CN113444765A - 耐药性乳腺癌治疗药物及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种耐药性乳腺癌药物筛选方法以及得到的有效治疗药物，所述筛选方法包括选择耐药乳腺癌细胞株以及确认细胞株对于抗乳腺癌药物的抗性，并选择参比药物；检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果，对耐药细胞糖酵解水平的影响以及对耐药细胞线粒体的影响，筛选得到的综合评价优异的黄芩素是一种有效的抗乳腺癌药物增敏剂，说明本发明的筛选方法尤其适用于针对特定的耐药性药物，得到匹配的增敏性药物，从而有利于针对特定耐药乳腺癌患者进行精准化医学治疗。

Description

耐药性乳腺癌治疗药物及其筛选方法
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及一种耐药性乳腺癌药物筛选方法以及得到的有效治疗药物。
背景技术
乳腺癌是严重威胁全世界女性健康的第一大恶性肿瘤。近几十年来，乳腺癌治疗技术有了较大的发展，抗乳腺癌一线治疗药物层出不穷，但是耐药性的发生在很大程度上阻扰了乳腺癌治疗的有效性。肿瘤耐药的产生可分为原发性耐药和获得性耐药，根据肿瘤细胞的耐药特点，其获得性耐药可分为原药耐药(primary drug resistance，PDR)和多药耐药(multidrug resistance，MDR)两大类。PDR是指仅对诱导药物产生交叉耐药；而MDR是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生抗药性的同时，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性，又称多向性耐药(pleiotropic drug resistance)。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因，也是困扰肿瘤治疗的一大难题。因此，克服肿瘤细胞MDR，提高抗癌药物疗效已成为肿瘤治疗亟待解决的关键性课题。
近年来，国内外对天然药物逆转肿瘤耐药的研究取得了较大进展，筛选得到多种植物源多酚、黄酮、萜类成分具有逆转肿瘤耐药的功效，且天然产物往往毒副作用小，且同时具有调节免疫性，抗氧化，抗自由基，调节自噬，抑制增殖，周期阻滞，诱导凋亡或分化，从多种机制靶点抑制肿瘤细胞活性的特点。从植物源天然成分中筛选得到具有乳腺癌化疗增敏作用以及降低乳腺癌耐药性的药物是抗乳腺癌药物研发的重要思路之一，但也正因为天然产物作用机理的复杂性，需要摸索构建合适的体外耐药细胞的药理筛选模型，针对乳腺癌药物产生耐药性以及效果减低的多种可能的药物通路的评价以及综合评分，找到一种普适性的、可筛选得到对乳腺癌耐药患者具有有效治疗效果或者对乳腺癌一线药物具有增敏作用的天然产物源药物的方法，从而可以快速、高效的从已知的天然抗肿瘤化合物库中进一步得到有益于耐药乳腺癌进展控制的药物，尤其是筛选得到对耐药乳腺癌已有治疗药物具有增敏作用，且有利于多靶点综合作用，降低乳腺癌患者复发率，提高存活率的治疗药剂。
黄芩素是中药黄芩的有效成分之一，具有较强的抗肿瘤活性，有着良好的应用前景和研究价值。已有研究发现黄芩素能够抑制乳腺癌的增殖、诱导凋亡以及抑制转移。因此，进一步深入研究黄芩素在乳腺癌治疗中作用机制，以及发现其对抗癌药物的增敏作用，有助于将其开发成为应用于对乳腺癌治疗已经产生耐药性患者的治疗增敏药物以及通过对其增敏机制的发现，进一步开发对产生耐药性的乳腺癌患者具有有效治疗效果或者对乳腺癌一线药物具有增敏作用的药物的筛选、预测模型和方法。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明首先提供一种药物筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选择耐药乳腺癌细胞株以及确认细胞株对于抗乳腺癌药物的抗性，并选择参比药物：采用MTT法测定耐药乳腺癌细胞株对抗乳腺癌药物的耐药倍数N，抗性达到N大于等于2的作为参比药物；
(2)检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果；
(3)检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响；
(4)测试待筛药物联用参比药物对耐药细胞线粒体的影响；
(5)根据步骤(2)-(4)的测试结果，筛选得到药物，所述药物在所述步骤(2)-(4)对应的三项测试中均表现出对参比药物的增敏效果；具体的，所述药物在步骤(2)的测试中，能够显著增加参比药物诱导耐药乳腺癌细胞株出现早期凋亡，所述药物在步骤(3)的测试中，能够下调耐药细胞的乳酸水平以及GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的表达水平，所述药物在步骤(4)的测试中，能够至少表现出增加细胞线粒体功能，增加线粒体数目，增加线粒体/细胞内活性氧，下调线粒体膜电位变化中两种以上效果。
所述药物筛选方法进一步包括如下步骤：
(1)选择耐药乳腺癌细胞株以及确认细胞株对于抗乳腺癌药物的抗性，并选择参比药物：采用抗癌药物诱导乳腺癌细胞株，构建耐药乳腺癌细胞或者采用市售耐药乳腺癌细胞株；采用MTT法测定耐药乳腺癌细胞株对抗乳腺癌药物的耐药倍数N，并通过琼脂糖克隆形成实验确认抗癌药物的抗性，抗性达到N大于等于2的作为参比药物；
(2)检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果：分别采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合处理耐药乳腺癌细胞，再用细胞凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪进行细胞凋亡分析；
(3)检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响：采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合处理耐药乳腺癌细胞；采用乳酸测定试剂盒，通过多功能酶标仪在530nm处检测吸光度，从细胞内乳酸含量的变化分析糖酵解水平；采用Western blot的方法，检测HIF-1ɑ及其下游糖酵解关键分子GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白水平的变化；
(4)测试待筛药物联用参比药物对耐药细胞线粒体的影响：采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，进行透射电镜分析；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，采用线粒体DNA(mtDNA)含量检测、Mito-Tracker Red荧光染色以及线粒体分裂蛋白Drp-1的表达等一种或两种以上手段分析线粒的数目变化；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，用DCFH-DA和Mito SOX荧光探针测量细胞内和线粒体的活性氧水平；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，采用TMRE试剂盒检测线粒体膜电位；
(5)根据步骤(2)-(4)的测试结果，筛选得到药物，所述药物在所述步骤对应的三项测试中均表现出对参比药物的增敏效果；具体的，所述药物在步骤(2)的测试中，能够显著增加参比药物诱导耐药乳腺癌细胞株出现早期凋亡，所述药物在步骤(3)的测试中，能够下调耐药细胞的乳酸水平以及GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的表达水平，所述药物在步骤(4)的测试中，能够至少表现出增加细胞线粒体功能，增加线粒体数目，增加线粒体/细胞内活性氧，下调线粒体膜电位变化中两种以上效果。
根据本发明的实施方案，所述步骤(1)中，可以通过浓度梯度筛选法，采用抗癌药物诱导敏感株乳腺癌细胞，逐渐增加药物剂量连续培养5-7个月，构建耐药乳腺癌细胞。在一些实施方式中，步骤(1)可采用市售耐药乳腺癌细胞。
根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞进行细胞凋亡分析；具体的，采用如下方法获得细胞凋亡测试结果：用不含有EDTA的胰酶消化至单细胞悬液，1000rpm，离心5min，弃上清；PBS清洗2遍，加入100μL 1×结合缓冲液重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染料，轻轻混匀；避光、室温反应10-15min；加入400μL结合缓冲液，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪于FITC和PE通道检测。
根据本发明的实施方案，所述步骤(3)中，所述采用Western blot的方法具体步骤为：提取蛋白后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，再转移至聚偏二氟乙烯膜，用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液进行封闭，分别加入GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的一抗，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗与一抗结合反应，加入HPR底物显色，检测HIF-1ɑ及其下游糖酵解关键分子GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白水平的变化。
根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，所述透射电镜分析步骤如下：药物处理耐药乳腺癌细胞后，消化离心收集细胞，PBS漂洗两遍，双醛(2％多聚甲醛+2.5％戊二醛)固定30min，PBS清洗3遍，用小的样品勺取出一点标本，置包埋板或小的离心管中，然后常规(不同浓度的乙醇)进行梯度脱水，浸透，包埋，送电镜室切片后置透射电镜下观察。
根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，所述mtDNA含量检测具体包括如下步骤：采用DNA提取试剂获得细胞总DNA，加入ND1、ND5及内参SLCO2B1、SERPINA1的引物，根据SYBRGreen PCR core reagents试剂盒说明，通过CFX Connect实时荧光定量PCR仪进行聚合链反应扩增，记录Ct值，计算ΔCt值，ΔCt1＝CtSLCO2B1-CtND1，ΔCt2＝CtSERPINA1-CtND5，将ΔCt1和ΔCt2分别代入2ΔCt中，计算得到2ΔCt1和2ΔCt2，将两者求和得到mtDNA的值，各组与control进行比较得到相对mtDNA水平。；所述Mito-Tracker Red荧光染色具体包括如下步骤：细胞经过处理后，消化收集，用含有Mito-Tracker Red荧光染料(100nM)培养基于37℃孵育20min，PBS清洗3次，1mL PBS重悬后经流式细胞仪检测，所述线粒体分裂蛋白Drp-1采用所述Western blot的方法进行检测(参照步骤(3))。
根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，用荧光探针测量细胞内和线粒体的活性氧水平包括如下具体步骤：药物处理后，PBS清洗1次，消化收集细胞；用含有DCFH-DA(10μM)探针或MitoSOX(5μM)探针的无血清培养基避光孵育细胞37℃，30min，随后离心收集细胞，PBS洗3次，1ml PBS重悬细胞，进行流式细胞仪分析；分别在FITC和PE通道记录1×104个细胞的荧光强度。
根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，采用TMRE试剂盒检测线粒体膜电位具体包括如下步骤：六孔板接种细胞，给药后，用PBS轻轻洗1次，用不含血清培养基稀释TMRE至工作浓度(200nmol/L)，每孔加入TMRE各1ml。避光，于培养箱内(37℃)孵育25min。弃含染料的培养基，PBS清洗2次去除多余染料，胰酶消化细胞，PBS清洗2次，流式细胞仪检测，PE通道检测荧光强度。
根据本发明的实施方案，所述筛选方法还可以进一步包括如下强化验证步骤：采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，然后进行台盼蓝拒染实验、MTT实验及软琼脂糖克隆形成实验，进一步确证待筛药物的增效效果。
根据本发明的实施方案，所述台盼蓝拒染实验具体包括如下步骤：称取台盼蓝粉末0.2g溶于5mL双蒸水中，0.22μm滤膜一次性滤器过滤除菌，4℃保存；使用前用PBS稀释至0.4％。取各组对数生长期细胞，以1×105个/孔接种于12孔板中，每组设4个复孔，分别培养24h、48h、72h；每隔24h胰酶消化收集细胞，制备单细胞悬液；PBS稀释台盼蓝染液至0.4％，与细胞悬液等体积混合，台盼蓝的终浓度为0.2％，静置30s，将混合液打匀后，加入计数板，倒置显微镜下观察未着色细胞(活细胞)；接种时即为0h，以细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线；
所述MTT实验具体包括如下步骤；将细胞接种至96孔板中(2000个细胞/孔)，过夜细胞贴壁后，用不同浓度的药物分别处理24h，48h或72h；然后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入37℃培养箱继续孵育4小时，除去孔中旧培养基，并加入DMSO(100μL/孔)在水平摇床上充分混匀；使用酶标仪在570nm下检测OD值；
1)结果以抑制细胞存活率表示，并使用下式计算：细胞存活率抑制率(％)＝[(正常对照组OD值-药物处理组OD/正常对照组OD值)]×100。采用抑制率IC50的差别判断细胞耐药情况。
2)用细胞活力(％)＝(药物处理组OD/正常对照组OD值)×100，通过细胞活力分析参比药物单用和参比药物联用测试药物的IC50，计算逆转倍数：IC50(参比药物)/IC50(参比药物+测试药物)，判断测试药物逆转耐药的作用；
所述软琼脂糖克隆形成实验包括如下步骤：配制1.2％琼脂糖，65℃水浴溶解，40℃水浴保存备用；将等体积琼脂糖溶液与等体积含有2×DMEM/F12，20％胎牛血清，使之成为含有0.6％琼脂糖、1×DMEM/F12、10％胎牛血清的混合液，0.22μm过滤器过滤除菌后，40℃保存。0.6％的混合液按1mL/孔铺于6孔培养板中，制备下层胶，置室温凝固备用。取对数生长期的细胞，胰酶消化制备单细胞悬液并计数，与0.6％琼脂糖溶液等体积混合制备成5×103/mL单细胞含0.3％琼脂糖的混合悬液；按1mL/孔将其接种于已经凝固的底层胶上；室温孵育60min，然后置于CO2恒温培养箱中培养；1×DMEM/F12完全含药培养基0.5mL间隔4天补充一次，倒置显微镜下观察细胞克隆形成情况，共培养21天；取出六孔板，500μL/孔0.005％结晶紫染色3min，双蒸水清洗10遍，采用Bio-Rad自动凝胶成像系统拍照，计数细胞集落形成数，细胞集落形成率＝(细胞集落形成数/接种细胞数)×100％。
根据本发明的实施方案，所述采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，采用如下条件：用1μM参比药物处理耐药乳腺癌细胞40-50h(优选为48h)；用25μM待筛药物样品单用处理耐药乳腺癌细胞株40-50h(优选为48h)；用25μM待筛药物样品联合1μM参比药物处理40-50h(优选为48h)。
根据本发明的实施方案，所述药物筛选方法可以获得适用于耐药性乳腺癌患者治疗以及对已有乳腺癌治疗药物增敏的药物。
根据本发明的实施方案，所述药物筛选方法尤其适用于从已知天然抗肿瘤活性成分中筛选得到适用于耐药性乳腺癌患者治疗以及对已有乳腺癌治疗药物增敏的药物。所述待筛药物可选自商用天然产物库或任意已知具有抗肿瘤活性的天然产物。优选的，待筛药物选自黄酮类天然抗肿瘤产物。
根据本发明的实施方案，所述已有乳腺癌治疗药物优选为他莫昔芬、氟维司群。
根据本发明的实施方案，所述参比药物选自他莫昔芬，4-羟基他莫昔芬。
根据本发明的实施方案，所述耐药乳腺癌细胞株选自MCF-7-TR和T47D-TR；所述抗癌药物选自他莫昔芬、氟维司群。
本发明提供一种黄芩素在制备用于治疗耐药性乳腺癌的药物中的用途。
根据本发明的实施方案，所述黄芩素可以作为耐药细胞增敏制剂。
根据本发明的实施方案，所述耐药性乳腺癌是指对他莫昔芬、氟维司群具有耐药性或对这两者交叉耐药的乳腺癌。
本发明还提供一种药物组合物，其包括黄芩素和他莫昔芬作为活性成分。所述药物组合物中，黄芩素与他莫昔芬的摩尔比为100:1-1:100，例如，黄芩素与他莫昔芬的摩尔比为25:1。
本发明进一步提供所述药物组合物在制备治疗乳腺癌的药物中的用途。
根据本发明的实施方案，所述乳腺癌进一步选自具有耐药性的乳腺癌，优选的，所述耐药性乳腺癌是指对他莫昔芬、氟维司群具有耐药性或对这两者交叉耐药的乳腺癌。
有益效果
1)本发明建立了从天然活性抗肿瘤药物中筛选得到耐药乳腺癌细胞治疗药物的方法，通过测试药物在糖酵解代谢，线粒体功能，细胞凋亡等方面的综合影响以及针对参比药物(TAM/OHT)在这些通路作用是否具有增敏作用有效的筛选得出针对他莫昔芬耐药细胞具有显著增敏提升效果的黄芩素。所述筛选办法建立了对糖酵解途径的完整评价，所筛选得到的药物对于耐药性癌细胞具有增敏效果以及加强的癌症治疗效果。且根据所述筛选方法，可以针对特定的耐药性药物，得到匹配的增敏性药物，从而有利于针对特定耐药乳腺癌患者进行精准化医学治疗。
2)本发明深入研究了黄芩素抑制耐药细胞代谢途径和增加抗乳腺癌药物对其耐药细胞敏感性的活性作用，明确了黄芩素的应用改变了耐药细胞的代谢途径和对抗癌药物的敏感性，评价黄芩素作为新的代谢调控药物和抗乳腺癌药物增敏剂的可能性，同时进一步验证黄芩素增加耐药细胞疗效的分子机制是通过抑制HIF-1ɑ及其下游糖酵解相关分子的表达，降低耐药细胞的糖酵解水平，并增加线粒体的数目和诱导凋亡的功能，从而增加耐药细胞对抗癌药物的敏感性。
附图说明
图1：图1A(MCF-7-TR和T-47D-TR两种细胞系均表现出对OHT的耐药性)；图1B(黄芩素能够呈现浓度依赖性增加OHT对两种细胞的生长抑制作用)；图1C和图1D(黄芩素能够显著增加他莫昔芬对两种耐药细胞的细胞活力及克隆形成的抑制作用)；
图2示意黄芩素增强他莫昔芬诱导耐药细胞凋亡(Bai代表黄芩素，OHT代表4-羟基他莫昔芬)；
图3示意黄芩素联用他莫昔芬可降低耐药细胞糖酵解水平；
图4示意黄芩素联用他莫昔芬对耐药细胞线粒体形态的影响；
图5：图5A(黄芩素单用或者联合OHT能够增加mtDNA的含量)；图5B(黄芩素单用或者联合OHT能够增加DRP-1的表达)；
图6示意黄芩素单用或者联合OHT增加线粒体或细胞内的活性氧；
图7示意黄芩素单用或者联合OHT下调线粒体膜电位的变化。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
实施例所用乳腺癌耐药细胞系从ATCC公司购买获得，包括MCF-7-TR(
Figure BDA0002425739470000091
CRL-3435TM)和T-47D-TR(
Figure BDA0002425739470000092
CRL-3436TM)。实施例中待筛选药物样品为天然抗肿瘤活性成分，选自商用天然产物库(MCE)，从中选择10种黄酮类(包含黄芩素)天然抗肿瘤化合物进行平行测试。
实施例1.药物筛选方法及结果
1.1确认乳腺癌耐药细胞株MCF-7-TR及T-47D-TR对已知乳腺癌药物的抗性
首先分析MCF-7-TR及T-47D-TR对不同乳腺癌药物的抗性，两种耐药细胞系分别经过不同浓度的乳腺癌药物处理后，进行MTT实验评价其耐药指数。
将细胞接种至96孔板中(2000个细胞/孔)，过夜细胞贴壁后，用不同浓度的药物分别处理24h，48h或72h。然后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入37℃培养箱继续孵育4小时，除去孔中旧培养基，并加入DMSO(100μL/孔)在水平摇床上充分混匀。使用酶标仪在570nm下检测OD值。结果以抑制细胞存活率表示，并使用下式计算：细胞存活率抑制率(％)＝[(正常对照组OD值-药物处理组OD/正常对照组OD值)]×100。
实验结果验证，当耐药细胞采用不同剂量OHT(即4-羟基他莫昔芬，他莫昔芬在体内需转化成活性代谢形式4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen，OHT)发挥效应，因此采用OHT进行测试)作用时，与敏感的亲本细胞相比，MCF-7-TR和T-47D-TR两种细胞系均表现出对OHT的耐药性，耐药指数分别为3.77和2.67(图1A)。因此，可以选择OHT作为参比药物。其他测试耐药指数N>2的药物如氟维司群亦可选择作为参比药物。
1.2检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果
在选用4-羟基他莫昔芬(OHT)作为参比药物的基础上，测试待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响。
实验方法如下：在OHT(1μM)处理48h，6.25，12.5以及25μM待筛药物样品联合OHT(1μM)处理48h的条件下，MCF-7-TR和T-47D-TR通过Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒结合流式细胞分析细胞凋亡情况。用不含有EDTA的胰酶消化至单细胞悬液，1000rpm，离心5min，弃上清。PBS清洗2遍，加入100μL 1×结合缓冲液重悬细胞，加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染料，轻轻混匀。避光、室温反应10-15min。加入400μL结合缓冲液，混匀后放置于冰上，样品在1小时内用流式细胞仪于FITC和PE通道检测。
结果显示：OHT单独作用时，两种耐药细胞并不出现明显的凋亡，而待筛药物中，25μM黄芩素能够显著增加OHT诱导两种药细胞出现早期凋亡。即实验结果证实所筛选的药物黄芩素能够有效增加耐药细胞对他莫昔芬的敏感性。
1.3检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响
低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)是机体缺氧应答反应中关键的转录因子，除促进肿瘤生长、血管生成、侵袭转移而外，其表达与多种乳腺癌耐药呈正相关。常氧条件下，HIF-1α被脯氨酸羟化酶(PHD)羟基化后，迅速经泛素-蛋白酶途径降解。在低氧条件下，PHD活性被抑制，HIF-1α降解受阻表达上调，发挥其转录活性。
在耐药乳腺癌细胞中，例如他莫昔芬(TAM)耐药的乳腺癌细胞中，即使在常氧条件下HIF-1ɑ的表达升高，转录活性增强，上调VEGF的表达促进耐药细胞生长。此外，HIF-1ɑ进入细胞核后与HIF-1β形成二聚体，随后与缺氧反应元件(HRE)结合，上调如磷酸果糖激酶1(PFK1)，丙酮酸脱氢酶激酶3(PDK3)、乳酸脱氢酶A(LDHA)等糖酵解酶的表达，采用siRNA沉默HIF-1ɑ的表达后，TAM耐药细胞的LDHA水平下降，并增加TAM对耐药细胞的增殖抑制作用。
发明人进一步发现并验证，通过抑制TAM耐药细胞的糖酵解，提高线粒体数目并恢复其功能，增加耐药细胞的敏感性，可能是筛选研发TAM耐药的重要思路，因此在建立药物筛选模型时，应检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响。
实验方法如下：
(1)MCF-7-TR和T-47D-TR细胞经过OHT(1μM)处理48h，以及25μM待筛药物样品联合OHT(1μM)处理48h的条件下。分别采用乳酸(lactic acid，LA)测定试剂盒，通过多功能酶标仪在530nm处检测吸光度，从细胞内乳酸含量的变化分析糖酵解水平。
(2)采用Western blot的方法，提取蛋白后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品，再转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液(PBS)进行封闭，分别加入GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的一抗，再用辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗与一抗结合反应，加入HPR底物显色，检测HIF-1ɑ及其下游糖酵解关键分子GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白水平的变化。
结果显示：乳酸是有氧糖酵解的主要产物。OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，细胞内乳酸水平显著升高，而待筛药物黄芩素联合OHT能够下调耐药细胞的乳酸水平，这提示联用黄芩素可以抑制耐药细胞的糖酵解水平；OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，细胞内HIF-1ɑ的表达上调，而25μM黄芩素单用或联合OHT能够下调耐药细胞内HIF-1ɑ的表达水平。OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，两种细胞内HIF-1ɑ调控的糖酵解相关蛋白GLUT-1、PDK-1、LDHA表达上调，而25μM黄芩素联合OHT能够下调两种耐药细胞内GLUT-1、PDK-1、LDHA的表达水平。
1.4.测试待筛药物联用参比药物对耐药细胞线粒体的影响
(1)线粒体形态
实验方法：耐药细胞MCF-7-TR经过OHT(1μM)处理48h，25μM待筛药物样品单用处理48h或25μM待筛药物样品联合OHT(1μM)处理48h的条件后进行透射电镜分析。药物处理后，消化离心收集细胞，PBS漂洗两遍，双醛(2％多聚甲醛+2.5％戊二醛)固定30min，PBS清洗3遍，用小的样品勺取出一点标本，置包埋板或小的离心管中，然后常规(不同浓度的乙醇)进行梯度脱水，浸透，包埋，送电镜室切片后置透射电镜下观察。
结果显示：耐药细胞MCF-7-TR的线粒体主要为圆形或椭圆形、脊结构(→表示)较少。其中，黄芩素单用后线粒体变细长、脊结构明显，呈现有功能的形态特点，黄芩素联合他莫昔芬使用后，线粒体变细长、脊结构更加明显。提示黄芩素能够增加耐药细胞线粒体的功能。
(2)线粒体数目
实验方法：耐药细胞MCF-7-TR经过OHT(1μM)处理48h，25μM待筛药物样品单用处理48h或25μM待筛药物样品联合OHT(1μM)处理48h，用线粒体DNA(mtDNA)含量检测、Mito-Tracker Red荧光染色以及线粒体分裂蛋白Drp-1的表达分析线粒的数目变化。
1)mtDNA含量检测：采用DNA提取试剂获得细胞总DNA，加入ND1、ND5及内参SLCO2B1、SERPINA1的引物，根据SYBR Green PCR core reagents试剂盒说明，通过CFXConnect实时荧光定量PCR仪进行聚合链反应扩增，记录Ct值，计算ΔCt值，ΔCt1＝CtSLCO2B1-CtND1，ΔCt2＝CtSERPINA1-CtND5，将ΔCt1和ΔCt2分别代入2ΔCt中，计算得到2ΔCt1和2ΔCt2，将两者求得到mtDNA的值，各组与control进行比较得到相对mtDNA水平。
2)Mito-Tracker Red荧光染色：细胞经过处理后，消化收集，用含有Mito-TrackerRed荧光染料(100nM)培养基于37℃孵育20min，PBS清洗3次，1mL PBS重悬后经流式细胞仪检测。
3)线粒体分裂蛋白Drp-1采用Western blot的方法进行检测(具体见1.2部分)。结果显示：OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，细胞内mtDNA含量未见明显变化，而黄芩素(25μM)单用或者联合OHT能够增加mtDNA的含量。Drp-1的表达水平可提示线粒分裂生成的多少。MCF-7-TR耐药细胞内DRP-1水平较低，OHT(1μM)作用后没有明显变化，而黄芩素(25μM)单用或者联合OHT能够增加DRP-1的表达。
(3)线粒体活性氧
实验方法：MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞经过OHT(1μM)处理48h，25μM待筛药物样品单用处理48h或25μM待筛药物样品联合OHT(1μM)处理48h，用DCFH-DA和Mito SOX荧光探针测量细胞内和线粒体的活性氧水平。药物处理后，PBS清洗1次，消化收集细胞。用含有DCFH-DA(10μM)探针或MitoSOX(5μM)探针的无血清培养基避光孵育细胞37℃，30min，随后离心收集细胞，PBS洗3次，1ml PBS重悬细胞，进行流式细胞仪分析。分别在FITC和PE通道记录1×104个细胞的荧光强度。
结果显示：OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，细胞内活性或线粒体内活性氧未见明显变化，而黄芩素(25μM)单用或者联合OHT能够增加线粒体或细胞内的活性氧。
(4)线粒体膜电位检测
MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞经过OHT(1μM)处理48h，待筛药物样品(25μM)单用或待筛药物样品(25μM)联合OHT(1μM)处理48h的条件下，采用TMRE试剂盒检测线粒体膜电位。TMRE是一种细胞渗透性，带正电荷的红橙色染料，由于其相对负电荷而容易聚积在活跃的线粒体中。具体步骤：六孔板接种细胞，给药后，用PBS轻轻洗1次，用不含血清培养基稀释TMRE至工作浓度(200nmol/L)，每孔加入TMRE各1ml。避光，于培养箱内(37℃)孵育25min。弃含染料的培养基，PBS清洗2次去除多余染料，胰酶消化细胞，PBS清洗2次，流式细胞仪检测，PE通道检测荧光强度。
结果显示：线粒体膜电位下降是细胞凋亡的一个早期事件。通过检测发现，OHT(1μM)作用于MCF-7-TR和T-47D-TR耐药细胞48h后，细胞内线粒体膜电位未见明显变化，而黄芩素(25μM)单用或者联合OHT能够下调线粒体膜电位的变化。
实施例2待筛药物对乳腺癌耐药细胞的增殖抑制作用
根据实施例1各步骤的实验结果，仅得到黄芩素能符合综合评价的预期，所述综合评价的原则为待筛药物需要同时达成以下三项测试结果：(1)显著增加参比药物诱导耐药乳腺癌细胞株出现早期凋亡；(2)能够下调耐药细胞的乳酸水平以及GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的表达水平；(3)能够至少表现出增加细胞线粒体功能，增加线粒体数目，增加线粒体/细胞内活性氧，下调线粒体膜电位变化中两种以上效果。本实验旨在进一步测试待筛药物对于参比药物抑制耐药细胞的增殖的影响效果，以期证实通过筛选方法得到的药物黄芩素在耐药乳腺癌防治中具有实际应用价值。
实验方法如下：实施例1已经分析了MCF-7-TR及T-47D-TR对他莫昔芬的抗性。在此基础上，在OHT(1μM)处理48h，6.25、12.5以及25μM待筛药物联合OHT(1μM)处理48h的条件下，进行台盼蓝拒染实验、MTT实验及软琼脂糖克隆形成实验。
实验方法：
(1)台盼蓝拒染实验
台盼蓝溶液：称取台盼蓝粉末0.2g溶于5mL双蒸水中，0.22μm滤膜一次性滤器过滤除菌，4℃保存。使用前用PBS稀释至0.4％。取各组对数生长期细胞，以1×105个/孔接种于12孔板中，每组设4个复孔，分别培养24h、48h、72h。每隔24h胰酶消化收集细胞，制备单细胞悬液。PBS稀释台盼蓝染液至0.4％，与细胞悬液等体积混合，台盼蓝的终浓度为0.2％，静置30s，将混合液打匀后，加入计数板，倒置显微镜下观察未着色细胞(活细胞)。接种时即为0h，以细胞数为纵坐标，时间为横坐标绘制细胞生长曲线。
(2)MTT实验
将细胞接种至96孔板中(2000个细胞/孔)，过夜细胞贴壁后，用不同浓度的药物分别处理24h，48h或72h。然后每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，放入37℃培养箱继续孵育4小时，除去孔中旧培养基，并加入DMSO(100μL/孔)在水平摇床上充分混匀。使用酶标仪在570nm下检测OD值。结果以细胞活力表示，并使用下式计算：细胞活力(％)＝(药物处理组OD/正常对照组OD值)×100。通过细胞活力分析OHT单用和OHT联用待筛药物的IC50，计算逆转倍数：IC50(OHT)/IC50(OHT+待筛药物)，判断待筛药物逆转OHT耐药的作用。
(3)软琼脂糖克隆形成实验
配制1.2％琼脂糖，65℃水浴溶解，40℃水浴保存备用；将等体积琼脂糖溶液与等体积含有2×DMEM/F12，20％胎牛血清，使之成为含有0.6％琼脂糖、1×DMEM/F12、10％胎牛血清的混合液，0.22μm过滤器过滤除菌后，40℃保存。0.6％的混合液按1mL/孔铺于6孔培养板中，制备下层胶，置室温凝固备用。取对数生长期的细胞，胰酶消化制备单细胞悬液并计数，与0.6％琼脂糖溶液等体积混合制备成5×103/mL单细胞含0.3％琼脂糖的混合悬液；按1mL/孔将其接种于已经凝固的底层胶上；室温孵育60min，然后置于CO2恒温培养箱中培养；1×DMEM/F12完全含药培养基0.5mL间隔4天补充一次，倒置显微镜下观察细胞克隆形成情况，共培养21天；取出六孔板，500μL/孔0.005％结晶紫染色3min，双蒸水清洗10遍，采用Bio-Rad自动凝胶成像系统拍照，计数细胞集落形成数，细胞集落形成率＝(细胞集落形成数/接种细胞数)×100％。
结果显示：MCF-7-TR和T-47D-TR两种细胞系均表现出对OHT的耐药性，耐药指数分别为3.77和2.67(图1A)。而黄芩素能够呈现浓度依赖性增加OHT对两种细胞的生长抑制作用(图1B)。同时分别检测OHT单用和OHT联用黄芩素(25μM)后细胞活力抑制的IC50，在MCF-7-TR细胞中，OHT单用IC50为12.1±0.3μM，OHT联用黄芩素IC50为5.2±0.3μM，耐药逆转倍数为2.32±0.23；在T-47D-TR细胞中，OHT单用IC50为8.6±0.9μM，OHT联用黄芩素IC50为4.2±0.3μM，耐药逆转倍数为2.08±0.11；逆转耐药倍数均＞2，逆转耐药效果良好(图1C)。此外，25μM黄芩素能够显著增加他莫昔芬对两种耐药细胞的细胞活力及克隆形成的抑制作用(图1D)。其他在实施例1中未通过综合评价的9种黄酮类化合物均未显著增加他莫昔芬对两种耐药细胞的细胞活力及克隆形成的抑制作用。该实验结果证明，实施例1所用筛选方法得到的药物能够有效的对已知乳腺癌药物增敏(参见下表1)。
表1待筛药物项目测试结果以及对乳腺癌耐药细胞的增殖抑制作用
Figure BDA0002425739470000171
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种药物筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选择耐药乳腺癌细胞株以及确认细胞株对于抗乳腺癌药物的抗性，并选择参比药物：采用MTT法测定耐药乳腺癌细胞株对抗乳腺癌药物的耐药倍数N，抗性达到N大于等于2的作为参比药物；
(2)检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果；
(3)检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响；
(4)测试待筛药物联用参比药物对耐药细胞线粒体的影响；
(5)根据步骤(2)-(4)的测试结果，筛选得到药物，所述药物在所述步骤(2)-(4)对应的三项测试中均表现出对参比药物的增敏效果；具体的，所述药物在步骤(2)的测试中，能够显著增加参比药物诱导耐药乳腺癌细胞株出现早期凋亡，所述药物在步骤(3)的测试中，能够下调耐药细胞的乳酸水平以及GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的表达水平，所述药物在步骤(4)的测试中，能够至少表现出增加细胞线粒体功能，增加线粒体数目，增加线粒体/细胞内活性氧，下调线粒体膜电位变化中两种以上效果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)选择耐药乳腺癌细胞株以及确认细胞株对于抗乳腺癌药物的抗性，并选择参比药物：采用抗癌药物诱导乳腺癌细胞株，构建耐药乳腺癌细胞或者采用市售耐药乳腺癌细胞株；采用MTT法测定耐药乳腺癌细胞株对抗乳腺癌药物的耐药倍数N，并通过琼脂糖克隆形成实验确认抗癌药物的抗性，抗性达到N大于等于2的作为参比药物；
(2)检测待筛药物对参比药物抑制细胞凋亡的影响效果：分别采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合处理耐药乳腺癌细胞，再用细胞凋亡检测试剂盒结合流式细胞仪进行细胞凋亡分析；
(3)检测待筛药物对耐药细胞糖酵解水平的影响：采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合处理耐药乳腺癌细胞；采用乳酸测定试剂盒，通过多功能酶标仪在530nm处检测吸光度，从细胞内乳酸含量的变化分析糖酵解水平；采用Western blot的方法，检测HIF-1ɑ及其下游糖酵解关键分子GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白水平的变化；
(4)测试待筛药物联用参比药物对耐药细胞线粒体的影响：采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，进行透射电镜分析；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，采用线粒体DNA(mtDNA)含量检测、Mito-Tracker Red荧光染色以及线粒体分裂蛋白Drp-1的表达等一种或两种以上手段分析线粒的数目变化；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，用DCFH-DA和Mito SOX荧光探针测量细胞内和线粒体的活性氧水平；采用参比药物，待筛药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，采用TMRE试剂盒检测线粒体膜电位；
(5)根据步骤(2)-(4)的测试结果，筛选得到药物，所述药物在所述步骤对应的三项测试中均表现出对参比药物的增敏效果；具体的，所述药物在步骤(2)的测试中，能够显著增加参比药物诱导耐药乳腺癌细胞株出现早期凋亡，所述药物在步骤(3)的测试中，能够下调耐药细胞的乳酸水平以及GLUT-1、PDK-1、LDHA等蛋白的表达水平，所述药物在步骤(4)的测试中，能够至少表现出增加细胞线粒体功能，增加线粒体数目，增加线粒体/细胞内活性氧，下调线粒体膜电位变化中两种以上效果。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述筛选方法还可以进一步包括如下强化验证步骤：采用参比药物，参比药物与待筛药物的组合分别处理耐药乳腺癌细胞，然后进行台盼蓝拒染实验、MTT实验及软琼脂糖克隆形成实验，进一步确证待筛药物的增效效果。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，所述药物筛选方法可以获得适用于耐药性乳腺癌患者治疗以及对已有乳腺癌治疗药物增敏的药物；优选的，所述待筛药物可选自商用天然产物库或任意已知具有抗肿瘤活性的天然产物；优选的，待筛药物选自黄酮类天然抗肿瘤产物。
5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述耐药乳腺癌细胞选自MCF-7-TR和T47D-TR；所述抗癌药物选自他莫昔芬、氟维司群。
6.黄芩素在制备用于治疗耐药性乳腺癌的药物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，所述黄芩素可以作为耐药细胞增敏制剂。
8.根据权利要求6或7所述的用途，所述耐药性乳腺癌是指对他莫昔芬、氟维司群具有耐药性或对这两者交叉耐药的乳腺癌。
9.一种药物组合物，包括黄芩素和他莫昔芬作为活性成分，所述药物组合物中，黄芩素与他莫昔芬的摩尔比为100:1-1:100，优选的，黄芩素与他莫昔芬的摩尔比为25:1。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述乳腺癌进一步选自具有耐药性的乳腺癌，优选的，所述耐药性乳腺癌是指对他莫昔芬、氟维司群具有耐药性或对这两者交叉耐药的乳腺癌。
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