CN110776521A - 一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用 - Google Patents

一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种1,2,4‑三唑‑1,3,4‑噻二唑类化合物及其应用，本发明所述的1,2,4‑三唑‑1,3,4‑噻二唑类化合物的结构式如式I所示：
Figure DDA0002245334140000011
本发明的化合物对免疫功能具有调节作用，可以作为NR2F6的抑制剂、肿瘤免疫治疗制剂及PD‑1抑制剂等肿瘤免疫疗法增效剂的候选药物。

Description

一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用。
背景技术
正常人体每天有1014个细胞处于分裂中，其中大约有107-109个细胞可能发生突变，免疫系统通过免疫监视功能识别和清除这些突变的细胞以维持机体的生理平衡稳定。尽管机体存在免疫监视机制，但由于免疫监视作用有一定的限度，因此难以完全清除突变的细胞，机体肿瘤得以发生发展。肿瘤的免疫逃逸机制涉及免疫应答的多个环节，其中共抑制分子的作用即是一个重要的原因。现已明确存在于T细胞上的细胞毒性T淋巴细胞抗原4(cytotoxic T lymphocyte antigen 4,CTLA-4)，程序性死亡受体1(programmed celldeath-1,PD-1)，T淋巴细胞弱化因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)以及淋巴细胞激活因子-3(lymphocyte activation gene 3,LAG-3)为协同刺激分子中的共抑制信号，发挥重要的负性免疫调节作用。
程序性死亡受体1(programmed death 1,PD-1,CD279)是肿瘤免疫治疗中的一种免疫抑制分子，主要表达于活化的T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞以及部分肿瘤细胞。PD-1与其配体分子PD-L1的结合将导致T细胞受体通路全面抑制，最终导致T细胞免疫效应降低，增殖减少，甚至耗竭。阻断PD-1/PD-L1通路可以在一定程度上解除T、B细胞抑制以达到免疫治疗的效果，实现肿瘤治疗的目的。研究发现，NR2F6(nuclear receptor subfamily 2,group F,member 6)受体的抑制能够直接杀伤恶性肿瘤细胞，同时促进T淋巴细胞的活化，并参与调节PD-1/PD-L1信号通路，从而能到抑制恶性肿瘤生长的目的。所以发现一类NR2F6的抑制剂将有可能为直接杀伤恶性肿瘤细胞，并通过促进T淋巴细胞的活化杀灭恶性肿瘤细胞，同时对PD-1抑制剂的免疫疗法起到协同作用，甚至，NR2F6可被视为一种新的肿瘤免疫治疗靶点。NR2F6抑制剂和PD-1抑制剂的联合使用有可能为肿瘤的治疗提供一种起到1+1＞2疗效的新型有效免疫治疗方法。
PD-1抑制剂已经应用到了临床，FDA已批准了6款PD-1/PD-L1单抗药物，分别是：Nivolumab(商品名Opdivo，简称O药)；Pembrolizumab(商品名Keytruda，简称K药)；Atezolizumab(商品名Tecentriq，简称T药)；Avelumab(商品名Bavencio，简称B药)；Durvalumab(商品名Imfinzi，简称I药)；Cemiplimab-rwlc(商品名Libtayo，简称L药)。Nivolumab在2014年被美国FDA批准用于黑色素瘤患者，2015年被美国FDA批准用于治疗非小细胞肺癌(NSCLC)，是首个肺癌免疫疗法药物。Pembrolizumab适用于不可切除或转移性黑素瘤的治疗。Atezolizumab用于治疗接受含铂化疗期间/之后或接受含铂化疗的新辅助疗法/辅助疗法12个月内疾病进展的局部晚期或转移性尿路上皮癌。该药最常见的不良反应为疲劳、食欲减退、恶心、尿路感染、发热、便秘。Durvalumab适应证与Atezolizumab相同，都是转移性尿路上皮癌。美国FDA已授予Avelumab孤儿药和突破性药物资格，以及治疗梅克尔细胞癌(Merkel cell carcinoma)的优先审批资格。cemiplimab-rwlc的适应症为转移Merkel细胞癌。目前，Avelumab对NSCLC、胃癌、胃食管交界腺癌、乳腺癌、黑素瘤等肿瘤的临床试验正在加紧开展中。使用单克隆抗体封闭PD-1/PD-L通路，因其对恶性肿瘤生存期实质性的提高、以及晚期黑色素瘤高治愈率等表现，使该通路的肿瘤免疫治疗潜力被广泛看好。
但是，在绝大多数、未经挑选的实体瘤中，单独使用PD-1抑制剂的有效率，其实并不高，有效率为10％-30％左右。同时，PD-1抑制剂仍存在许多副作用，最常见的副作用是“流感”样的表现：发热、乏力、头晕、全身肌肉酸痛、嗜睡等。此外，大约5％-10％的患者，会出现严重的免疫相关的炎症反应：甲状腺炎症(表现为甲亢、甲减、或先甲亢后甲减)、免疫性肺炎、免疫性肠炎、免疫性肝炎、甚至免疫性心肌炎，如果发现不及时，处理不到位，偶尔发生致命的事故。因此，基于肿瘤免疫的联合治疗将是提高PD-1肿瘤治疗的有效途径。
目前，RegenBioPharma公司已经发现了一系列抑制NR2F6的小分子药物，这些新型化合物可能抑制NR2F6靶点，且有望被开发为癌症疗法。RegenBioPharma公司的HarryLander博士声称，Regen目前开发了3种结构的NR2F6拮抗剂，研究显示它们对NR2F6具有剂量依赖性抑制作用而没有细胞毒性。而对于人体免疫细胞的影响还未见其报道。
目前，现有技术中未见有关于该1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物在免疫调节方面的作用，以及作为NR2F6抑制剂和作为PD-1抑制剂增效剂方面的应用报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有免疫功能调节作用的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物及其应用。
本发明的技术方案如下：本发明的一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物，其特征在于：所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物的结构式如式I所示：
Figure BDA0002245334120000031
Figure BDA0002245334120000041
式(I)中，R1为如下基团之一：
Figure BDA0002245334120000042
R2为如下基团之一：
Figure BDA0002245334120000051
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为NR2F6靶标的小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物促进活化T淋巴细胞相关因子IF-2和IFN-γ的释放。
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物在制备肿瘤免疫调节药物中的应用。本发明的化合物有调节免疫功能的作用，促进T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用。
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为PD-1抑制剂等肿瘤免疫疗法增效剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
进一步地，所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物可能通过下调PD-L1配体的表达而阻断与PD-1的结合，从而达到肿瘤免疫治疗的效果。
有益效果：本发明的化合物对免疫功能具有调节作用，可以作为NR2F6的抑制剂、肿瘤免疫治疗制剂及PD-1抑制剂增效剂的候选药物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)本发明的化合物对肿瘤细胞的生长具有显著抑制。通过实施例4中肿瘤细胞内PD-L1的mRNA的表达发现，本发明的化合物可能通过下调PD-L1配体的表达而阻断与PD-1的结合，从而达到肿瘤免疫治疗的效果。本发明的化合物促进活化T淋巴细胞相关因子IF-2和IFN-γ的释放，本发明的化合物有调节免疫功能的作用，促进T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用。
(2)本发明提出了这类化合物有可能通过促进T淋巴细胞的活化杀灭恶性肿瘤细胞，同时对PD-1抑制剂的免疫疗法起到协同作用，从而为肿瘤的治疗提供一种有效的靶向+免疫治疗的新疗法。
附图说明
图1为本发明的NR2F6蛋白序列及模型构建所得到的晶体结构图；
图2为本发明的对接所用NR2F6蛋白模型拉试图；
图3为本发明的NR2F6蛋白虚拟筛选对接口袋图；
图4为本发明的3号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图4A为本发明的3号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图，图4B为本发明的3号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图；
图5为本发明的6号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图5C为本发明的6号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图，图5D为本发明的6号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图；
图6为本发明的9号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图6E为本发明的9号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图6F为本发明的9号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图；
图7为本发明的3号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图7A本发明的3号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图7B本发明的3号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
图8为本发明的6号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图8C为本发明的6号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图8D为本发明的6号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
图9为本发明的9号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图9E为本发明的9号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图9F为本发明的9号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
图10为本发明的细胞内PD-L1 mRNA表达水平；图10A HepG2细胞内PD-L1 mRNA表达水平；图10B H292细胞内PD-L1 mRNA表达水平图；
图11为本发明的相关因子释放量的图；图11A本发明的相关因子IFN-γ释放量的图；图11B为本发明的相关因子IF-2释放量的图。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
本发明的一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物，其特征在于：所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物的结构式如式I所示：
Figure BDA0002245334120000071
式(I)中，R1为如下基团之一：
Figure BDA0002245334120000081
R2为如下基团之一：
Figure BDA0002245334120000082
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为NR2F6靶标的小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物促进活化T淋巴细胞相关因子IF-2和IFN-γ的释放。
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物在制备肿瘤免疫调节药物中的应用。本发明的化合物有调节免疫功能的作用，促进T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用。
本发明所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为PD-1抑制剂增效剂在制备肿瘤药物中的应用。所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物可能通过下调PD-L1配体的表达而阻断与PD-1的结合，从而达到肿瘤免疫治疗的效果。
试验例1
基于NR2F6蛋白模型进行虚拟筛选：
蛋白质模型的确立
1.1蛋白模型的构建、优化及评估
由于没有已知的晶体结构及同源相似度较好的模板蛋白，故采用Zhang-Server组的I-Tasser程序进行从头建模。RN2F6蛋白由404个氨基酸构成，蛋白质的氨基酸序列由NCBI的蛋白数据库中得到。I-Tasser的核心操作是Threading，是将目标蛋白序列与PDB数据库中的已有蛋白结构进行比对，由合适的局部片段寻找匹配的模型序列，并将确定的序列拼接成为初始的全长模板，用蒙特卡洛方法组装后，进行结构聚类分析，选择最大的聚类分析，重复这一过程，从新生的结构集合中挑选能量最低的结构，添加侧链并得到最终的蛋白结构。得到的模型使用UCLA-DOE的SAVE服务器进行了评价，其中包括PROCHECK、WHATCHECK、ERRAT、Verify_3D、PROVE等评价标准。
1.2实验结果
1.2.1本发明的NR2F6蛋白序列及模型构建所得到的晶体结构如图1所示。
1.2.2对蛋白结构优化之后通过SAVE进行打分，其中拉试图如图2所示，图中落在核心区+允许区+最大允许区的碱基百分比为98.5％，该值大于95％，说明该模型质量较好，构型合理。图2对接所用NR2F6蛋白模型拉试图。
2、虚拟筛选。
本研究所使用的软件有AutoDockTools 1.5.6,AutodockVina,Pymol，Chimera1.10.2等。小分子化合物的结构来自SPECS数据库(http://www.specs.net/)。受体蛋白由I-Tasser构建完成，并使用I-Tasser进行了活性位点的预测。从SPECS化合物数据库中下载天然产物化合物库，其中含有大概7.5万个天然化合物。使用服务器中安装的Autodock Vina软件进行虚拟对接，软件采用模拟退火和遗传算法来寻找受体和配体的最佳结合位置，并用结合能方法评价复合物的对接情况。在得出Autodcok Vina的筛选结果之后，我们对小分子和蛋白的结合能进行了排序，结合能越低，其结合越稳定，筛选结合了能量最低的500个化合物，使用FAF-Drugs4平台，经过里宾斯基规则(分子量小于500、logP在-2到5之间、氢键给体数量不超过5个、氢键受体数量不超过10个)、假阳性、ADMET及毒性、PPI的筛选，得出了一类符合筛选且具有相同母核结构的化合物。
2.3实验结果。
2.3.1NR2F6蛋白虚拟筛选对接口袋如图3所示，对接参数如下：
receptor＝n6refine.pdbqt
center_x＝87.403
center_y＝45.983
center_z＝75.131
size_x＝28
size_y＝36
size_z＝24
exhaustiveness＝8
seed＝0
2.3.2化合物的筛选结果如下表1所示：
表1
Figure BDA0002245334120000111
Figure BDA0002245334120000121
试验例2
本发明化合物对肿瘤细胞(实验所用7种肿瘤细胞)活力影响的测定：
1、实验原理
检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臢(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲臢，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
2、实验步骤
2.1淋巴细胞的制备。脊柱脱臼处死新生小鼠，置于75％酒精浸泡2-3秒(时间不宜过长、以免酒精从口和肛门进入体内)再用碘酒消毒腹部，取新生小鼠带入超净台内解剖取其脾脏，置于培养皿中。用Hank`s液洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物。用手术剪将脾脏剪成小块(1mm2)，再用Hank`s液洗涤三次，转移至另一培养皿中。视组织块量加入5-6倍的0.25％胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5min振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。加入3-5ml培养基以终止胰酶消化作用。过筛取悬液于离心管中，1000rpm，离心10min，取沉淀加入红细胞裂解液1ml，混匀，静置1min，加入Hank`s液，离心，再加入Hank`s液，离心。加入培养液，血球计数板计数，将细胞调整到5×105/ml左右，转移至培养瓶中。
2.2MTT测定用于确定细胞活力和增殖。用磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT，制备浓度为5mg/mL的MTT储备液，用0.2μm过滤器灭菌，然后储存在4℃的加盖的防光容器中。对于该测定，将肿瘤细胞接种到96孔板上。通过将其与0.25％胰蛋白酶在EDTA中37℃下孵育2min，然后从培养瓶中取出细胞，将其铺板到内孔中以防止边缘效应。培养24小时后，肿瘤细胞可附着于底部。然后除去培养基，于96孔板中每孔加入100μl淋巴细胞悬液，50μl的三种不同浓度的受试药物(对照组加入50μl的培养基)和50μl的刀豆蛋白A(ConA)总体积200μl。每个实验组设3个复孔，另设3孔不加有丝分裂原作为细胞增殖的本底对照以及不加药物的空白对照。将细胞再培养24小时后，吸去上清，补加180μl培养基，每孔加入20μL MTT，在5％CO2的潮湿环境和37℃空气中培养4h。接下来，小心吸去上清，每孔加入150μL DMSO。遮光并在振荡台上混合10min后，用酶标仪(Thermo Fisher)在490nm处检测其吸光度。
3、细胞、试剂及仪器
动物：实验所用新生小鼠由实验室C57小鼠自行繁殖，所有小鼠喂养于20℃-26℃，相对湿度60％-80％,每天12h光照加12h黑夜的洁净动物房内。
细胞：人肝癌细胞(HepG2)、人肺癌细胞(A549，H292)、人卵巢癌细胞(A2780，OVCAR-3)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人结肠癌细胞(SUN-1040)从中国昆明细胞中心购买获得。细胞使用含10％胎牛血清、100U/ml G-青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640或高糖培养基培养，培养环境为5％CO2，37℃，细胞每隔3～4天传代一次；
试剂：MTT购自Solarbio公司，DMSO和其他常用化学品购自广东西龙科学公司，均为分析纯；
仪器：CO2培养箱(Thermo Fisher)，超净工作台(Thermo Fisher)，化学发光酶标仪(Thermo Fisher)。
4、实验结果
式(I)中部分化合物的活性如表1所示，其中IC50表示测试化合物对肿瘤细胞生长的抑制作用。部分化合物对肿瘤细胞生长影响IC50(mol/L)如表2所示：
表2
Figure BDA0002245334120000141
试验例3
本发明化合物对肿瘤模型在体实验的影响：
1、实验动物
实验使用雄性Balb/c裸鼠，体重在16-20g，饲养于无菌鼠笼，自由饮水，光照、黑暗时间：12h:12h。无菌动物房温度保持25℃，待裸鼠适应动物房环境后进行实验。
2、实验步骤
将体外培养肿瘤细胞，调整浓度为5×107个/ml，置于冰上，用75％酒精棉球对裸鼠腋下皮肤进行擦拭消毒。用1ml无菌注射器吸取0.2ml细胞悬液，注射于裸鼠腋下位置。接种肿瘤细胞后每天观察组织生长情况并用游标卡尺测量荷瘤小鼠肿瘤长宽并计算体积。将裸鼠随机分为6组，每组5只，即模型组(control)、高浓度组(H)、中浓度组(M)、低浓度组(L)、顺铂组(cisplatin)、PD-1抑制剂+高浓度化合物组(anti-PD-1)。灌胃给药，对照组给予同体积溶剂，连续给药15天，每天观察裸鼠活动状况，每隔两天测量一次肿瘤体积和重量，末次给药24h后，眼球取血，摘取肿块，并观察裸鼠其他脏器是否存在病变转移。
3、实验结果
3.1肿块体积
图4为本发明的3号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图4A为本发明的3号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图，图4B为本发明的3号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图；
图5为本发明的6号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图5C为本发明的6号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图，图5D为本发明的6号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图；
图6为本发明的9号药的裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图6E为本发明的9号药HepG2裸鼠模型给药后肿瘤体积图；图6F为本发明的9号药H292裸鼠模型给药后肿瘤体积图。
由图4-6可以看出，每组实验动物的肿瘤体积大小都处于上升趋势，但给药组较模型组上升趋势明显放缓，且实验组与顺铂组和PD-1抑制剂组对比，对肿瘤生长抑制更加显著，说明该化合物具有明显的抗肿瘤作用。
3.2相对肿瘤抑制率。
图7为本发明的3号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图7A本发明的3号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图7B本发明的3号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
图8为本发明的6号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图8C为本发明的6号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图8D为本发明的6号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
图9为本发明的9号药的裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图9E为本发明的9号药的HepG2裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；图9F为本发明的9号药的H292裸鼠模型给药后相对肿瘤抑制率图；
由图7-9可以看出，化合物对模型动物的肿瘤生长有明显的抑制作用，且呈现出浓度依赖性，说明该化合物具有明显的抗肿瘤作用。
试验例4
本发明化合物对肿瘤细胞PD-L1转录水平调控的影响：
1、实验原理
利用Q-PCR技术对HepG2及H292中PD-L1 mRNA水平进行定量分析，分析本发明中的化合物对PD-L1在转录水平的调控。
2、实验步骤
首先，提取细胞RNA，弃去细胞培养基，加入1mL冰冷的Trizol，用洁净的细胞刮刀将细胞刮下，吸入1.5ml EP管中，室温下裂解5min；按照1mLTrizol中加0.2mL氯仿的比例加入氯仿，剧烈涡旋震荡15s，室温下放置2-3min；12000rpm，4℃离心15min；准备新的无Rnase的EP管，标记待用；吸取上层清液约200-400μL于1.5mL EP管中，注意不要搅动中间白色絮状蛋白质层，防止混入DNA及蛋白。等体积加入异丙醇；颠倒混匀，室温静置30min；12000rpm，4℃离心15min；轻轻倒出上层液体，用100μL枪头吸出剩余液体，加入1mL75％乙醇；12000rpm，4℃离心5min，轻轻倒出液体。如果能看到沉淀，可再快速短暂离心，吸出残余液体，但不要触碰沉淀。如果看不到沉淀，则12000rpm离心5min，在可能形成沉淀的反方向用100μL枪头吸出剩余液体。注意不能让加样枪管触碰到EP管的内壁；将EP管敞口于超净台内挥干剩余液体(约20min)。根据沉淀的量用相应体积的DEPC水溶解(约10-20μL，一般6孔板提取的RNA加入10μL)，但注意不要加水过多防止RNA浓度过低；定量，标记后，RNA原液储存于-80℃。然后，对RNA浓度进行检测，取纯水1μL调零，擦净后，取1μL RNA测定浓度。样品间不用每次调零，也不用纯水清洗，直接测定即可。逆转录后进行Real Time PCR反应。
3、实验结果
图10为本发明的细胞内PD-L1 mRNA表达水平；图10A HepG2细胞内PD-L1 mRNA表达水平；图10B H292细胞内PD-L1 mRNA表达水平图。
由图10可以看出，化合物作用于肿瘤细胞后，胞内PD-L1的mRNAs水平明显降低，且具有显著性差异，说明该化合物具有能够降低肿瘤细胞PD-L1表达，从而实现肿瘤免疫的作用。
试验例5
本发明化合物对活化T淋巴细胞IF-2和IFN-γ表达量的影响：
1、实验原理
ELISA试剂盒采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术。在λmax＝450nm(OD＝450nm)处测定反应孔样品吸光度(OD)，样本中的大鼠IL-2及IFN-γ浓度与OD成正比，通过绘制标准曲线和四参数拟合软件便可计算出样本中大鼠IL-2和IFN-γ的浓度。
2、实验步骤
首先，取细胞培养上清液。然后准备试剂：(1)试剂回温：首先在实验前30min将试剂盒，待测样本放置于室温下，浓缩洗涤液如出现结晶，放入37℃温浴直到结晶全部溶解。(2)配制洗涤液(3)标准品梯度稀释：加入标准品/样本稀释液(SR1)1ml至冻干标准品中，静置15分钟待其完全溶解后轻轻混匀(浓度为4000pg/ml)，然后按照以下浓度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/ml进行稀释。(4)生物素化抗体工作液。(5)酶结合物工作液。之后，分别将样品和标准品加入相应孔中，随后在样本和标准品中加入50μL生物素化抗体工作液，用封板胶封住反应孔。室温孵育120分钟，使用微量振荡器(频率，300rpm)。洗板5次。除空白外，每孔加入酶结合物工作液100μL，用用封板胶封住反应孔。室温孵育60分钟，使用微量振荡器(频率，300rpm)。洗板5次。加入显色底物100μL，室温避光孵育15分钟，加入终止液100μL，混匀后即刻测量OD450值。
3、实验结果
图11为本发明的相关因子释放量的图；图11A本发明的相关因子IFN-γ释放量的图；图11B为本发明的相关因子IF-2释放量的图。
由图11可以看出，化合物作用于T淋巴细胞后，IFN-γ和IF-2的释放量均有增加，且具有显著性差异，说明该化合物可以活化T淋巴细胞，强化其免疫功能。
本发明通过试验例1中的计算机虚拟筛选得到一系列1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物，通过试验例2中的活性测试实验和试验例3在体实验发现，通式(I)中的化合物对肿瘤细胞的生长具有显著抑制。通过试验例4中肿瘤细胞内PD-L1的mRNA的表达发现，通式(I)中的化合物可能通过下调PD-L1配体的表达而阻断与PD-1的结合，从而达到肿瘤免疫治疗的效果。通过试验例5中该类化合物促进活化T淋巴细胞相关因子IF-2和IFN-γ的释放，可知通式(I)中的化合物有调节免疫功能的作用，促进T淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用。综上，通式(I)中的化合物对免疫功能具有调节作用，可以作为NR2F6的抑制剂、肿瘤免疫治疗制剂及PD-1增效剂的候选药物。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物，其特征在于：所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物的结构式如式I所示：
Figure FDA0002245334110000011
式(I)中，R1为如下基团之一：
Figure FDA0002245334110000012
R2为如下基团之一：
Figure FDA0002245334110000021
2.权利要求1所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为NR2F6靶标的小分子抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
3.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物促进活化T淋巴细胞相关因子IF-2和IFN-γ的释放。
4.权利要求2所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物在制备肿瘤免疫调节药物中的应用。
5.权利要求3所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物作为PD-1抑制剂等肿瘤免疫疗法增效剂在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述的1,2,4-三唑-1,3,4-噻二唑类化合物可通过下调PD-L1配体的表达而阻断与PD-1的结合。
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