CN112300262B - Plk1调节蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Plk1调节蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种PLK1调节蛋白及其编码基因与应用，所述PLK1调节蛋白是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

Description

PLK1调节蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明涉及一种PLK1调节蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
在细胞增殖的过程中，有丝分裂作为最重要的一环，不同时期的微小错误都可能引起染色体分离出现问题，从而导致非整倍体细胞的产生以及基因组的不稳定性，其最终的结果就是引起细胞凋亡或者肿瘤的发生。
目前的研究发现，在有丝分裂进程中有三大蛋白激酶家族发挥着至关重要的作用，这三大激酶家族包括：The CDK family，The Polo family和The Aurora family。Cyclin依赖的蛋白激酶CDK1与另外两个激酶家族Polo(PLK1、PLK2、PLK3、PLK4、PLK5)与Aurora(Aurora A、Aurora B、Aurora C)均参与到细胞有丝分裂的各个过程，包括建立正确的动点微管连接；完善纺锤体定向；协助姐妹染色单体分离等。除此之外还有很多其它激酶例如SAC检验点激酶(Mps1、Bub1、BubR1)等。同时，对应有丝分裂进程中激酶的磷酸化，负责去磷酸化的磷酸酶同样扮演着不可或缺的角色，磷酸酶家族PP1(PP1α、PP1β、PP1γ)和PP2A(PP2A-B55、PP2A-B56)承担了人类细胞95％的磷酸酶活性。
PLK1是Polo家族的5个成员之一，在有丝分裂期发挥着重要功能，包括中心体成熟、纺锤体组装调节、染色体臂中粘连蛋白的去除、后期促进复合物的失活、有丝分裂退出和胞质分裂的调控。PLK1的POLO结构域识别特定氨基酸基序上已被磷酸化的蛋白并与之结合进一步磷酸化。通过磷酸化CCNB1、CDC25C、FOXM1、CENPU、MYT1、MYPT1和WEE1在细胞周期G2/M转换中发挥核心作用，通过磷酸化KIZ、NEDD1和NINL促进了中心体的成熟和双极纺锤体的组装，通过磷酸化CEP55、ECT2、MKLP2、CENPU、PRC1和RACGAP1调控有丝分裂退出和胞质分裂。此外，有研究发现，PLK1在未建立动点-微管连接的动点上的激酶活性水平高，从而揭示了PLK1参与动点-微管连接和纺锤体组装检验点(Spindle Assembly Checkpoint，SAC)的调控。
蛋白磷酸酶通过结合多种调节蛋白从而形成高度特异性的全酶，进而完成数百种蛋白的去磷酸化。蛋白磷酸酶PP1是细胞分裂增殖必不可少的，同时参与糖原代谢、肌肉收缩和蛋白质合成的调节。有研究发现，PP1通过去磷酸化CSNK1D和CSNK1E，调节了PER1和PER2磷酸化的速度和节律进而决定了昼夜节律的长度。而在细胞周期进程中，PTW/PP1磷酸酶复合物在有丝分裂向间期转变过程中，调控了有丝分裂的进行及染色质结构的转变。
发明内容
本发明的目的是提供了一种PLK1调节蛋白及其编码基因与应用。
本发明提供的PLK1调节蛋白，基因名称为C1orf112，其功能在本研究前未知。鉴于本研究发现其衔接Polo 1的有丝分裂调控功能，故将此基因编码的蛋白命名为Apolo1(Adaptor of Polo1)，来源于人，是如下的蛋白质：由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或所述蛋白质的缀合物，优选所述蛋白质缀合了纯化标签，更优选地，所述纯化标签选自Poly-His，FLAG，HA或GST，更优选地，所述纯化标签缀合于所述蛋白质的N端或C端。
序列表中的序列1由853个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第1-176位氨基酸残基为PLK1结合区域，自N端第177-728位氨基酸残基为Domain of unknown function(DUF4487)结构域，自N端第729-853位氨基酸残基为PP1γ结合区域。
为了使Apolo1蛋白便于纯化，可在由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上纯化标签，例如表1所示的标签。
表1标签的序列
标签 残基 序列
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH(SEQ ID NO:)
FLAG 8 DYKDDDDK(SEQ ID NO:)
HA 9 YPYDVPDYA(SEQ ID NO:)
GST 218 /
上述Apolo1蛋白的编码基因(C1orf112)也属于本发明的保护范围。
所述Apolo1蛋白的编码基因(C1orf112)为如下的DNA分子：
是SEQ ID NO:2所示的DNA分子。
SEQ ID NO:2由2559个脱氧核糖核苷酸组成，其编码序列为自5’末端第1-2559位核苷酸，编码具有SEQ ID NO:1的氨基酸残基序列的蛋白质，其中，自5’末端第1-528位核苷酸编码PLK1结合区域，自5’末端第529-2184位核苷酸编码DUF4487结构域，自5’末端第2185-2559位核苷酸编码PP1γ结合区域。
含有所述编码基因(C1orf112)的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系及重组菌株均属于本发明的保护范围。
可用现有的表达载体构建含有所述编码基因(C1orf112)的重组表达载体。
使用C1orf112构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
本发明还保护扩增所述基因的引物。
所述引物具体可为SEQ ID NO:3所示的核苷酸和SEQ ID NO:4所示的核苷酸。
本发明还提供了一种抑制所述基因(C1orf112)的表达的方法，是将抑制所述基因的小干扰RNA导入宿主，从而抑制所述基因的表达。
所述小干扰RNA具体可为正义链为SEQ ID NO:5或7，反义链为SEQ ID NO:6或8的双链RNA。
所述蛋白、所述基因可应用于制备抑制肿瘤增殖的药物和/或制备抑制PLK1蛋白活性的药物。
本发明还保护一种因抑制Apolo1而影响PLK1蛋白的激酶活性和/或抑制肿瘤增殖的药物，它的活性成分是所述Apolo1蛋白、所述C1orf112基因和所述重组表达载体中的至少一种。
所述PLK1蛋白具体可为人PLK1蛋白。所述PLK1蛋白具体可为GenBank AccessionNumber NP_005021.2所示的蛋白质。
本发明提供了一个分子量为97kDa的PLK1相互作用蛋白，同时动态调控了PLK1的激酶活性，因此将其命名为Apolo1(Adaptor of Polo1)。生化实验表明Apolo1直接与PLK1相互作用。如果siRNA敲除Apolo1，则其动点定位消失，同时PLK1的激酶活性下调。说明PLK1需要通过与Apolo1结合才能完全维持其激酶活性。Apolo1还与PP1γ蛋白相互作用，点突变实验及磷酸化实验表明它们之间的相互作用受PLK1激酶调控。PLK1对Apolo1的磷酸化导致PP1γ与Apolo1的结合受到抑制，PP1γ与Apolo1解离导致PLK1 T210被PP1γ去磷酸化，导致PLK1激酶活性的下调。以上实验说明，本发明Apolo1是一个重要的动态调节PLK1蛋白激酶活性的蛋白，并且进一步影响有丝分裂进程，可以作为药物靶点调控肿瘤细胞增殖，本发明所涉及的蛋白及其编码基因将在医学及制药领域发挥重要作用，应用前景广阔。
附图说明
图1为Apolo1氨基酸序列的结构及各缺失突变体示意图。
图2为免疫荧光检测Apolo1在有丝分裂不同时期定位的结果。
图3为Apolo1与PLK1相互作用免疫沉淀检测结果。
图4为Apolo1与PLK1相互作用区域鉴定结果。
图5为C1orf112基因siRNA对PLK1蛋白在细胞内激酶活性的抑制作用的检测结果。
图6为Apolo1 KO(条件性敲除)细胞系活细胞成像结果。
图7为对图6拍摄的细胞进行分析统计的结果。
图8为Apolo1与PP1γ相互作用的免疫沉淀鉴定结果。
图9为Apolo1磷酸化位点突变体与PP1γ相互作用的体外pull-down鉴定结果。
图10为理论模型的提出。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
下述实施例中的实验方法可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rdedition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。
实施例1.Apolo1编码基因的获得及其缺失突变体的表达载体的构建
一、Apolo1编码基因的获得及GFP-Apolo1的构建
以人宫颈癌HeLa细胞(Stratagene,Cat.No.937248)的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-ggaagatctatgtttttacctca-3’(SEQ ID NO:3)；
下游引物：5’-ccgacgtcgactcaccctagagtatg-3’(SEQ ID NO:4)。
用BglII和SalI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pEGFP-C1(Clontech，Cat.No.6084-1)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，得到含有目的片段的重组质粒，命名为pEGFP-C1-Apolo1。
对pEGFP-C1-Apolo1进行测序，测序结果表明：人C1orf112基因具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。SEQ ID NO:2由2559个核苷酸组成，其编码序列为5’端第1-2559位碱基，编码具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的蛋白质。
对Apolo1蛋白的氨基酸序列进行结构域分析，分析结果如图1所示。Apolo蛋白(SEQ ID NO:1)中，自氨基端(N端)第176-728位氨基酸残基为DUF4487结构域。C1orf112基因(SEQ ID NO:2)中，自5’端第529-2184位核苷酸编码编码DUF4487结构域。
二、FLAG-Apolo1的构建
用限制性内切酶BglII和SalI酶切pEGFP-C1-Apolo1，将酶切产物与同样酶切的p3×FLAG-myc-CMV-24(Sigma，Cat.No.E6151)进行连接，得到FLAG-Apolo1。
三、HA-Apolo1的构建
用限制性内切酶BglII和SalI酶切pEGFP-C1-Apolo1，将酶切产物与同样酶切的p3×HA-myc-CMV-24(本实验室改造)进行连接，得到HA-Apolo1。
四、His-Apolo1及His-Apolo1-C-WT、His-Apolo1-C-4A的构建
用限制性内切酶KpnI和ApaI酶切pEGFP-C1-Apolo1，将酶切产物与同样酶切的pcDNA3.1/Myc-HisApolo1(Invitrogen，Cat.No.V800-20)进行连接，得到pcDNA3.1/Myc-His-Apolo1或His-Apolo1。
以pcDNA3.1/Myc-His-Apolo1为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-ggtaccatgatagttccacagtgtctcagttctgaa-3’(SEQ ID NO:9)；
下游引物：5’-tggaactatcatggtaccaagcttaactagcca-3’(SEQ ID NO:10)。
用DpnI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物进行重组，将重组产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明：得到了Apolo1-C-WT重组质粒，命名为pcDNA3.1/Myc-His-Apolo1-C-WT或His-Apolo1-C-WT。
以pcDNA3.1/Myc-His-Apolo1-C-WT为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-acgccgttgccgccgccctggagaagactgggtttgtagatg-3’(SEQ ID NO:11)；
下游引物：5’-ggcggcggcaacggcgttcttagtttcttcagaactgagacact-3’(SEQ IDNO:12)。
用DpnI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物进行重组，将重组产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明：得了Apolo1-C-4A重组质粒，命名为His-Apolo1-C-4A。
五、GFP-PP1α、GFP-PP1β和GFP-PP1γ的构建
以人宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-acgcgtcgacatgtccgacagcgag-3’(SEQ ID NO:13)；
下游引物：5’-cgcggatccctatttcttggcttt-3’(SEQ ID NO:14)。
用SalI和BamHI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pEGFP-C1(Clontech，Cat.No.6084-1)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明得了到含有目的片段PP1α的重组质粒，命名为GFP-PP1α。
以人宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-acgcgtcgacatggcggacggggag-3’(SEQ ID NO:15)；
下游引物：5’-cgcggatcctcaccttttcttcgg-3’(SEQ ID NO:16)。
用SalI和BamHI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pEGFP-C1(Clontech，Cat.No.6084-1)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明得到了含有目的片段PP1β的重组质粒，命名为GFP-PP1β。
以人宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-acgcgtcgacatggcggatttagat-3’(SEQ ID NO:17)；
下游引物：5’-cgcggatccctatttctttgcttg-3’(SEQ ID NO:18)。
用SalI和BamHI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体pEGFP-C1(Clontech，Cat.No.6084-1)连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，测序鉴定，结果表明得到了含有目的片段PP1γ的重组质粒，命名为GFP-PP1γ。
六、FLAG-PLK1的构建
以人宫颈癌HeLa细胞的cDNA为模板，进行PCR扩增，进行PCR扩增所采用的引物如下：
上游引物：5’-ccggaattcaatgagtgctgcagtg-3’(SEQ ID NO:19)；
下游引物：5’-cggggtaccttaggaggccttgag-3’(SEQ ID NO:20)。
用EcoRI和KpnI酶切PCR产物，将酶切后的PCR产物与同样酶切后的载体p3×FLAG-myc-CMV-24(Sigma，Cat.No.E6151)进行连接，将连接产物转化大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提质粒，进行测序，结果表明得到了含有目的片段PLK1的重组质粒，命名为FLAG-PLK1。
七、GST-PP1γ的构建
用限制性内切酶BamHI和NotI酶切GFP-PP1γ，将酶切产物与同样酶切的pGEX-6P-1(Amersham Biosciences公司，Cat.No.27-4597-01)进行连接，得到GST-PP1γ。
八、Apolo1的缺失突变体的构建
所有Apolo1的缺失突变体基因都是通过设计引物对GFP-Apolo1进行PCR获得的(如图1所示)。
根据Apolo1的核苷酸序列，PCR构建3段不同长度的缺失突变体基因(deletions)：
DNA片段1：SEQ ID NO:1自5’端第1-528位核苷酸，编码自N端第1-176位氨基酸残基，将其命名为Apolo1-N。引物对：5’-ggaagatctatgtttttacctcat-3’(SEQ ID NO:21)；5’-cgacgtcgacatggtccatactgga-3(SEQ ID NO:22)’。
DNA片段2：SEQ ID NO:1自5’端第529-2184位核苷酸，编码自N端第177-728位氨基酸残基，将其命名为Apolo1-M。引物对：5’-ggaagatctgcatttcatgccaata-3’(SEQ ID NO:23)；5’-cgacgtcgacgagacactgtggaac-3’(SEQ ID NO:24)。
DNA片段3：SEQ ID NO:1自5’端第2185-2559位核苷酸，编码自N端第729-853位氨基酸残基，将其命名为Apolo1-C-WT。引物对：5’-ggaagatctgttccacagtgtctc-3’(SEQ IDNO:25)；5’-cgacgtcgactcaccctagagtatg-3’(SEQ ID NO:26)。
用BglII和SalI酶切Apolo1-N，将酶切后的Apolo1-N插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-Apolo1-N。
用BglII和SalI酶切Apolo1-M，将酶切后的Apolo1-M插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-Apolo1-M。
用BglII和SalI酶切Apolo1-C-WT，将酶切后的Apolo1-C-WT插入同样酶切后的EGFP-C1载体，得到缺失突变体GFP-Apolo1-C-WT。
实施例2.Apolo1在有丝分裂期的定位鉴定
24孔板内的HeLa细胞，在37℃下培养于添加10％FBS的DMEM培养基中。转染36小时后弃去培养基，用预热的PHEM buffer于37℃下固定10分钟，然后按照(Yao,X.,A.Abrieu,Y.Zheng,K.F.Sullivan,and D.W.Cleveland.2000.CENP-E forms a link betweenattachment of spindle microtubules to kinetochores and the mitoticcheckpoint.Nat Cell Biol.2:484-91.)所述方法进行。在去卷积倒置荧光显微镜下观察，并拍照(去卷积倒置荧光显微镜为OLYMPUS公司产品IX71；相机为COOLSNAP HQ2相机，采集图象的软件为DeltaVision softWoRx)。结果如图2所示，Apolo1于有丝分裂的前中期定位于动点，从后期开始动点定位的荧光强度下降，出现中心纺锤体定位，bar＝10μm。
实施例3.Apolo1与PLK1相互作用区域的鉴定
一、免疫沉淀检测Apolo1和PLK1之间的相互作用
处理一：将HA载体(Addgene：Cat.No.128034)和FLAG-PLK1用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T(HEK293T)细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理二：将HA-Apolo1和FLAG-PLK1用Lipofectamine 2000试剂共转染HEK293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
上述两组处理的细胞培养24小时后，收集培养的细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的HEK293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。将1毫升上清与20微升结合FLAG标签抗体的树脂(anti-FLAG M2 coupled to UltraLink Protein A/G)(Ezview Redanti-FLAG M2 Affinity Gel)(Sigma:Cat.No.F2426)在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并将其转移至硝酸纤维素膜上。图3中，泳道1、2分别代表FLAG-PLK1与HA载体及HA-Apolo1共转染HEK293T细胞以后的细胞裂解液用FLAG抗体(Sigma，Cat.No.F1804)和HA抗体(CST，Cat.No.C29F4)进行检测的结果，泳道3、4分别代表FLAG-PLK1与HA载体及HA-Apolo1共转染293T细胞以后的细胞裂解液用结合FLAG标签抗体的树脂纯化后用FLAG抗体和HA抗体进行检测的结果。结果表明：FLAG-PLK1和HA-Apolo1存在相互作用。
二、免疫沉淀检测Apolo1和PLK1相互作用的区域
处理一：将FLAG-PLK1和GFP-Apolo1-N用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理二：将FLAG-PLK1和GFP-Apolo1-M用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理三：将FLAG-PLK1和GFP-Apolo1-C-WT用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
上述三组处理的细胞培养24小时后，收集培养的细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的HEK293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。将1毫升上清与20微升结合FLAG标签抗体的树脂(anti-FLAG M2 coupled to UltraLink Protein A/G)(Ezview Redanti-FLAG M2 Affinity Gel)(Sigma:Cat.No.F2426)在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并将其转移至硝酸纤维素膜上。图3中，泳道1-3分别代表FLAG-PLK1与GFP-Apolo1及其缺失突变体共转染293T细胞以后的细胞裂解液用FLAG抗体(Sigma，Cat.No.F1804)和GFP抗体(Sigma，Cat.No.G1544)进行检测的结果，泳道4-6分别代表FLAG-PLK1与GFP-Apolo1及其缺失突变体共转染293T细胞以后的细胞裂解液用结合FLAG标签抗体的树脂纯化后用FLAG抗体和GFP抗体进行检测的结果。
结果表明：只有Apolo1-N与FLAG-PLK1有明显相互作用，表明Apolo1的第1-176位氨基酸残基负责与PLK1的相互作用。
实施例4.Apolo1基因siRNA的合成及其对PLK1激酶活性的抑制作用
一、抑制Apolo1基因表达的siRNA及其编码基因的设计及合成
根据Apolo1基因的mRNA序列，借助Ambion公司在网上提供的siRNA工具软件设计其siRNA序列，得到两条双链RNA序列，命名为Apolo1 siRNA-1、Apolo1 siRNA-2，再设计一条作为阴性对照的双链RNA序列，命名为Control siRNA，序列如下：
Apolo1 siRNA-1：
正义链：5’-caggauaucucuacucaaauu-3’(SEQ ID NO:5)；
反义链：5’-aauuugaguagagauauccug-3’(SEQ ID NO:6)；
Apolo1 siRNA-2：
正义链：5’-caacagacauucagccuuuuu-3’(SEQ ID NO:7)；
反义链：5’-aaaaaggcugaaugucuguug-3’(SEQ ID NO:8)；
Control siRNA：
正义链：5’-aauccuuaggcaacagccaccug-3’(SEQ ID NO:27)；
反义链：5’-cagguggcuguugccuaaggauu-3’(SEQ ID NO:28)。
二、检测Apolo1基因的siRNA对Apolo1基因在细胞内表达的抑制作用
用美国Invitrogen公司的LipofectamineTM 2000试剂盒并参照试剂盒操作指南将化学合成的Apolo1 siRNA-1、Apolo1 siRNA-2和Control siRNA分别转染24孔板内的Hela细胞(每105细胞转染0.1nmol siRNA)，转染36小时后收集转染细胞，使用裂解缓冲液裂解细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清，加入加样缓冲液(2×加样缓冲液：100mmol/LTris·HCl(pH6.8)，200mmol/L二硫苏糖醇，4％SDS(电泳级)，0.2％溴酚蓝，20％甘油)后在100℃下煮10分钟，然后进行10％SDS-PAGE分离细胞中的蛋白，并将其转移至硝酸纤维素膜上，然后分别使用Apolo1抗体(Bioss，Cat.No.bs-15008R)、pT210抗体(CST，Cat.No.5472)、PLK1抗体(CST Cat.No.377100)、pT288抗体(CST，Cat.No.2914)、Aurora A抗体(Abcam,Cat.No.ab13824)、Bora抗体(CST Cat.No.12109))、tubulin抗体(Sigma，Cat.No.T9026)与膜在25℃下孵育1小时，再分别与辣根过氧化酶标记的二抗羊抗鼠抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，Cat.No.115-035-174)和羊抗兔抗体(JacksonImmunoResearch Laboratories，Cat.No.112-035-175)在25℃下孵育30分钟。使用显影仪进行显影，检测pT210、PLK1、pT288、Aurora A、Bora在分别转染Apolo1 siRNA和ControlsiRNA条件下蛋白的表达水平差异，检测结果见图5。结果表明：本发明的Apolo1 siRNA能特异地抑制C1orf112基因在细胞内的表达，同时影响了PLK1蛋白的激酶活性但对Aurora A和Bora无影响。
实施例5.活细胞成像检测Apolo1在细胞周期中的功能
利用HeLa细胞，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术得到了Apolo1条件敲除的细胞系Apolo1 KO细胞。当培养的细胞用doxycycline(Sigma，Cat.No.D9891)处理后，Apolo1蛋白无法表达，从而达到目的基因被敲除的目的。
将细胞培养于35mm玻璃底的细胞培养皿(MatTek，Cat.No.TKO-289-367)。
处理一：将mCherry-H2B(Addgene，Cat.No.20972)和GFP-Tubulin(Addgene，Cat.No.62736)用Lipofectamine 3000试剂共转染Apolo1 KO细胞，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中，此处理定义为对照(Control)。
处理二：将mCherry-H2B(Addgene，Cat.No.20972)和GFP-Tubulin(Addgene，Cat.No.62736)用Lipofectamine 3000试剂共转染Apolo1 KO细胞，在37℃下培养于添加doxycycline和10％FCS的DMEM培养基中，此处理定义为KO。
上述两个处理的细胞转染6小时后，处理两组细胞以Thymidine(Sigma，Cat.No.50895)16小时，PBS释放细胞8小时，置于偶联温度控制箱的去卷积倒置荧光显微镜下观察，并拍照(去卷积倒置荧光显微镜为OLYMPUS公司产品IX71；相机为COOLSNAP HQ2相机，采集图象的软件为DeltaVision softWoRx)。结果如图6所示，Control组的细胞正常分裂而KO组细胞表现为有丝分裂时间延长、滞后染色体、多极纺锤体和染色体桥，对以上表型进行统计如图7，Control组和KO组在有丝分裂时间的对比上差异极显著。
实施例6.免疫沉淀检测Apolo1与PP1γ的相互作用
处理一：将FLAG-Apolo1和GFP Vector(Clontech，Cat.No.6084-1)用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理二：将FLAG-Apolo1和GFP-PP1α用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理三：将FLAG-Apolo1和GFP-PP1β用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
处理四：将FLAG-Apolo1和GFP-PP1γ用Lipofectamine 2000试剂共转染人胚肾成纤维293T细胞(每106细胞转染10μg每种质粒)，在37℃下培养于添加10％FCS的DMEM培养基中。
上述四个处理的细胞培养24小时后，收集培养细胞，用细胞裂解液在冰上裂解转染的293T细胞，4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清。将1ml微升上清与20微升结合FLAG标签抗体的树脂(anti-FLAG M2 coupled to UltraLink Protein A/G)(Ezview Red anti-FLAG M2 Affinity Gel)(Sigma:Cat.No.F2426)在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，在4℃下50rpm振荡孵育4小时后，用细胞裂解液洗三次，用预冷的PBS洗二次，随后，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行10％SDS-PAGE电泳并将其转移至硝酸纤维素膜上。图8中，泳道1-4分别代表FLAG-Apolo1与GFPVector、GFP-PP1α、GFP-PP1β和GFP-PP1γ共转染293T细胞以后的细胞裂解液用FLAG抗体(Sigma Cat.No.F1804)和GFP抗体(Sigma，Cat.No.G1544)进行检测的结果，泳道5-9分别代表FLAG-Apolo1与GFP Vector、GFP-PP1α、GFP-PP1β和GFP-PP1γ共转染293T细胞以后的细胞裂解液用结合FLAG标签抗体的树脂纯化后用FLAG抗体和GFP抗体进行检测的结果。结果表明：PP1α、PP1β不能与Apolo1结合，只有PP1γ和Apolo1存在相互作用。
实施例7.体外pull-down鉴定Apolo1磷酸化位点突变体对其结合PP1γ的影响
His-Apolo1-C-WT和His-Apolo1-C-4A在Rossetta(DE3)pLysS(Novagen，Cat.No.70956)宿主菌中30℃表达，然后用Ni-NTA Agarose(Qiagen)，按照标准步骤进行纯化，分别得到纯化的His-Apolo1-C-WT和His-Apolo1-C-4A融合蛋白。GST-PP1γ在Rossetta(DE3)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用Glutathione-Agarose(Sigma)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的GST-PP1γ融合蛋白。pGEX-6P-1在Rossetta(DE3)pLysS宿主菌中30℃表达，然后用Glutathione-Agarose(Sigma)，按照标准步骤进行纯化，得到纯化的GST蛋白。
处理1：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的His-Apolo1-C-WT蛋白。
处理2：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的His-Apolo1-C-4A融合蛋白。
处理3：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST-PP1γ融合蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的His-Apolo1-C-WT融合蛋白。
处理4：在Eppendorf管中加入10μl结合了GST-PP1γ融合蛋白的GST树脂，再加入100μl浓度为0.1μg/μl的纯化后的His-Apolo1-C-4A融合蛋白。
4℃混匀仪2h，然后4℃、12000rpm离心0.5min，将上清去除。用1mL冰预冷的裂解液(50mM NaH2PO4,pH8.0；300mM NaCl)悬浮树脂，4℃、12000rpm离心0.5min，重复三次，加入2×电泳上样缓冲液50μl，100℃煮样品3分钟，进行电泳并用考马斯亮蓝染色。
电泳图谱如图9所示。图9中，1：纯化的His-Apolo1-C-WT融合蛋白；2：纯化的His-Apolo1-C-4A融合蛋白；3：处理1；4：处理2；5：处理3；6：处理4。结果表明：Apolo1可以和PP1γ在体外直接相互作用，模拟不可被磷酸化突变体融合蛋白无法与PP1γ相互作用。
实施例8.理论模型
如图10所示，在有丝分裂的前期，PLK1处于较高的激酶活性状态，伴随有丝分裂的进行，在前中期/中期，PLK1对Apolo1氨基C端KVVSF基序的磷酸化导致Apolo1与PP1γ的相互作用减弱，从而促进了PP1γ对PLK1的去磷酸进程，此时PLK1的激酶活性下调，从而保证了有丝分裂得以继续正常进行。
Figure GDA0002761269440000131
Figure GDA0002761269440000141
Figure GDA0002761269440000151
Figure GDA0002761269440000161
Figure GDA0002761269440000171
Figure GDA0002761269440000181

Claims (7)

1.一种蛋白，是由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第1-176位氨基酸组成的蛋白质，或所述蛋白质的缀合物，其中所述蛋白质缀合了GFP。
2.权利要求1所述的蛋白，其中所述GFP缀合于所述蛋白质的N端或C端。
3.权利要求1所述蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于：是SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的第1-528位核苷酸组成的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.权利要求1所述蛋白、权利要求3或4所述基因在制备抑制肿瘤增殖的药物中的应用。
7.药物组合物，其包含权利要求1所述蛋白、权利要求3或4所述基因和权利要求5所述重组表达载体中的至少一种。
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