CN109337923A - 通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素c含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，通过杂结合标记选择聚合D‑Man/L‑Gal途径中的关键结构基因SlGMP、SlGME、SlGGP和SlGPP；对不同聚合转基因株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加番茄AsA含量、AsA转运能力和对氧化胁迫的耐受性。本发明通过将抗坏血酸合成途径D‑甘露糖/L‑半乳糖途径中的四个关键结构基因的超量表达转基因系进行杂交聚合，使聚合植株提高番茄果实和叶片中抗坏血酸含量及转运，同时提高番茄对氧化胁迫的抗性，为培育高品质番茄和抗性育种提供一种新的方法。

Description

通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法。
背景技术
目前，业内常用的现有技术是这样的：
作为蔬菜最主要的品质组分，L-抗坏血酸(AsA，维生素C)是植物和大多数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合物。作为重要的抗氧化剂和酶辅因子，AsA在各种植物生理过程中发挥关键作用，包括去除活性氧(ROS)、增强植物抗氧化能力，参与过早衰老和程序性细胞死亡(PCD)，调控植物细胞伸长和分裂等(Gallie 2013)。植物在光呼吸和光合作用下产生ROS主要集中在叶绿体中，而研究报道植物细胞中30％至40％的AsA位于叶绿体中，表明AsA在保护植物的光合作用中也起重要作用(Vishwakarma et al 2015)。对人体自身来说，AsA可以清除自由基对细胞的伤害，从而预防和抑制癌症的发生，降低血液中的胆固醇，并增强人体的免疫系统(Pavet et al 2005)。由于催化AsA合成最后一步反应的L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶功能丧失，人类失去了合成维生素C的能力。因此，新鲜蔬菜和水果，成为人类摄取维生素C的主要来源。
目前，在植物中已经鉴定了4条AsA生物合成途径，包括D-甘露糖/L-半乳糖(D-Man/L-Gal)途径，古洛糖途径，D-半乳糖醛酸途径和肌醇途径。其中，D-Man/L-Gal途径被普遍接受并且被认为是植物中最重要的AsA生物合成途径(Wheeler et al 1998)。D-Man/L-Gal途径中所有结构基因都已经被克隆了，包括编码GDP-甘露糖焦磷酸化酶的基因SlGMP，编码GDP-甘露糖-3’,5’-表型异构酶的基因SlGME，编码GDP-L-半乳糖磷酸化酶的基因SlGGP，编码L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶的基因SlGPP，编码L-半乳糖脱氢酶的基因SlGalDH和编码L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶SlGLDH。
GMP是D-Man/L-Gal途径中的限速酶，参与D-甘露糖-1-磷酸与GDP-D-甘露糖的可逆转化。研究证明GMP在D-Man/L-Gal途径中具有重要作用。GMP突变体(拟南芥中命名为vtc1)中的AsA含量，与野生型相比降低了75％，当用野生型VTC1基因转化vtc1时，叶片AsA浓度恢复到野生型水平(Conklin et al 1999)。在番茄基因组中，有4个GMP基因家族成员(SlGMP1-SlGMP4)，其中SlGMP3的功能丧失和功能获得分别导致AsA的积累减少和增加，这证实了SlGMP3在番茄中AsA的生物合成中起着至关重要的作用(Cronje et al 2012)。位于SlGMP下游并将GDP-D-甘露糖转化为GDP-L-半乳糖的SlGME被认为是AsA生物合成的中心酶。过量表达或敲除SlGME的转基因番茄，导致AsA浓度增加或降低(Gilbert et al 2009；Zhang et al 2011)。SlGGP催化GDP-L-半乳糖转化为L-半乳糖-1-磷酸，该酶促反应是不同于古洛糖途径的D-Man/L-Gal途径中独有步骤的第一步。拟南芥中GGP的缺失突变体(vtc2/vtc5)中AsA积累相对于野生型减少20％，导致发芽后立即生长停滞，子叶随后被漂白，而通过补充抗坏血酸或L-Gal恢复正常生长(Dowdle et al 2007)。GPP催化L-半乳糖-1-磷酸转化为L-半乳糖，在拟南芥中命名为VTC4。拟南芥vtc4突变体显示积累较少的肌醇和AsA，表明VTC4是一种双功能酶，同时影响肌醇和AsA合成途径。AsA相关基因的表达分析表明，GPP在番茄中AsA积累的调控中起重要作用(Torabinejad et al 2009)。
众所周知，自然界中植物的许多性状是多基因控制，特别是代谢产物，因为其代谢过程复杂，包括生物合成、降解和转运。对于复杂的生物合成途径，在某些情况下，单独调控某个基因的表达不足以显著改善代谢终产物的含量，这就需要对多基因同时进行表达调控。为了达到多基因聚合调控的目的，研究人员提出了不同的基因聚合方法，例如多基因共转的转基因聚合和通过常规杂交结合分子标记进行的单个基因的聚合。通过聚合目标代谢物生物合成途径的一些调控因子或结构基因，科学家开发了几个成功的例子，例如富含β-胡萝卜素的“黄金大米”，富含花青素的“紫色番茄”和“紫色胚乳米”。与多基因的共转化相比，传统的杂交方法，虽然需要花费很长时间但能够确保靶基因稳定遗传，这种方法相对容易操作(Saltzman et al 2013)。
与花青素途径和类胡萝卜素途径不同，目前还没有AsA生物合成途径转基因聚合的报道。一方面是因为花青素和类胡萝卜素作为植物次级代谢产物，其合成途径单一，结构基因对代谢产物的调控显著。因此，对主效的结构基因进行聚合很容易达到提高其含量的目的。而AsA作为植物界广泛存在的有机酸，在植物处及代谢网络中处于中心位置，受到上游糖代谢、TCA循环、AsA-谷胱甘肽循环等很多途径的影响。另一方面，目前为止有4条AsA的合成途径被鉴定，其结构基因对含量的影响小于花青素和类胡萝卜素等次级代谢产物。此外，AsA的含量容易受到外界环境，如光照、温度等的影响。因此，AsA生物合成途径的基因聚合的研究相对于花青素和类胡萝卜素来说相对落后。
综上所述，现有技术存在的问题是：
(1)目前还没有AsA生物合成途径转基因聚合的报道。
现有技术对相关基因表达高的番茄种质中，没有通过标记辅助选择聚合这些基因，使聚合植株提高番茄果实和叶片中抗坏血酸含量，同时提高番茄对氧化胁迫的抗性，不能为培育高品质番茄和抗性育种提供依据。
(2)通过调控单一结构基因来提高AsA含量的能力是有限的。已经报到的文献和方法主要是针对单一基因的超量和敲除来研究其对AsA含量的影响，这样对植物中AsA含量和抗氧化能力的提高是有限的。解决上述技术问题的难度和意义：抗坏血酸作为植物中广泛存在的小分子功能物质，对植物本身的生长发育和人类的健康都有很重要的作用。由于AsA处于植物初生代谢网络的中心，且合成途径复杂、容易受外界环境影响，导致揭示其调控机制困难较大。利用基因工程结合常规杂交育种技术聚合AsA合成途径中主要结构基因，极大提高植物AsA合成能力对植物的生长发育具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法。为了加快AsA合成生物学和生物工程的研究，在本发明通过常规杂结合标记选择聚合了D-Man/L-Gal途径中的关键结构基因SlGMP、SlGME、SlGGP和SlGPP。通过对不同聚合转基因株系进行分析，发现基因聚合能显着增加番茄AsA含量、AsA转运能力和对氧化胁迫的耐受性。该发明中抗坏血酸基因聚合方法将为我国番茄品质遗传改良以及植物抗性育种奠定基础。
本发明是这样实现的，一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，所述通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法包括：
通过杂结合标记选择聚合D-Man/L-Gal途径中的关键结构基因SlGMP、SlGME、SlGGP和SlGPP；对不同聚合转基因株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加番茄AsA含量、AsA转运能力和对氧化胁迫的耐受性。
进一步，所述通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法具体包括：
将GMP(GenBank:NM_001247096)、GME(GenBank:GQ150165)、GGP(GenBank:AK326318.1)、GPP(GenBank:AK320470)单价超量转基因系进行杂交，将目的基因进行聚合，获得二价聚合植株GMP×GME、GGP×GPP和四价聚合植株GMP×GME×GGP×GPP；
通过对聚合植株番茄叶片、果实中的AsA含量进行测定；
对不同聚合株系及对照的果实和叶片分别饲喂AsA合成的前体物质，以饲喂AsA和H2O分别作为阳性对照和阴性对照；
通过对不同聚合株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加叶片和果实中AsA的转运能力；
对不同转基因聚合株系及对照进行氧化逆境处理；通过测定叶绿素和丙二醛含量分析基因聚合对番茄氧化胁迫的抗性。
进一步，前体物质包括：肌醇【MI】表示肌醇途径的前体物质，半乳糖醛酸【GLA】表示半乳糖醛酸途径的前体物质，葡萄糖【GLc】表示D-甘露糖/L-半乳糖途径的前体物质。
进一步，对不同转基因聚合株系及对照进行氧化逆境处理中，喷施浓度为75μM百草枯进行氧化逆境处理。
进一步，测定叶绿素和丙二醛含量分析基因聚合提高番茄对氧化胁迫的抗性中，通过DAB染色和H2DCFDA荧光检测对叶片的H2O2积累分析叶进行分析。
本发明的另一目的在提供一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法在在番茄抗坏血酸积累遗传改良中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
相对于单基因的超量表达，多基因聚合能更加显著的提高番茄叶片和果实中AsA的含量(图4)，同时也提高的番茄抗氧化能力(图8，9)。2、饲喂实验表明，在AsA合成前体物质充足的前提下，多基因聚合植株相对于对照和单基因转基因植株具有更强的AsA合成能力(图5)。3、通过AsA果柄饲喂实验，证明了多基因聚合植株相对于对照具有更强的AsA转运能力(图7)。
本发明具体涉及基因克隆、载体构建、遗传转化、生理指标测定方法、常规育种技术。具体涉及一种提高番茄品质组分含量的方法及应用。实例是番茄品种组分(抗坏血酸)，通过常规杂交将抗坏血酸合成途径D-甘露糖/L-半乳糖途径中的四个关键结构基因(SlGMP、SlGME、SlGGP和SlGPP)的超量表达转基因系进行聚合，也可以分别对相关基因表达高的番茄种质，通过标记辅助选择聚合这些基因，使聚合植株提高番茄果实和叶片中抗坏血酸含量，同时提高番茄对氧化胁迫的抗性，为培育高品质番茄和抗性育种提供一种新的方法。因此，该方法可以在番茄不同品质性状的改良，特别是在抗氧化胁迫等方面的应用。
本发明通过常规杂交手段聚合抗坏血酸合成途径中关键结构基因的超量转基因系，或者基因表达高的番茄种质。能够提高番茄叶片果实中抗坏血酸含量，同时增强番茄的抗氧化能力。
本发明通过同时聚合该四个基因，是一种新方法，效果比单基因更明显。
附图说明
图1是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径结构基因超量表达载体pHELLSGATE8的图谱；
图2是本发明实施例提供的转基因聚合植株目的基因的PCR检测。
图中：a图是二价聚合植株GMP×GME的PCR检测；b图是二价聚合植株GGP×GPP的PCR检测；c图是四价聚合植株GMP×GME×GPP×GGP的PCR检测。
图3是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶片(a图)和果实(b图)中AsA代谢途径相关结构基因的表达量析图。
图4是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶片(a图)和果实(b图)中AsA含量的测定图。
图中：*指与对照AC有显著差异(*P<0.05和**P<0.01)。
图5是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶片(a图)和果实(b图)饲喂五种不同底物后AsA含量的测定图。
图中：*指与对照AC有显著差异(*P<0.05和**P<0.01)。
图6是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶柄和果柄AsA含量的测定图。
图中：a图是D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶柄和果柄中AsA含量；b图是D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照叶柄和果柄分泌物中AsA含量。
图7是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照果柄饲喂AsA后果实中AsA含量的分析图。
图中：a图是通过果柄饲喂AsA后D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照果实AgNO3染色；b图是通过果柄饲喂AsA后D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照果实中AsA含量。
图8是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照在抗氧化胁迫前后叶绿素(a图)及丙二醛(b图)含量的变化图。
图9是本发明实施例提供的D-Man/L-Gal途径二价、四价聚合株系及对照在抗氧化胁迫前后H2O2的积累变化图。
图中：a图是DAB染色检测叶片H2O2的积累；b图是H2DCFDA荧光检测叶片H2O2的积累。G×G×G×G：GMP×GME×GPP×GGP。
通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
现有技术对相关基因表达高的番茄种质中，没有通过标记辅助选择聚合这些基因，使聚合植株提高番茄果实和叶片中抗坏血酸含量，同时提高番茄对氧化胁迫的抗性，不能为培育高品质番茄和抗性育种提供依据。
下面结合具体分析对本发明的应用作进一步描述。
本发明实施例提供的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，包括：
通过杂结合标记选择聚合D-Man/L-Gal途径中的关键结构基因
SlGMP SEQ ID NO：1；5’-GAAGAAGAGGAGAACTGGAAAC-3’；
SlGME SEQ ID NO：2；5’-CACTTGGCTTCATCTATACTTCACTC-3’；
SlGGP SEQ ID NO：3；5’-AACATGCGATGAACACCAGAGC-3’；
SlGPP SEQ ID NO：4；5’-CTGGTTTTGAAGTGTCCGCT-3’；
对不同聚合转基因株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加番茄AsA含量、AsA转运能力和对氧化胁迫的耐受性。
具体包括：
以番茄(Solanum lycopersicum)这一重要的蔬菜作物为对象，首先通过将实验室已保存的GMP(GenBank:NM_001247096)、GME(GenBank:GQ150165)、GGP(GenBank:AK326318.1)、GPP(GenBank:AK320470)单价超量转基因系进行常规杂交，将目的基因进行聚合，从而获得了二价聚合植株GMP×GME、GGP×GPP和四价聚合植株GMP×GME×GGP×GPP(附图2)。通过对聚合植株AsA含量进行测定，发现基因聚合能显著增加番茄叶片中AsA的含量。在果实中，除GGP×GPP外，基因聚合也可以显著增加AsA含量(附图4)。
对不同聚合株系及对照的果实和叶片分别饲喂AsA合成的前体物质(肌醇【MI】表示肌醇途径的前体物质，半乳糖醛酸【GLA】表示半乳糖醛酸途径的前体物质，葡萄糖【GLc】表示D-甘露糖/L-半乳糖途径的前体物质)，以饲喂AsA和H2O分别作为阳性对照和阴性对照。在叶片中，只有饲喂Glc能显著增加对照和聚合株系叶片中AsA含量，说明D-甘露糖/L-半乳糖途径途径在叶片AsA合成中占主导地位。在果实中，饲喂MI和GLc都能显著增加对照和聚合株系果实中AsA含量，而饲喂GLA只能增加GMP×GME和GMP×GME×GGP×GPP果实中AsA含量，而不能增加AC和GGP×GPP聚合株系果实中AsA含量(附图5)。结果说明D-甘露糖/L-半乳糖途径，D-半乳糖醛酸途径和肌醇途径在番茄果实AsA合成中都发挥作用。
通过对不同聚合株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，发现基因聚合能显著增加叶片和果实中AsA的转运(附图6)。此外，通过对不同聚合株系及对照的绿熟其果实的果柄进行AsA饲喂实验后，通过测定果实中AsA含量和AgNO3染色发现基因聚合能显著增加AsA向果实中的转运(附图7)。
对不同转基因聚合株系及对照进行氧化逆境处理(喷施浓度为75μM百草枯)，后测定叶绿素和丙二醛含量发现基因聚合能显著提高番茄对氧化胁迫的抗性(附图8)。通过DAB染色和H2DCFDA荧光检测对叶片的H2O2积累分析叶证实这一结论(附图9)。
下面结合具体实施例对本发明的应用作进一步描述
实施例1：本发明转基因聚合材料的获得
本发明通过将实验室以保存的单价转基因系(SlGMP-OE、SlGME-OE、SlGGP-OE和SlGPP-OE)通过常规杂交手段得到聚合植株，以番茄常规品系(Solanum lycopersicumcv.Ailsa Craig(AC))作为对照，分析转基因聚合对番茄中AsA含量的影响。对转基因材料杂交后代的分子鉴定具体方法如下：
1.杂交后的转基因聚合植株和对照植株长至3-4片真叶时，用CTAB法提取DNA：
A.取幼嫩叶片(2～3片)置于1.5ml离心管底部；
B.新鲜配制样品提取液，置于室温；
C.加入200μl样品提取液，用便携式钻枪充分磨碎样品，再加入550μl样品提取液，充分摇匀，65℃水浴30～120min；
D.用氯仿:异戊醇(24:1)加满离心管(约0.7～0.8ml)充分抽提，13000r/min离心5min；
E.转移上清液至1.5ml新离心管中加入2/3～1体积-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀直至DNA沉淀析出；
F.立即于13000r/min离心5min，倒掉异丙醇，用70％乙醇洗涤DNA沉淀一次，超净工作台上风干约1h；
G.加入50μl TE(pH 8.0)，于65℃溶解DNA沉淀15min。10000r/min离心10min，4℃或-20℃保存DNA样品。
样品提取液的配制：
每60mL DNA提取液中分别加25mL抽提液，25mL裂解液，10mL 5％十二烷基肌氨酸纳溶液，0.25g亚硫酸氢钠。
DNA抽提液：0.35mol/L山梨醇，0.1mol/L三(羟甲基)氨基甲烷，5mmol/L乙二胺四醋酸二钠，pH 7.5；
裂解液：0.2mol/L三(羟甲基)氨基甲烷，0.05mol/L乙二胺四醋酸二钠，2mol/L氯化钠，2％十六烷基三甲基溴化铵；
十二烷基肌氨酸钠溶液：5％(质量/体积)。
2.PCR扩增
以各个单价目的基因载体(pHELLSGATE8-GMP；pHELLSGATE8-GME；pHELLSGATE8-GGP；pHELLSGATE8-GPP,质粒结构见附图1)的质粒为阳性对照，以非转基因植株(AC)为阴性对照，用35S正向引物(5’-ACGCACAATCCCACTATCCTTC-3’)和目的基因特异的反向引物
(GMP：5’-GAAGAAGAGGAGAACTGGAAAC-3’；
GME：5’-CACTTGGCTTCATCTATACTTCACTC-3’；
GPP：5’-CTGGTTTTGAAGTGTCCGCT-3’；
GGP：5’-AACATGCGATGAACACCAGAGC-3’)
进行PCR检测。PCR反应体系：总体积20μL。10×PCR Buffer 2.0μL，dNTP(10mmol/μL)0.4μL，正反引物各0.4μL,DNA模板(100-200ng/μL)1.0μL,Taq酶(5U/μL)0.1μL，用ddH2O补足20μL(引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成，Buffer，dNTP和Taq酶购自北京全 式金生物技术有限公司)；PCR反应程序：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min30s，进行35个循环，72℃延伸10min，4℃保存10min；凝胶电泳检测：PCR产物用用加有EB(溴化乙锭)的1％琼脂糖在100-120V电压条件下电泳25min，最终结果在凝胶成像系统上显示。能扩增出特异条带的认为成功将结构基因聚合进了番茄基因组中，通过这种方法筛选出具有目的基因的转基因聚合纯系(附图2)。
实施例2：本发明番茄材料抗坏血酸测定
抗坏血酸的测定包括还原型抗坏血酸和总抗坏血酸的测定，其中总抗坏血酸包括还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸。测定方法参考胡体旭博士学位论文(2015)的方法。具体步骤如下：样品制备。选取待测样品鲜样(本发明为番茄红熟果果实)，用液氮速冻，研磨成粉末状。用液氮预冷的2mL离心管称取0.2g左右的叶片粉末或者0.4g左右的果实粉末，加入1mL冰上预冷的6％的TCA(三氯乙酸，购自国药集团化学试剂有限公司)溶液，充分混匀，在冰上避光抽提15min，4℃离心机12000r/min离心15min；样品的处理与抗坏血酸测定。总抗坏血酸测定：取20μL样品上清液于干净的酶标板(96孔透明板，购自世泰伟业)中，加入20μL浓度为5mmol/L的DTT(二硫苏糖醇，强还原剂，购自北京普博欣生物)溶液，平板离心机离心混匀后37℃培养箱温浴20min。反应完成后，加入10μL浓度为0.5％的NEM(N-乙基马来酰亚胺，购自国药集团化学试剂有限公司)，室温反应1min。然后加入80μL的Color Reagent(显色剂，购自国药集团化学试剂有限公司)，平板离心机混匀后在37℃培养箱暗反应60min。酶标仪测定550nm波长下的吸光值。还原型抗坏血酸的含量测定：取20μL样品上清液于干净的酶标板中，加入30μL 0.4mol/L的PBS(磷酸缓冲液，pH＝7.4)，再加入80μL ColorReagent，平板离心机混匀后在37℃培养箱暗反应60min。酶标仪(infinite M200PRO，购自Tecan公司,Switzerland)测定550nm波长下的吸光值；抗坏血酸标准曲线的制备：以还原型抗坏血酸为标样(购自北京普博欣生物)，用6％TCA溶液稀释成不同浓度梯度的抗坏血酸溶液，吸取20μL于酶标板中，按还原性型抗坏血酸的测定方法进行测定，以横坐标为吸光值、纵坐标为20μL中抗坏血酸的质量(μg)绘制标准曲线。
试剂配制:
实施例3：本发明番茄材料叶片和果实中各基因表达量分析
提取相关材料叶片和果实总RNA(Trizol法，试剂盒购于Invitrogen)，用反转录试剂盒HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(购于诺唯赞生物科技有限公司)将RNA反转录成cDNA。利用LightCycler480SYBR Green I Master Kit(Roche,http:// www.roche.com/)，根据试剂盒步骤进行荧光定量PCR(qRT-PCR)检测抗坏血酸合成代谢基因的相对表达量。实验所用到的qRT-PCR引物如表1(引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成)：
表1实验用到的qRT-PCR引物
qRT-PCR反应体系为SYBR-Green Mix 5μL，正向引物+反向引物0.5μL+0.5μL，cDNA4μL。qPCR反应程序为：95℃5min，95℃5sec，56℃15sec，72℃20sec，共40个循环。每个样品至少包括三次重复，以番茄β-Actin(SGN-U580609)基因为内参进行模板浓度的校正。
实施例4：本发明番茄材料AsA合成前体饲喂实验
叶片合成前体的饲喂：
选取长势一致的一个月苗龄的对照(AC)和聚合杂交植株，每个系选取三颗植株，每颗植株使用打孔器打孔约20个叶盘，然后分别放入含有20mL的5mM肌醇(MI，购自Sigma公司，货号87-89-8)、葡萄糖(GLc，购自Sigma公司，货号50-99-7)、半乳糖醛酸(GLA，购自Sigma公司，货号91510-62-2)和AsA(购自Sigma公司，货号50-81-7)和H2O的培养皿中，将培养皿放置在光照/黑暗为16h/8h条件下培养24h，培养结束后将叶盘用蒸馏水洗涤三次，轻轻擦干，然后用液氮速冻并保存在-70℃的冰箱中，之后磨样进行抗坏血酸的测定。
果实合成前体的饲喂：
选取不同成熟时期的对照(AC)与杂交聚合植株的带果柄的果实，将果柄分别浸入20mL的5mM肌醇(MI)，葡萄糖(GLc)，半乳糖醛酸(GLA)和AsA和H2O的培养皿中，将培养皿放置在光照/黑暗为16h/8h条件下培养24h，饲喂结束后将果柄去掉，果实用蒸馏水洗涤两次，轻轻擦干，用液氮速冻并保存于-70℃，用于测定AsA含量。
实施例5：叶柄、果柄卸载液的AsA测定
取处于同一茎上下部位且粗细一致的的果柄和叶柄，立即用ddH2O冲洗干净，轻轻擦干，并称重，在远轴端切除1cm左右后，切口用干净的滤纸吸干，然后将切口端浸泡于15mM的EDTA(pH 7.5)溶液中，H2O做对照，暗处放置24h，然后加入1mL的10％的TCA溶液，之后进行AsA含量的测定。
实施例6：本发明番茄果实AgNO3染色实验
由于AsA有强还原性，能够将AgNO3中(购自Sigma公司，货号：7761-88-8)的Ag+还原为易观察的黑色银，并且AgNO3有强穿透性，容易进入番茄果实的组织中，存在AsA的组织会经过AgNO3显黑色。
果实分别纵向和横向切取大约1cm的果盘，用ddH2O冲洗干净，浸泡在预冷在4℃冰箱的5％AgNO3溶液中，AgNO3溶于预冷的溶液(乙酸∶H2O∶乙醇为10∶29∶66(v/v/v))，在4℃条件下培养24h，用上述溶剂冲洗，然后用5％氨水的70％乙醇溶液浸泡3次，每次2min，显色反应终止，再用水冲洗3次，放于70％乙醇中保存，后期拍照。
实施例7：本发明番茄苗期抗氧化实验
选取苗期约一个月长势一致且植株健壮的聚合杂交番茄植株与对照(AC)，进行氧化胁迫处理。对叶片进行喷施甲基紫精即MV溶液(购自Sigma公司，货号：75365-73-0)，浓度为75μM，每天早上喷施，连续两天，喷施过程中要对植株从上到下彻底喷施。处理一周后，观察表型，进行拍照记录，并取样进行叶绿素、MDA(丙二醛，购自上海国药公司)、DAB染色(二氨基联苯胺，二氨基联苯胺)和H2DCFDA(2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯，购自Sigma公司，货号：4091-99-0)荧光观察，然后进行分析杂交聚合植株的氧化胁迫的抗性。
叶绿素的测定方法。叶片样品液氮研磨后，取0.2g于干净的预冷的2mL的离心管中，加入1.5mL的80％丙酮(购自国药集团化学试剂有限公司)，摇晃混匀，放置于暗处进行抽提1h，12000r/min，离心10min，吸取200μL的上清于干净的96孔酶标板中，将酶标板放于酶标仪中(infinite M200PRO，购自Tecan公司,Switzerland)，在646nm，663nm波长下测定吸光值，对测定数据进行分析，叶绿素浓度(mg/L)＝17.32A646+7.18A663。
MDA的测定方法。叶片样品液氮研磨后，取0.2g于干净的预冷的10mL的离心管中，加入3mL的5％三氯乙酸(TCA，购自上海国药公司)，混匀，放置室温抽提30min，3000r/min，离心10min，吸取2mL的上清于10mL的离心管中，再加入2mL的0.67％TBA溶液，混匀，然后沸水浴30min，离心，吸取200μL上清于干净的96孔酶标板中，在450nm，532nm和600nm波长下测定吸光值，对测定数据进行分析，MDA浓度(μM/L)＝6.45(A532-A600)-0.56A450。
DAB染色。将处理后的植株叶片离体，浸泡于1mg/mL的DAB溶液，放置于暗处24h，再将叶片取出放置于96％乙醇中，沸水浴10min，倒掉乙醇，加入新的96％乙醇，脱去浮色，最后进行拍照。
H2DCFDA荧光。将处理后的叶片离体，浸泡在25μM H2DCFDA溶液中，放置于暗处15min，处理后用20mM，PH 6的磷酸钾缓冲液清洗三次，将清洗后的叶片取相同部位做临时切片，放置于无目镜荧光显微镜下(NIKON ECLIPSE 80i,Japan)观测荧光并保存照片
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaagaagagg agaactggaa ac 22
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacttggctt catctatact tcactc 26
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacatgcgat gaacaccaga gc 22
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggttttga agtgtccgct 20

Claims (6)

1.一种通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，其特征在于，所述通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法包括：
通过杂结合标记选择聚合D-Man/L-Gal途径中的关键结构基因SlGMP、SlGME、SlGGP和SlGPP；对不同聚合转基因株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加番茄AsA含量、AsA转运能力和对氧化胁迫的耐受性。
2.如权利要求1所述的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，其特征在于，所述通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法具体包括：
将GMP、GME、GGP、GPP单价超量转基因系进行杂交，将目的基因进行聚合，获得二价聚合植株GMP×GME、GGP×GPP和四价聚合植株GMP×GME×GGP×GPP；
通过对聚合植株番茄叶片、果实中的AsA含量进行测定；
对不同聚合株系及对照的果实和叶片分别饲喂AsA合成的前体物质，以饲喂AsA和H2O分别作为阳性对照和阴性对照；
通过对不同聚合株系叶柄和果柄中AsA含量及AsA外排量进行测定，分析基因聚合增加叶片和果实中AsA的转运能力；
对不同转基因聚合株系及对照进行氧化逆境处理；通过测定叶绿素和丙二醛含量分析基因聚合对番茄氧化胁迫的抗性。
3.如权利要求2所述的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，其特征在于，前体物质包括：肌醇【MI】表示肌醇途径的前体物质，半乳糖醛酸【GLA】表示半乳糖醛酸途径的前体物质，葡萄糖【GLc】表示D-甘露糖/L-半乳糖途径的前体物质。
4.如权利要求2所述的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，其特征在于，对不同转基因聚合株系及对照进行氧化逆境处理中，喷施浓度为75μM百草枯进行氧化逆境处理。
5.如权利要求2所述的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法，其特征在于，测定叶绿素和丙二醛含量分析基因聚合提高番茄对氧化胁迫的抗性中，通过DAB染色和H2DCFDA荧光检测对叶片的H2O2积累分析叶进行分析。
6.一种如权利要求1所述的通过多基因聚合提高番茄品质组分维生素C含量的方法在在番茄抗坏血酸积累遗传改良中的应用。
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