CN115054598A - 小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了小分子化合物(安五脂素)在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，安五脂素对多发性骨髓瘤细胞具有杀伤作用，且与蛋白酶体抑制剂具有协同作用。
Description
技术领域
本发明属于药物应用技术领域，具体涉及一种小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞恶性增殖的肿瘤，其重要的特征之一是多发性骨的病变，常见好发部位为肋骨、颅骨和胸骨等。 MM通常以浆细胞恶性增殖为特征，最终导致突变浆细胞在整个骨髓中积累。目前多发性骨髓瘤的治疗取得了很大的进展，但是MM仍然是不可治愈的恶性浆细胞增殖的血液肿瘤，位列第二大血液系统疾病。近年来，随着人口老龄化MM发病率不断上升，发病年龄的中位数为64岁。常见的症状有溶骨性病变、贫血、肾功能损害和感染等，严重影响了患者的生活质量，目前确切的诱发病因及发病机制仍不清楚。
在近二十年里，出现了许多新的疗法与治疗药物，如：蛋白酶体抑制剂、单克隆抗体、免疫调节药物以及骨髓移植和嵌合抗原受体T细胞治疗。临床上的治疗方案多为多药联合使用，新的药物和联合疗法的出现拓宽了MM的治疗可选择范围，并为患者提供了更加个性化的方法。目前MM的标准一线与二线治疗药物是蛋白酶体抑制剂，硼替佐米(Bortezomib,BTZ)应用于 MM的临床治疗已有10余年的历史。BTZ是一种人工合成的具有高度选择性的26S硼酸盐，能与细胞中的蛋白酶活性位点的苏氨酸结合，可逆地抑制 26S亚基的胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶的活性，促进MM细胞的凋亡并阻止其在骨髓微环境中的黏附。临床上，BTZ治疗MM取得了瞩目的成效，有其参与的化疗方案大大提高了MM患者的缓解率。但是，BTZ也带来了一定的治疗相关毒副作用，如血细胞减少、乏力、胃肠道不适和周围神经病变等。更不幸的是，几乎所有的MM患者经BTZ治疗后最终仍不可避免地出现了原发或继发性耐药。据报道显示，约40～50％的初治MM患者对BTZ存在原发耐药现象，BTZ对经其他药物治疗后的复发/难治性多发性骨髓瘤 (Relapsed/refractory multiple myeloma,RRMM)患者的有效率仅为25％，甚至更低；在使用BTZ维持治疗后，有约30％的MM患者出现继发耐药现象。目前对MM特别是RRMM的治疗不断有新药被开发出来，比如在第一代蛋白酶体抑制剂BTZ的基础上开发了第二代蛋白酶体抑制剂卡非佐米及伊沙佐米，在第一代免疫调节剂(Immunomodulatory drug,IMiD)沙利度胺和第二代IMiD来那度胺的基础上开发了第三代IMiD泊马度胺。这些新药在针对MM治疗的临床试验中均显示出充满希望的疗效，虽都被美国食品药品监督管理局(US Food and Drug Administration,FDA)批准上市，但目前仍处于临床试验阶段，远期疗效需要观察。因此，在现有治疗MM的药物中，无论是在MM的诱导、巩固、补救或维持治疗上，我们当前迫切需要找到一种大幅度提高MM 药物效应且毒副作用小、价格相对低廉的药物，以增强现有药物的疗效，改善MM患者的生存率及生活质量。
中医药作为我国特色的医疗手段，现已成为抗肿瘤综合治疗的重要组成部分，有其独特的优势，它可及时修复化疗药物所带来的毒副作用，提高病体的生理机能，改善患者的生活质量，增加肿瘤对化疗药物的敏感性，其抗肿瘤的作用已经被广泛应用于临床中。相比人工体外合成的小分子化合物，天然产物不仅在肿瘤治疗应用方面存在高效低毒的天然优势，而且骨架结构往往新颖，有利于进一步新药开发利用。此外，部分天然产物在其他适应症中经过大量临床试验的尝试，安全性已有初步的保证。因此，近年来，从天然产物中筛选抗肿瘤药物已经成为肿瘤药物开发中的一种重要手段。
安五脂素(Anwulignan)，来源于我国传统中药南五味子的干燥果实的提取物的木脂素成分。作为五味子中的主要药用活性成分，安五脂素是一种多功能的中药单体成分，具有抗氧化、抑制血小板聚集等药理活性。在过往的研究中，安五脂素相关的研究大多集中在其抗氧化、肝脏保护等方面上，而对其抗肿瘤活性研究甚少。
因此，有必要研究一种从中药中提取的小分子化合物(安五脂素)来制备治疗多发性骨髓瘤药物。
发明内容
本发明目的是提供一种小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
本发明的技术方案是：小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，所述小分子化合物为安五脂素，其结构式如下式(I)：
进一步的，在所述制备治疗多发性骨髓瘤药物中，还包括蛋白酶体抑制剂，所述蛋白酶体抑制剂与所述小分子化合物协同。
进一步的，所述蛋白酶体抑制剂为硼替佐米或卡非佐米中的任意一种。
本发明提供了一种小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其优点是：天然小分子化合物安五脂素能够诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡、细胞周期阻滞，并且与蛋白酶体抑制剂硼替佐米、卡非佐米具有协同作用。本发明有助于为临床上治疗多发性骨髓瘤提供一种潜在有效的，能够增强蛋白酶体抑制剂效应的药物。
附图说明
图1为安五脂素对U266、ARH-77细胞系增殖抑制的IC50示意图；
图2为经安五脂素处理后，U266、ARH-77细胞系凋亡变化图；
图3为经安五脂素处理后，U266、ARH-77细胞系的周期分布变化图；
图4为安五脂素与硼替佐米在U266、ARH-77细胞系中的协同关系示意图；
图5为安五脂素与卡非佐米在U266、ARH-77细胞系中的协同关系示意图；
图6为小鼠急性毒性实验：安五脂素对小鼠体重及脏器指数的影响图；
图7为小鼠骨髓瘤原位移植瘤实验验证安五脂素对小鼠多发性骨髓瘤的抑制作用图；
图8为生物素化修饰安五脂素图；
图9为生物素化修饰安五脂素的核磁共振碳谱图；
图10为生物素化修饰安五脂素的核磁共振氢谱图；
图11为生物素化修饰安五脂素的体外活性检测图；
图12为LC-MS法鉴定安五脂素的靶蛋白图。
具体实施方式
本发明的目的在于提供一种天然小分子化合物作为多发性骨髓瘤潜在治疗药物，通过检测安五脂素对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用及与蛋白酶体抑制剂的协同作用，来对其治疗多发性骨髓瘤的可行性进行评估，有助于为骨髓瘤患者的临床治疗提供新的治疗选择。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。
此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
实施例1
1、CCK8检测安五脂素对多发性骨髓瘤U266、ARH-77细胞系的增殖抑制作用：将U266、ARH-77细胞系(105个细胞/ml)以90ul/孔的体积接种到96孔板中，然后加10u/孔的不同药物浓度(6.125,12.5,25,50,100uM)，处理48小时，对照组加入10ul培养基。72小时每孔加入10ul CCK8试剂， 37℃孵育2小时，使用酶标仪在450nm波长处测量最终吸光度，Graphpad prism计算IC50。请参阅图1，图1为安五脂素对U266、ARH-77细胞系增殖抑制的IC50示意图。如图1所示，安五脂素对于多发性骨髓瘤细胞株 ARH-77及U266具有杀伤作用，其IC50分别为56.69μm，70.61μm，得出安五脂素在体外具有抑制多发性骨髓瘤增殖的作用。
2、流式细胞术检测细胞凋亡情况：收集对数生长期的细胞，接种于6 孔板中，于培养箱中培养过夜，分别设安五脂素处理组加入对应的含药培养基，同时设空白对照组。药物处理48h后，收集细胞。PBS洗涤细胞2次(2000 rpm离心5分钟)收集1-5x105细胞；在50uLBinding Buffer中加入5ul 7-AAD 染液，混匀；收集细胞加入上述7-AAD染液，混匀，室温避光反应5-15min；反应后再加入450ul Binding Buffer混匀，混匀后加入1ul Annexin V-FITC混匀；室温、避光、反应5-15min；1小时内使用流式细胞仪检测(Ex＝488nm； Em＝530nm)细胞凋亡的情况。请参阅图2，图2为经安五脂素处理后，U266、 ARH-77细胞系凋亡变化图。如图2所示，安五脂素能够使多发性骨髓瘤细胞株U266及ARH-77发生细胞凋亡，得出安五脂素在体外能够诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡。
3、流式细胞术检测细胞周期变化情况：收集对数生长期的细胞，接种于6孔板中，细胞在无血清培养基中预处理12小时，然后加入血清混匀， 12小时后分别设安五脂素处理组加入对应的含药培养基，同时设空白对照组。药物处理48h后，离心机1000g左右离心3-5分钟收集细胞；加入1ml 冰浴预冷70％乙醇，吹打混匀，4℃固定12小时；12小时后离心机1000g 左右离心3-5分钟收集细胞，每个样品使用0.5ml碘化丙啶染色液重悬细胞， 37℃避光温育30分钟；使用流式细胞仪488nm波长处检测荧光。请参阅图 3，图3为经安五脂素处理后，U266、ARH-77细胞系的周期分布变化图。如图3所示，安五脂素对于多发性骨髓瘤细胞株U266及ARH-77具有诱导细胞周期阻滞的作用，使细胞周期阻滞在S期，得出安五脂素在体外具有抑制多发性骨髓瘤增殖的作用。
4、CCK8法检测安五脂素与蛋白酶体抑制剂硼替佐米，卡非佐米是否存在药物协同作用：用安五脂素与硼替佐米，卡非佐米联合作用于ARH-77、 U266两株多发性骨髓瘤细胞中，以检测其与安五脂素是否具有协同作用， CI<1表示两药具有协同作用。(联合指数：Combination Index,CI)。不同药物浓度组合的安五脂素与硼替佐米，卡非佐米作用于两株多发性骨髓瘤细胞 48h后，CCK8法检测细胞活力，并用Calcusyn软件计算出联合指数(CI值) 请参阅图4和图5，图4为安五脂素与硼替佐米在U266、ARH-77细胞系中的协同关系示意图；图5为安五脂素与卡非佐米在U266、ARH-77细胞系中的协同关系示意图。如图4所示，安五脂素在多发性骨髓瘤细胞株U266及 ARH-77中与硼替佐米具有协同作用，其协同指数小于1，得出在体外安五脂素与硼替佐米具有协同作用。如图5所示，安五脂素在多发性骨髓瘤细胞株U266及ARH-77中与卡非佐米具有协同作用，其协同指数小于1，得出在体外安五脂素与卡非佐米具有协同作用。
5、安五脂素对小鼠多发性骨髓瘤的抑制作用：进行动物实验前为确保药物剂量的安全性，首先进行小鼠急性毒性实验，即一次给予小鼠安五脂素 (400mg/kg)，观察7日内体重变化，及各主要脏器指数变化。请参阅图6，图6为小鼠急性毒性实验：安五脂素对小鼠体重及脏器指数的影响图。如图 6所示，灌胃剂量为正常治疗剂量的10倍时，未观察到小鼠产生毒性反应，体重及主要脏器指数均无显著变化，说明安五脂素在体内具有良好的安全性。
体内实验：尾静脉接种105个LP-1-luciferase细胞，14天成瘤后每天给予安五脂素治疗(40mg/kg)，观察4周内小鼠肿瘤负荷变化。请参阅图7，图7为小鼠骨髓瘤原位移植瘤实验验证安五脂素对小鼠多发性骨髓瘤的抑制作用图。如图7所示，安五脂素治疗组小鼠肿瘤负荷显著降低。
6、生物素化修饰安五脂素：应用生物素化修饰联合液相色谱-质谱联用 (LC-MS)法研究安五脂素的结合蛋白，明确安五脂素对多发性骨髓瘤增殖抑制的分子靶点。利用化学合成的方法，使安五脂素与生物素发生酯化反应，生成生物素化修饰的安五脂素，为后续进行链和亲霉素沉淀(pull-down)及 LC-MS分析筛选靶蛋白提供实验基础。请参阅图8，图8为生物素化修饰安五脂素图。如图8所示，MS检测新化合物分子量为554，初步说明成功合成生物素化修饰的安五脂素。
7、核磁共振检测生物素化修饰安五脂素结构：利用核磁共振碳谱及氢谱检测生物素化修饰安五脂素结构，请参阅图9和图10，图9为生物素化修饰安五脂素的核磁共振碳谱图；图10为生物素化修饰安五脂素的核磁共振氢谱图。如图9和10所示，核磁共振碳谱及氢谱检测生物素化修饰的安五脂素的碳原子，氢原子数量正确，进一步说明合成新化合物的准确性。
8、生物素化修饰安五脂素的体外活性检测：
采用CCK8法检测安五脂素在2种不同MM细胞中的IC50值。在ARH-77 和U266两株多发性骨髓瘤细胞株中分别为71.9μM,85.7μM。请参阅图11，图11为生物素化修饰安五脂素的体外活性检测图，图11表明生物素化修饰的安五脂素仍对不同的多发性骨髓瘤细胞具有增殖抑制作用。
9、LC-MS法鉴定安五脂素的靶蛋白：生物素化修饰安五脂素与链和亲霉素磁珠在体外进行pull-down实验，请参阅图12，图12为LC-MS法鉴定安五脂素的靶蛋白图。如图12所示，银染结果显示安五脂素组具有特异性蛋白条带。LC-MS法对特异性蛋白条带进行鉴定，鉴定出41个可能与安五脂素结合的蛋白。蛋白互作结果显示NPM1，SLC3A2蛋白处于网络核心位置，推测其为安五脂素发挥生物活性的关键靶蛋白，后续对NPM1，SLC3A2 与安五脂素的结合及对生物活性的影响进行进一步的验证。
综上所述，本发明提供的一种小分子化合物安五脂素在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，安五脂素对多发性骨髓瘤细胞具有杀伤作用，且与蛋白酶体抑制剂具有协同作用。
应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (3)
1.小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，所述小分子化合物为安五脂素，其结构式如下式(I)：
2.根据权利要求1所述的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其特征在于：在所述制备治疗多发性骨髓瘤药物中，还包括蛋白酶体抑制剂，所述蛋白酶体抑制剂与所述小分子化合物协同。
3.根据权利要求2所述的小分子化合物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其特征在于：所述蛋白酶体抑制剂为硼替佐米或卡非佐米中的任意一种。
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