CN109293681B - 一种抗结核化合物及其在制备抗结核药物中的应用以及一种抗结核药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗结核化合物，具有式I所示结构，当式I中n＝0时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二唑衍生物(IMB‑SDb8)，当式I中n＝1时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二嗪衍生物(IMB‑SDc9)。根据实施例中的抗结核活性评价结果可知，化合物IMB‑SDb8和IMB‑SDc9具有明确的抗结核杆菌活性，且生物利用度较好，毒性小，在制备抗结核药物方面具有广阔的应用前景。

Description

一种抗结核化合物及其在制备抗结核药物中的应用以及一种 抗结核药物组合物

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种抗结核化合物及其在制备抗结核药物中的应用以及一种抗结核药物组合物。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌复合群(Mycobacterium tuberculosis complex, 简称结核分枝杆菌或结核菌)引起的慢性感染性疾病，可累及全身多器官系统，最常见的患病部位是肺脏，占各器官结核病总数的80-90％。也可以累及肝、肾、脑、淋巴结等器官。结核分枝杆菌复合群包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌和田鼠分枝杆菌，引起人类疾病的主要是结核分枝杆菌。

近年来，随着结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)中的耐单药(SDR-MTB)、多药耐药(MDR-MTB)和广泛耐药结核分枝杆菌 (XDR-MTB)的不断出现和蔓延，使得传统抗结核药物的临床治疗效率不断下降，不能有效应对由耐药结核杆菌引发的结核疫情，结核病也因此再次成为严重危害人类健康和公共安全的传染性疾病。

最新世界卫生组织统计结果表明，2016年全球范围内新增结核病患者 1040万，其中49万人感染了MDR-MTB；死亡患者170万，其中37万人死于MTB与人类免疫缺陷病毒(HIV)合并感染。

新型抗结核药物匮乏，近五十年仅两个新药上市，一旦耐药性传播，又会陷入无药可用的困境。研发新型的高效、低毒的抗结核药物，解决结核病治疗所面对的难题成为控制结核病疫情的当务之急。

发明内容

有鉴于此，本发明目的在于提供一种抗结核化合物及其在制备抗结核药物中的应用以及一种抗结核药物组合物。本发明提供的抗结核化合物生物利用度较好，毒性小，在制备抗结核药物方面具有广阔的应用前景。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下方案：

一种抗结核化合物，具有式I所示结构：

式I中，n＝0或1。

本发明还提供了上述方案所述的抗结核化合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的应用。

本发明还提供了一种抗结核药物组合物，包括有效成分和药学上可接受的载体，所述有效成分为上述方案所述的抗结核化合物。

优选的，单元剂型的药物组合物中有效成分的含量为1～5000mg。

本发明还提供了上述方案所述抗结核药物组合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的应用。

本发明提供的抗结核化合物，具有式I所示结构，当式I中n＝0时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二唑衍生物(IMB-SDb8)，当式I中n＝1时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二嗪衍生物(IMB-SDc9)。根据实施例中的抗结核活性评价结果可知，化合物IMB-SDb8和IMB-SDc9具有明确的抗结核杆菌活性，对结核分枝杆菌标准菌株H37Rv具有抑制活性，MIC分别为0.5μg/mL和1.0μg/mL；初步药代动力学实验结果显示IMB-SDb8口服生物利用度为21.74％；心脏毒性研究结果显示IMB-SDb8没有明显心脏毒性问题；小鼠急性毒性实验结果表明IMB-SDb8的半数致死量LD50>1000mg/kg；初步研究显示IMB-SDb8具有良好的成药性，表明该化合物作为抗结核药物具有良好应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例3中静脉注射给药后的药时曲线图；

图2为本发明实施例3中口服给药后的药时曲线图。

具体实施方式

本发明提供了一种抗结核化合物，具有式I所示结构：

式I中，n＝0或1。

在本发明中，当式I中n＝0时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二唑衍生物(IMB-SDb8)，名称为：3-(4-溴苯基)-6-三氟甲基-[1,2,4]均三唑并 [3,4-b][1,3,4]噻二唑，具有式a所示结构：

在本发明中，当式I中n＝1时，本发明提供的化合物是一种均三唑并噻二嗪衍生物(IMB-SDc9)，名称为：3-(4-溴苯基)-6-三氟甲基-7H-[1,2,4]均三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二嗪，具有式b所示结构：

本发明对具有式I所示结构的抗结核化合物的合成方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的合成方法即可，优选的合成路线如式Ⅱ所示：

式Ⅱ中：a～f表示反应所需的试剂及反应条件，其中：(a)N,N'-羰基二咪唑，四氢呋喃，回流；(b)水合肼(浓度为60wt％)，乙醇，回流；(c) CS₂，KOH，乙醇；(d)水合肼(浓度为60wt％)，H₂O，回流；(e)三氟乙酸，POCl₃，回流；(f)3-溴-1,1,1-三氟丙酮，乙醇，微波；式Ⅱ中的百分数表示各个步骤的收率。

本发明还提供了上述方案所述的抗结核化合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的应用。在本发明中，所述结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis) 也被称为结核杆菌，是引起结核病的病原菌。结核分枝杆菌H37Rv是1905年分离出来的并被全球广泛应用于生物医学研究的菌株，有完整毒性的肺结核动物模型。在本发明中，所述抗结核分歧杆菌具体是指杀死分枝杆菌或抑制分枝杆菌的生长和繁殖。

在本发明中，所述的结核病是指结核分枝杆菌能够引起的各种类型的结核病，例如为肺结核或肺外结核；所述肺外结核例如为骨关节结核、结核性脑膜炎、结核性胸膜炎、肾结核、肠结核等。

本发明对所述抗结核化合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的具体应用方式没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法，将所述抗结核化合物制备成不同剂型的药物即可。

本发明还提供了一种抗结核药物组合物，包括有效成分和药学上可接受的载体，所述有效成分为上述方案所述的抗结核化合物。本发明对载体的种类没有特殊要求，可以包括一种或多种药学上可接受的载体。

在本发明中，所述抗结核药物组合物可以制备成多种剂型，以便于给药。本发明的药物组合物可通过口服、直肠、胃肠外、池内、阴道内、腹膜内、局部(如通过散剂、软膏剂或滴剂)、口颊给予人类和其他哺乳动物，或者作为口腔喷雾剂或鼻腔喷雾剂给予。本发明所用术语“胃肠外”指包括静脉内、肌肉内、腹膜内、胸骨内、皮下和关节内注射和输液的给药方式。

在本发明的具体实施例中，所述抗结核药物组合物具体可为口服制剂，以便于口服给药。所述口服制剂具体可以为固体剂型或液体剂型；所述固体剂型具体的如片剂、糖衣丸剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂或包衣剂，所述液体剂型具体的可为乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂或酏剂。

在本发明中，所述口服制剂中的固体剂型除包括抗结核化合物和至少一种药学上可接受的赋型剂(如柠檬酸钠或磷酸二钙)外，还可包括以下物质中的一种或几种：a)填充剂或增量剂，具体的如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，具体的如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶中的一种或几种；c)保湿剂，具体的如甘油；d)崩解剂，具体的如琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉、木薯淀粉、海藻酸、硅酸盐和碳酸钠中的一种或几种；e)溶液阻滞剂，具体的如石蜡；f)吸收加速剂，具体的如季铵化合物；g)湿润剂，具体的如鲸蜡醇和/或甘油单硬脂酸酯；h)吸附剂，具体的如高岭土和/或膨润土；i)润滑剂，具体的如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇和十二烷基硫酸钠中的一种或几种。此外，在胶囊剂、片剂或丸剂中，还可包含缓冲剂。

另外，相似类型的固体组合物使用的赋形剂(例如乳糖及高分子量聚乙二醇等)也可用作软胶囊和硬胶囊中的填充物。

另外，片剂、糖衣丸剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型可与包衣和壳料(如肠溶衣材和医药制剂领域公知的其他衣材)一起制备。这些固体剂型还可选择添加遮光剂；所述抗结核药物组合物的组成还可使其只在肠道某个部位或优先地在肠道的某个部位以延迟方式释放活性成分；在本发明的具体实施例中，可以使用高分子物质或蜡类制备成包埋组合物的形式；还可以配成微囊形式。

在本发明中，所述口服制剂中的液体剂型除包括抗结核化合物外，还包括以下物质中的一种或几种：a)本领域常用的惰性稀释剂，具体的如水或其他溶剂；b)增溶剂和乳化剂，具体的如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯中的一种或几种。

此外，所述口服剂型还可包含辅料，具体的如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香味剂中的一种或几种。

在本发明的具体实施例中，所述抗结核药物组合物具体可为肠道外用药制剂，具体的如注射剂、栓剂。

在本发明中，所述注射剂可以为溶液、混悬液或者可注射的干燥粉末(在注射前加入注射水可立即使用)；所述注射剂除包括抗结核化合物外，还包括以下载体或助剂：生理上可接受的无菌含水或非水溶液剂、分散剂、混悬剂、乳剂、合适的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或媒介物，具体的如水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、植物油(如橄榄油)和可注射有机酯中的一种或多种，所述可注射有机酯优选包括油酸乙酯。

在本发明中，所述注射剂还可以是可注射贮库制剂形式；所述可注射贮库制剂可通过在可生物可降解聚合物中形成药物的微胶囊基质来制备。所述可生物可降解聚合物优选包括聚丙交酯-聚乙交酯、聚原酸酯或聚类酐类。所述可注射贮库制剂能够通过药物与聚合物之比及其所采用的具体聚合物的性质对药物的释放速度加以控制；此外，可注射贮库制剂也可通过将药物包埋于能与身体组织相容的脂质体或微乳中来制备。

在本发明中，可注射制剂通过以下形式进行灭菌：a)用滤菌器过滤；b) 掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂；所述无菌固体组合物可在临用前溶解或分散于无菌水或其他无菌可注射介质中。

在本发明中，所述注射用混悬剂和口服用混悬剂中还可包括悬浮剂；所述悬浮剂具体优选为乙氧基化异十八醇、聚氧乙烯山梨醇、聚氧乙烯失水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍胶中的一种或几种。

此外，在一些情况下，为延长药物的作用，期望减慢皮下或肌内注射药物的吸收。此时可通过使用水溶性差的晶体或无定形物质的液体混悬剂来实现；药物的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又可取决于晶体大小和晶型，通过添加上述物质可以达到延长药物作用的目的。此外，胃肠外给药的药物形式的延迟吸收可以通过将药物溶解或悬浮于油媒介物中来实现。

在本发明中，所述栓剂可用于直肠或阴道给药；所述栓剂可通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合进行制备；所述赋型剂或载体具体优选为可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡；所述赋型剂或载体在室温下为固体，但在体温下则为液体，因此可在直肠腔或阴道腔内熔化而释放出活性化合物。

在本发明的具体实施例中，所述抗结核药物组合物具体可为局部给药制剂，如散剂、喷雾剂、软膏剂和吸入剂。在无菌条件下将本发明的抗结核化合物与药学可接受的载体以及所需的防腐剂、缓冲剂、推进剂混合即可得到局部给药制剂；此外，眼用制剂、眼软膏剂、散剂和溶液剂也被考虑在本发明范围内。

在本发明的具体实施例中，所述抗结核药物组合物具体可为脂质体制剂，以脂质体形式给药。本发明对所述脂质体制剂的具体制备方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法即可。在本领域中，脂质体通常用磷脂或其他脂类物质制得；脂质体由分散于含水介质中的单层或多层水化液晶所形成，任何能够形成脂质体的无毒、生理上可接受和可代谢的脂质均可使用；在本发明中，所述脂类优选为天然和合成的磷脂和/或磷脂酰胆碱(卵磷脂)；形成脂质体的方法参见Prescott,Ed.,Methods in Cell Biology,Volume XIV,Academic Press,NewYork,N.Y.(1976),p.33。此外，所述脂质体形式制剂除含有本发明的抗结核化合物外，还可含有稳定剂、防腐剂、赋形剂等。

上述所有形式的制剂中，本发明所述的抗结核化合物的剂量是以单元剂型中存在的化合物量计算的。在单元剂型中本发明所述抗结核化合物的含量优选为1～5000mg，更优选为10～500mg，进一步优选为20～300mg。

本发明对上述方案所述剂型的制备方法没有特殊要求，使用本领域技术人员熟知的方法，将本发明提供的抗结核化合物制备成相应剂型的药物即可。

本发明对所述抗结核化合物以及抗结核药物组合物可用于预防或治疗哺乳动物(例如人)的结核病，在治疗或预防过程中，给有需要的受试者预防或治疗有效量的本发明提供的抗结核化合物。本发明的抗结核化合物可以以纯形式应用，或者以前药形式应用，或者以含本发明提供的抗结核药物组合物形式应用。在本发明的具体实施例中，可改变本发明药物组合物中活性成分(抗结核化合物)的实际剂量水平，以使活性化合物的量能有效针对具体患者、组合物和给药方式得到所需的治疗反应。剂量水平须根据具体化合物的活性、给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史来选定。

在本发明中，“治疗和/或预防有效量”的本发明化合物指以适用于任何医学治疗和/或预防的合理效果/风险比治疗障碍的足够量的化合物。本发明化合物或组合物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与所采用的具体化合物组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。本领域的常规做法是，化合物的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明提供的抗结核化合物用于哺乳动物(特别是人)时剂量优选为 0.001～1000mg/kg体重/天，更优选为0.01～100mg/kg体重/天，进一步优选为0.01～10mg/kg体重/天。

下面结合实施例对本发明提供的一种抗结核化合物及其在制备抗结核药物中的应用以及一种抗结核药物组合物进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

所用试剂和原料无特别说明都购自国药集团化学试剂有限公司。

实施例1

1)对溴苯甲酰肼(中间体3)的合成

在250mL的三口瓶中加入对溴苯甲酸(10.0g，49.75mmol)和100mL 四氢呋喃，再加入N,N'-羰基二咪唑(10.45g，64.68mmol)，TLC监测原料反应是否完全，反应完毕后，缓慢滴加80％水合肼(4.93g，78.77mmol)，滴毕，搅拌反应6小时左右。TLC监测原料反应是否完全(展开剂：石油醚 /乙酸乙酯1:1)。反应完毕后，冷至室温，减压浓缩除去大部分有机溶剂，加水约30mL，室温下打浆片刻，抽滤，水洗，得白色片状固体。经15mL 无水乙醇重结晶得中间体3的白色固体9.09g，收率85％。m.p.166～167℃，与文献值一致。

2)对溴苯甲酰肼基二硫代甲酸钾盐(中间体4)的合成

250mL单口瓶中加入步骤1)制备的中间体3(5.0g，23.25mmol)、无水乙醇100mL和KOH(1.90g，33.82mmol)，室温下搅拌溶清，氮气保护下逐滴滴加CS₂(2.59g，33.82mmol)的20mL无水乙醇溶液。伴有大量白色沉淀生成。滴毕，室温下继续搅拌反应18h。TLC监测原料反应至完全。减压浓缩除去约80mL溶剂，抽滤，滤饼用少量冷的无水乙醇洗涤，干燥得中间体4的白色粉末固体7.50g，未经进一步纯化直接用于下一步。

3)4-氨基-5-(4-溴苯基)-1,2,4-三唑-3-硫醇(中间体5)的合成

100mL单口瓶中依次加入步骤2)制备的中间体4(5.0g，15.18mmol)、 15mL水和80％水合肼(1.92g，29.56mmol)，搅拌溶清，室温下搅拌反应1h后升至90℃反应3小时，期间反应液渐变浅绿色并不断有硫化氢气体产生，反应至无硫化氢气体产生停止。将反应液倾入15mL冰水中，搅拌片刻后，抽滤，滤液用6N HCl调至pH值3左右，析出大量固体，抽滤，水洗涤，干燥得中间体5的白色固体2.47g，收率60％。

mp 204～205℃。¹HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.99(s,1H),8.00(d,J ＝8.0Hz,2H),7.76(d,J＝8.0Hz,2H),5.79(s,2H)。MS(ESI)m/z 271.1 (M+1)+。

4)3-(4-溴苯基)-6-三氟甲基-[1,2,4]均三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二唑(化合物6，即：IMB-SDb8)的合成

50mL单口瓶中加入步骤3)制备的中间体5(1.000g，3.69mmol)、三氟乙酸(2.7ml，36.90mmol)和9mL的POCl₃，回流反应7h。将反应液分批倾入200g左右冰水中，搅拌2h，加入乙酸乙酯/正己烷1:1混合溶剂萃取100mL×3，合并有机相，稀的NaHCO₃水溶液洗2～3次，有机层无水Na₂SO₄干燥，减压浓缩至干，再经乙醚10mL打浆，抽滤得目标化合物 6，干燥，得白色粉末状固体1.205g，收率93.6％。

mp 242.0～246.5℃。¹H NMR(600MHz,d-DMSO)δ8.12(d,J＝8.6Hz, 2H),7.88(d,J＝8.6Hz,2H)；¹³C NMR(151MHz,d-DMSO)δ154.50,145.41, 132.45,127.87,124.188,118.92,117.11,29.01。HRMS(APCI)m/z计算得 C₁₇H₁₄N₄OSNa⁺：370.9184；实际值：370.9188。

5)3-(4-溴苯基)-6-三氟甲基-7H-[1,2,4]均三唑并[3,4-b][1,3,4]噻二嗪(化合物7，即：IMB-SDc9)的合成

在10mL微波反应管中加入步骤3)制备的中间体5(0.300g，1.11 mmol)、3-溴-1,1,1-三氟丙酮(140μl，1.33mmol)和5mL的无水乙醇， 95℃微波反应25min。自然冷至室温有淡黄白晶体析出，抽滤，冷乙醇、乙醚洗涤，真空干燥，得淡黄白色晶体7 0.370g，收率92.1％。

mp 194.0～197.0℃。¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.89(d,J＝8.6Hz,2H), 7.62(d,J＝8.6Hz,2H),3.83(s,2H)；¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ152.11, 141.30,132.25,129.58,125.90,123.83,120.75,118.00,20.53。HRMS(APCI) m/z计算得C₁₇H₁₄N₄OSNa⁺：384.9340；实际值：370.9357。

实施例2

对实施例1制备的IMB-SDb8和IMB-SDc9在体外对结核杆菌H37Rv 抑制活性进行测定，以常用的抗结核药物异烟肼作为对比，步骤如下：

采用微孔板二倍稀释法测定IMB-SDb8和IMB-SDc9的体外抗结核活性。

1)转接MTB H37Rv菌株于7H9培养基中，37℃静置培养10d；

2)用新鲜培养基稀释菌液，至菌体CFU约为1×10⁵个/ml；

3)将稀释后的菌液加入96孔板，第一列每孔200μL，其余每孔100μL；

4)将化合物加入第一列孔中，至终浓度为32μg/ml，进行二倍稀释，使化合物的终浓度由32μg/ml稀释至0.125μg/ml，共设11个梯度，每组 3个平行；以稀释菌液作为生长对照，无菌培养基做为空白对照；

5)将96孔板封好口后，置于37℃静置培养10d；读取MIC值。

实验结果显示IMB-SDb8和IMB-SDc9对MTB标准菌株H37Rv的MIC 分别为0.5μg/ml和1.0μg/ml，异烟肼的MIC为4.0μg/ml。

实施例3

IMB-SDb8初步药代动力学性质评价

IMB-SDb8血浆药代动力学参数测定

1)雄性SPF级的ICR小鼠，每个时间点3只。给药前，所有动物禁食过夜(约14小时)，给药后4小时给食；

2)分别采用静脉注射和口服给药两种给药方式。用于静脉注射给药的化合物用20％DMSO+60％PEG400+20％(20％HP-β-CD)混合溶剂配制成 0.4mg/ml澄清液体，给药剂量为2mg/kg。用于口服给药的化合物用MCT 配制成0.5mg/ml混悬液，给药剂量为5mg/kg；

3)于静脉给药后5min，15min，30min，1h，4h，8h和24h收集血浆样品；于口服给药后30min，1h，2h，4h，6h，8h和24h收集血液样品。血液样品置于K₂EDTA离心管中，离心分离血浆；

4)采用LC-MS/MS方法分析血浆样品中化合物浓度。LC-MS/MS系统是沃特世ACQUITY UPLC超高效液相系统与美国应用生物系统公司TQ 6500+串联四级杆质谱仪连用。色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50 mm,1.7μm)。流动相是含0.1％甲酸水溶液和0.1％甲酸甲醇溶液，流速0.5 ml/min。以200ng/ml甲苯磺丁脲作为内标物；

5)采用软件Phoenix

非房室模型计算血浆药代动力学参数。

分别采用静脉注射和口服给药两种方式，研究了IMB-SDb8的药代动力学参数。实验组动物给予IMB-SDb8后，所有动物均未见任何异常，表明实验动物对IMB-SDb8较为耐受。在不同时间点采集全血液，分离血浆，应用液质联用技术测定了血浆中IMB-SDb8的浓度，结果如下表1。

表1静脉注射2mg/kg、口服给药5mg/kg后血浆中IMB-SDb8浓度

(注：BQL:低于检测限；ND：未计算)

根据在不同时间点，血浆中IMB-SDb8的浓度，绘制静脉注射、口服给药后的药时曲线图，结果如图1～图2所示，其中图1为静脉注射后的药时曲线图，图2为口服给药后的药时曲线图。

使用Phoenix WinNonlin 7.0按照非房室模型计算药代动力学参数，结果如表2所示。

表2静脉注射2mg/kg、口服给药5mg/kg后IMB-SDb8主要的血浆药代动力学参数

由表2中的数据可以看出，IMB-SDb8的口服生物利用度为21.74％。

实施例4

IMB-SDb8心脏毒性研究

1)实验方法

快速激活的人延迟整流外向钾电流(IKr)主要由hERG离子通道介导，参与人类心肌细胞复极化。药物阻断这一电流是导致临床上出现QT间期延长综合征，甚至急性心律紊乱猝死的主要原因。采用膜片钳方法检测IMB-SDb8对hERG钾离子通道的抑制作用，从而初步评价IMB-SDb8的心脏毒性。

(1)配制细胞外液：10mM HEPES、145mM NaCl、4mM KCl、2mM CaCl₂、1mM MgCl₂和10mM葡萄糖，用1M NaOH调节pH至7.4；渗透压调至290～300mOsm；过滤后4℃保存；

(2)配制电极内液：120mM KCl、31.25mM KOH、5.374mM CaCl₂、 1.75mM MgCl₂、10mMEGTA、10mM HEPES和4mM Na 2-ATP，用1M KOH调节pH至7.2；渗透压调至280～290mOsm；过滤后-20℃保存；

(3)化合物用DMSO配成10mM储备液，使用前用细胞外液梯度稀释，终浓度为0.1、0.3、1、3、10μM。以阿米替林为阳性药对照，阿米替林用DMSO配成30mM储备液，使用前用细胞外液梯度稀释，终浓度为0.3、 1、3、10、30μM。

(4)取稳定细胞株CHO-hERG细胞悬液加于载玻片，置于正置显微镜载物台上。待细胞贴壁后，用细胞外液灌流，灌流速速为1～2ml/min。玻璃微电极由微电极拉制仪两步控制，其入水电阻值为2～5MΩ。

(5)建立全细胞记录后，保持钳制电位-80mV。给予电压刺激时去极化至+60mV，然后复极化至-50mV，引出hERG尾电流；

(6)胞外灌流给药，从低浓度开始，每个浓度5～10min，至电流稳定，再给下一个浓度。每个样品组设置两个平行；

(7)通过PatchMaster 2.40软件进行刺激发放及信号采集，膜片钳放大器HEKAEPC10USB放大信号，滤波为3KHz；

(8)将尾电流峰值和其基线进行校正，用尾电流抑制率表示不同浓度下各化合物的作用。IC50数值由Hill方程进行拟合所得。使用PatchMaster 2.40和GraphPadPrism进行数据分析和曲线拟合。

2)实验结果

由于心脏毒性是限制成药的重要因素，因此首先采用膜片钳方法检测了 IMB-SDb8对hERG钾离子通道的抑制作用。实验结果显示IMB-SDb8在最高测试浓度(30μM)时对hERG钾离子通道的抑制作用未达到IC50，其对 hERG钾离子通道的IC50大于30μM，说明了IMB-SDb8对hERG通道没有明显的抑制作用，说明本发明提供的化合物没有明显的心脏毒性。

实施例5

IMB-SDb8小鼠急性毒性初步研究

1)实验方法

(1)SPF级小鼠，雌雄各三只，体重16～18g。给药前禁食12h；

(2)IMB-SDb8用0.5％CMC溶液配成20mg/ml。口服灌胃给药，给药剂量为500mg/kg；

(3)每天观察小鼠存活情况，连续观察一周。

2)实验结果

小鼠急性毒性实验结果显示：口服给药1000mg/kg剂量下，实验组小鼠全部存活，且健康状况良好。表明IMB-SDb8的半数致死量LD50>1000 mg/kg。

通过以上的研究发现，IMB-SDb8具有较好的体外抗结核活性、口服生物利用度较好、潜在的心脏毒性较小，急性毒性作用较低，该化合物有可能发展成为新的抗结核药物。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种抗结核化合物，具有式I所示结构：

式I中，n＝0或1。

2.权利要求1所述的抗结核化合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的应用。

3.一种抗结核药物组合物，包括有效成分和药学上可接受的载体，其特征在于，所述有效成分为权利要求1所述的抗结核化合物。

4.根据权利要求3所述的抗结核药物组合物，其特征在于，单元剂型的药物组合物中有效成分的含量为1～5000mg。

5.权利要求3或4所述抗结核药物组合物在制备抗结核分歧杆菌药物中的应用。

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