CN110101697A - 小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达的药物中的应用，通过体外机制研究显示，BBR可以调控细胞周期相关蛋白p16，CDK4及CyclinD1的表达，促进细胞周期G1‑S期转换，使进入S期细胞数量增多，进而改善自然衰老细胞系2BS及WI38的复制性衰老状态。还可以抑制蛋白p16表达，对阿霉素引起的早衰或者化疗药引起的副作用起到保护作用，减缓衰老或能够减轻损伤；对小檗碱在开发减轻化疗引起的副作用的药物组合物及延长生物寿命药物研发中有一定的指导作用。

Description

小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表 达的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物领域，特别涉及小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达的药物中的应用。

背景技术

衰老是随着年龄增长机体组织器官功能退化的过程，与正常胚胎发育、机体老化、衰老相关疾病等都有着密切的联系。近些年对细胞衰老的研究越来越深入，其在抗衰老方面发挥的生物学作用也越来越受到重视。研究表明细胞衰老(cellular senescence)是指随着时间的推移或面临外界应激压力时，细胞的正常生理功能和增殖能力就会逐渐发生衰退，从而脱离细胞周期，该过程与肿瘤、组织再生及机体衰老等都具有重要的联系。细胞衰老需要借助信号通路转导，其中最主要的两条信号通路是P16Ink4a/Rb(retinoblastomaprotein)途径和P19Arf/P53/P21Cip1途径，这两条途径相互作用但又相互独立地调控细胞周期的进程。

小檗碱(Berberine,BBR)又名黄连素在中国拥有悠久的药用历史，可从黄连和黄柏中提取出的一种异喹啉类生物碱，具有多种药理作用，包括抗病原微生物、抗炎、抗肿瘤、心脏保护、降血脂、调节脂质代谢以及免疫抑制等。

发明内容

为了细胞分裂次数，延长细胞的寿命，改善老年的人胚肺成纤维细胞的衰老状态，本发明提供了小檗碱的应用。

本发明的第一方面，提供了小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达的药物中的应用。

申请人发现，小檗碱在低浓度能够缓解细胞复制性衰老、在低浓度能够改善细胞复制性衰老形态特征、在低浓度能够增加分裂期细胞数量、在低浓度能够上调细胞周期相关蛋白表达，申请人发现，小檗碱的浓度为0.3125μg/ml，即可实现以上功能。

本发明的第二方面，提供了小檗碱在制备阿霉素引起的生物衰老药物中的应用。

本发明的第三方面，提供了本发明提供了联合用药物组合物，包括小檗碱和阿霉素，可有效降低阿霉素的毒副作用，延缓阿霉素引起的生物衰老。

本发明的第四方面，提供了小檗碱在制备提高运动能力药物中的应用。

有益效果：本发明提供的小檗碱能显著改善早衰小鼠与自然衰老小鼠的衰老状态并延长其寿命，通过体外机制研究显示，BBR可以调控细胞周期相关蛋白p16，CDK4及CyclinD1的表达，促进细胞周期G1-S期转换，使进入S期细胞数量增多，进而改善自然衰老细胞系2BS及WI38的复制性衰老状态。还可以抑制蛋白p16表达，对阿霉素引起的早衰或者化疗药引起的副作用起到保护作用，减缓衰老或能够减轻损伤；对小檗碱在开发减轻化疗引起的副作用的药物组合物及延长生物寿命药物研发中有一定的指导作用。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1显示BBR能够延长芽殖酵母寿命:其中，(A)芽殖酵母寿命图。(B)芽殖酵母分裂周期图。右上角为酵母平均寿命。

图2显示低浓度BBR可以缓解2BS(PD45)和WI38(PD45)细胞的复制性衰老；其中，(A)BBR对老年2BS(左)和WI38(右)细胞活力分析。(B)低浓度BBR对处于PD45的2BS(左)和WI38(右)细胞增殖的影响。给药浓度单位：μg/ml(C)0.3125μg/ml BBR对处于PD45的2BS(左)和WI38(右)细胞分裂代数的影响。Mean±SEM.n＝5-8.*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图3显示低浓度BBR可以改善老年2BS的细胞衰老形态；其中，(A)年轻(PD30)与老年(PD55)2BS细胞形态对比(放大倍数×400)。(B)年轻(PD30)与老年(PD55)2BS细胞衰老相关蛋白p16表达变化。(C)细胞衰老SA-β-gal染色(放大倍数×400)。(D)细胞衰老SA-β-gal染色定量。(E)给药后细胞衰老相关蛋白p16表达变化。Mean±SEM.n＝3.*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.PD30组vs PD55组。#p<0.05,##p<0.01，###p<0.001.对照组vs给药组。

图4显示低浓度BBR能够增加S期细胞数量；其中，(A)WI38-PD45细胞周期检测。(B)2BS-PD45细胞周期检测。(C)各周期细胞比例统计。Mean±SEM.n＝5-8.*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.WI38对照组vs给药组。#p<0.05,##p<0.01，###p<0.001.2BS对照组vs给药组。

图5显示低浓度BBR能够影响细胞周期相关蛋白水平；其中，(A)细胞周期相关蛋白的表达。(B)细胞周期相关蛋白的定量结果，n＝3。Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01，对照组vs给药组。

图6显示Doxorubicin可诱导体外早衰；其中，(A)Doxorubicin诱导时间不同造成细胞不同程度早衰。(B)Doxorubicin诱导时间不同造成衰老相关蛋白表达不同。(C)衰老相关蛋白定量分析。n＝3。Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01，对照组vs给药组。

图7显示BBR能够预防Doxorubicin造成的细胞早衰；(A)BBR预防给药与治疗给药改善细胞早衰SA-β-gal染色(放大倍数×400)。(B)细胞衰老SA-β-gal染色定量。(C)细胞衰老相关蛋白的定量结果，n＝3。Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.01，对照组vs模型组。#p<0.05,##p<0.01，###p<0.001，预防组vs治疗组。

图8显示Doxorubicin诱导C57小鼠早衰；其中，(A)Doxorubicin构建早衰模型流程图。(B)生存曲线。(C)运动能力评估。(D)体重变化。(E)肝肾重量指数。(F)肝肾生化指标，n＝6。AST(U/L),ALT(U/L),BUN(mg/dl),creatinine(μM).Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对照组vs模型组。

图9显示BBR能够预防Doxorubicin造成的早衰损伤；(A)BBR预防给药流程图。(B)预防给药生存曲线。(C)预防给药运动能力评估。(D)预防给药体重变化。(E)BBR治疗给药流程图。(F)治疗给药生存曲线。(G)预防组与治疗组肝肾生化指标。Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，模型组vs预防给药组。

图10显示BBR可以延长自然衰老小鼠寿命；其中，(A)18月龄小鼠给药流程图。(B)18月龄小鼠生存曲线。(C)体重变化。(D)运动能力评估。(E)毛发密度改变。(F)22月龄小鼠给药期间生存曲线。(G)22月龄小鼠生存曲线。Mean±SEM。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，对照组vs给药组。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

C57BL/6J小鼠，雄性，8周，20～22g，购买于北京大学医学部实验动物中心。

维持饲料：购买于北京大学医学部实验动物中心。

C57BL/6J小鼠，雄性，13月，25～28g，购买于北京斯贝福实验动物中心。

维持饲料：购买于北京大学医学部实验动物中心。

C57BL/6J小鼠，雄性，20月，25～28g，购买于北京斯贝福实验动物中心。

维持饲料：购买于北京大学医学部实验动物中心。

所有动物实验都严格按照《实验动物管理和使用指南》的要求，并取得北大实验动物管理委员会的许可。在处死动物的过程中，在麻醉的状态下并尽量减轻动物的痛苦。

NRK-52E细胞(大鼠近曲小管上皮细胞系)购买于上海生物科学研究所细胞资源中心。

2BS细胞(人二倍体成纤维细胞)，WI-38细胞(人胚胎肺成纤维细胞)购买于中国食品药品检定研究院。

小檗碱由成都德思特生物研究所提供(NO.DX0009)。小檗碱是一种棕黄色粉末，水溶性较差，加热可促溶，平均分子量约为336.36g/mol。在本发明中，小鼠给药时将小檗碱溶于生理盐水，细胞实验中小檗碱溶解于细胞完全培养基。

实施例1小檗碱抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达

一、实验方法

1、芽殖酵母培养微流实验

在衰老领域，高等动物或者灵长类恒河猴是研究人类衰老的最理想的替代模型，但由于实验的复杂性、周期长、成本高以及伦理方面的诸多原因使得对于它们的研究存在诸多挑战。但对于低等短寿命模式生物而言，它们大多系统相对简单、成本低、研究时间短，是研究衰老机制的理想模型。因此从实际问题出发，恰当地选择衰老相关模式生物，充分发挥模式生物的优势对于进一步完善衰老及其机制的研究极其重要。Saccharomycescerevisiae是人类衰老研究中最简单的单细胞真核生物，其细胞的衰老代谢机制与人体细胞代谢机制相似，其简单而独特的生长代谢规律使其成为细胞衰老研究的重要模式生物。芽殖酵母的培养基分液体培养基SD及固体培养基YEPD，其均含有酵母生长所需的氨基酸及葡萄糖。因为酵母在YEPD上存活时间远长与SD，于是我们选用YEPD用于酵母的培养及菌种保存，选用SD进行微流实验，有利于缩短实验周期。

我们先从YEPD培养基上挑取少量单克隆菌落放入SD培养基，于30℃摇床中震荡培养20h，然后将生长至一定数量的酵母通入微流芯片。根据所设的BBR浓度梯度0，5,30,80μg/ml一共选取四个芯片通道，使用显微拍照设备，每隔10min对芯片内部酵母分裂情况进行一次拍摄，一共跟踪拍摄48～60h，监测并记录酵母在整个生命周期的分裂次数，以此来反映酵母的寿命是否得到延长。

2、细胞复苏与冻存

从液氮中取出冻存的2BS细胞，立即放入37℃水浴锅中晃动，使之迅速融化。在超净工作台上将2BS细胞转移至离心管(含5mL完全培养基)，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物，再加入1mL完全培养基。轻柔吹打至细胞分散呈单个后，移入新的无菌培养皿中并放置在37℃5％CO₂培养箱中进行培养。

消化得到的细胞液转移至离心管，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物加入1mL细胞冻存液(90％完全培养基+10％DMSO)。轻柔吹打细胞，转移至1.5mL冻存管中，先放置于4℃冰箱静置30min，再放置于-20℃冰箱静置2h，再于-80℃冰箱隔夜静置，最后隔日冻存于液氮罐中。

3、细胞培养与传代

离体实验采用的细胞使用含有10％胎牛血清、100 U/ml penicillin和100mg/mlstreptomycin的DMEM(2BS及WI38用MEM)培养液，置于CO₂细胞培养箱中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO₂，95％空气。

当细胞长至80％-90％时，倒掉培养基，用PBS缓冲液缓慢冲洗3遍，然后加入1mL0.125％胰蛋白酶，轻轻摇晃至完全覆盖细胞，消化2min左右，在显微镜下观察细胞突起的触角回缩呈圆形后，马上倒掉胰酶，加入1mL完全培养基终止消化。用吸管轻柔的反复吹打细胞直至全部脱落，转移至离心管，封口膜封口后置于离心机内800rpm离心4min，弃上清留取沉淀物加入1mL完全培养基。轻柔吹打至细胞分散呈单个后，以1:2比例传代至新的无菌培养皿中并放置在37℃5％CO₂培养箱中进行培养。

4、细胞计数

取待计数细胞，在超净台中冲洗、消化后，加入适量细胞完全培养基，重悬细胞并吹打均匀，用10/20μL移液器吸取10μL细胞悬液，轻轻滴到细胞计数板盖玻片一侧的边缘，使盖玻片和计数板之间充满细胞悬液，放置3分钟(注意盖玻片下不要有气泡，以免影响计数准确度)，于光学显微镜下用细胞计数器进行计数，再根据相应公式进行计算得到最终细胞总数(计算公式：细胞总数/mL＝四个大格细胞总数/4×10⁴个/mL)

5、细胞活力测定

Cell Counting Kit-8是一种基于WST-8的细胞活力检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan，96孔板每孔加入10％CCK8试剂后，37℃孵育1h，酶标仪450nm测定吸光度。每组设5复孔，细胞活力通过下列公式计算：

Cell viability(％)＝(OD_{treatment group}-OD_blank)/(OD_{control group}-OD_blank)×100

6、细胞增殖检测

取对数生长期的细胞用胰酶消化，以每孔3.5×10³个/100μl的密度接种于96孔板，每组设5个复孔，从左到右按时间点顺序(第0,1,2,3,4,5,6天)排列，每个时间点下分为对照组与给药组。96孔板的边缘孔用无菌PBS充填防止边缘效应。置于CO₂细胞培养箱中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO₂，95％空气。接种后四小时以上待细胞贴壁，吸除第0天组细胞培养液，每孔加入10％CCK8试剂后，37℃孵育1h，酶标仪490nm测定吸光度。其余分别进行换液，以后每天同一时间测对应时间点的细胞吸光度，直至监测一周，最后根据吸光度值绘制一周细胞增殖曲线。

7、早衰细胞模型

化疗药作为细胞毒药物，具有杀伤肿瘤细胞的作用，但化疗药也存在一定的脱靶毒性，即也会对正常组织细胞产生一定的损伤，导致正常机体组织或细胞产生类似早衰样特征。于是我们采用0.1μM阿霉素作用于NRK-52E细胞(大鼠近曲小管上皮细胞系)，体外处理4h，置于CO₂细胞培养箱中，培养条件为37℃，饱和湿度，5％CO₂，95％空气。最后通过衰老标志物SA-β-gal染色分析，探究构建体外早衰模型是否成功。

8、衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-βgal)染色(SABG染色法)

1995年，Dimri等第一次用衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-βgal)来鉴定组织衰老，此后这一方法被广泛使用，比较著名的是2009年Wang等用肝中SA-βgal和DNA损伤的精细对比量，得到可比较的数据资料：年轻老鼠中衰老细胞8％，年老老鼠中衰老细胞17％。此方法原理是基于SA-β-gal在衰老细胞中的特异性高活性表达，而染色剂中的X-Gal被SA-βgal催化生成显微镜下可见的蓝色产物，从而染色衰老细胞，而不会染色衰老前的细胞、静止期细胞、永生细胞或肿瘤细胞。

染色工作液按“细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒”说明书方法配置，再放于摇床上震荡30min，取出后经0.22μm微孔滤膜过滤，该法可有效改善染色液析晶对于照片处理的干扰。染色液工作液应注意避光，现用现配。

操作方法：培养皿中培养液吸除，PBS轻轻冲洗3遍，每遍5min，再加入定量β-半乳糖苷酶染色固定液(六孔板对应加入1mL，96孔板对应加入100μL)，室温固定15min，吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次5min。吸除PBS，每孔加入能够完全覆盖培养皿底部的定量染色工作液(六孔板对应加入1mL，96孔板对应加入100μL)。37℃恒温培养箱(空气)中孵育过夜，用封口膜封住六孔板防止蒸发，再用锡纸包住六孔板遮光。

隔日弃除染色液，加入能够完全覆盖培养皿底部的定量核固红染色液复染(核固红复染使得细胞轮廓更加清晰)，静置7min。弃除染色液，加入PBS，显微镜下观察，100倍拍照记录，染上蓝色的阳性细胞即为衰老细胞。

按下列公式计算衰老比例(蓝染率)：

衰老比例＝照片中蓝色细胞个数/照片中细胞总数×100％

9、细胞周期检测

参照Dong等构建衰老模型时对衰老细胞的鉴定，本文采用碘化丙啶(PI)染色法检测细胞周期分布。PI和双链DNA结合产生荧光，荧光强度与双链DNA含量成正比，PI染色后，用流式细胞仪对细胞进行DNA含量测定根据DNA含量分布情况，分析细胞周期。若假设G0/G1期荧光强度＝1，则G2/M期理论值＝2，而正在进行DNA复制的S期＝1～2，从而区分细胞处于的不同细胞周期。

染色工作液按“细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒”说明书方法配置，注意避光，现用现配。

操作方法：各分组细胞消化得到的细胞悬液800rpm离心min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50μL左右的培养液，以免吸走细胞。加入约1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞，并转移到1.5Ml离心管中，再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，可以残留约50μL左右的PBS，以避免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。滴加至1mL冰浴预冷的70％乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定12-24小时。

1000rpm离心4min，沉淀细胞。小心吸除上清，残留约50μL左右的70％乙醇，以避免吸走细胞。加入约1mL冰浴预冷的PBS，重悬细胞。再次离心沉淀细胞，小心吸除上清，残留约50μL左右的PBS，以免吸走细胞。轻轻弹击离心管底以适当分散细胞，避免细胞成团。

每管细胞样品中加入0.5mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min。随后可以于4℃避光存放，尽快完成流式检测。通过Modfit软件分析结果，得到样品的细胞周期分布比例(G0/G1期，G2/M期，S期)。

10、组织或细胞蛋白提取

取约100mg组织，用剪刀尽量小心剪切成细小的组织碎片。加入1ml临用前添加了PMSF的膜蛋白抽提试剂A，轻轻悬浮组织碎片，冰浴放置10-15min。细胞培养完毕后，用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有EDTA但不含胰酶的细胞消化液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。离心收集细胞，吸除上清，留下细胞沉淀备用。把细胞悬液或组织样品转移到一适当大小的冰浴预冷玻璃匀浆器中，匀浆约30～50下。4℃，700g离心10min，小心收集上清液至一新的离心管中。4℃，14000g离心30min，以沉淀细胞膜碎片。吸取上清即为细胞浆蛋白，可-80℃保存备用。4℃，14000g离心10s，尽最大努力吸尽上清。加入膜蛋白抽提试剂B 200μl，最高速剧烈Vortex5秒重悬沉淀，冰浴5～10min。重复前述步骤的vortex和冰浴孵育1～2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4℃，14000g离心5min，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。-80℃保存备用。

11、Western blot分析

蛋白质的提取。①组织蛋白提取：将小鼠肾放入离心管投入液氮中，全部取材结束后，放入-80℃保存。蛋白提取前，将离心管置于冰水混合液中使组织复温，按100mg/ml加入RIPA裂解液(含cocktail蛋白酶抑制剂，RIPA:cocktail＝24:1。磷酸酶抑制剂，1％)，在冰浴中用机械匀浆器匀浆，然后超声10s。冰浴静置30min，4℃离心，12000g，20min。②细胞蛋白提取：用6cm培养皿培养细胞，用于细胞蛋白提取。吸干培养液，加3ml4℃预冷的PBS(0.01M，pH7.4)，轻轻摇动洗涤细胞3次。加入100μl裂解液(含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂)，用干净预冷的细胞刮将细胞刮于培养皿一侧，细胞悬液移至离心管，超声10s。4℃离心，12000g，20min，取上清液备用测定蛋白浓度。

蛋白质的含量测定(BCA法)。①配制标准溶液：用微量移液器像一管蛋白标准(20mg BSA)内加入0.8mL蛋白标准配制液，并充分吹打使其溶解，此即浓度为25mg/mL的蛋白标准液，可以立即使用，也可放置于-20℃冰箱中长期保存。②稀释标准溶液：取5μL上述标准液加入到500μL EP管中，继续加入245μL预冷的PBS稀释为终浓度为0.5mg/ml的蛋白标准品。③加样：用合适的微量移液器将0.5mg/ml的蛋白标准品按照0,5,10,15,20μL的顺序依次加入到96孔板内，后用预冷的PBS补足至20μL/孔(每孔加样时可先加较多的液体，以免造成样品丢失，引起误差)。再分别取上述提取的待测浓度的细胞蛋白样4μL、PBS16μL加入到样品孔内(待测蛋白样品稀释比例为1:5)。④制备工作液：按照标准孔和待测样品孔的数量，取适量BCA试剂A和试剂B(配比为50:1)加入到5-10mL试管中，充分吹打混匀，配制成BCA工作液(可室温下稳定放置24h)⑤测定吸光度并绘制标准曲线：用200μL微量移液器向第③步各标准孔和样品孔内加入200μLBCA工作液，可观察此时各孔的颜色，将96孔板放入37℃恒温孵箱内孵育18-20分钟，之后取出放于酶标仪上，测定波长为562nm时各孔的吸光度值。将所测数值用excel软件绘制出标准曲线，再根据标准曲线得出蛋白浓度与吸光度值之间的公式，最后通过样品蛋白吸光度值计算得出最终蛋白浓度(注意按稀释比例进行转换)。⑥蛋白样品变性：提前打开水浴锅并将温度设定为100℃，蛋白样品中加入蛋白上样缓冲液loading buffer(含β-巯基乙醇，1％)，充分混匀并沸水加热10min，冰浴10min，4℃冷却后-80℃分装保存。

SDS-PAGE凝胶电泳。制备聚丙烯酰胺凝胶，将凝胶板固定于电泳装置，同时加入1×SDS电泳缓冲液。加入待测样品(蛋白含量20～30μg/孔)及蛋白质分子量标准样品。70V电泳使蛋白跑至分离胶，蛋白压成一条直线，然后改为110V至电泳结束。取下凝胶，去除积层胶，置于转膜液中以备蛋白质检测。

免疫印迹。按照阴极-Scotch-Brite垫-滤纸-凝胶-PVDF膜(预先用甲醇浸泡15s极化，在转膜缓冲液中平衡15min)-滤纸-Scotch-Brite垫-阳极的顺序组装转印夹层。将转印夹层放入转移槽，加入转膜缓冲液，按正确的电极方向将转移槽放入电转仪中。在4℃层析柜中50mA恒流转膜过夜。将PVDF膜放入封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST)室温孵育2h。将PVDF膜放入含1％BSA的TBST稀释的一抗中，4℃过夜。TBST洗膜10min×3。将PVDF膜放入用1％BSA的TBST稀释的HRP偶联的二抗中，室温孵育1h。TBST洗膜10min×3。加入ECL PLUS发光液(A液：B液＝40:1)，0.125ml/cm²，室温孵育5min。暗室内PVDF膜对X感光胶片曝光，显影及定影。用扫描仪进行图像扫描，Bio-Rad的生物图像处理系统(Quantity One4.4.0)进行灰度测定。实验在相同条件下重复三次。

二、实验结果

1、BBR能够延长芽殖酵母寿命并改善衰老引起的分裂周期紊乱

我们首先选取经典衰老模式生物芽殖酵母作为研究对象，采用微流技术，检测了不同浓度BBR作用下芽殖酵母的寿命。结果如图1A所示，与对照组相比，给药组芽殖酵母寿命均有一定程度改变，且在BBR浓度为20μg/ml时，可以延长～28％芽殖酵母的寿命。接着我们又检测了芽殖酵母得分裂周期。结果如图1B所示，对照组芽殖酵母在分裂后期，分裂周期间隔时间长且异质性大，提示分裂减慢伴周期紊乱，是芽殖酵母衰老的表现之一。而给药组(BBR20μg/ml)在分裂后期，分裂周期间隔时间短且异质性小，说明BBR在一定程度上改善了芽殖酵母的复制性衰老表现。

2、BBR在低浓度能够缓解细胞复制性衰老

BBR的抗衰老作用在模式生物芽殖酵母中得到初步验证后，接下来，我们采用两种自然衰老细胞系：2BS(人胚肺二倍体细胞)和WI38(人胚肺成纤维细胞)作为研究对象，进一步探究BBR在体外的抗衰老作用。我们首先通过细胞活力测定实验，检测BBR对老年(PD45)2BS及WI38细胞活力影响。结果如图2A所示，BBR在2.5μg/ml的范围内对2BS及WI38细胞无明显的细胞毒作用，且在相对较低的浓度0.3125μg/ml时细胞活力显著高于对照组。接着我们继续探究BBR在低浓度范围内对细胞增殖能力的影响，通过细胞活力测定实验跟踪检测并绘制一周增殖曲线，在490nm波长处吸光度值越大表明细胞增殖速率越高，而增殖速率减缓也是细胞衰老的重要表现之一。结果如图2B所示，0.3125μg/ml BBR能够显著促进细胞增殖，而对照组细胞随着时间增长，增殖速率减缓，且两组差异随时间增长逐渐增大。最后，我们通过细胞计数的方法，记录了0.3125μg/ml BBR对细胞分裂代数的影响并绘制一月分裂曲线。结果如图2B所示，0.3125μg/ml BBR能够使细胞分裂代数延长15～20PD。以上结果从细胞增殖数量与细胞分裂代数说明低浓度BBR对能够改善细胞的复制性衰老并延长分裂次数。

3、BBR在低浓度能够改善细胞复制性衰老形态特征

检测了衰老细胞的增殖分裂能力之后，我们继续采用2BS(人胚肺二倍体细胞)作为研究对象，进一步探究BBR在对衰老细胞形态的作用。图3Aa为年轻2BS(PD30)，细胞形态为成纤维细胞样，贴壁生长，排列整齐且方向一致。图3Ab为老年2BS(PD55)，细胞形态皱缩呈颗粒状，贴壁程度降低，排列凌乱。接着我们检测了年轻与衰老细胞中衰老相关标志蛋白的p16的表达。结果如图3B所示，在衰老细胞中p16表达显著升高，提示细胞进入细胞周期阻滞导致细胞衰老。接着我们又进行细胞衰老SA-β-gal染色分析观察细胞形态改变。结果如图3Ca-b所示，老年2BS(PD45)相比于年轻2BS(PD30)细胞β-半乳糖苷酶染色阳性更多，提示细胞衰老。而给予0.3125μg/ml BBR后衰老染色结果如图3Cc-d，相比于对照组，给药组成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色阳性比例显著下降，且存在统计学差异(图3D)。最后我们检测了给药之后细胞衰老相关蛋白p16的表达变化。结果如图3E所示，相比于对照组，给药组p16蛋白表达水平显著下调，且存在统计学差异。以上结果从衰老细胞染色与衰老相关蛋白表达变化提示BBR具有一定的抗衰老作用。

4、BBR在低浓度能够增加分裂期细胞数量

P16属于细胞周期依赖性激酶抑制剂，在调节细胞周期中发挥重要作用，主要是抑制G1期向S期转换，使细胞周期停止在G1期，进而抑制细胞分裂进程。基于以上实验结果，BBR在一定程度上影响了衰老细胞p16的表达，于是我们进一步探究低浓度范围内BBR对老年2BS和WI38细胞周期的影响。结果如图4A-B所示，我们采用细胞流式的方法分别检测了低浓度范围内BBR对老年2BS和WI38细胞周期的影响。经统计学分析发现，给予0.3125μg/mlBBR后，S期细胞数量比例显著高于对照组，提示BBR抑制了p16的表达后促进了细胞G1向S期的转换(图4C)。

5、BBR在低浓度能够上调细胞周期相关蛋白表达

基于细胞周期检测的结果，细胞由G1期向S期转换增加，于是我们利用westernblot实验检测了G1-S期细胞周期相关蛋白的表达。结果如图5A所示，我们发现给予0.3125μg/ml BBR后，细胞周期依赖性激酶抑制性蛋白p16表达下调，解除对CDK4的抑制作用，细胞周期蛋白CyclinD1及细胞周期依赖性激酶CDK4表达上调，二者结合形成CyclinD1-CDK4复合物使RB蛋白磷酸化，即pRB表达上调，进一步释放E2F1促进有关DNA复制的基因表达，推动细胞周期的G1期向S期转换。经统计学分析发现，0.3125μg/ml BBR相比于其他浓度作用下，相关蛋白表达的上调与下调均具有显著性差异(图5B)。于是我们认为0.3125μg/ml BBR。

实施例2

一、实验方法

1、Doxorubicin能够诱导细胞早衰

化疗药作为细胞毒药物，具有杀伤肿瘤细胞的作用，但化疗药也存在一定的脱靶毒性，即也会对正常组织细胞产生一定的损伤，导致正常机体组织产生早衰样表现。于是我们采用0.1μM阿霉素作用于NRK-52E细胞(大鼠近曲小管上皮细胞系)，通过衰老标志物SA-β-gal染色分析，探究构建体外早衰模型的作用时间。结果如图6A所示，染色发现阿霉素作用时间长短与早衰程度呈正相关，且当处理时间大于6h时，细胞损伤程度过大导致正常细胞结构改变丢失，于是我们选用处理时间4h构建体外细胞早衰模型。同时，我们通过Western blot分析了衰老相关蛋白p16的表达变化。结果如图6B所示，当作用时间大于4h时，p16表达明显增加，提示细胞衰老，但大于12h时有所下降，可能是因为细胞损伤过于严重导致细胞凋亡，也可见p53随作用时间增加表达增多，提示细胞凋亡，统计学分析也显示存在显著差异(图6C)。以上结果说明0.1μM阿霉素作用4h可以构建细胞早衰模型。

2、BBR能够预防Doxorubicin诱导的细胞早衰

按照以上方法利用Doxorubicin构建了体外细胞早衰模型。我们想进一步探究BBR对化疗药诱导的早衰是否有一定的保护或治疗作用，于是采用细胞衰老标志物SA-β-gal染色评估预防与治疗两种给药方式的抗衰老效果。预防给药结果如图7A所示，经0.3125μg/mlBBR预处理24h后再进行Doxorubicin诱导早衰的成纤维细胞β-半乳糖苷酶染色阳性比例显著下降，早衰模型细胞给予0.3125μg/ml BBR处理24h后β-半乳糖苷酶染色阳性比例也有一定程度下降，但作用效果不如预防给药。经统计学分析(图7B)，预防给药的保护作用优于模型给药的抗衰老作用。同时，我们通过Western blot分析了衰老相关蛋白p16的表达变化。如图7C所示，预防给药组的衰老相关蛋白p16表达显著低于模型给药组，提示BBR对化疗药诱导的早衰具有一定的保护作用，而模型给药组效果不佳可能是因为给药时间较短，BBR未能充分的发挥药效减轻损伤。

3、Doxorubicin诱导小鼠早衰模型

探究了BBR对体外早衰模型的保护作用，接着我们继续探究其对早衰动物模型的作用。如图8A所示，我们利用Doxorubicin进行10mg/kg腹腔注射给药两次，诱导8周龄健康C57小鼠早衰。给药期间记录小鼠生存状况，绘制生存曲线如图1B，模型组给予Doxorubicin相比于对照组给予生理盐水，存活时间显著缩短。同时分别在给药前与给药后，利用平衡转棒实验对小鼠运动能力进行行为学评估，小鼠在转棒上停留时间长短与运动能力成正比，进而可以从行为学角度反映小鼠的衰老程度。结果如图8C，对照组小鼠在给药前后运动能力无显著差异，模型组小鼠在给药前后运动能力显著下降，提示小鼠早衰。两周后记录小鼠体重(图7D)并取材，对肝肾组织进行称重记录(图7E)，模型组体重与肝肾指数均显著下降。最后检测了小鼠血清中AST、ALT、尿素氮和肌酐浓度等反应肝肾损伤的生化指标(图7F)，模型组各项生化指标均显著升高。以上结果表明Doxorubicin诱导小鼠早衰模型构建成功。

4、BBR能够预防Doxorubicin诱导的动物早衰

按照以上方法利用Doxorubicin构建了体内小鼠早衰模型，进一步探究BBR对化疗药诱导的小鼠早衰是否有一定的保护或治疗作用。如图9A所示，我们首先对8周龄C57健康小鼠灌胃给予50mg/kg BBR两周(对照组给予等体积生理盐水)，再腹腔注射给予10mg/kgDoxorubicin两次，探究BBR对化疗造成的早衰的保护作用。结果如图9B-C所示，给药期间分别进行了小鼠存活时间记录及运动能力评估，给药结束记录小鼠体重(图9D)，与对照组相比，预先给予BBR的小鼠寿命得到显著延长(～52％)，且运动能力与体重均未出现显著下降，提示BBR预给药对Doxorubicin造成的早衰损伤具有一定的保护作用。接着我们探究了BBR的治疗作用，如图9E所示，首先对8周龄C57健康小鼠腹腔注射给予10mg/kgDoxorubicin两次构建早衰模型，再灌胃给予50mg/kg BBR两周，记录小鼠存活时间。结果如图9F，模型给药组的小鼠寿命并与对照组相比并无显著差异。这些结果表明BBR对于Doxorubicin引起的早衰的治疗效果不佳。其可能原因为造模后给药时间较短，BBR未能充分的发挥药效减轻损伤。

5、BBR可以延长自然衰老小鼠寿命

最后我们采用分别采用18月龄与22月龄自然衰老小鼠作为对象，探究BBR对自然衰老小鼠的抗衰老作用。如图10A所示，对18月龄衰老小鼠分别灌胃给予生理盐水与50mg/kg BBR，持续给药4个月，给药期间记录小鼠存活时间与每周体重，每月评估运动能力，拍摄小鼠毛发密度改变，给药结束后监测小鼠至自然死亡。结果如图10B所示，相比于对照组，给药组小鼠寿命得到显著延长(～16.49％)，同时体重与对照组无明显差异(图10C)，提示BBR持续低剂量给药是相对安全的。此外，运动能力评估结果显示(图10D)对照组运动能力随小鼠衰老显著降低，而给药组运动能力只有轻微下降。有趣的是随着小鼠衰老程度的加深，给药组小鼠毛发逐渐稀疏并光泽度降低，而给药组小鼠未出现，毛发密度及光泽度变化(图10E)，我们猜测毛发密度及光泽度改变也可视为衰老的特征之一，而BBR具有的抗衰老作用也在一定程度上对小鼠的毛发产生了影响。最后，我们使用22月龄极度衰老的小鼠进行BBR给药三周，给药期间给药组相对于对照组小鼠寿命得到～12.5％的延长(图10F)，但相对于同批次小鼠总体存活率，BBR并未显著提高给药组存活率(图10G)，我们猜测由于22月龄小鼠衰老损伤程度较深且相对虚弱，BBR给药已无法逆转。以上结果说明针对自然衰老的小鼠，BBR给药可以延长早期衰老的小鼠的寿命，维持小鼠运动能力以及抑制毛发衰老，而对于后期衰老的小鼠，BBR给药无显著改善作用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.小檗碱在制备抑制细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p16表达的药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于：小檗碱的浓度为0.3125μg/ml。

3.小檗碱在制备阿霉素引起的生物衰老药物中的应用。

4.联合用药物组合物，其特征在于：包括小檗碱和阿霉素。

5.小檗碱在制备提高运动能力药物中的应用。