CN101254198A - 红景天苷延缓衰老的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及传统中药红景天有效成分在延缓衰老方面的新用途，具体而言，涉及红景天苷在制备延缓衰老药物中的应用，实验研究证明，所述红景天苷在细胞模型和动物体内，均有明显延缓衰老的作用，有望将其开发成为相关保健品利防治衰老疾病的药物。

Description

红景天苷延缓衰老的新用途

技术领域：

本发明涉及传统中药红景天有效成分在延缓衰老方面的新用途，具体而言，涉及红景天苷在制备延缓衰老药物中的应用。

背景技术：

高山红景天是景天科红景天属的多年生草本植物，分布于俄罗斯西伯利亚及我国东北等高纬度寒冷地区，具有类似中医扶正固本、滋补强身的“适应原样”的作用。高山红景天的主要成分是红景天苷(salidroside，C₁₄H₂₀O₇)。目前红景天苷的来源可以是天然提取，亦可人工合成。现代药理学研究证明，红景天对人体免疫系统、内分泌系统及代谢系统具有良好的调理作用，主要功能有抗疲劳作用、强心作用、抗炎作用、抑制血糖升高、抗氧化作用和抗微波辐射作用等。但是，本发明所涉及红景天有效成分红景天苷在延缓衰老方面的作用与功效，迄今尚未见有相关的报道。

本发明的目的是，提供红景天有效成分在延缓衰老方面的新用途，具体而言，是提供红景天苷在制备延缓衰老药物中的应用。

发明内容：

本发明所使用的红景天苷系参照两步树脂法工艺制备的(专利公开号：CN1880326A)。

本发明提供了红景天苷延缓衰老的系列生物学实验研究，进而提供了红景天苷延缓衰老的新用途。具体生物学实验包括以下方面：

1、红景天苷对延缓果蝇衰老的影响

果蝇是一种真核多细胞生物，因其代谢系统、生理功能、生长发育等方面与哺乳动物基本相似，故将其作为衰老或延寿方面的研究对象。研究结果表明，红景天苷能明显延长果蝇的平均寿命，雄蝇延长10.5天，雌蝇延长15.8天，经统计学处理，有显著性差异。

2、通过检测机体内相关酶学等指标的变化，研究衰老的进程

由于自然衰老的发生，小鼠体内抗氧化相关酶SOD(超氧化物歧化酶)和GSH-Px(谷胱甘肽过氧化物酶)的活力较低，LPO(过氧化脂质)生成增加，脂褐素堆积也出现增龄性增加。SOD活力高低反映体内抗氧化能力的酶指标，LPO生成量和脂褐素的累积程度反映衰老进程。GSH-Px可催化GSH(谷胱甘肽)清除氧自由基，间接降低过氧化脂质的形成。通过给自然衰老小鼠口服一定剂量的红景天苷，系统测定小鼠四种主要脏器以及血清中各指标的变化，发现老年小鼠给红景天苷后，血清、心脏、肝脏、肾脏和脑的SOD活力有所提高，其中血清、心脏、肝脏和脑中的SOD活力明显高于对照组，分别为686.30±67.87NU(亚硝酸盐单位)/ml，28.49±7.63NU/mg，101.02±20.88NU/mg和214.90±10.25NU/mg，差异显著(P＜0.05)；肾脏中活力提高不明显。对老年小鼠体内LPO生成影响研究结果，对照组的LPO生成维持在较高水平，血清及心脏、肝脏、肾脏、脑组织中MDA(丙二醛)含量分别为1.392±0.381nmol/ml，101.26±28.62nmol/g，46.22±7.44nmol/g，16.38±2.12nmol/g，61.66±2.26nmol/g，高剂量红景天苷对小鼠血清、心脏、肝脏和肾脏MDA含量有显著降低作用(P＜0.05)，分别平均降低27％、34％、71％和20％左右，对脑组织的MDA水平改变不显著。

3、红景天苷对衰老作用的动物体内实验研究

老年小鼠血清中AGE(晚期糖基化终产物)含量比年轻小鼠高(P＜0.01)；红景天苷可以抑制AGE在D-半乳糖处理的年轻小鼠血清中的积累(P＜0.01)，对年轻小鼠血清中AGE含量无影响。D-半乳糖模型小鼠表现为学习记忆能力和自主活动能力下降，大脑皮层中GFAP(胶质纤维酸性蛋白)、NT-3(神经营养蛋白-3)含量增加，两者的含量和衰老程度成正相关，红景天苷可干预其衰老进程，降低两者在大脑皮层中的表达。老年小鼠和D-半乳糖模型小鼠的脾细胞增殖能力均有不同程度下降，IL-2(白细胞介素-2)活力也下降40％以上，红景天苷可以部分拮抗这种改变。

4、通过建立早熟性衰老模型，研究红景天苷对模型细胞的影响

本发明以双氧水(H₂O₂)诱导人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS)早熟性衰老为模型，研究红景天苷对模型细胞形态、细胞周期、衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)和单细胞凝胶电泳等方面的影响。结果表明，年轻2BS细胞SA-β-gal染色阳性率很低，而衰老细胞染色阳性率较高。同时使用红景天苷处理，SA-β-gal染色阳性率明显下降，同时，形态上也向年轻化转变，彗星拖尾现象减轻，表明减轻DNA的断裂或加速DNA的修复。自然衰老细胞及H₂O₂诱导细胞增殖缓慢，G1细胞可达70-80％，而红景天苷处理后G1细胞减少到60％左右。

发明效果：

本发明的优点和积极效果在于，通过系统研究发现并证明，红景天苷在细胞模型和动物体内，均有明显延缓衰老的作用，有望将其开发成为相关保健品和防治衰老疾病的药物。

附图说明：

图1-老年小鼠血清、心脏、肝脏、肾脏和脑中的SOD活力

其中：纵坐标-SOD活力(NU/ml血清或NU/mg组织)；

      横坐标-A-血清；

             B-心脏；

             C-肝脏；

             D-肾脏；

             E-脑。

□对照组

人参皂苷给药组

红景天苷给药组(5g/kg)

图2-老年小鼠血清、心脏、肝脏、肾脏和脑中的MDA水平

其中：纵坐标-MDA水平(nmol/ml血清或nmol/g组织)；

      横坐标-A-血清；

             B-心脏；

             C-肝脏；

             D-肾脏；

             E-脑。

□对照组

人参皂苷给药组

红景天苷给药组(5g/kg)

图3-老年小鼠血清、心脏、肝脏、肾脏和脑中的GSH-Px活力

其中：纵坐标-GSH-Px活力(U/ml血清或U/mg蛋自)；

      横坐标-A-血清；

             B-心脏；

             C-肝脏；

             D-肾脏；

             E-脑。

□对照组

人参皂苷给药组

红景天苷给药组(5g/kg)

图4-小鼠血清中AGE水平

其中：纵坐标-AGE含量(U/ml)；

      横坐标-A-年轻小鼠(5月龄)；

             B-老年小鼠(18月龄)；

             C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

             D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)；

             E-红景天苷给药小鼠(5月龄)。

图5-小鼠的自主活动能力

其中：纵坐标-自主活动率(％)；

      横坐标-A-年轻小鼠(5月龄)；

             B-老年小鼠(18月龄)；

             C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

             D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)。

图6-小鼠被动学习记忆能力

其中：纵坐标-潜伏期时间(秒)；

      横坐标-A-年轻小鼠(5月龄)；

             B-老年小鼠(18月龄)；

             C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

             D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)。

图7-小鼠大脑皮层中GFAP的表达

其中：A-年轻小鼠(5月龄)；

      B-老年小鼠(18月龄)；

      C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

      D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)。

图8-小鼠大脑皮层中NT-3的表达

其中：A-年轻小鼠(5月龄)；

      B-老年小鼠(18月龄)；

      C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

      D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)。

图9-小鼠免疫增殖变化

其中：纵坐标-刺激指数或IL-2活力；

      横坐标-A-年轻小鼠(5月龄)；

             B-老年小鼠(18月龄)；

             C-D-半乳糖给药小鼠(5月龄)；

             D-D-半乳糖和红景天苷同时给药小鼠(5月龄)；

             E-红景天苷给药小鼠(5月龄)。

□刺激指数

IL-2活力(U/ml)

图10-2BS细胞形态学变化

其中：A-年轻2BS(25PD)；

      B-衰老2BS(58PD)

      C-H₂O₂和红景天苷同时给药2BS(25PD)；

      D-H₂O₂给药2BS(25PD)。

图11-2BS细胞增殖曲线

其中：纵坐标-细胞数(10⁴)

      横坐标-时间(天)

衰老2BS(58PD)

-■-H₂O₂给药2BS(25PD)

-◆-年轻2BS(25PD)

图12-2BS细胞周期时相百分比变化

其中：A-年轻2BS(25PD)；

B-衰老2BS(58PD)；

C-H₂O₂给药2BS(25PD)；

D-H₂O₂和红景天苷同时给药2BS(25PD)。

□G1

S

G2/M

图13-单细胞凝胶电泳结果

其中：A-年轻2BS(25PD)；

      B-H₂O₂给药2BS(25PD)；

      C-H₂O₂和红景天苷同时给药2BS(25PD)。

具体实施方案：

以下所列实施例，仅为帮助本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

<实施例1>红景天苷的制备

取市售红景天初提取物500克，加水5000ml溶解，加热至30℃，搅拌保温2.5小时。过滤得到澄清滤液。滤液调节pH至3，常温下流过HZ-816吸附树脂(上海华震科技有限公司)柱，然后通入30％的乙醇1200ml，收集流出液。流出液浓缩至糖浆状，加入HZ-816吸附树脂混合均匀并烘干。按照烘干的吸附树脂∶已装柱的吸附树脂＝1∶6的比例，将烘干的树脂加入已填充了HZ-816吸附树脂的层析柱，常温下通入15％的乙醇溶液进行层析。收集层析液，浓缩至干。加入乙醇溶解，加热至50℃，趁热过滤。浓缩滤液，冷却至0℃，析出结晶，滤液同收套用。红景天苷结晶用乙醇清洗后，60℃真空干燥，得到红景天苷白色粉末，经HPLC测定，纯度为97.2％。

<实施例2>红景天苷对果蝇寿命的影响

培养基：

1)基础培养基：取蔗糖26g、琼脂3g、苯甲酸0.3g溶于190ml重蒸馏水中，取玉米粉24g、酵母4g溶于150ml重蒸馏水中，分别煮沸后混合搅拌均匀，凝固前倒入培养基中，每管培养基厚度约为2cm.。

2)含药培养基：将红景天苷以1g/100ml浓度加入上述培养基中，混合搅拌均匀，凝固前倒入培养基中，每管培养基厚度约为2cm。

动物：黑腹果蝇(引自南京师范大学)。

实验方法：

取24小时内孵化出的黑腹果蝇200只，随机分为两组，即对照组和红景天苷组。每组各100只，雌雄各半。对照组置基础培养基中，红景天苷组置含药培养基中，隔日更换培养基，每日观察并记录死亡果蝇数，直至果蝇全部死亡。计数各组的平均寿命、半数死亡时间及最高寿命并作统计学处理。

实验结果表明，对照组雄性果蝇平均寿命为52.4天，雌性果蝇平均寿命60.1天；红景天苷组雄性果蝇平均寿命为62.9天，雌性果蝇平均寿命75.9天，与对照组相比，平均寿命分别延长为10.5天和15.8天，经统计学处理呈显著性差异，表明红景天苷能明显延长果蝇平均寿命(表1)。

表1  红景天苷对果蝇寿命的影响(mean±SD)

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.001

<实施例3>对自然衰老小鼠主要酶学指标的影响

1)自然衰老小鼠分组及给药方案：

将50只老年ICR小鼠(给药开始时16月龄)随机分为五组，即对照组，高中低三个不同剂量给药组和阳性对照组(人参皂苷)。给药组分别以5g/kg，1g/kg，0.2g/kg，阳性对照组以0.2g/kg的剂量连续灌胃60天，对照组灌以同体积生理盐水。在末次给药2小时后，处死动物，制备所需组织匀浆和血清，进行生化指标测定。

2)SOD活力的测定：

超氧化物歧化酶广泛存在于各种生物体内，其活力水平与衰老和增龄密切相关，其活力提高，有益于于机体的抗氧化能力。本试验采用羟胺法测定总SOD活力，其原理如下：超氧阴离子氧化羟胺的最终产物为亚硝酸盐，后者在对氨基苯磺酸及甲奈胺作用下呈现紫红色，在530nm波长处有最大吸收。当SOD清除超氧阴离子后，形成的亚硝酸盐减少。

①试剂配制：65mmol/L，pH7.8磷酸盐缓冲液(PBS)；10mmol/L盐酸羟胺；7.5mmol/L黄嘌呤；0.2mg/ml黄嘌呤氧化酶；10g/L甲萘胺；3.3g/L对氨基苯磺酸；15U/ml超氧化物歧化酶。

②测试前样品处理：

a.血清样品：摘眼球取血，分离血清，可直接用于测定。

b.组织样品：断颈处死小鼠，迅速剖取肝、心、脑、肾组织，放入生理盐水(0℃)洗净血液，滤纸吸干，称取-定量在冰浴上剪碎，加冷生理盐水，以20000rpm匀浆10秒钟，间歇为30秒，反复3次，制成50g/L组织匀浆，用超声波发生器使线粒体振破(以中性红-詹钠氏绿B染色证明是线粒体破碎)。以4000rpm离心5分钟，取上清液待测。

③样品测定：操作步骤见表2

表2  SOD样品测定程序

^*A表示所用样品量：血清20μl(发生溶血的样本不计入结果)；组织匀浆10-40μl上清。

^**表示用双蒸水将反应液体积调到6.0ml。

④SOD标准抑制曲线：

将SOD标准品用PBS配制成750U/ml的溶液，稀释50倍至15U/ml，用本法测定不同量SOD标准液的百分抑制率，以百分抑制率为纵坐标，以SOD活力单位U/ml为横坐标绘制标准曲线。

SOD百分抑制率＝(对照管OD-测定管OD)/对照管OD×100％

⑤酶活力单位定义：

每ml反应液中，SOD抑制率达到50％时所对应的SOD量为一个亚硝酸盐单位(NU)。血清以NU/ml表示；组织以NU/mg表示。

⑥计算公式：

SOD活力＝(SOD百分抑制率/50％)×(反应液总量/取液量)×样品稀释倍数

⑦SOD测定结果：

检测不同给药组小鼠体内各脏器SOD含量的变化发现，老年小鼠在给红景天苷后，血浆、心脏、肝脏、肾脏、脑的SOD活力有所提高。其中高剂量组(5g/kg)血清、心脏、肝脏、脑中的SOD活力明显高于对照组，分别为血清686.30±67.87NU/ml，心脏28.49±7.63NU/mg，肝脏101.02±20.88NU/mg，脑214.90±10.25NU/mg，差异显著(P＜0.05)；肾脏中活力变化不明显(图1)。

3)红景天苷对LPO生成的影响：

LPO是自由基作用于多不饱和脂肪酸的产物，含量与自由基的生成成正相关。测定LPO是评价抗衰老药物的重要指标之一。LPO在酸性条件下加热分解生成MDA(丙二醛)，MDA的实际含量反映了LPO在组织中的浓度。本试验采用比色法测定MDA，其原理如下：1个MDA分子与2个硫代巴比妥酸(TBA)分子在酸性条件下共热，形成紫红色复合物，在532nm波长下有最大吸收。四乙氧基丙烷(TEP)与TBA在同样条件反应也能生成紫红色复合物，故以它作为标准品。

①试剂配制：40nmol/L TEP标准应用液(甲醇溶解)；0.8％TBA；8.1％SDS；0.2mol/L乙酸盐缓冲液。

②测试前样品处理：

a.血清样品：同SOD处理。

b.组织样品：断颈处死小鼠，迅速剖取肝、心、脑、肾组织，放入生理盐水(0℃)洗净血液，滤纸吸干，称取一定量在冰浴上剪碎，加冷生理盐水，以20000rpm匀浆10秒钟，间歇为30秒，反复3次，制成50g/L组织匀浆，3000rpm离心10分钟，取上清液待测。

③样品测定：操作步骤见表3。

表3  MDA样品测定程序

④计算公式：

A＝(样品管OD值-空白管OD值)/(标准管OD值-空白管OD值)

B＝TEP浓度(nmol/L)

C＝匀浆体积(L)/组织样本重量(g)

血清中MDA含量(nmol/ml)＝A×B/1000

组织中MDA含量(nmol/g)＝A×B×C

⑤LPO测定结果：

试验显示，对照组的LPO生成维持在较高水平，血清及心脏、肝脏、肾脏、脑组织中MDA含量分别为1.392±0.38Inmol/ml，101.26±28.62nmol/g，46.22±7.44nmol/g，16.38±2.12nmol/g，61.66±2.26nmol/g；高剂量红景天苷对小鼠血清，心脏，肝脏，肾脏MDA含量有显著降低作用(P＜0.05)，各自平均降低27％、34％、71％、20％左右；对脑组织的MDA水平改善不明显(图2)。

4)血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统，对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要。GSH-Px在有谷胱甘肽(GSH)存在时，可清除过氧化物如H₂O₂，同时消耗GSH。5，5′-二硫对硝基苯甲酸(DTNB)是一种可以被GSH还原的二硫化物，还原后的DTNB呈黄色，在412nm波长处有最大吸收峰，通过测DTNB被还原的量而估计GSH的消耗，以GSH的消耗量可以推算GSH-Px的活力。由于GSH可进行非酶反应氧化，所以计算酶活力时须扣除非酶反应引起的GSH减少。

①试剂配制：磷酸缓冲液(pH7.0，0.1mol/L Na₂HPO₄-NaH₂PO₄，2.5mmol/L NaN₃，0.2mol/l EDTA)；1mmol/L GSH(3.07mg GSH溶于10ml磷酸缓冲液中)；1.5mmol/LH₂O₂(新鲜配制)；1.67％偏磷酸(1.67g偏磷酸，30gNaCl，0.2gEDTA，加双蒸水至100ml)；0.32mol/LNa₂HPO₄；显色液(DTNB40mg，柠檬酸钠1g，加双蒸水至100ml)。

②测试前样品处理：

a.血清样品：同SOD处理。

b.组织样品：断颈处死小鼠，迅速剖取肝、心、脑、肾组织，放入生理盐水(0℃)洗净血液，滤纸吸干，称取一定量在冰浴上剪碎，加冷磷酸缓冲液，以20000rpm匀浆10秒钟，间歇为30秒，反复3次，制成50g/L组织匀浆，4℃12000rpm离心15分钟，取上清液待测，并采用Bradford法测定上清液蛋白浓度。

③样品测定：操作步骤见表4。

表4  GSH-Px样品测定程序

④GSH标准曲线：

取1.0mmol/L GSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，分别置于10ml小容量瓶中，各加入1.67％偏磷酸8ml，用双蒸水稀释至10ml刻度，即得浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的GSH标准液。

取上述不同浓度标准液各2ml，放入试管中，加入0.32mol/L Na₂HPO₄2.5ml，比色前加入DTNB显色液0.5ml，5分钟内于412nm波长测定OD值，以双蒸水调零点。

以GSH含量(μmol/L)为横坐标，OD₄₁₂值为纵坐标，即可制作标准曲线并得到回归方程。

⑤计算方法：

a.血清GSH-Px活力计算：规定每ml血清每分钟扣除非酶反应的1g[GSH]降低后，使1g[GSH]降低1为一个酶活单位。

血清GSH-Px活力(U/ml)＝

{1g[非酶管OD-空白管OD]-1g[样品管OD-空白管OD]}/0.012

b.组织GSH-Px活力计算：规定每mg组织蛋白每分钟扣除非酶反应，使GSH浓度降低1μmol/L为一个酶活单位。

组织GSH-Px活力(U/mg蛋白)＝

(非酶管OD-样品管OD)×A×5/3×样品蛋白含量(A＝GSH标准曲线斜率)

⑥GSH-Px活力测定结果：

谷胱甘肽过氧化物酶是机体中重要的一种抗氧化酶，能间接减少体内过氧化脂质的形成。随着衰老的加剧，酶活力也随之降低。对照组血清、心脏、肝脏、肾脏、脑组织中，GSH-Px的酶活分别为27.17±1.53U/ml，14.91±1.60U/mg蛋白，30.50±5.72U/mg蛋白，22.10±1.65U/mg蛋白，45.63±7.38U/mg蛋白。高剂量给药组的血清和肝脏中，GSH-Px酶活力较对照组明显提高，分别达到了45.57±1.39U/ml和38.62±2.30U/mg蛋白；心脏、肾脏及脑组织中酶活力改善不显著，但较对照组也有所提高(图3)。

<实施例4>红景天苷干预D-半乳糖衰老效应的研究

1)动物分组及给药方案：

健康雌性C57BL/6J小鼠(由中国医学科学院实验动物中心提供)；

年轻小鼠80只(给药开始时3月龄，18-22g)；

老年小鼠30只(给药开始时16月龄，26-28g)；

第一组：年轻小鼠(生理盐水，腹腔注射)对照组；

第二组：老年小鼠(生理盐水，腹腔注射)对照组；

第三组：D-半乳糖(50mg/Kg/天，腹腔注射)模型组；

第四组：D-半乳糖(50mg/Kg/天，腹腔注射)+红景天苷(1g/Kg/天，灌胃)；

第五组：年轻小鼠+红景天苷(1g/Kg/天，灌胃)。

给药前后称重，给药60天后处死动物，收集血清、脏器组织，-70℃储存。

2)AGE的检测

在96孔板中，加入100μl用0.1mol/L碳酸钠缓冲液(pH9.6)稀释成AGE-BSA(牛血清白蛋白)的标准品(3μg/ml)，于4℃孵育过夜。用200μl洗涤缓冲溶液(PBS，0.05％Tween-20，1mmol/LNaN₃)洗3次，加入150μl封阻液[PBS，1％正常羊血清(NGS)]，37℃温育2小时。用200ml洗涤缓冲液洗3次，加入50μl稀释液(PBS，0.02％Tween-20，1mmol/LNaN₃，1％NGS)1∶10稀释的血清和50μl用稀释液1∶3000稀释的AGE多克隆抗体，室温下轻摇2小时。用200μl洗涤缓冲液洗3次，加入100μl用稀释液1∶2000稀释的碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG，37℃温育1小时。用200ml洗涤缓冲液冲洗6次，加入100μlpNPP(对硝基苯甲酸)底物，37℃温育1小时。于405nm波长测定OD值，用AGE-BSA标准品制备标准曲线，计算样品AGE含量。

3)自主活动试验

本实验采用光电法，XZ-4型小鼠自主活动仪有四个直径190mm高100mm的暗盒，每个暗盒的周边都有4个光源及与之对应的光电管，小鼠在盒内的活动通过光电探测器进行记录。将小鼠分别置于盒中，每盒一只，两分钟适应期后，记录10分钟内动物运动的次数。以给予生理盐水的年轻鼠运动次数为标准，记为100％，计算其他组动物的运动率。

4)避暗试验

避暗试验用来检测小鼠的学习记忆能力。WX-5型小鼠避暗实验仪的大小为36×12×12cm，分为明暗两室，在底部均安装有铜栅，其中暗室的铜栅通电，明室上方置台灯，明暗两室之间有一直径为3cm的洞口，暗室连接有一记录器，可记录小鼠从明室通过洞口进入暗室前的潜伏期时长和进入暗室的次数。实验时将小鼠的头部背对洞口放入明室，开始计时。小鼠基于嗜暗的习性会进入暗室，一进入暗室即受电击，计时器同时停止计时，此时间为潜伏期。给药结束前10天将小鼠置于明室内，暗室通以30v，50hz的电刺激，训练5分钟。10天后将动物置于明室内，记录潜伏期及5分钟内的错误次数(进入暗室的次数)，检测小鼠的记忆能力。

5.免疫组织化学研究脑组织中GFAP与NT-3的表达

用乙醚麻醉小鼠，剪开胸腔，自左心室插入灌流管至主动脉内固定，在右心耳剪一小口让血液和灌流液流出。先用100ml生理盐水灌流，接着以100ml 4％(w/v)多聚甲醛溶液(pH7.4，以0.01mol/LPBS配制)灌流。取出脑组织，置于4％多聚甲醛溶液中，4℃固定24小时；然后转入含30％蔗糖的4％多聚甲醛溶液中，4℃固定24小时；再转入30％蔗糖溶液中4℃放置，24小时后换液一次。在冰冻切片机上，按冠状面切成40μm厚的组织切片，贴于涂有多聚赖氨酸的玻片上。

用含0.2％Triton X-100的PBS(0.01mol/L，pH7.4)浸泡20分钟，用含10％NGS的PBS室温下封闭20分钟。弃去血清，加上1∶50稀释的一抗(含3％BSA，0.1％ TritonX-100的PBS稀释)，于4℃反应48小时。PBS冲洗3次，每次5分钟，滴加1∶100稀释的生物素标记的二抗(含1％BSA，0.1％Triton X-100的PBS稀释)，室温反应60分钟。PBS冲洗3次，每次5分钟，加1∶100稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS稀释)，室温反应20分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟，DAB(3，3-二氨基联苯胺)显色，室温下显色15分钟。自来水充分冲洗，浸入蒸馏水5分钟。取出后按照以下步骤脱水透明：70％乙醇，1分钟；80％乙醇，1分钟；95％乙醇，1分钟；100％乙醇，5分钟，2次；二甲苯，2次。滴上二甲苯溶解的加拿大树胶，盖上盖玻片，自然晾干。

6)脾淋巴细胞增殖实验：

处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，放入培养液中，在不锈钢网上研磨，制备细胞悬液。离心收集细胞，加入Tris-氯化铵红细胞裂解液处理2分钟，裂解红细胞，再用RPM11640培养液(GIBCO BRL公司)洗涤细胞2次，调节细胞浓度为10⁷/ml。在96孔板中加入100μl脾淋巴细胞悬液，然后加入用培养液配制的ConA(刀豆蛋白A)，使ConA终浓度达到7μg/ml。在二氧化碳培养箱中37℃培养44小时，然后每孔分别加入20μl 5mg/ml的MTT(四甲基偶氮唑蓝)，在培养箱中继续放置4小时。弃去培养液，加入200μl二甲亚砜，37℃震荡10分钟，于570nm波长测定OD值，并计算刺激指数，刺激指数＝加ConA孔OD值/空白对照孔OD值。

7)IL-2活性测定

在培养瓶中加入ConA和脾淋巴细胞，使ConA终浓度为7μg/ml，脾淋巴细胞终浓度为5×10⁶/ml。于37℃培养24小时，离心收集上清液，在-20℃下保存备用。

将CTLL-2细胞(美国菌种保藏中心，ATCC)在含有IL-2的培养液中进行传代。使用时离心收集细胞，用不含IL-2的RPMI-1640培养液洗涤2次，调节细胞浓度为4×10⁵/ml。在96孔板上每孔加入100μl CTLL-2细胞悬液，再加入100μl稀释的脾淋巴细胞上清液。在37℃培养20小时，然后每孔分别加入20μl 5mg/ml的MTT，在培养箱中继续放置4小时。弃去培养液，加入200μl二甲亚砜，37℃震荡10分钟，于570nm波长测定OD值。用标准品制备标准曲线，计算样品中IL-2浓度。

实验结果：

A、老年小鼠形态学变化

老年小鼠与对照组年轻小鼠相比，体毛蓬松，没有光泽，运动减少，动作相对较迟缓，因抢食发生的争斗减少。D-半乳糖处理的年轻小鼠也具有类似特征。同时给与D-半乳糖和红景天苷的年轻小鼠与对照组年轻小鼠相比，没有明显差别。

B、红景天苷对AGE含量的影响

老年小鼠血清AGE含量为6.10±1.54U/ml，而年轻小鼠血清AGE含量仅为2.95±1.10U/ml，老年小鼠血清AGE与年轻小鼠相比有非常显著差异(P＜0.01)；D-半乳糖处理年轻小鼠血清AGE亦有显著升高，达到6.18±2.14U/ml，接近自然衰老小鼠的AGE水平，说明D-半乳糖对小鼠的影响十分明显，而年轻小鼠给D-半乳糖的同时再给红景天苷后，其血消AGE含量则下降为3.85±1.32U/ml，与D-半乳糖组小鼠AGE水平有非常显著差异(P＜0.01)，高于对照组年轻小鼠的AGE水平，但无显著差异。这说明红景天苷可以部分抑制AGE在D-半乳糖处理的年轻小鼠血清中的积累(P＜0.01)。红景天苷对年轻小鼠血清中AGE含量无影响(图4)。

C、自主活动能力检测

利用自主活动仪监测神经肌肉活动，发现与年轻小鼠相比，老年小鼠的自主活动能力较低(P＜0.05)，自主活动率只有年轻小鼠的70％左右。D-半乳糖处理的年轻小鼠的自主活动能力显著下降(P＜0.01)，只有年轻对照组活动率的50％左右。红景天苷给药组的活动能力则与年轻对照组没有差别(图5)。

D、小鼠被动学习记忆能力

避暗试验法在明室中的潜伏期时间长短与学习记忆能力成正比，而进入暗室的错误次数与学习记忆能力成反比。结果显示，老年小鼠的学习记忆能力较差，潜伏期仅有179±31秒，比年轻小鼠的265±43秒有明显缩短，数据具有显著差异(P＜0.05)，而错误次数无显著差异。D-半乳糖处理的年轻小鼠的潜伏期缩短非常显著(P＜0.01)，减至118±24秒，潜伏期同对照组年轻小鼠相比，缩短了55％，D-半乳糖处理年轻小鼠的错误次数同样无统计学差异。同时给与D-半乳糖和红景天苷的年轻小鼠，其潜伏期较单纯给予D-半乳糖的年轻小鼠延长了一倍以上，差异非常显著(P＜0.01)(图6)。由此可以看出，红景天苷可部分拮抗D-半乳糖产生的生物学效应。

E、免疫组织化学试验

老年小鼠大脑皮层中有大量GFAP阳性细胞，而年轻小鼠大脑皮层中GFAP阳性细胞极少。在D-半乳糖处理的年轻小鼠大脑皮层中，GFAP阳性细胞与对照组年轻小鼠相比，有少量增加。与D-半乳糖组相比，D-半乳糖和红景天苷同时给药的年轻小鼠大脑皮层中GFAP阳性细胞较少(图7)。

老年小鼠与D-半乳糖处理的年轻小鼠，大脑皮层中有较高的NT-3表达，而同时给予D-半乳糖和红景天苷的年轻小鼠和对照组年轻小鼠的大脑皮层中，NT-3含量均相对较低(图8)。

F、红景天苷对免疫增殖的影响

伴随机体衰老进程的是机体免疫能力的下降，其中包括淋巴细胞在促分裂原[ConA和PHA(植物凝血素)等]刺激下，增殖能力和IL-2产量下降。与预期相同，老年小鼠的刺激指数和IL-2活力与年轻小鼠相比显著降低(P＜0.01)。它的刺激指数和IL-2活力分别为1.66±0.18和8.05±1.36U/ml，而年轻小鼠为3.25±0.26和13.80±2.60U/ml。D-半乳糖处理的年轻小鼠也具有较低的刺激指数和IL-2活力，分别为1.54±0.15和5.92±1.94U/ml，而红景天苷可抑制D-半乳糖引起的小鼠免疫机能下降，刺激指数和IL-2活力提高了50％左右，分别达到了2.69±0.22和12.25±1.98U/ml。红景天苷单独处理的年轻小鼠的免疫功能没有明显变化(图9)。

<实施例5>红景天苷延缓细胞衰老的分子机制研究

本发明以H₂O₂诱导的人胚肺成纤维细胞早熟性衰老为模型，研究天然活性成分红景天苷对模型细胞形态、细胞周期、SA-β-gal染色、DNA损伤修复能力等方面的影响，以进一步阐明红景天苷延缓细胞衰老的作用机制。具体步骤包括：

1)细胞培养：

2BS细胞(中国药品生物制品检定所)用含有10％胎牛血清(北京经科宏达生物技术公司)的高糖DMEM培养基(GIBCO BRL公司)，37℃5％CO₂恒温培养，待细胞生长到80-90％汇合时用0.25％胰酶消化，移液管轻轻吹散后按照1‘2比例传代培养。年轻细胞挑选代龄在30PD以内的细胞使用，衰老细胞传至55PD以上使用。

细胞冻存：合适浓度(约10⁷/ml)的2BS细胞经消化后，转移至含有30％胎牛血清，10％DMSO的高糖DMEM培养基中，液氮保存。

2)DNA损伤模型的建立

用H₂O₂处理2BS细胞。H₂O₂储存液密封置于4℃避光保存，试验前临时用无菌PBS稀释至100mmol/L后，加入培养基中，添加至100μmol/L，处理2BS细胞2周左右(每3天更换新鲜培养基，同时添加相同浓度H₂O₂，37℃5％CO₂恒温培养)，得到DNA损伤细胞模型。

3)细胞形态及增殖特性的观察

10×光学显微镜下观察细胞形态的变化，并拍摄及记录结果。

将对数生长期的年轻2BS(25PD)接种于六孔板中，接种浓度1×10⁴/孔。置于细胞培养箱内37℃、5％CO₂条件下培养20小时，而后转入含有100μmol/L H₂O₂的培养基中继续培养，分别于0、24、48、72、96、120、144、168、240、312和384小时进行细胞计数。每次计数操作重复六次取平均值，绘制生长曲线，比较H₂O₂处理的细胞与对照细胞的增殖速率。

4)流式细胞仪分析细胞周期

当细胞培养至70-80％汇合时，用冷PBS洗涤2次，0.25％胰酶消化，收集于离心管中。取1×10⁶个细胞，75％乙醇4℃固定后，于4℃存放备用。上机检测前，离心去除乙醇，用0.01mol/LPBS洗2次，用1ml的PBS重悬细胞，加入RNaseA至终浓度为50μg/ml于37℃消化30分钟，然后用终浓度为65μg/ml PI避光染色1小时，经尼龙网过滤后，用流式细胞仪FACScan(Becton Diskinson，美国，氩离子激光激发，波长488nm)检测，每个样品收集1×10⁴个细胞，数据采集分析软件为ModFit LT。

5)衰老相关的β-半乳糖苷酶染色

细胞培养至70-80％接触时，用冷PBS洗涤2次后，于室温用3％甲醛固定3-5分钟。再用PBS洗涤2次，加上新配制的SA-β-gal染液(1mg/ml X-gal，40mmol/L柠檬酸-磷酸钠缓冲液pH6.0，5mmol/L铁氰化钾，5mmol/L亚铁氰化钾，150mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂)37℃温育(无CO₂)，2-4小时后开始显色，12-16小时显色程度即可达到最大化。

6)单细胞凝胶电泳(亦名彗星电泳)

细胞经胰酶消化并离心收集，用PBS洗涤2遍，制成单细胞悬液，调整浓度为2×10⁵个细胞/ml。取200μl 0.5％正常熔点的琼脂糖铺于载玻片上，用盖玻片压平胶面，4℃凝固10分钟，取37℃水浴中的1％低熔点琼脂糖50μl与等量的细胞悬液混匀，铺于上述载玻片胶面上，立即用盖玻片压平胶面，4℃凝固10分钟，取掉盖玻片，将胶板浸没于预冷的细胞裂解液(2.5mol/L NaCl，100mmol/L Na₂EDTA，1％月桂酰基肌氨酸钠，10mmol/L Tris，1％Triton X-100，pH 10.0)中，4℃裂解1小时，取出胶板放入水平电泳槽中，加入新配制的电泳缓冲液(0.3mol/LNaOH，1mmol/L EDTA，pH13.0)中，放置20分钟后，4℃电泳20分钟(25V，300mA)。电泳完毕后，将胶板浸泡于中和液(0.4mol/L Tris-HCL，pH7.5)中，中和2次，每次15分钟，然后用5μg/ml的PI于暗室染色15分钟，蒸馏水脱色15分钟，立即在荧光显微镜下观察，绿光激发，激发滤片567nm，阻挡滤片590nm，目镜10×，物镜20×，普通胶片(100°)拍摄。

实验结果：

A、细胞形态变化

衰老2BS细胞形态明显不同于年轻细胞，年轻细胞形状细长，胞浆清亮，细胞呈漩涡状规则排列；而衰老细胞的体积肥大，胞浆内颗粒增多，胞浆浑浊，折光性下降，细胞排列不规则；用H₂O₂(100μmol/L，培养12天)处理后，细胞与衰老细胞相似；用H₂O₂处理的同时加入20μmol/L红景天苷，细胞形状细长，排列规则，接近年轻细胞状态(图10)。

B、细胞增殖曲线测定

细胞增殖能力是判断细胞衰老程度的重要生物学指标之一，H₂O₂对2BS细胞具有增殖抑制作用，与不加药的对照组细胞相比，H₂O₂组生长速率低，细胞倍增时间延长。在培养到第120小时时，对照组细胞浓度为接种时的10.2倍，自然衰老细胞组由于代龄过大，增殖明显减慢，其细胞浓度为接种时的2.6倍，而100μmol/L H₂O₂组的细胞浓度也仅为接种时的3.4倍，与自然衰老组相当。说明H₂O₂处理年轻细胞已经出现了衰老现象(图11)。

C、细胞周期时相的变化

分别将给药完毕的各组2BS细胞继续培养72小时，然后将细胞1∶3传代，收集细胞，测定细胞的周期时相。将细胞进行传代的目的是避免空白对照细胞由于增殖过快，在培养瓶内积聚的细胞过多，影响其细胞周期的测定。

对周期结果进行分析发现，二倍体成纤维细胞的年轻细胞G1期为53.8±4.8％，S期为37.3±5.2％，G2/M期为8.8±2.8％；衰老细胞周期时相分别为76.4±3.5％、16.0±2.1％、7.7±1.3％。用H₂O₂(100μmol/L，培养12天)处理的年轻细胞周期时相分别为82.7±2.4％、8.2±3.8％、9.3±2.2％。年轻细胞用H₂O₂处理的同时加入20μmol/L红景天苷，其细胞周期时相分别为66.5±2.9％、22.4±4.0％、11.1±1.7％。可见，经H₂O₂处理的2BS细胞周期分布与衰老细胞相似，细胞主要分布于G1期，占到80％以上，细胞周期阻滞于G1期，红景天苷则可减少细胞阻滞于G1期(图12)。

D、衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色

SA-β-Gal染色阳性率可以反映体外培养细胞的群体衰老水平。当2BS细胞培养至50PD后，细胞汇合速度明显减慢，几乎不再增殖，细胞集体进入衰老状态。细胞形态学上的变化表现为：细胞形状变得扁平，细胞体积增大，胞浆内颗粒状物增多等。细胞的SA-β-Gal染色阳性率较高，达到60％以上，而年轻对照组的染色阳性率则低于10％，只有零星分布的细胞着色。

100μmol/L的H₂O₂处理2周以上的年轻2BS细胞，其SA-β-Gal染色阳性率已经接近衰老细胞，达92.5％。20μmol/L红景天苷对H₂O₂引起的细胞损伤有保护作用，染色阳性率降至54.2％。

E、单细胞凝胶电泳结果

通过彗星电泳分析红景天苷对H₂O₂损伤2BS细胞DNA的影响，结果表明，2BS细胞未进行H₂O₂处理前，无DNA链断裂损伤。H₂O₂(100μmol/L，培养12天)处理后，2BS细胞出现彗尾，表明DNA链断裂，这可能是H₂O₂引起年轻细胞出现衰老表型的原因之一。红景天苷组(20μmol/L)彗尾细胞明显减少，从单细胞水平上，本发明进一步证实了红景天苷可降低2BS细胞DNA受损伤程度(图13)。

Claims (2)

1、红景天苷在制备延缓衰老药物中的应用。

2、权利要求1中红景天苷的药物组合物在制备延缓衰老药物中的应用。

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