CN106866705B

CN106866705B - 化合物f083-0063及其抗肿瘤应用

Info

Publication number: CN106866705B
Application number: CN201710128766.1A
Authority: CN
Inventors: 司书毅; 张晶; 陈云雨; 王彦昶; 蒋建东; 朱宁屿; 李妍; 陈明华; 刘超
Original assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Current assignee: Institute of Medicinal Biotechnology of CAMS
Priority date: 2017-03-06
Filing date: 2017-03-06
Publication date: 2019-02-05
Anticipated expiration: 2037-03-06
Also published as: CN106866705A

Abstract

本发明涉及一种具备抗肿瘤活性的小分子化合物F083‑0063，其化学名为：3‑甲酰胺‑N‑(呋喃‑2‑基甲基)‑1‑硫酮‑5‑氧代‑8氯‑4,5‑双氢‑1H–噻唑并[3,4‑a]喹唑啉，该小分子化合物能够结合与Plk1的PBD活性中心，阻断Plk1的功能，从而调控肿瘤细胞的细胞周期，抑制肿瘤细胞迁移并促进肿瘤细胞凋亡。

Description

化合物F083-0063及其抗肿瘤应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体而言，涉及一种化合物F083-0063的抗肿瘤应用。

背景技术

保罗样激酶1(PLK1)作为细胞周期必要的调节因子，是公认的抗肿瘤药物靶点。PLKs最初作为有丝分裂必需的基因之一发现于果蝇中，是一类从酵母到人类都高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶[1-3]。人类的PLKs共包括五个成员[4]。这类激酶在N端有一个保守的酶活性区域(KD)外,在C端有一个高度保守的(叫做polo-box-PBD)的非催化活性区，主要调节蛋白和底物或调节因子之间的相互作用[5,6]。PLK1在调节细胞分裂的过程中(包括中心体功能、有丝分裂中染色体动态平衡、纺锤体功能和胞质分裂)发挥着多种必需和非必需的功能[3,6,7]。

大量的研究将PLKs与肿瘤从不同的方面联系在一起。PLK1在多种肿瘤细胞系中高表达，且和不良预后密切相关[8-10]。与健康组织相比，多种不同组织来源的肿瘤对低表达的PLK1更敏感，这在理论上打开了一个治疗契机。更有研究发现Ras转化和p53缺陷的细胞与PLK1的高活性密切相关[11-14]。基于上述原因，PLK1被公认为是一个很好的抗肿瘤药物靶点。而PLK2和3则在细胞周期检验点发挥作用并具有抗细胞增殖的功能，被认为属于肿瘤抑制因子[15-18]。

近些年来发现了很多PLK1的激酶活性抑制剂，有一些已经进入了临床研究阶段[19,20]。由于激酶结构域在激酶中高度保守，使得PLK1抑制剂的特异性不强，尤其对PLK家族其他成员[21]。BI2536及其衍生物Volasertib(BI6727)是目前最有前景的PLK1抑制剂[22,23]。Volasertib处于临床前第三阶段，已取得了不错的疗效，特别是对急需新药的急性髓细胞样白血病(AML)的治疗上[24]。2013年，FDA给与Volasertib“突破性治疗”的高度评价。这些发展都在此证明了PLK1作为抗肿瘤药物靶点的可行性。然而，毒性仍然是一个函待解决的难题[24]。同时BI2536和Volasertib对于PLK2、3还有其他激酶也具有抑制活性，IC₅₀值相当[22,23,25]。由于PLK2和3具有类似肿瘤抑制的功能，理想的药物还是只针对PLK1。

利用抑制PBD来干预PLK1的功能成为近年来的替代策略。PLK1有功能的PBD是细胞分裂必不可少的[26-28]。PLK1在中心体、着丝粒、胞质分裂中的中心纺锤体等发挥作用均需要通过PB才能与底物结合并[3，29,30]。不同于KD，PBD是PLK家族所特有的且不同成员之间的PBD在序列和结构上相较KD相似度更低。并且不同PLK成员倾向结合的磷酸肽基序不同[6，31,32]。因此，PBD是比KD更适合于筛选针对PLK1的抑制剂的靶点。除此之外，PLK1的功能有些更依赖于KD，有些更依赖于PBD。因此，抑制PBD和抑制KD导致对PLK1功能影响是不同的，这使得PBD抑制剂更有优势[33]。PBD抑制剂还能协同性的和KD抑制剂一起发挥作用。

基于此，采用PBD作用筛选PLK1抑制剂的靶点已越来越引起关注。Poloxin和其同系物thymoquinone(TQ)的发现第一次证明了这个策略的可行性，这两个化合物是利用体外的荧光偏振模型筛选得到的[34,35]。它们均能在体外低纳摩尔水平抑制PBD活性。但是，这两个化合物需要更高的浓度才能诱导凋亡和扰乱有丝分裂。PBD和TQ共结晶显示TQ是通过非共价结合于PBD的磷酸肽结合区域[36]。通过荧光标记的PBD与固定化的磷酸肽结合的体外检测筛选得到了另一个PBD抑制剂PPG[37]。此化合物也同样存在需要高浓度才能影响有丝分裂的问题。最具潜力的PBD化学抑制剂是磷酸肽或类肽分子。但是，此类抑制剂的细胞通透性成为其一大瓶颈[38,39]。

寻找新型的以Plk1PBD为靶点的抗肿瘤小分子抑制剂将对Plk1高表达的肿瘤治疗带来新的希望。

参考文献：

[1]Llamazares,S.et al.polo encodes a protein kinase homolog requiredfor mitosis in Drosophila.Genes Dev 5,2153–65(1991).

[2]Sunkel,C.E.&Glover,D.M.polo,a mitotic mutant of Drosophiladisplaying abnormal spindle poles.J Cell Sci 89(Pt 1),25–38(1988).

[3]Archambault,V.&Glover,D.M.Polo-like kinases:conservation anddivergence in their functions and regulation.Nat Rev Mol Cell Biol 10,265–75(2009).

[4]de Carcer,G.,Manning,G.&Malumbres,M.From Plk1to Plk5:functionalevolution of polo-like kinases.Cell Cycle 10,2255–62(2011).

[5]Elia,A.E.,Cantley,L.C.&Yaffe,M.B.Proteomic screen finds pSer/pThr-binding domain localizing Plk1to mitotic substrates.Science 299,1228–31(2003).

[6]Zitouni,S.,Nabais,C.,Jana,S.C.,Guerrero,A.&Bettencourt-Dias,M.Polo-like kinases:structural variations lead to multiple functions.Nat RevMol Cell Biol 15,433–52(2014).

[7]Petronczki,M.,Lenart,P.&Peters,J.M.Polo on the Rise-from MitoticEntry to Cytokinesis with Plk1.Dev Cell 14,646–59(2008).

[8]Strebhardt,K.&Ullrich,A.Targeting polo-like kinase 1for cancertherapy.Nat Rev Cancer 6,321–30(2006).

[9]Strebhardt,K.Multifaceted polo-like kinases:drug targets andantitargets for cancer therapy.Nat Rev Drug Discov 9,643–60(2010).

[10]Degenhardt,Y.&Lampkin,T.Targeting Polo-like kinase in cancertherapy.Clin Cancer Res 16,384–9(2010).

[11]Liu,X.,Lei,M.&Erikson,R.L.Normal cells,but not cancer cells,survive severe Plk1depletion.Mol Cell Biol 26,2093–108(2006).

[12]Schmit,T.L.,Zhong,W.,Setaluri,V.,Spiegelman,V.S.&Ahmad,N.Targeteddepletion of Polo-like kinase(Plk)1 through lentiviral shRNA or a small-molecule inhibitor causes mitotic catastrophe and induction of apoptosis inhuman melanoma cells.J Invest Dermatol 129,2843–53(2009).

[13]Luo,J.et al.A genome-wide RNAi screen identifies multiplesynthetic lethal interactions with the Ras oncogene.Cell 137,835–48(2009).

[14]Guan,R.et al.Small interfering RNA-mediated Polo-like kinase 1depletion preferentially reduces the survival of p53-defective,oncogenictransformed cells and inhibits tumor growth in animals.Cancer Res 65,2698–704(2005).

[15]Yang,Y.et al.Polo-like kinase 3 functions as a tumor suppressorand is a negative regulator of hypoxia-inducible factor-1 alpha under hypoxicconditions.Cancer Res 68,4077–85(2008).

[16]Smith,P.,Syed,N.&Crook,T.Epigenetic inactivation implies a tumorsuppressor function in hematologic malignancies for Pololike kinase 2 but notPolo-like kinase 3.Cell Cycle 5,1262–4(2006).

[17]Coley,H.M.et al.Polo Like Kinase 2 Tumour Suppressor and cancerbiomarker:new perspectives on drug sensitivity/resistance in ovariancancer.Oncotarget 3,78–83(2012).

[18]Helmke,C.,Becker,S.&Strebhardt,K.The role of Plk3 inoncogenesis.Oncogene 35,135–47(2015).

[19]Lee,K.S.,Burke,T.R.Jr.,Park,J.E.,Bang,J.K.&Lee,E.Recent Advancesand New Strategies in Targeting Plk1 for Anticancer Therapy.Trends PharmacolSci 36,858–77(2015).

[20]Liu,X.Targeting Polo-Like Kinases:A Promising TherapeuticApproach for Cancer Treatment.Transl Oncol 8,185–95(2015).

[21]McInnes,C.&Wyatt,M.D.PLK1 as an oncology target:current statusand future potential.Drug Discov Today 16,619–25(2011).

[22]Steegmaier,M.et al.BI 2536,a potent and selective inhibitor ofpolo-like kinase 1,inhibits tumor growth in vivo.Curr Biol 17,316–22(2007).

[23]Rudolph,D.et al.BI 6727,a Polo-like kinase inhibitor withimproved pharmacokinetic profile and broad antitumor activity.Clin Cancer Res15,3094–102(2009).

[24]Gjertsen,B.T.&Schoffski,P.Discovery and development of the Polo-like kinase inhibitor volasertib in cancer therapy.Leukemia 29,11–9(2015).

[25]Davis,M.I.et al.Comprehensive analysis of kinase inhibitorselectivity.Nat Biotechnol29,1046–51(2011).

[26]Seong,Y.S.et al.A spindle checkpoint arrest and a cytokinesisfailure by the dominant-negative polo-box domain of Plk1 in U-2 OS cells.JBiol Chem 277,32282–93(2002).

[27]Hanisch,A.,Wehner,A.,Nigg,E.A.&Sillje,H.H.Different Plk1functions show distinct dependencies on Polo-Box domainmediated targeting.MolBiol Cell 17,448–59(2006).

[28]Lera,R.F.&Burkard,M.E.High mitotic activity of Polo-like kinase 1is required for chromosome segregation and genomic integrity in humanepithelial cells.J Biol Chem 287,42812–25(2012).

[29]Lee,K.S.,Grenfell,T.Z.,Yarm,F.R.&Erikson,R.L.Mutation of thepolo-box disrupts localization and mitotic functions of the mammalian polokinase Plk.Proc Natl Acad Sci USA 95,9301–6(1998).

[30]Jang,Y.J.,Lin,C.Y.,Ma,S.&Erikson,R.L.Functional studies on therole of the C-terminal domain of mammalian polo-like kinase.Proc Natl AcadSci USA 99,1984–9(2002).

[31]Yun,S.M.et al.Structural and functional analyses of minimalphosphopeptides targeting the polo-box domain of polo-like kinase 1.NatStruct Mol Biol 16,876–82(2009).

[32]van de Weerdt,B.C.et al.Polo-box domains confer targetspecificity to the Polo-like kinase family.Biochim Biophys Acta 1783,1015–22(2008).

[33]Archambault,V.,Lepine,G.&Kachaner,D.Understanding the Polo Kinasemachine.Oncogene 34,4799–807(2015).

[34]Reindl,W.,Yuan,J.,Kramer,A.,Strebhardt,K.&Berg,T.Inhibition ofpolo-like kinase 1by blocking polo-box domain-dependent protein-proteininteractions.Chem Biol 15,459–66(2008).

[35]Yuan,J.et al.Polo-box domain inhibitor poloxin activates thespindle assembly checkpoint and inhibits tumor growth in vivo.Am J Pathol179,2091–9(2011).

[36]Yin,Z.,Song,Y.&Rehse,P.H.Thymoquinone blocks pSer/pThrrecognition by Plk1Polo-box domain as a phosphate mimic.ACS Chem Biol 8,303–8(2013).

[37]Watanabe,N.et al.Deficiency in chromosome congression by theinhibition of Plk1polo box domain-dependent recognition.J Biol Chem 284,2344–53(2009).

[38]Park,J.E.et al.Putting a bit into the polo-box domain of polo-like kinase 1.J Anal Sci Technol 6,27(2015).

[39]Park,J.E.,Kim,T.S.,Kim,B.Y.&Lee,K.S.Selective blockade of cancercell proliferation and anchorage-independent growth by Plk1activity-dependentsuicidal inhibition of its polo-box domain.Cell Cycle 14,3624–34(2015).

发明内容

本发明首先涉及一种具备抗肿瘤活性的小分子化合物F083-0063，其结构如式1所示，化学名为3-甲酰胺-N-(呋喃-2-基甲基)-1-硫酮-5-氧代-8氯-4,5-双氢-1H–噻唑并[3,4-a]喹唑啉，

本发明还涉及以所述的小分子化合物F083-0063为主要活性成分的制剂或药物。

本发明还涉及一种抗肿瘤药物，所述的药物包括，

(1)治疗有效量的小分子化合物F083-0063；

(2)必要的药用辅料。

本发明还涉及所述的小分子化合物F083-0063在制备如下制剂中的应用；

(1)结合于Plk1的PBD的特定区域并阻断其功能的阻断剂，所述的Plk1的PBD的特定区域为Plk1蛋白三级结构中的His538、Lys540、Arg557构成的结构区域；

(2)阻滞细胞至G2/M期的细胞周期调节剂，所述的细胞优选为肿瘤细胞系，最优选为肝癌、子宫癌或结直肠癌细胞；

(3)促进细胞凋亡制剂，所述的细胞优选为肿瘤细胞系，最优选为肝癌、子宫癌或结直肠癌细胞；

(4)抑制肿瘤细胞迁移的抑制剂，所述的肿瘤细胞优选为子宫癌细胞。

本发明还涉及所述的小分子化合物F083-0063的如下应用：

(1)抑制Plk1与其天然配体结合；

(2)阻滞细胞至G2/M期；

(3)促进细胞凋亡，所述的细胞优选为肿瘤细胞系，最优选为肝癌、子宫癌或结直肠癌细胞；

(4)抑制肿瘤细胞的迁移和转移，所述的肿瘤细胞优选为子宫癌细胞；

(5)抑制肿瘤和/或抑制肿瘤的转移，所述的肿瘤优选为肝癌、子宫癌或结直肠癌。

本发明还涉及一种以Plk1 PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为靶标的Plk1抑制剂的筛选方法，所述的Plk1 PBD活性中心的关键氨基酸空间结构为Plk1蛋白的His538、Lys540、Arg557在具备生物学活性的Plk1蛋白三级结构的空间构象中形成的立体结构，所述的筛选方法为：使用分子对接预测靶标和化合物的相互结合。

附图说明

图1、F083-0063的结构及基本功能，1A，F083-0063的分子结构；1B，F083-0063的量效关系曲线；1C，F083-0063在HeLa细胞中的细胞毒性。

图2、F083-0063的功能验证，2A，F083-0063时间依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；2B，F083-0063引发时间依赖性的G2/M期阻滞的定量分析；2C，F083-0063剂量依赖性的引发HeLa细胞G2/M期阻滞；2D，F083-0063引发剂量依赖性的G2/M期阻滞的定量分析；2E，Western Blot分析F083-0063引发G2/M期阻滞。

图3、F083-0063促进肿瘤细胞凋亡，3A，F083-0063引发HeLa细胞的大量凋亡；3B，F083-0063引发细胞大量凋亡的定量分析。

图4、F083-0063抑制细胞迁移，4A，F083-0063时间依赖性的抑制HeLa细胞迁移；4B，F083-0063引发时间依赖性的细胞迁移的定量分析；4C，F083-0063剂量依赖性的抑制HeLa细胞迁移；4D，F083-0063引发剂量依赖性的细胞迁移的定量分析。

图5、F083-0063与Plk1PBD结合方式验证，F083-0063和Plk1PBD分子对接示意图。

具体实施方式

实施例1.细胞的培养

人成骨肉瘤细胞MG63、人子宫颈癌细胞HeLa、人结肠癌细胞HCT-116、人结肠癌细胞HT-29、人肝癌细胞HepG2、人前列腺癌PC3、人肝细胞L02，所有细胞均为贴壁细胞，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，用PBS漂洗细胞后弃掉，之后加适量胰酶，在室温下消化约2-10min，弃掉消化液，立即加入含10％FBS的培养基，以抑制胰蛋白酶活力，用弯头吸管反复轻轻吹打培养瓶内细胞，使细胞完全脱离瓶底且吹打使之分散为单个细胞悬液。再按1:3-1:6比例接种细胞悬液于新的细胞瓶内，然后补加适量完全培养基，放入培养箱继续培养。培养条件：37℃，5％CO₂。

实施例2.化合物F083-0063对PLK1PBD抑制活性的测定

本活性测定采用荧光偏振(FP)高通量筛选模型进行化合物活性的测定。

测定原理：

主要基于荧光分子的偏振性与其受激发时荧光分子的旋转速度密切相关的原理。当荧光分子受平面偏振光激发时，如果荧光分子在受激发时保持静止状态，那么发射光将位于同样的偏振平面；如果荧光分子在受激发时保持旋转状态，那么发射光将位于与激发光不同的偏振面。如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子量较大，受激发时荧光分子的旋转速度较慢，则发射光偏振程度较高；如果分子量较小，受激发时荧光分子的旋转速度较快，则发射光相对于激发光平面将去偏振化。因此，本研究拟建立的荧光偏振高通量筛选方法将以FITC-Poloboxtide((FITC-GPMQSpTPLNG-OH；MW:1583.61；Purity＞95％；λex/λem:485/535nm，由上海强耀生物科技有限公司合成)作为Plk1PBD的模拟底物，从而进行靶向Plk1PBD的小分子抑制剂的活性测定。

测定方法：

(1)将400nM Plk1PBD溶液以30μL/孔依次加入到384孔板中，将10mg·mL^-1的F083-0063进行倍比稀释后，以终浓度10μg·mL^-1、5μg·mL^-1、2.5μg·mL^-1、2μg·mL^-1、1μg·mL^-1、0.5μg·mL^-1、0.25μg·mL^-1、0.1μg·mL^-1、0.05μg·mL^-1、0.02μg·mL^-1、0.01μg·mL^-1依次加入到384孔板中并做好对应的准确记录，以同时加入0.3μL DMSO孔作为阴性对照(NegativeControl,0％Inhibition)；以仅含有60μL 30nM FITC-Probe孔为阳性对照(PositiveControl,100％Inhibition)。将其混匀后室温缓慢振摇，孵育60min。

(2)将60nM FITC-Probe以30μL/孔依次加入到384孔板中的上述各反应孔中，将其混匀后室温缓慢振摇，避光孵育15min，以多功能微孔板检测仪进行mP检测。

(3)用如下方程计算待测化合物抑制率：

并以GraphPad Primer 5拟合抑制曲线确定化合物F083-0063的表观IC₅₀。

以FP实验测得不同浓度化合物对Plk1PBD的抑制率(表1)对化合物F083-0063进行量效关系分析，表观IC₅₀≈1.9±0.1μM(图1B)，能在体外抑制Plk1PBD的活性。

选用HeLa细胞作为肿瘤细胞的代表细胞，以MTT方法进行小分子抑制剂F083-0063的细胞毒性初步评价。在上述实验中，我们发现小分子抑制剂F083-0063对HeLa细胞具有明显的细胞毒性，其IC₅₀值约为5.8±0.6μM(图1C，表2)。

表1不同浓度化合物F083-0063对Plk1PBD的抑制率

实施例3、小分子抑制剂F083-0063的细胞毒性测定

利用MTT比色实验进行。

测定原理：

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在560nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与活细胞数成正比。

测定方法：

(1)从保存细胞冻存管的液氮中取出细胞冻存管后，迅速投入37℃水浴中，轻轻摇动使其尽快融化。然后从37℃水浴中取出细胞冻存管，用乙醇消毒后，1000rpm×5min离心，小心地吸去上清液，再加入1mL培养液重悬细胞并再次离心。用生长培养基适当稀释后，接种培养瓶，接种密度以5×10⁵/mL为宜。将细胞培养瓶放入CO2培养箱37℃、5％CO2静止培养。次日更换培养液，继续培养备用。

(2)以0.25％胰蛋白酶消化单层贴壁培养的细胞，用含10％FBS的生长培养基配成单细胞悬液，以4～5×10³/mL接种于96孔细胞培养板，每孔体积200μL，同时96孔细胞培养板的边缘孔以无菌PBS填充，尽量避免边缘效应。

(3)将上述接种细胞的96孔细胞培养板放入CO2培养箱，在37℃、5％CO₂条件下静止培养24小时至对数生长期。

(4)准备从10μg·mL^-1开始以生长培养基梯度稀释的化合物F083-0063，共制备8个梯度浓度(100μM、75μM、50μM、25μM、10μM、5μM、2.5μM、1μM)的稀释液。

(5)小心地吸弃各孔内的生长培养基后，将化合物F083-0063的上述8个梯度浓度分别加入对应96孔细胞培养板，每孔200μL，每个浓度设置3组复孔并做好相应的标记。以加入DMSO组为阴性对照，只含正常培养基组为阳性对照，各组分别设置3组复孔。

(6)在37℃、5％CO₂培养条件下，化合物F083-0063与细胞继续共培养48小时。小心地吸弃各孔内生长培养基，每孔各加入200μL新鲜生长培养基，继续培养24小时。

(7)培养24小时后，每孔加入MTT溶液22μL，37℃避光培养4小时后终止培养。小心地吸弃各孔内培养基后，每孔加入150μL DMSO，避光震荡15min，使甲瓒充分溶解呈紫色。

(8)选择560nm波长，在多功能微孔板检测仪上测定各孔OD值，记录并保存数据，以GraphPad Prism 5拟合化合物F083-0063在各细胞株的生长抑制曲线并计算其IC₅₀值。

本实验选用本室保存的6株临床常见的人癌细胞系和1株正常人源细胞，以MTT比色法进行小分子抑制剂F083-0063的细胞毒性评价。发现小分子抑制剂F083-0063对6株肿瘤细胞具有不同的细胞毒性，IC₅₀值差别较大，其中对Hela的细胞毒性最为明显，IC₅₀小于10μM(表2)。但是，小分子抑制剂F083-0063对L02代表的正常细胞的细胞毒性与肿瘤细胞的细胞毒性相比并没有显著差别。上述数据表明，小分子抑制剂F083-0063在体外对肿瘤细胞和正常细胞具有等同的细胞毒性。

表2小分子抑制剂F083-0063对肿瘤细胞和正常细胞的细胞毒性

实施例4、小分子抑制剂F083-0063对Hela细胞周期的影响

利用流式细胞仪和Western blot进行。

测定原理：

由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N),而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

测定方法：

周期同步化的HeLa细胞是后续FACS和Western Blot进行细胞周期分析的基础，周期同步化方法如下：

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁵/mL接种于6孔细胞培养板，接种量2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下培养24h至指数生长期。

(2)细胞贴壁后，小心地弃掉生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后加入终浓度2mM Thymidine的生长培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养12h。

(3)小心地弃掉含2mM Thymidine的生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。更换新鲜的生长培养基，在37℃、5％CO₂条件下继续培养12h。

(4)轻轻地弃掉正常生长培养基后，以无菌PBS漂洗细胞1次。然后再次加入终浓度2mM Thymidine的生长培养基，在37℃、5％CO₂条件下培养12h后，此时所有的HeLa细胞的周期将被阻滞在G1/S期。

将同步化的HeLa细胞以小分子抑制剂F083-0063作用24h，在各设置的时间点收集细胞并与DMSO对照组比较，以FACS进行HeLa细胞周期的综合分析。

以FACS进行HeLa细胞周期的综合分析：

(5)在上述含有细胞周期同步化的HeLa细胞6孔细胞培养板中，分别加入含有20μM小分子抑制剂F083-0063的新鲜培养基继续培养，在0h、12h、16h和24h时间点分别收集细胞。

(6)在上述各时间点收集的细胞分别以4℃预冷的PBS漂洗细胞3次并以0.25％胰酶消化细胞，再以4℃预冷的PBS重悬细胞，1000rpm×6min离心并收集细胞。

(7)小心地弃掉离心后的细胞上清液，缓慢加入4℃预冷的含70％乙醇的PBS固定液1mL充分悬浮细胞，4℃固定30min。

(8)固定后的细胞以1200rpm×6min离心并收集细胞，小心地弃掉乙醇固定液。尔后加入100μL PI/RNase A溶液并充分混匀，37℃避光孵育30min。

(9)各样品做好对应的标记后，将细胞过滤到BD流式细胞管，各管再补加400μLPBS后，以FACS进行分析。

(10)将含5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制剂F083-0063的新鲜培养基加入到周期同步化的HeLa细胞中并在作用12h后收集细胞，固定步骤及PI染色步骤同上所述，以FACS进行量效关系分析。

或，以Western Blot进行HeLa细胞周期的综合分析：

(5)将周期同步化的HeLa细胞以5μM、10μM和15μM小分子抑制剂F083-0063作用16h后，收集细胞。各收集的细胞样品分别加入60μL RIPA细胞裂解液(含100μg/mL PMSF)，充分悬浮细胞，冰浴30min，12000rpm×30min离心，小心地吸取上清液并做好对应的标记，再以BCA法进行裂解蛋白的定量。裂解蛋白定量后，将各样品的蛋白裂解液浓度调整为2mg/mL，每次上样量约为30～40μg/Lane。

(6)准备15％SDS-PAGE，上样量30μg/Lane。SDS-PAGE电泳结束后，将聚丙烯酰胺凝胶和2张3mm Bio-Rad滤纸放入4℃预冷的1×转移缓冲液中浸泡2～5min。

(7)将裁剪的与胶尺寸相当的PVDF膜先用甲醇润湿30s，再用蒸馏水洗1min，然后置于上述1×转移缓冲液浸泡2min。

(8)在Bio-Rad半干法转膜仪的正极上放置一张平衡过的滤纸，将PVDF膜整齐地放在滤纸上，然后将聚丙烯酰胺凝胶平铺于PVDF膜上，最后在该凝胶上面再整齐地放置另一张平衡过的滤纸。用洁净的试管小心地轻压，以去除夹层中的气泡，然后以上述少许1×转移缓冲液润湿周围，使其保持一定的导电性。最后放置转膜仪的负极并压紧、压实。

(9)Western Blot电转条件设置：恒流转膜0.2A×30min。

(10)电转结束后，用镊子小心地取出PVDF膜浸入TBST洗涤1次，再用镊子小心夹出并室温晾干后，依据预染Marker标示分子量和目的蛋白分子量适当裁剪PVDF膜并做好相应的标记。

(11)将裁剪的PVDF膜放入含5％Milk-TBST的封闭液中室温缓慢振摇2h进行封闭。

(12)封闭结束后，取出PVDF膜，将其放入到TBST中漂洗3次，每次10min。漂洗完毕后将标记好的PVDF膜放入孵育盒中进行一抗孵育反应。

(13)按照相关抗体说明书，以封闭液稀释上述抗体并将抗体稀释液置于孵育盒中，室温缓慢振摇1h后，4℃过夜。

(14)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。漂洗完毕后再将PVDF膜放入孵育盒中进行二抗孵育反应。

(15)用封闭液稀释对应的HPR-Secondary Antibody(WB 1:2000)并将其置于含有对应一抗孵育完毕的PVDF膜的孵育盒中，室温缓慢振摇1～2h。

(16)从孵育盒中取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次10min。然后进行显色反应。

(17)显色反应：在PVDF膜正面(印记目的蛋白一面)加入适量增强型HRP底物化学发光液(按照说明书配制A:B＝1:1)，立即置于凝胶成像仪中曝光5～10s后成像。

从流式结果可以看到，化合物F083-0063作用12h后G2/M的含量为53.3±1.8％，作用16h时G2/M的含量为7.3±0.2％，作用24h时G2/M的含量为3.1±0.4％，如(表3，图2A，2B)所示趋势呈现逐渐下降，这应该是与化合物在不同时间的作用强度有关。接下来我们选取12h作为G2/M期阻滞的比较时间点。

在流式实验中发现，当5μM、10μM、15μM和20μM小分子抑制剂F083-0063作用于周期同步化的HeLa细胞12h时，与DMSO对照组相比，随着小分子抑制剂F083-0063剂量的不断增加，HeLa细胞的G2/M期比率逐渐升高(表4)。与DMSO对照组的G2/M期比率0.3±0.1％相比，20μM小分子抑制剂F083-0063作用于周期同步化的HeLa细胞12h后，HeLa细胞的G2/M期比率达到56.4±2.3％，HeLa细胞的G2/M期比率呈剂量依赖性的增加趋势(图2C，2D)。上述数据表明，小分子抑制剂F083-0063对HeLa细胞的G2/M期阻滞作用具有明显的剂量依赖性。

表3化合物F083-0063作用12h后对细胞周期的阻滞效果

表4化合物F083-0063剂量变化对HeLa细胞的G2/M期的阻滞效率

Western Blot实验中，我们发现5μM、10μM、15μM小分子抑制剂F083-0063作用12h的HeLa细胞中Plk1、Cyclin B1、pHH-3随着F083-0063剂量的不断增加而逐渐积聚。其中，15μM小分子抑制剂F083-0063引发的周期阻滞中含有大量的M期细胞(图2D)。Plk1、CyclinB1、pHH-3在HeLa细胞周期中的大量积聚表明，小分子抑制剂F083-0063引发了HeLa细胞的G2/M期阻滞。

综上所述，小分子抑制剂F083-0063可以引发HeLa细胞发生G2/M期阻滞。

实施例5.小分子抑制剂F083-0063对HeLa细胞凋亡的影响

利用Annexin V/PI双染法进行。

测定原理：

磷酯酰丝氨酸(PS)是一种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂分布的不对称性被破坏而使PS暴露在细胞膜外。Annexin V是一种Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，具有易于结合到磷脂类如PS的特性，对PS有高度的亲和性。但PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/PI-)；右上象限是非活细胞，即凋亡晚期的细胞和坏死细胞，为(FITC+/PI+)；而右下象限为早期凋亡细胞，显现(FITC+/PI-)；而左上象限为许可范围内的检测误差。

测定方法：

Annexin V/PI双染法

(1)将HeLa细胞以0.25％胰酶消化后，以3×10⁶/mL接种于6孔细胞培养板，接种量2mL/孔。将细胞板置于37℃、5％CO2条件下培养24h至指数生长期。

(2)上述HeLa细胞培养24后，以无菌PBS清洗细胞3次，更换分别含有DMSO、5μM、10μM、15μM小分子抑制剂F083-0063的新鲜培养液。做好相应标记后，将细胞板置于37℃、5％CO₂条件下继续培养24h。

(3)取出上述细胞培养板，以PBS小心地漂洗1次，再以0.25％胰酶消化细胞，1000rpm×5min离心，收集细胞。

(4)用去离子水按1:4稀释结合缓冲液(1×结合缓冲液：10mM Hepes/NaOH、140mMNaCl,2.5mM CaCl₂pH7.4)。

(5)将上述消化的HeLa细胞以4℃预冷的PBS洗涤2次，用250μL 1×结合缓冲液悬浮细胞，调节其浓度为5×10⁶/mL。

(6)取100μL的细胞悬液(细胞数约为5×10⁵)于EP管中，再加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488，室温避光孵育30min。

(7)在上述反应体系中再加入5μL PI，室温避光孵育5～10min。

(8)将上述细胞悬液过滤到BD流式管中，再补加400μL PBS并做好对应的标记，立刻以流式细胞仪(BD Biosciences)进行检测和数据统计分析。

根据双染实验中，小分子抑制剂F083-0063作用24h后，通过流式细胞仪检测与对照组相比加药组在5μM、15μM、25μM浓度下，随着小分子抑制剂剂量的逐渐增加，HeLa细胞的凋亡比例逐渐增大。如早期凋亡比例由6.2±0.1％增加到37.1±0.4％(表5，图3A，3B)。当浓度达到25μM时早期凋亡比例增加到43.6±3.5％。可见小分子抑制剂可以很明显的引起细胞凋亡并且具有较为明显的浓度依赖性。

表5化合物F083-0063剂量变化对细胞凋亡的影响

综上所述，小分子抑制剂F083-0063可以引发HeLa细胞发生大量凋亡。

实施例6.小分子抑制剂F083-0063对HeLa细胞迁移的影响

利用细胞划痕法进行

测定原理：

细胞划痕法是测定肿瘤细胞的运动性的方法之一。在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后在加入药物等试验条件观察其对肿瘤细胞迁移的影响。

测定方法：

划痕实验

(1)事先将Maker笔，直尺，枪，枪头均放入超净台中紫外照射至少30min，先用Maker笔在6孔板的背面比着直尺划线，线与线之间距离至少为0.5-1cm，横穿过孔，每孔至少穿过3条线，以便在不同视野下观察。

(2)以5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，接种的密度以不同细胞而有所差异，掌握为过夜铺满为好。

(3)培养24h后，显微镜下观察细胞的生长情况，看细胞是否铺满，若状态良好，则用枪头比着直尺，划得线尽量垂直于背面的横线痕迹，枪头要垂直，不要倾斜。

(4)用灭过菌的PBS清洗3次，除去划痕下的细胞，加入以配好浓度的阳性化合物(5μM、10μM、15μM、20μM)，放入37℃5％CO2的培养箱孵育培养48h后取样，拍照。

(5)小分子抑制剂F083-0063浓度为20μM，分别培养12h、24h、36h、48h后，进行取样拍照。

20μM的小分子抑制剂F083-0063，分别作用12h、24h、36h、48h后观察细胞的迁移情况，与对照组相比，12h与对照组相近，随时间延长，加药组迁移明显受到抑制，表现出时间依赖性(图4A、4B)。

细胞迁移结果如(图4C、4D)所示,与对照组相比,加药组的细胞迁移能力明显减弱,尤其是在20μM时,由最开始的58.8±0.5％变为39.6±0.7％。随着剂量的逐渐增加,迁移率明显受抑制,存在剂量依赖性。

实施例7.小分子抑制剂F083-0063与Plk1PBD结合方式的研究-分子对接

利用Discovery Studio 4.0软件(Designed by Accelrys Inc.San Diego,CA)软件进行。

测定原理：

分子对接(Molecular Docking)是指配体与受体之间通过能量匹配和几何匹配而互相识别的过程，其主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用力、范德华力等。近年来，随着计算机辅助药物设计技术的飞速发展，分子对接技术已成为基于结构的药物设计和计算机辅助药物设计的重要方法之一。Discovery Studio 4.0软件(Designed by AccelrysInc.San Diego,CA)是目前全球应用最为广泛的计算机辅助设计平台之一，其在计算分子模拟和药物设计领域都有着极其广泛的应用。

Discovery Studio 4.0软件有多个模块，主要功能包括：蛋白质的表征(包括蛋白质-蛋白质相互作用)、同源建模、分子力学计算、分子动力学模拟、基于结构药物设计(包括配体-蛋白质相互作用、全新药物设计和分子对接)、基于小分子的药物设计(包括定量构效关系、药效团、数据库筛选、ADMET)和组合库的设计与分析等。

测定方法：

在以Discovery Studio 4.0软件进行的小分子抑制剂F083-0063和Plk1PBD的分子对接中，我们选择PDB(Protein Data Bank)中4H71结构。

使用Discovery Studio 4.0软件将小分子抑制剂F083-0063与Plk1PBD的活性中心(PDB code 4H71)进行分子对接。PLK1PBD结构域是由His538、Lys540、TRP414(是氨基酸中的一种色氨酸，是人体必需氨基酸)、Lys540和Asp416等多个氨基酸组成，通过对接结果显示(图5)，F083-0063与PLK1PBD的结构域呈现出较高的亲和性，其中小分子抑制剂苯环上的羰基能与His538、Lys540、TRP414形成牢固的氢键，同时与TRP414、ASP416、ARG516以及ARG557形成叠加的π键，此外，F083-0063与PLK1PBD还存在非共价键的竞争结合方式，进而使得小分子抑制剂与PBD结构域结合得更加紧密。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，而不用于对本发明保护范围的限制。

Claims

1.一种抗肿瘤药物，所述的药物包括，

(1)治疗有效量的小分子化合物F083-0063；

(2)必要的药用辅料；

所述小分子化合物F083-0063的结构如下式1所示：

2.小分子化合物F083-0063在制备如下制剂中的应用；

(2)阻滞肿瘤细胞至G2/M期的细胞周期调节剂；

(3)促进肿瘤细胞凋亡的制剂；(4)抑制肿瘤细胞迁移的抑制剂；

所述小分子化合物F083-0063的结构如下式1所示：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤细胞为肝癌、子宫癌或结直肠癌细胞。