immunol., 171:6072-6079, 2003). A mistura de microglia-astroglia depois foidividida em uma razão de 4 frascos/1 cabeça e cultivada em meio MEM con-tendo 10% de FBS em um frasco de 75 cm2 durante 2 semanas. A microgliafoi separada das células cultivadas e foi cultivada em meio MEM contendo5% de FBS durante 24 horas. A microglia cultivada depois foi lavada com omeio isento de soro duas vezes, e tratada com 1 ug/ml de LPS e 2,5 e 10uM do composto de lignano da presente invenção durante 24 horas. Depois,a quantidade de IL-6 e TNF-a secretadas no meio cultivado em célula foimedida com o sistema ELISA de fase sólida (RPN2742 para IL-6, RPN2744para TNF-a, Amersham Bioscience). Para esta análise, 50 ul do sobrena-dante do meio cultivado de microglia e 50 ul do padrão de cada material (IL-6 ou TNF-a puramente isolada e quantificada) foram adicionados em umaplaca de 96 cavidades revestida com um anticorpo específico para IL-6 eTNF-a de camundongo. Depois de duas horas da reação na temperaturaambiente, cada cavidade foi lavada com um tampão de lavagem (AmershamBioscience) 3 vezes. 100 uM do anticorpo específico para IL-6 ou TNF-a tra-tadas com biotina foram adicionados em cada cavidade e incubados na tem-peratura ambiente durante uma hora. Cada cavidade foi lavado com umtampão de lavagem 3 vezes. 100 ul de solução de estreptavidina (Amer-sham Bioscience) ligada com HRP foram adicionados em cada cavidade, eincubados na temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois, 100 ul deuma solução de parada (Amersham Bioscience) foram adicionados em cadacavidade para parar a reação, e a absorbância da solução em cada cavidadefoi medida com um microleitor a 450 nm. Como um resultado, mostrado nasfiguras 12 e 13, a produção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF-a) in-duzidas por LPS foi inibida dependentemente da dose pelo composto de lig-nano da presente invenção. Especialmente, o efeito inibitório na produção deTNF-a foi mais alto.

<6-2> efeito inibitório da produção de NO em microglia ativada por LPS

Quando a microglia é ativada, a expressão de NO como um me-diador de transmissão nervosa e resposta imune é induzida (Liu, B. et ai,Ann. N. Y. Acad. Sei., 962:318-331, 2002). Portanto, o efeito do composto delignano da presente invenção na produção de NO em microglia foi examina-do. Primeiro, apenas o neocórtex foi isolado do cérebro do camundongo de 1dia de idade. Depois, uma mistura de microglia-astroglia foi preparada deacordo com um método conhecido na técnica (Kim, H. Y. et ai, J. Immunol.,171:6072-6079, 2003). A mistura de microglia-astroglia depois foi divididaem uma razão de 4 frascos/1 cabeça e cultivada em meio MEM contendo10% de FBS em um frasco de 75 cm2 durante duas semanas. A microglia foiseparada das células cultivadas e cultivada em meio MEM contendo 5% deFBS durante 24 horas. A microglia cultivada em tecido foi inoculada em meioMEM contendo 5% de FBS em uma concentração de 1,5x104 célu-las/cavidade e cultivada em uma placa de 96 cavidades. Depois de 1 dia decultivo, a microglia foi tratada com 1 ug/ml de LPS (Sigma) para induzir aativação da microglia. Simultaneamente, a microglia também foi tratada com2,5 e 10 uM do composto de lignano da presente invenção juntamente comLPS, e reagida durante 16 ou 24 horas. Depois, o meio cultivado em célulafoi coletado e a produção de NO foi medida. A produção de NO foi analisadamedindo-se a quantidade de nitrito como um metabólito estável de NO nomeio cultivado em célula usando o kit de reagente de Griess (Molecular Pro-be). O método de medição é como segue: 150 ul do meio cultivado em célu-la foram misturados com 20 ul de reagente de Griess e 130 ul de água, eincubados em uma microplaca na temperatura ambiente durante 30 minutos.Depois, a absorbância da solução resultante foi medida com um leitor demicroplaca a 548 nm.

Como um resultado, mostrado na figura 14, a produção de NOinduzida por LPS na microglia cultivada em tecido foi inibida dependente-mente da dose pelo composto de lignano da presente invenção. Especial-mente, 10 uM do composto de lignano da presente invenção exibiram cercade 90% de taxa de inibição.

<6-3> Efeito inibitório na expressão de iNOS e COX-2

No exemplo <6-2>, foi observado que a produção de NO induzi-da por LPS na microglia cultivada em tecido de camundongo foi inibida pelocomposto de lignano da presente invenção. NO é produzido pela enzimaiNOS da qual a expressão é induzida por ativação da microglia. Portanto, acorrelação entre a redução da produção de NO e inibição da expressão deiNOS foi examinada. Adicionalmente, uma mudança na quantidade de umaproteína COX-2 que participa na produção de outros materiais mediadoresde inflamação foi examinada. Para a análise de Western blotting, a microgliacultivada em tecido foi cultivada em uma placa de cultura celular de 60 mmaté uma concentração de 7,5x105 células/ml. Depois de 1 dia de cultivo, aativação da microglia foi induzida por 1 ug/ml de tratamento com LPS (Sig-ma). Simultaneamente, a microglia também foi tratada com 2,5 e 10 uM docomposto de lignano da presente invenção juntamente com LPS, e incubadadurante 16 ou 24 horas. A célula incubada foi lavada com PBS fria 2 vezes,e depois dissolvida em um tampão de lise frio (1 % de SDS, 1 mM deNa3V04, 10 mM de NaF, 10 mM de Tris-CI, pH 7,4 contendo 1 X de coquetelde inibidores de protease). O lisato celular foi centrifugado a 4°C e 12.000xgdurante 10 minutos e o sobrenadante foi coletado. Depois, a quantidade deproteínas foi quantificada de acordo com o método BCA. As proteínas com amesma quantidade foram separadas através de SDS-PAGE, e transferidasem uma membrana de PVDF. Cada membrana foi bloqueada com 3 % desolução de BSA, e lavada com solução de TBS-T (10 mM de Tris-CI, pH 7,5,150 mM de NaCI contendo 0,1% de Tween 20) 3 vezes. Os anticorpos pri-mários específicos para iNOS (Ab policlonal de coelho, Upstate, 06-573) eCOX-2 (Ab policlonal de coelho, Santa Cruz Biotechnology, sc-7951) depoisforam adicionados na membrana e incubados na temperatura ambiente du-rante uma hora. Depois que a membrana foi lavada com solução de TBS-T 3vezes, anticorpos secundários específicos lidados a HRP foram adicionadosna membrana, e incubados na temperatura ambiente durante 1 hora. Nova-mente, a membrana depois foi lavada com solução de TBS-T 3 vezes, e ca-da faixa na membrana foi analisada usando sistema ECL (Sigma).

Como um resultado, mostrado na figura 15, a expressão de i-NOS e COX-2 induzida por LPS na microglia cultivada em tecido foi inibidaem uma maneira dependente da concentração pelo composto de lignano dapresente invenção.

Teste de transmissão do composto de lignano da presente invenção para océrebro

A transmissão do composto de lignano da presente invençãopara o cérebro foi examinada.

<7-1> Tratamento de maceliqnano da presente invenção e coleta da amostraTubos PE50 são independentemente inseridos na veia femoral eartéria femoral de um rato SD macho de 250 g, e seringas individualmentecontendo solução salina fisiológica e heparina (25 I.U.) são conectadas aostubos, respectivamente. O macelignano isolado e purificado no exemplo 1 foidissolvido em DMSO, e intravenosamente administrado no rato na quantida-de de 1 mg/kg. 400 ul das amostras de sangue foram coletados da artériaem 0,5, 1, 1,5 e 2 minutos depois da administração. Depois da última amos-tragem, a cabeça do rato foi rapidamente cortada, e o tecido cerebral foi ex-traído e levemente lavado com solução salina fisiológica.<7-2> Tratamento da amostra

a. Tratamento da amostra de sangue

A amostra de sangue preparada no exemplo <7-1> foi centrifu-gada a 3.000 rpm durante 5 minutos para obter 100 pi de plasma sangüíneo.500 ul de acetato de etila foram adicionados no plasma sangüíneo e a mistu-ra foi agitada com um agitador automático durante 10 minutos. Depois, amistura foi centrifugada a 3.000 rpm durante 5 minutos para obter 400 ul dosobrenadante. O sobrenadante foi evaporado e seco na corrente de nitrogê-nio e reformulado como 100 ul de uma fase móvel.

b. Tratamento da amostra de tecido cerebral

0 peso da amostra de tecido cerebral preparada no exemplo <7-1> foi medido, e depois solução salina correspondendo ao peso de duas ve-zes mais alto do que aquele do tecido cerebral foi adicionada no tecido cere-bral e a mistura foi homogeneizada. A mistura homogeneizada foi agitadacom um agitador automático durante 5 minutos, e depois a mistura foi centri-fugada a 3.000 rpm durante 5 minutos. 5 ml de acetato de etila foram adicio-nados em 1 ml do sobrenadante obtido da centrifugação e a mistura foi agi-tada com um agitador automático durante 10 minutos. Depois, a mistura foicentrifugada a 3.000 rpm durante 5 minutos para obter o sobrenadante. 4 mldo sobrenadante foram evaporados e secos na corrente de nitrogênio e re-formulados como 100 pi de uma fase móvel.

<7-3> Teste padrão

1 mg/ml de uma solução de estoque preparada dissolvendo-semacelignano isolado no exemplo 1 em metanol foi sucessivamente diluído.10 pi da solução de macelignano foram adicionados em 90 pi de plasmasangüíneo em branco de rato ou 90 pl de homogenado cerebral em brancode rato para preparar uma concentração desejada de amostra de plasma ouamostra de tecido cerebral. Depois, cada amostra foi tratada de acordo como método do exemplo <7-2>. 10 pl da amostra reformulada como 100 pl dafase móvel foram introduzidos no sistema de LC/EM (Agilent 1100 Series,Agilent Technologies, Santa Clara, USA). A análise de LC/EM foi conduzidausando coluna Luna C18 de 3,0 mm x 150 mm (Phenomenex, Torrance, CA,USA) sob a condição de fase móvel de acetonitrila:metanol:água destiladadesionizada (DDW) = 40:40:20.

Como um resultado, mostrado na figura 16, o macelignano foidetectado em SIM [327.0-328.0] de ESI negativo, e o tempo de retenção éde 8,36 minutos. No cromatograma acima, a área de um pico de maceligna-no foi calculada e a curva padrão linear com respeito à concentração e áreade macelignano foi preparada.

<7-4> Análise da amostra

A amostra de sangue e amostra de tecido cerebral tratadas noexemplo <7-2> foram introduzidas no sistema de LC/EM, e depois a análisede LC/EM foi realizada de acordo com o método do exemplo <7-3> e a áreade um pico de macelignano foi obtida na cromatografia. A concentração demacelignano foi calculada usando-se a área do pico de macelignano atravésda curva padrão preparada no exemplo <7-3>.

<7-5> Cálculo de transmissão de macelignano no cérebro

Em um gráfico de tempo-concentração de macelignano obtidona amostra de sangue através do exemplo <7-4>, AUCo1 (Área Sob a Curva:AUC) de 0 ao último tempo de amostra "tlast", foi obtida com um método tra-pezoidal (SchaunYs Outline of Mathematica, MaGraw-Hill, 2000). Adicional-mente, a quantidade (Xb) de macelignano foi calculada usando a concentra-ção da amostra de tecido cerebral. AUC de macelignano pode ser calculadausando a equação matemática 1.

[Equação matemática 1]

<formula>formula see original document page 26</formula>

em que, C é a concentração de macelignano, e At é uma mudança de tempo.

O valor de depuração de captação cerebral (CLuptake) detransmissão de macelignano ao cérebro pode ser calculado usando a equação matemática 2.

[Equação matemática 2]<formula>formula see original document page 27</formula>

A equação matemática 2 foi obtido pelo processo seguinte.

A mudança da quantidade de macelignano no cérebro pode serrepresentada pela equação matemática 3.

[Equação matemática 3]

<formula>formula see original document page 27</formula>

em que CLcaptação é o valor de depuração de captação cerebralde transmissão de macelignano ao cérebro, CLefiUxo é o valor de depuraçãode captação cerebral da transmissão de macelignano ao sangue, Cp é umaconcentração de macelignano no sangue, eCbéa concentração de mace-lignano no tecido cerebral.

Na hipótese de que Cb é próximo a 0 imediatamente depois dainjeção, a equação matemática 3 pode ser representada pela equação ma-temática 4.

[Equação matemática 4]

<formula>formula see original document page 27</formula>

Se ambos os lados são integrados de t = 0 a t = t, a equaçãomatemática 4 pode ser representada pela equação matemática 5.

[Equação matemática 5]

<formula>formula see original document page 27</formula>

A equação matemática 5 é calculada na equação matemática 6.

[Equação matemática 6]

<formula>formula see original document page 27</formula>

Portanto, a depuração de captação cerebral da transmissão de macelignano ao cérebro pode ser representada pela dita equação matemáti-ca 2.A depuração de captação cerebral da transmissão de macelig-nano ao cérebro foi calculada usando a equação matemática 2. Como umresultado, mostrado na Tabela 2, a depuração de captação cerebral datransmissão de macelignano ao cérebro foi de 0,203 ± 0,039 mL/min. Nabase do resultado, pode ser observado que a transmissão ao cérebro demacelignano foi relativamente satisfatória.

Tabela 2

A depuração de captação cerebral da transmissão de macelignano ao cérebro

<table>table see original document page 28</column></row><table>

Preparação das formulações farmacêuticas compreendendo acomposição farmacêutica para tratar ou prevenir a doença cerebral de acor-do com a presente invenção

<1-1> Preparação da formulação de comprimido

25 mg do composto de lignano ou extrato de Myristica fragransda presente invenção, 26 mg de lactose para formação de comprimido direta,3,5 mg de Avicel (celulose microcristalina), 1,5 mg de gliconato de amidosódico (auxiliar de desintegração) e 8 mg de L-HPC (hidroxipropilceluloseinferior; aglutinante) para formação de comprimido direta foram colocadosem um misturador tipo U e misturados entre si durante 20 minutos. Depoisda conclusão da mistura, 1 mg de estearato de magnésio (lubrificante) foiadicionado ainda a esta e misturado durante 3 minutos. A mistura foi subme-tida ao teste para a análise quantitativa e análise do teor de umidade, com-primida e revestida com uma película, preparando assim uma formulação decomprimido.

<1-2> Preparação da formulação de xarope

Um xarope compreendendo 2% (p/v) do macelignano da presen-te invenção ou seu sal farmaceuticamente aceitável como um ingredienteativo foi preparado na maneira seguinte:

2 g de um sal de adição de ácido do macelignano da presenteinvenção, 0,8 g de sacarina e 25,4 g de açúcar foram dissolvidos em 80 g deágua quente. A solução foi esfriada, e depois 8,0 g de glicerina, 0,04 g defragrância, 4,0 g de etanol, 0,4 g de ácido sórbico e uma quantidade ade-quada de água destilada foram adicionados na solução esfriada. À mistura,água foi adicionada para compor um volume de 100 ml.

<1-3> Preparação da formulação de cápsula

50 mg do composto de lignano ou extrato de Myristica fragransda presente invenção, 50 mg de lactose, 46,5 mg de amido, 1 mg de talco euma quantidade adequada de estearato de magnésio foram misturados en-tre si. A mistura foi enchida em uma cápsula de gelatina dura, preparandoassim uma formulação de cápsula.

<1-4> Preparação de líquido injetável

Um líquido injetável compreendendo 10 mg do ingrediente ativofoi preparado na maneira seguinte:

1 g de um cloridrato do macelignano da presente invenção, 0,6 gde cloreto de sódio e 0,1 g de ácido ascorbico foram dissolvidos em águadestilada para preparar 100 ml de uma solução. A solução foi colocada emfrasco e esterilizada aquecendo-a a 20°C durante 30 minutos.

Doença de Parkinson

Foi conhecido que a doença de Parkinson é uma doença cere-bral degenerativa do sistema nervoso central, e apresenta tremor, rigidezmuscular e uma perda do movimento físico (acinesia) acompanhada por me-lancolia mental. Também foi conhecido que a doença de Parkinson é princi-palmente devido à morte de célula neuronal dopaminérgica da substâncianegra compacta (Fahn S., Parkinson's disease in: Diseases of the nervoussystem, (ED) por A. Asbury, G. Mckhann, páginas 1217-1238, Saunders,1986). Foi relatado que a morte de célula neuronal acompanhada pela doen-ça de Parkinson é devido ao estresse oxidativo, distúrbio do metabolismo deenergia, mutação de genes mitocondriais, toxicidade de aminoácido excitató-ria, etc. Especialmente, existem muitos relatos que a morte de célula neuro-nal é principalmente devido ao estresse oxidativo (Fahn S. e Cohen, G., Ann.Neurol. 32(6):804-812, 1992; Foley P. e Riederer P., J. Neurol., 247 [Sppl.2]II/82-II/94, 2000). Conseqüentemente, a composição farmacêutica da pre-sente invenção tendo atividade protetiva das células cerebrais do estresseoxidativo e atividade inibitória da morte da célula cerebral por apoptose éaltamente eficaz no tratamento ou prevenção da doença de Parkinson.

Demência de Alzheimer

Foi conhecido que a doença de Alzheimer é uma doença neuro-nal degenerativa acompanhada por distúrbio de memória severo e doençamental, e sua taxa de ocorrência é de cerca de 10 a 15%/ano. De acordocom a opinião de autópsia de pacientes com doença de Alzheimer, eles a-presentam placa senil e emaranhado neurofibrilar. O dano oxidativo é rela-cionado na ocorrência de placa senil, e a placa senil propriamente dita causauma resposta à inflamação. Houve um relato na evidência epidemiológica deque agentes antiinflamatórios tais como ibuprofeno retardaram o progressoda doença de Alzheimer (McGeer e McGeer, Exp. Gerontol., 33:371-378,1998). Em um camundongo de doença de Alzheimer aparente, o tratamentode ibuprofeno retardou o progresso da doença (Lim et ai, J. Neurosci.,20:5709-5714, 2000). Conseqüentemente, a composição farmacêutica dapresente invenção tendo atividade protetiva das células cerebrais do estres-se oxidativo e atividade antiinflamatória é altamente eficaz no tratamento ouprevenção da doença de Alzheimer.

Apoplexia cerebral

A apoplexia cerebral refere-se a sintomas neurológicos mostra-dos por dano de uma porção correspondente do cérebro, ocorridos por obs-trução ou rompimento do vaso sangüíneo que fornece o sangue ao cérebro.

O cérebro realiza muitas funções. Entretanto, a porção danificada do cérebronão funciona, exibindo assim distúrbio de movimento físico e distúrbio dememória. A apoplexia cerebral é ocorrida em pessoas principalmente idosas,mas pode ser ocorrida em pessoas da casa dos vinte ou trinta. A taxa deocorrência da apoplexia cerebral não é reduzida durante 10 anos. Foi co-nhecido que a apoplexia cerebral é devido à apoptose induzida por superex-citação de um receptor de NMDA (N-metil-D-aspartato) por glutamato super-secretado. A atividade da microglia contribui para a toxicidade de NMDA(Tikka e Koistinaho, J. Immunol., 166(12):7527-33, 2001). Adicionalmente,uma outra razão da apoplexia cerebral é o estresse oxidativo. Conseqüen-temente, a composição farmacêutica da presente invenção tendo atividadeprotetiva das células cerebrais de estresse oxidativo e atividade antiinflama-tória é altamente eficaz no tratamento ou prevenção de apoplexia cerebral.

Deficiência cognitiva suave (MCI)

Muitas pessoas idosas apresentam um distúrbio de memórialeve, mas não tem nenhuma dificuldade severa na vida diária normal. Estasituação é referida como "deficiência cognitiva suave (MCI)". As pessoasidosas diagnosticadas como MCI têm uma possibilidade alta (10 a 15%/ano)para progredir nas doenças neuronais degenerativas tais como doença deAlzheimer dentro de alguns anos. Esta deficiência cognitiva suave é um es-tágio transicional entre senilidade normal e doença de Alzheimer inicial, e umsintoma predromal de doença neuronal degenerativa. De acordo com a opi-nião de autópsia de pacientes com MCI, eles apresentam placa senil e ema-ranhado neurofibrilar como sendo similares à doença de Alzheimer. O danooxidativo é relacionado em ocorrência de placa senil, e a placa senil propri-amente dita causa uma resposta à inflamação. Conseqüentemente, a com-posição farmacêutica da presente invenção tendo atividade protetiva dascélulas cerebrais de estresse oxidativo e atividade antiinflamatória é alta-mente eficaz no tratamento ou prevenção da deficiência cognitiva suave.

Referência Cruzada aos Pedidos Relacionados

Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente CoreanoN- 10-2005-0026963, depositado em 31 de Março de 2005, os conteúdos doqual são por meio desta incorporados por referência.Aplicabilidade Industrial

Como descrito acima, o composto de lignano da presente inven-ção tem o efeito inibitorio em vários mediadores causando a morte da célulacerebral e sua atividade. Especialmente, ele tem um efeito antioxidativo real-çado inibindo a peroxidação de lipídeo e produção de espécies de oxigênioreativo, um efeito protetor de célula cerebral realçado inibindo a apoptose decélulas cerebrais, e um efeito antiinflamatório realçado. Conseqüentemente,o composto de lignano da presente invenção ou extrato de Myristica fragransserá altamente útil para o tratamento ou prevenção de doenças cerebrais.

Claims

1. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doençacerebral, que compreende um composto de lignano representado pela Fór-mula I ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo como um ingredi-ente ativo:[Fórmula I] <formula>formula see original document page 33</formula> em que Ri e R2são independentemente grupo alcóxi C1-5 ou grupo hidroxila,e R3 é <formula>formula see original document page 33</formula>

2. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, ocomposto de lignano é o macelignano representado pela Fórmula Química I:[Fórmula Química I] <formula>formula see original document page 33</formula>

3. Composição farmacêutica para tratar ou prevenir uma doençacerebral, que compreende água ou extrato de solvente orgânico d-C6 deMyristica fragrans como um ingrediente ativo.

4. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1 ou-3, em que a doença cerebral é qualquer uma selecionada do grupo consis-tindo em demência, doença de Parkinson, apoplexia cerebral, doença deHuntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, doença de Pick, esclerose lateralamiotrófica (ALS), complexo de Parkinson-ALS-demência, doença de Wilson,paralisia supranuclear progressiva, deficiência cognitiva suave e epilepsia.

5. Método para tratar ou prevenir uma doença cerebral, compre-endendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quanti-dade eficaz de um composto de lignano representado pela Fórmula I.

6. Método para inibir uma morte da célula cerebral, compreen-dendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantida-de eficaz de um composto de lignano representado pela Fórmula I.

7. Método de acordo com a reivindicação 5 ou 6, o composto delignano é o macelignano representado pela Fórmula Química I:[Fórmula Química I]

8. Método para tratar ou prevenir uma doença cerebral, compre-endendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo em umaquantidade eficaz de água ou um extrato de solvente orgânico CrC6 de M-yristica fragrans.

9. Método para inibir uma morte da célula cerebral, compreen-dendo administrar a um paciente em necessidade do mesmo em uma quan-tidade eficaz de água ou um extrato de solvente orgânico CrC6 de Myristicafragrans.

10. Uso de um composto de lignano representado pela Fórmula Ipara preparar uma composição farmacêutica para a prevenção ou tratamen-to de uma doença cerebral.

11. Uso de um composto de lignano representado pela Fórmula Ipara preparar uma composição farmacêutica para a inibição da morte dacélula cerebral.

12. Uso de acordo com a reivindicação 10 ou 11, o composto delignano é o macelignano representado pela Fórmula química I:<formula>formula see original document page 35</formula>

13. Uso de água ou um extrato de solvente orgânico CrC6 deMyristica fragrans para preparar uma composição farmacêutica para a pre-venção ou tratamento de uma doença cerebral.

14. Uso de água ou um extrato de solvente orgânico C1-C6 deMyristica fragrans para preparar uma composição farmacêutica para a inibi-ção da morte da célula cerebral.