CN104177373A - 抗结核化合物imb-cc223 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药领域，涉及一种如式Ⅰ所示的抗结核化合物或其药学上可接受的盐，本发明还涉及包含该化合物或其药学上可接受的盐的组合物，以及该化合物或其药学上可接受的盐用于制备预防或治疗结核病的药物的用途。

Description

抗结核化合物IMB-CC223

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种抗结核化合物、其类似物或药学上可接受的盐，本发明还涉及包含该化合物、其类似物或药学上可接受的盐的组合物，以及该化合物、其类似物或药学上可接受的盐用于制备预防或治疗结核病的药物的用途。

背景技术

结核病是人类长期的掠夺者，目前仍然是威胁到人类生命健康的主要传染病之一。最新世界卫生组织统计结果表明，目前全球有三分之一的人口被结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）感染，其中每年新增病例超过880万，死亡140万，成为与AIDS、疟疾并称的三大传染病，而我国更是结核病的高发区。近年来耐药菌不断出现，结核耐药成为结核病临床治疗的棘手问题，迫切需要研制高效、低毒的新型抗结核药物。

发明内容

为了找到新型抗结核药物，本发明的发明人应用高通量结核杆菌莽草酸脱氢酶（shikimate dehydrogenase，MtSD）抑制剂筛选模型，从80000多个不同来源的化合物中筛选得到MtSD的抑制剂IMB-CC223；通过对IMB-CC223的抗结核活性评价，确认该化合物具有明确的抗结核杆菌活性，由此完成了本发明。

本发明第一方面涉及式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐，

式Ⅰ

其中R₁表示取代或未取代的苯基，氨基酸酰基，C₁-C₆烷基或酰基，C₃-C₁₄含环的酰基或烷基，C₁-C₆的磺酰基，取代或未取代的苯磺酰基，其中所述取代基是指卤素、羟基或C₁-C₆烷基；R₂表示卤素。

在本发明中，所述取代的苯基是指卤素或C₁-C₆烷基取代的苯基，其中所述卤素为氟、氯、溴、碘，所述C₁-C₆烷基为甲基、乙基、丙基或异丙基等，所述取代的位置例如为邻位、间位或对位，所述取代的个数例如为1个、2个或3个；例如所述取代的苯基为 和等，其中X为卤素或C₁-C₆烷基（例如甲基、乙基、丙基或异丙基等）；

在本发明中，所述氨基酸是指二十种天然氨基酸。

在本发明中，所述C₁-C₆烷基是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基或环烷基，例如为甲基、乙基、丙基、异丙基等。

在本发明中，所述C₁-C₆酰基是指含有1-6个碳原子的直链或支链烷基的酰基，例如甲酰基、乙酰基、丙酰基、异丙酰基等。

在本发明中，所述C₃-C₁₄含环的酰基或烷基，其中的环例如是指C₃-C₈的单环、C₃和C₃组合的双环C₃和C₄组合的双环C₃和C₅组合的双环 C₃和C₆组合的双环 C₃和C₇组合的双环C₃和C₈组合的双环C₄和C₄组合的双环C₄和C₅组合的双环 C₄和C₆组合的双环 C₄和C₇组合的双环C₄和C₈组合的双环C₅和C₅组合的双环 C₅和C₆组合的双环C₅和C₇组合的双环C₅和C₈组合的双环C₆和C₆组合的双环 和等。

在本发明中，所述C₁-C₆的磺酰基是指含有1-6个碳原子的直连或支链烷基或环烷基的磺酰基，例如为甲磺酰基、乙磺酰基、丙磺酰基、异丙磺酰基或等。

在本发明中，所述取代或未取代的苯磺酰基例如是指未取代的苯磺酰基或者羟基、C₁-C₆直连或支链烷基或环烷基取代的苯磺酰基，例如羟基、甲基、乙基、丙基、异丙基取代的苯磺酰基，所述取代的位置例如为邻位、间位或对位，所述取代的个数例如为1个、2个、3个或4个；例如为 和等。

在本发明中，所述卤素是指氟、氯、溴、碘。

在本发明中，所述取代基的个数例如为1个、2个、3个或4个。

在本发明中，所述R₂的位置为邻位、对位或间位。

优选地，所述R₁为取代或未取代的苯基，其中所述取代基为卤素。

在本发明的具体实施方案中，所述R₁为苯基，R₂为氟，氟的位置为对位。

本发明另一方面涉及组合物，其含有本发明第一方面的化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的，药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明再一方面涉及本发明第一方面的化合物或其药学上可接受的盐在体内/体外作为莽草酸脱氢酶抑制剂的用途。

在本发明中，其中所述的莽草酸脱氢酶为分枝杆菌的莽草酸脱氢酶；在本发明的实施方案中，所述的分枝杆菌为结核分枝杆菌。

本发明还涉及本发明第一方面的化合物或其药学上可接受的盐在体内/体外用于抑制分枝杆菌活性的用途。

在本发明的实施方案中，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

本发明还涉及本发明第一方面的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗分枝杆菌药物的用途。

在本发明的实施方案中，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

本发明还涉及本发明第一方面的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗结核病的药物中的用途。

在本发明中，其中所述的结核病是指结核分枝杆菌能够引起的各种类型的结核病，例如为肺结核或肺外结核；所述肺外结核例如为骨关节结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、肾结核、肠结核等。

本发明还涉及预防或治疗哺乳动物（例如人）结核病的方法，其包括给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明第一方面的化合物、其类似物或药学上可接受的盐的步骤。

在本发明中，所述结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）也被称为结核杆菌，是引起结核病的病原菌。结核分枝杆菌H37Rv是1905年分离出来的并被全球广泛应用于生物医学研究的菌株，有完整毒性的肺结核动物模型。在本发明的实施方案中，所述结核分枝杆菌既包括标准菌株H37Rv、敏感菌株，也包括对异烟肼和利福平耐药的菌株和广泛耐药的菌株。

在本发明中，所述组合物是指包括包含指定量的各指定成分的产品，以及直接或间接从指定量的各指定成分的组合产生的任何产品。

在本发明中，所述抑制分枝杆菌活性或者抗分枝杆菌是指杀死分枝杆菌或抑制分枝杆菌的生长和繁殖。

在本发明中，所述结核病是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosis complex,简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多器官系统，最常见的患病部位是肺脏，占各器官结核病总数的80-90%。也可以累及肝、肾、脑、淋巴结等器官。

在本发明中，所述结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，引起人类疾病的主要是结核分枝杆菌。

本发明的化合物可以以衍生自无机酸或有机酸的药学可接受的盐的形式使用。术语“药学上可接受的盐”指在可靠的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而不出现过度的毒性、刺激、过敏反应等，且与合理的效果/风险比相称的盐。药学可接受的盐是本领域公知的。例如，S.M.Berge,et al.,J.Pharmaceutical Sciences,1977,66:1中对药学可接受的盐进行了详细描述。所述盐可通过使本发明化合物的游离碱官能度与合适的有机酸反应来制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、二葡糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(异硫代硫酸盐，isothionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。同样，碱性含氮基团可用以下物质季铵化：低级烷基卤化物如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯如硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；长链卤化物如癸基、十二烷基、十四烷基和十八烷基的氯化物、溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基溴和苯乙基溴及其他。因此得到可溶于或分散于水或油的产品。可用来形成药学可接受的酸加成盐的酸实例包括无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸。

碱加成盐可通过使本发明化合物的含羧酸部分与合适的碱反应，在本发明化合物的最终分离和纯化过程中原位制备，所述的碱例如药学可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐和碳酸氢盐，或者氨或有机伯胺、仲胺或叔胺。

药学可接受的盐包括但不限于基于碱金属或碱土金属的阳离子如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等，以及无毒的季铵和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲基铵、二甲基铵、三甲基铵、三乙基铵、二乙基铵和乙基铵等。可用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。

本发明式I化合物还包括其异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物、和酯，本发明式I化合物以及它的异构体、消旋体、对映体、非对映体、对映体富集物、溶剂合物、和酯还可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。上述化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术。一般来说，对于本发明的目的，与药学可接受的溶剂如水、乙醇等的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。

可改变本发明药物组合物中各活性成分的实际剂量水平，以便所得的活性化合物量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。但是，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

当用于上述治疗和/或预防或其他治疗和/或预防时，治疗和/或预防有效量的一种本发明化合物可以以纯形式应用，或者以药学可接受的酯或前药形式(在存在这些形式的情况下)应用。或者，所述化合物可以以含有该目的化合物与一种或多种药物可接受赋形剂的药物组合物给药。词语“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。但应认识到，本发明化合物和组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。一般说来，本发明式I化合物用于哺乳动物特别是人的剂量可以介于0.001～1000mg/kg体重/天，例如介于0.01～100mg/kg体重/天，例如介于0.01～10mg/kg体重/天。

运用本领域技术人员熟悉的药物载体可以制备成含有效剂量的本发明化合物的药物组合物。因此本发明还提供包含与一种或多种无毒药物可接受载体配制在一起的本发明化合物的药物组合物。所述药物组合物可特别专门配制成以固体或液体形式供口服给药、供胃肠外注射或供直肠给药。

所述的药物组合物可配制成许多剂型，便于给药，例如，口服制剂(如片剂、胶囊剂、溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射水可立即使用)。所述的药物组合物中载体包括：口服制剂使用的粘合剂(如淀粉，通常是玉米、小麦或米淀粉、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮)，稀释剂(如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、纤维素，和/或甘油)，润滑剂(如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其盐，通常是硬脂酸镁或硬脂酸钙，和/或聚乙二醇)，以及如果需要，还含有崩解剂，如淀粉、琼脂、海藻酸或其盐，通常是藻酸钠，和/或泡腾混合物，助溶剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等，可注射的制剂使用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可以将其配制成肠衣片剂。

更具体地说，本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本文所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

适合于胃肠外注射的组合物可包括生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂或乳剂，及供重构成无菌可注射溶液剂或分散剂的无菌散剂。合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)、可注射有机酯如油酸乙酯及它们的合适混合物。

这些组合物也可含有辅料，如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如尼泊金酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸等，可确保防止微生物的作用。还期望包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等。通过使用能延迟吸收的物质，例如单硬脂酸铝和明胶，可达到可注射药物形式的延长吸收。

混悬剂中除活性化合物外还可含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇和聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶或者这些物质的混合物等。

在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。这可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现。这样，药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型。或者，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收通过将该药物溶解于或悬浮于油媒介物中来实现。

可注射贮库制剂形式可通过在生物可降解聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯(polylactide-polyglycolide)中形成药物的微胶囊基质来制备。可根据药物与聚合物之比和所采用的具体聚合物的性质，对药物释放速度加以控制。其他生物可降解聚合物的实例包括聚原酸酯类(poly(orthoesters))和聚酐类(poly(anhydrides))。可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

可注射制剂可例如通过用滤菌器过滤或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂来灭菌，所述固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质。

本发明化合物或其组合物可用口服方法或非胃肠道给药方式。口服给药可以是片剂、胶囊剂、包衣剂，肠道外用药制剂有注射剂和栓剂等。这些制剂是按照本领域的技术人员所熟悉的方法制备的。为了制造片剂、胶囊剂、包衣剂所用的辅料是常规用的辅料，例如淀粉、明胶、阿拉伯胶，硅石，聚乙二醇，液体剂型所用的溶剂如水、乙醇、丙二醇、植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)。含有本发明化合物的制剂中还有其它辅料，例如表面活性剂，润滑剂，崩解剂，防腐剂，矫味剂和色素等。在片剂、胶囊剂、包衣剂、注射剂和栓剂中含有本发明式I化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明式I化合物一般含量为1-5000mg，优选的单元剂型含有10-500mg，更优选的单元剂型含有20-300mg。具体地说，本发明可以提供的供口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性的药物可接受赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下物质混合：a)填充剂或增量剂如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保湿剂如甘油；d)崩解剂如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶液阻滞剂如石蜡；f)吸收加速剂如季铵化合物；g)湿润剂如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂如高岭土和膨润土以及i)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠和它们的混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型中也可包含缓冲剂。

相似类型的固体组合物使用赋形剂例如乳糖及高分子量聚乙二醇等，也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

片剂、糖衣丸剂(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材一起制备。这些固体剂型可任选含有遮光剂，且其组成还可使其只是或优先地在肠道的某个部位任选以延迟方式释放活性成分。可以使用的包埋组合物的实例包括高分子物质和蜡类。如果适合，活性化合物也可与一种或多种上述赋形剂配成微囊形式。

供口服给药的液体剂型包括药学可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。液体剂型除含有活性化合物外还可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其他溶剂，增溶剂和乳化剂例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(特别是棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇(tetrahydrofurfuryl alcohol)、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及它们的混合物。口服组合物除包含惰性稀释剂外还可包含辅料，例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂。

供直肠或阴道给药的组合物优选是栓剂。栓剂可通过将本发明化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合来制备，它们在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

本发明的化合物及其组合物还考虑用于局部给药。供局部给予本发明化合物的剂量形式包括散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将活性化合物与药学可接受的载体和任何所需的防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

本发明化合物也可以脂质体形式给药。如本领域所公知，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得。脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成。任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用。脂质体形式的本发明组合物除含有本发明化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。优选的脂类是天然和合成的磷脂和磷脂酰胆碱(卵磷脂)，它们可单独或者一起使用。形成脂质体的方法是本领域公知的。参见例如Prescott,Ed.,Methods inCell Biology,Volume XIV,Academic Press,New York,N.Y.(1976),p.33。

发明的有益效果

本发明证明了如式Ⅰ所示的化合物、其类似物或药学上可接受的盐具有明确的抗结核杆菌活性，对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv、临床分离的敏感菌株、异烟肼和利福平耐药的MDR菌株和广泛耐药的XDR菌株具有相同的抑制活性；初步药代动力学以及毒性研究显示其具有良好的成药性，表明该类化合物作为抗结核药物具有良好应用前景。

附图说明

图1抑制剂IMB-CC223动力学图谱。

图2化合物IMB-CC223的细胞毒性研究

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1通过应用高通量的MtSD抑制剂筛选模型，筛选以MtSD为靶点的新型抗结核药物

参见文献（以结核分枝杆菌H37Rv莽草酸脱氢酶为靶点的高通量筛选模型的建立及应用，中国医药生物技术，Vol.7,NO.3,2012，191-196），在完成MtSD蛋白的克隆、表达、纯化等研究的基础上，构建了MtSD抑制剂的高通量筛选模型模型，并对所建模型进行了评价，确认该模型可用于MtSD抑制剂的筛选。该模型的反应体系及其成分如下：反应体系总体积为100μl，各物质的终浓度分别为：pH9.0的Tris-HCl100mM，NADP1mM，SKH8mM（shikimate，莽草酸）（SKH购自Fluka公司），MtSD2.5U/100μl。反应温度为37℃，反应时间为30min。通过此方法筛选到了MtSD抑制剂IMB-CC223（所筛选的样品库为中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室保存的2012年新增化合物样品库，样品量约为4万）。IMB-CC223也可购自Chembridge公司，CAS编号是791824-26-5。IMB-CC223的结构式为：

实施例2抑制剂IMB-CC223对MtSD的动力学研究

实验方法：

1）测定底物NADP对MtSD的影响：在96孔板上加入用20μL pH9.0的Tris-HCl100mM溶解的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADP)（NADP购自瑞士Roche公司）确保100μL的终浓度分别为1mM、0.5mM、0.25mM，再向96孔板的每一孔种加入80μL，pH9.0的Tris-HCl100mM稀释的含有SKH10mM，MtSD2.5U的混合溶液。

2）测定底物SKH对MtSD的影响：在96孔板上加入用20μL pH9.0的Tris-HCl100mM溶解的SKH确保100μL的终浓度分别为8mM、4mM、2mM、1mM、0.5mM、0mM；再向96孔板的每一孔种加入80μL，pH9.0的Tris-HCl100mM稀释的含有NADP1.25mM，MtSD2.5U的混合溶液。

3)测定抑制剂对MtSD的影响：在步骤2）的每一种SKH的浓度下添加抑制剂IMB-CC223浓度分别为60μg/ml、40μg/ml、20μg/ml、10μg/ml、0μg/ml；即每一种抑制剂的浓度下对应底物SKH有六个梯度。再向96孔板的每一孔种加入80μL，pH9.0的Tris-HCl100mM稀释的含有NADP1.25mM，MtSD2.5U的混合溶液。

在37℃酶标仪中340nm波长下每隔1min测一次，连续测定40min，根据反应速度在Excel中绘制曲线（参见图1）并计算Ki值。

结果：当NADP的浓度固定时，不同浓度的活性化合物IMB-CC223抑制直线的交点位于X轴负半轴，说明化合物IMB-CC223以非竞争的方式抑制MtSD的活性，抑制常数Ki为70.55μM。

实施例3MtSD抑制剂IMB-CC223在体外对敏感和耐药结核杆菌抑制活性测定

1)采用无菌的96孔培养板进行抗结核活性测定，每个孔的总体积为100μl（菌液体积加化合物体积为100μl）。

2)测试孔中分别加入含5×10⁵个结核分枝杆菌H37Rv（ATCC25618）、临床分离的对异烟肼和利福平敏感的菌株（960）、对异烟肼和利福平耐药的MDR菌株(330)和广泛耐药的XDR菌株（926）（后三株菌是南京市胸科医院检验科临床标本经过改罗法和分枝杆菌微量直观快速药敏试验多次验证的菌株，括号内的数字为菌株编号）的培养液，同时加入适当浓度的阳性对照药异烟肼（INH）和利福平（RFP）（异烟肼和利福平在用结核分枝杆菌H37Rv进行试验时从32μg/ml进行二倍稀释到0.0625μg/ml，用临床分离菌株进行试验时从128μg/ml二倍稀释到0.125μg/ml）或DMSO配制的不同浓度的待测样品IMB-CC223，待测样品IMB-CC223在测定体系中的终浓度为128.0μg/ml、64.0μg/ml、32.0μg/ml、16.0μg/ml、8.0μg/ml、4.0μg/ml、2.0μg/ml、1.0μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml、0.0625μg/ml；

3)培养板中设置4个生长阳性对照孔（等体积的不含测试样品的DMSO）和4个生长阴性对照孔（等体积的不含任何结核杆菌的培养基）；

4)将96孔板加盖后周围用封口膜密封，置于温箱中37°C孵育；

5)第6天观察阳性生长对照孔和阴性生长对照孔，当观察到两者有明确差别时，对各个试验孔细菌生长的数量和形态进行观察，判定抑制或耐药并记录结果；

6)第8天再观察一次确认记录结果。

结果表明：IMB-CC223对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv的最低抑菌浓度（MIC）为0.5μg/ml；对临床分离的敏感菌株（960）、MDR菌株(330)和XDR菌株（926）具有相同的抑制活性，MIC均为0.5-1μg/ml（见表1）。

表1IMB-CC223对各类结核分枝杆菌的MIC（μg/ml）

实施例4MtSD抑制剂IMB-CC223对其他微生物的抑制活性

实验方法：

测定于96微孔板中进行，海分枝杆菌（ATCC BAA-535），耻垢分枝杆菌（ATCC700084）和金黄分枝杆菌（ATCC23366）用7H9培养基，其他细菌（其它的细菌保存于中国医学科学院医药生物技术研究所药理研究室）用MH培养基，抑制剂的终浓度：128.0、64.0、32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25、0.125μg/ml，用MH肉汤培养基或7H9培养基（含10%ADC）二倍稀释成所需浓度，实验菌的接种量约为5×10⁵CFU/ml，稀释菌液于15min内接种完毕。接种海分枝杆菌，耻垢分枝杆菌和金黄分枝杆菌时，需在7H9培养基（含10%ADC）中加入0.05%的吐温80。除粪肠球菌37°C孵育24小时和海分枝杆菌30°C孵育4天外，其他菌株都是37°C孵育18小时观察结果。结果见表2。

表2IMB-CC223对其他微生物的MIC（μg/ml）

可以看出：IMB-CC223对结核分枝杆菌有特异性的抑制活性，而对其他的微生物，包括其他的分枝杆菌（不包括海分枝杆菌）、敏感和耐药的革兰阳性和革兰阴性菌，均无抑制活性。

实施例5化合物IMB-CC223的细胞毒性研究

将巨噬细胞J774A.1（购自中国协和医科大学基础医学研究所细胞中心）用DMEM培养基复苏；

1）将复苏的J774A.1按1:3接种于DMEM中，37℃CO₂温箱中培养3天；

2）取出细胞，倒掉培养基，加入新鲜的DMEM，用枪将细胞从壁上吹打下来；

3）用细胞计数板计数，然后用DMEM将细胞稀释成1×10⁶/ml；

4）将细胞稀释液加入到96孔板中，每孔100μl，相当于每孔细胞数为1×10⁵；

5）将96孔板置于37℃CO₂温箱中培养1天；

6）取出96孔板，加入终浓度为20μg/ml抗结核活性化合物IMB-CC223，同时设加DMSO的对照组、不加DMSO的空白对照组，每组4个平行，将96孔板继续放入CO₂温箱中37℃培养2天；

7）取出96孔板加入10μl MTS（四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]）检测试剂，放入37℃CO₂温箱中反应2h；

8）取出96孔板于酶标仪中检测490nm吸收值，excel计算对照组与实验组的比值，见图2。

半数中毒浓度（TC₅₀）测定是在本实施例第6步中，抗结核化合物IMB-CC223加入的终浓度分别为200μg/ml、150μg/ml、112.5μg/ml、84.5μg/ml、63.5μg/ml、48μg/ml、36μg/ml、27μg/ml、20.25μg/ml、15μg/ml和0μg/ml，其它步骤同细胞毒性测定。然后根据OD₄₉₀值计算TC₅₀。

结果表明：用40倍MIC浓度（20μg/ml）的IMB-CC223处理巨噬细胞J774A.1后，IMB-CC223与对照组比值大于0.8，说明在此浓度下，基本无细胞毒性；半数中毒浓度（TC₅₀）测定研究结果表明其半数中毒浓度（TC₅₀）＞200μg/ml。

以上实施例结果表明，IMB-CC223是高效低毒的抗结核化合物。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (9)

1.式Ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中R₁表示取代或未取代的苯基，氨基酸酰基，C₁-C₆烷基或酰基，C₃-C₁₄含环的酰基或烷基，C₁-C₆的磺酰基，取代或未取代的苯磺酰基，其中所述取代基是指卤素、羟基或C₁-C₆烷基；R₂表示卤素。

2.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述R₁为取代或未取代的苯基，其中所述取代基为卤素。

3.权利要求1的化合物或其药学上可接受的盐，其为下式化合物：

4.组合物，其含有权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐，以及任选的，药学上可接受的载体或赋形剂。

5.权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐在体内/体外作为莽草酸脱氢酶抑制剂的用途，优选地，所述莽草酸脱氢酶为分枝杆菌的莽草酸脱氢酶，更优选地，所述莽草酸脱氢酶为结核分枝杆菌的莽草酸脱氢酶。

6.权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐在体内/体外用于抑制分枝杆菌活性的用途，优选地，所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

7.权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备抗分枝杆菌药物的用途，优选地，其中所述分枝杆菌为结核分枝杆菌。

8.权利要求1-3任一项的化合物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗结核病的药物中的用途。

9.权利要求8的用途，其中所述的结核病为肺结核或肺外结核（例如骨关节结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、肾结核、肠结核等）。