CN115449560B - 一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法，属于果蔬作物耐缺铁性品种的鉴别方法。首先将不同番茄品种的种子，播种土培，分别移栽至加铁和缺铁水培营养液中培养，取番茄幼苗根部进行RNA提取和cDNA反转录；通过qRT‑PCR实验，分析番茄品种中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因的表达水平；对基因的表达水平进行显著性差异P值的计算，当SlFRO1和SlIRT1基因表达水平的显著上调且差异显著，P值<0.05；SlMYB4和SlMNB1基因表达水平显著抑制且差异显著，P值<0.05时；则初步为缺铁耐受型品种番茄；再将初步认定的番茄种子播种土培，分别移栽至加铁和缺铁水培营养液中培养，进一步确定为缺铁耐受型番茄品种；最后测定新叶中的叶绿素含量、根和叶中的铁含量等，确定为缺铁耐受型番茄品种。
Description
技术领域
本发明属于果蔬作物耐缺铁性品种的鉴别方法，确切地说是一个快速筛选鉴定番茄缺铁耐受型品种的方法。
背景技术
铁（Fe）是食品中重要矿质营养元素之一，也是动物和植物所必需的重要营养元素之一。铁作为许多功能蛋白的重要辅助因子，对于植物的生长发育起着极其重要的作用。在人类中，缺铁是引起人类贫血症发生的主要原因，而植物性食物是人类获得铁的主要来源。土壤中虽然富含大量的铁，但可利用率极低，高pH值和高碳酸盐含量严重降低了土壤中铁的有效性，从而导致植物难以从土壤中吸收铁，进而造成缺铁胁迫影响植物的生长发育。植物受到缺铁胁迫时不仅会导致农作物减产，而且还会造成农作物中的铁缺乏。因此，耐缺铁性作物品种的选育已成为农业生产中一个亟待解决的关键问题。
番茄是一种经济价值比较高的果蔬菜作物。其果实营养丰富，含多种维生素和和矿物质，是现代人最佳营养食品之一，同时番茄也是保健食品、功能性食品和爱美女士们青睐的美容化妆品。番茄原产来自南美洲，目前我国普遍栽培的植物番茄常被种植于盐碱地等土壤中，导致在生长过程中因缺少有效铁的吸收而引起植株黄化、低产以及果实品质变差等问题，而合理选择缺铁耐受型番茄品种进行培育是解决番茄缺铁问题的重要途径。因此，寻找一种快速筛选鉴定缺铁耐受型番茄品种的方法显得尤为必要。
传统依靠植物基因型之间对缺铁胁迫的这种反应上的差异筛选鉴定优良耐缺铁性状的番茄种质资源的方法存在量大，周期长，性状不稳定等缺点。因此，本发明提供一种快速筛选鉴定缺铁耐受型番茄品种（系）的方法，可大大缩短筛选鉴定缺铁耐受型番茄品种的选育周期。
发明内容
为了解决现有番茄缺铁耐受型品种筛选鉴定方法存在的周期长，性状不稳定等缺陷，避免优良番茄种质资源的丢失，本发明提供一种缺铁耐受型番茄品种的快速筛选鉴定方法。
一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定操作步骤如下：
（1）番茄幼苗的培养和缺铁处理
将10种以上番茄品种的种子采用土壤培养10天，得到番茄幼苗；
用去离子水洗净番茄幼苗的根表泥土，分别移栽至加铁营养液的育苗盘中和缺铁营养液的育苗盘中，分别在人工气候培养室中培养6天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，分别得到10种以上加铁待测番茄幼苗和10种以上缺铁待测番茄幼苗；
所述加铁待测番茄幼苗为对照组番茄幼苗，所述缺铁待测番茄幼苗为处理组番茄幼苗；
（2）SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因表达水平的测定
分别取10种以上加铁待测番茄幼苗的根部和10种以上缺铁待测番茄幼苗的根部，进行核糖核酸（RNA）的提取和cDNA的反转录，通过定量即时聚合酶链锁反应（qRT-PCR）实验，分别分析加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平；
所述SlMYB4基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示；
所述SlMNB1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：2所示；
所述SlFRO1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：3所示；
所述SlIRT1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：4所示；
得到10种以上加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据和10种以上缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据；
（3）显著性差异的计算
对加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平分别进行显著性差异的计算；缺铁胁迫下当SlFRO1基因和SlIRT1基因表达水平的显著上调，且P值< 0.05，差异显著；SlMYB4基因和SlMNB1基因表达水平显著抑制，且P值< 0.05差异显著时，则初步为缺铁耐受型品种番茄；其所述的缺铁胁迫下SlFRO1、SlIRT1、SlMYB4和SlMNB1基因表达水平的显著性差异P值的计算，是使用SPSS 22软件，并选择单因子ANOVA方差分析的方式求算P值，若P值< 0.05，则会被认为是具有显著性差异，所述的显著性差异则被认为是缺铁耐受；
通过显著性差异的计算分析从10种以上番茄品种中初步获得缺铁耐受型番茄品种；
（4）番茄幼苗遗传表型分析
将初步获得缺铁耐受型番茄品种的种子和野生型番茄品种的种子播种至土培盆中生长10天，用去离子水清洗干净两种番茄幼苗根部表面的泥土，分别移栽至加铁水培营养液和缺铁水培营养液中，培养12天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，观察缺铁条件下两种番茄植株的生长情况，所述野生型番茄为对照番茄幼苗，与野生型番茄相比较进一步确定缺铁耐受型番茄为缺铁耐受型番茄品种；
（5）番茄幼苗生理指标的测定
分别测定缺铁耐受型番茄幼苗和野生型番茄幼苗的生理指标。
表型分析中的番茄植株生理指标根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性的测定：A，在加铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行测定；B，对缺铁条件下测定获得的野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行显著性差异的计算，缺铁胁迫下，当初步获得缺铁耐受型番茄植株中根和叶的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性与野生型番茄相比显著上调，且P值< 0.05，差异显著，即为缺铁耐受型番茄品种；使用SPSS 22软件，并选择单因子ANOVA方差分析的方式求算P值，若P值< 0.05，则会被认为是具有显著性差异，所述的显著性差异则被认为是缺铁耐受型番茄品种。
进一步的技术方案如下：
番茄土壤培养具体操作：取黑土，经过121℃高压高温灭菌处理20 min，将珍珠岩、蛭石和黑土按1:3:9的比例混合，搅拌均匀，装入土培盆中；再将预先置于42 ℃去离子水中浸泡1小时的番茄种子播种至土培盆的培养土中，将土培盆在人工气候培养室中培养10天，培养条件为温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1、光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替。
1 L所述加铁营养液由5 mL A1、5 mL A2 、1 mL B、1 mL C、1 mL D和 987 mL水混合均匀制成；
所述A1由101.12g硝酸钾（KNO3）、283.44g四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A2由147.84g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B由3.092g硼酸（H3BO3）、2.028g一水硫酸锰（MnSO4·H2O）、0.172g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.286g七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、0.058g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述C由18.36g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D由21.12g五水偏硅酸钠（Na2SiO3·5H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
1 L所述缺铁营养液由5 mL A3、5 mL A4 、1 mL B1、1 mL D1 和 988 mL水混合均匀制成；
所述A3由101.12g硝酸钾（KNO3）、283.44g四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A4由147.84g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B1由3.092g硼酸（H3BO3）、2.028g一水硫酸锰（MnSO4·H2O）、0.172g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.286g七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、0.058g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和500mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D1由21.12g五水偏硅酸钠（Na2SiO3·5H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
本发明的有益技术效果体现在以下方面：
1.本发明方法简便，易于掌握，大大缩短了番茄育种周期。整个系统的缺铁耐受型筛选鉴定工作在2个月内即可完成并且在可控培养条件下（温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替）进行，使得筛选结果更加可靠，利用番茄植株根中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因表达水平可反映植株缺铁耐受性程度，首先将未知番茄品种的种子播种至土培盆中生长10天用去离子水清洗干净表面的泥土后分别移栽至加铁和缺铁水培营养液中培养6天，进行实验样本的收集，提取RNA后，以SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1作为筛选耐缺铁番茄品种的候选基因，进行qRT-PCR的分析筛选。当SlFRO1和SlIRT1基因表达水平的显著上调且差异显著，P值< 0.05；SlMYB4和SlMNB1基因表达水平显著抑制且差异显著，P值< 0.05时，即初步为缺铁耐受型品种番茄；同时将初步获得缺铁耐受型番茄品种的种子播种至土培盆中生长10天，用去离子水清洗干净表面的泥土，分别移栽至加铁和缺铁水培营养液中，培养12天观察番茄植株的生长情况进一步确定为缺铁耐受型番茄品种；表型分析中的番茄植株生理指标根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性的测定：A，在加铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄（AC）和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行测定；B，对加铁条件下测定获得的野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行显著性差异的计算，缺铁胁迫下，当初步获得缺铁耐受型番茄植株中根和叶的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性与野生型番茄（AC）相比显著上调，且P值< 0.05，差异显著，即为缺铁耐受型番茄品种；使用SPSS 22软件，并选择单因子ANOVA方差分析的方式求算P值，若P值<0.05，则会被认为是具有显著性差异，所述的显著性差异则被认为是有意义的；通过结合遗传学表型分析和生理指标的测定，既鉴定了番茄植株在缺铁条件下直接的缺铁耐受能力，又鉴定了番茄植株在缺铁条件下其体内生理指标发生的变化。
2. 为确立番茄品种耐缺铁性与SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因表达水平。首先，通过qRT-PCR实验，分析了缺Fe条件下33个番茄品种（表1）中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因的表达水平，发现在缺铁条件下，紫珍珠和串珠樱桃番茄品种中SlFRO1和SlIRT1基因的表达相比较野生型均被显著上调且差异显著，P值< 0.05；SlMYB4和SlMNB1基因的表达相比较野生型均被显著抑制且差异显著，P值< 0.05。所以将筛选获得的紫珍珠和串珠樱桃番茄品种初步默认为缺铁耐受型番茄品种，并且进一步对其进行遗传学表型及生理指标分析，结果发现，在缺Fe胁迫下，紫珍珠和串珠樱桃的表型相比野生型更耐受，且生理指标根和叶的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性与野生型番茄相比显著上调，且P值< 0.05，差异显著。这些结果表明，SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因作为筛选番茄缺Fe耐受型品种的候选基因是一个可靠的指标，并能够在筛选番茄缺Fe耐受型品种上进行分子标记利用，然后据此对缺铁耐受型未知的番茄品种进行实验鉴别验证。本发明也可用于引种缺铁耐受型的鉴定，可加快新品种鉴定速度，尽早投入生产，可提高番茄耐缺铁性突变体筛选的有效性，避免在生产过程中可能发生的优良品种资源的丢失。
附图说明
图1是缺铁胁迫下野生型、紫珍珠和串珠樱桃根中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因的表达图。
图2是野生型、紫珍珠和串珠樱桃加铁和缺铁处理后表型变化图。
图3是野生型、紫珍珠和串珠樱桃生理指标的分析图。
图4是验证试验中缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802根中SlMYB4、 SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因的表达图。
图5是验证试验中缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802加铁和缺铁处理后表型变化图。
图6是验证试验中缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802生理指标的分析图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。
下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。实验用的野生型番茄材料购自于美国康奈尔大学植物研究所，实验中用的其他番茄品种是由市场上各种质资源有限公司提供。
实施例1
一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定操作步骤如下：
（1）番茄幼苗的培养和缺铁处理
参见表1，首先从市场上购买33个番茄品种的种子，将33个番茄种子采用土壤培养10天，得到番33种番茄幼苗。
番茄土壤培养具体操作：取黑土，经过121℃高压高温灭菌处理20 min，将珍珠岩、蛭石和黑土按1:3:9的比例混合，搅拌均匀，装入土培盆中；再将预先置于42 ℃去离子水中浸泡1小时的番茄种子播种至土培盆的培养土中，将土培盆在人工气候培养室中培养10天，培养条件为温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1、光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替。
用去离子水洗净33种番茄幼苗的根表泥土，分别移栽至加铁营养液的育苗盘中和缺铁营养液的育苗盘中，分别在人工气候培养室中培养6天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，分别得到33种加铁待测番茄幼苗和33种缺铁待测番茄幼苗；
所述加铁待测番茄幼苗为对照组番茄幼苗，所述缺铁待测番茄幼苗为处理组番茄幼苗。
1 L所述加铁营养液由5 mL A1、5 mL A2 、1 mL B、1 mL C、1 mL D和 987 mL水混合均匀制成；
所述A1由101.12g硝酸钾（KNO3）、283.44g四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A2由147.84g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B由3.092g硼酸（H3BO3）、2.028g一水硫酸锰（MnSO4·H2O）、0.172g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.286g七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、0.058g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述C由18.36g乙二胺四乙酸铁钠（NaFeEDTA）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D由21.12g五水偏硅酸钠（Na2SiO3·5H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
1 L所述缺铁营养液由5 mL A3、5 mL A4 、1 mL B1、1 mL D1 和 988 mL水混合均匀制成；
所述A3由101.12g硝酸钾（KNO3）、283.44g四水硝酸钙（Ca(NO3)2·4H2O）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A4由147.84g七水硫酸镁（MgSO4·7H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B1由3.092g硼酸（H3BO3）、2.028g一水硫酸锰（MnSO4·H2O）、0.172g五水硫酸铜（CuSO4·5H2O）、0.286g七水硫酸锌（ZnSO4·7H2O）、0.058g钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和500mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D1由21.12g五水偏硅酸钠（Na2SiO3·5H2O）和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
（2）、SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因表达水平的测定
分别取33种加铁待测番茄幼苗的根部和33种缺铁待测番茄幼苗的根部，进行核糖核酸（RNA）的提取和cDNA的反转录，通过定量即时聚合酶链锁反应（qRT-PCR）实验，分别分析加铁待测番茄幼苗的根部中和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、 SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平；
所述SlMYB4基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示；
所述SlMNB1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：2所示；
所述SlFRO1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：3所示；
所述SlIRT1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：4所示。
得到33种加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据和33种缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、 SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据。
（3）显著性差异的计算
对33种加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平和33种缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平分别进行显著性差异的计算，结果见图1 中的A和图1中的B所示，在缺铁条件下，发现紫珍珠和串珠樱桃番茄品种中SlFRO1和SlIRT1基因的表达水平相比较野生型被显著上调，且差异显著，P值< 0.05；而SlMYB4和SlMNB1基因的表达水平相比较野生型被显著抑制，且差异显著，P值< 0.05，结果见图1 中的 C和图1 中的D；在加铁条件下，紫珍珠和串珠樱桃植株中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因表达水平相比较野生型被显著抑制或无明显差异。
由图1中的A可见，缺铁胁迫下野生型、紫珍珠和串珠樱桃和FG802根中SlIRT1基因的表达；
由图1中的B可见，缺铁胁迫下野生型、紫珍珠和串珠樱桃根中SlFRO1基因的表达；
由图1中的C可见，缺铁胁迫下野生型、紫珍珠和串珠樱桃根中SlMYB4基因的表达；
由图1中的D可见，缺铁胁迫下野生型、紫珍珠和串珠樱桃根中SlMNB1基因的表达；
图1中所示数据为三个独立重复实验的平均值和标准差，不同小写字母表示统计显著性差异（Tukey's test，P值< 0.05）。
通过显著性差异的计算分析从33种番茄品种中初步获得缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄品种。
（4）番茄幼苗遗传表型分析
将野生型和初步获得缺铁耐受型番茄品种紫珍珠和串珠樱桃的种子播种至土培盆中生长10天，用去离子水清洗干净表面的泥土，分别移栽至加铁水培营养液和缺铁水培营养液中，培养12天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，观察野生型、紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的生长情况。结果见图2D-F所示，在缺铁水培营养液上，观察发现紫珍珠和串珠樱桃番茄植株相比较野生型表现出叶片更绿的缺铁耐受表型，图2A-C所示，在加铁水培营养液上观察发现紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的生长表型与野生型相比无明显差异。
由图2中的A可见，野生型加铁处理后表型变化；
由图2中的B可见，紫珍珠加铁处理后表型变化；
由图2中的C可见，串珠樱桃加铁处理后表型变化；
由图2中的D可见，野生型缺铁处理后表型变化；
由图2中的E可见，紫珍珠缺铁处理后表型变化；
由图2中的F可见，串珠樱桃缺铁处理后表型变化。
（5）番茄幼苗生理指标的测定
表型分析中的缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄品种生理指标根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性的测定：A，在加铁条件下对野生型番茄和缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄植株分别进行测定；B，对缺铁条件下测定获得的野生型番茄和缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和缺铁耐受型紫珍珠和串珠樱桃番茄植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行显著性差异的计算，结果发现，当检测在加铁水培营养液上生长的紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的叶绿素含量时与野生型植株相比无明显差异；当检测在缺铁水培营养液上生长的紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的叶绿素含量时与野生型植株相比显著升高，且差异显著，P值< 0.05。其结果见图3 中的A。
其次结果发现，当检测在加铁水培营养液上生长的紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的铁还原酶活性时与野生型植株相比无明显差异；当检测在缺铁营养液上生长的紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的铁还原酶活性时与野生型植株相比明显升高，且差异显著，P值< 0.05，其结果见图3中的 B。最后结果发现，在加铁条件下，紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的茎部和根部中的铁含量显著高于野生型，且差异显著，P值< 0.05，其结果见图3中的 C-D；在缺铁胁迫条件下，紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的茎部和根部中的铁含量明显高于野生型，且差异显著，P值< 0.05。以上结果表明，在缺铁胁迫下，紫珍珠和串珠樱桃的表型相比野生型更耐受，这些结果进一步证实SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因筛选获得的紫珍珠和串珠樱桃番茄植株为缺铁耐受型番茄品种。
由图3中的A可见，野生型、紫珍珠和串珠樱桃番茄植株在加铁和缺铁胁迫下叶绿素含量分析；
由图3中的B可见，野生型、紫珍珠和串珠樱桃番茄植株在加铁和缺铁胁迫下氧化还原酶活性分析；
由图3中的C可见，野生型、紫珍珠和串珠樱桃番茄植株在加铁和缺铁胁迫下茎中铁含量；
由图3中的D可见，野生型、紫珍珠和串珠樱桃番茄植株在加铁和缺铁胁迫下根中含量；
图3中所示数据为三个独立重复实验的平均值和标准差，不同小写字母表示统计显著性差异（Tukey's test，P值< 0.05）。
实施例2
前期实验能够通过SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因的mRNA表达水平的变化，筛选获得了串珠樱桃和紫珍珠缺铁耐受型番茄品种。那么SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因在初步筛选的缺铁敏感型番茄品种中的表达，随后随机选取了3个前期qRT-PCR分析比较明显的缺铁敏感型番茄品种的定量数据进行展示，具体实施步骤如下所示：
（1）番茄幼苗的培养和缺铁处理
首先从市场上购买33个番茄品种（表）的种子，将33个番茄种子采用土壤培养10天，得到番茄幼苗；
用去离子水洗净番茄幼苗的根表泥土，分别移栽至加铁营养液的育苗盘中和缺铁营养液的育苗盘中，分别在人工气候培养室中培养6天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，分别得到加铁待测番茄幼苗和缺铁待测番茄幼苗；
所述加铁待测番茄幼苗为对照组番茄幼苗，所述缺铁待测番茄幼苗为处理组番茄幼苗。
（2）、SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因表达水平的测定
分别取加铁待测番茄幼苗的根部和缺铁待测番茄幼苗的根部，进行核糖核酸（RNA）的提取和cDNA的反转录，通过定量即时聚合酶链锁反应（qRT-PCR）实验，分别分析加铁待测番茄幼苗的根部中和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平；
所述SlMYB4基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示；
所述SlMNB1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：2所示；
所述SlFRO1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：3所示；
所述SlIRT1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：4所示。
（3）显著性差异的计算
对加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平分别进行显著性差异的计算，结果见图4 A-D所示，在加铁条件下，中蔬四号、小仙桃和粉冠802植株中SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1基因表达水平相比较野生型被显著抑制或无明显差异；而在缺铁条件下，中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株中SlFRO1和SlIRT1基因的表达水平相比较野生型明显抑制或无明显差异，且差异显著，P值< 0.05，其结果见图4 A-B；而SlMYB4和SlMNB1基因的表达水平相比较野生型（AC）显著上调或无明显差异，且差异显著，P值< 0.05，其结果见图4 C-D；这些结果表明筛选获得的番茄品种为缺铁敏感型番茄品种而非缺铁耐受型番茄品种，因为其不满足缺铁耐受型番茄品种的初步筛选鉴定条件如SlFRO1和SlIRT1基因表达水平显著上调且差异显著，P值< 0.05；SlMYB4和SlMNB1基因表达水平显著抑制且差异显著，P值< 0.05时则初步为缺铁耐受型品种番茄，结果见图4；
由图4中的A可见，缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802根中SlIRT1基因的表达；
由图4中的B可见，缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802根中SlFRO1基因的表达；
由图4中的C可见，缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802根中SlMYB4基因的表达；
由图4中的D可见，缺铁胁迫下野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802根中SlMNB1基因的表达；
图4中所示数据为三个独立重复实验的平均值和标准差，不同小写字母表示统计显著性差异（Tukey's test，P值< 0.05）。
（4）番茄幼苗遗传表型分析
将野生型和初步获得缺铁敏感型番茄品种小仙桃、中蔬四号和粉冠802的种子播种至土培盆中生长10天，用去离子水清洗干净表面的泥土，分别移栽至加铁水培营养液和缺铁水培营养液中，培养12天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，观察野生型、小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄植株的生长情况。结果见图5E-H所示，在缺铁水培营养液上观察发现中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株与野生型均表现出叶片黄化的缺铁敏感表型，图5A-D在加铁水培营养液上观察发现中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的生长表型与野生型相比无明显差异，结果见图5；
由图5的A可见，野生型加铁处理后表型变化；
由图5的B可见，中蔬四号加铁处理后表型变化；
由图5的C见，小仙桃加铁处理后表型变化；
由图5的D见，粉冠802加铁处理后表型变化；
由图5的E见，野生型缺铁处理后表型变化；
由图5的F见，中蔬四号缺铁处理后表型变化；
由图5的G见，小仙桃缺铁处理后表型变化；
由图5的H，粉冠802缺铁处理后表型变化。
（5）番茄幼苗生理指标的测定
表型分析中的野生型、小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄品种生理指标根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性的测定：A，在加铁条件下对野生型番茄和缺铁敏感型小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和缺铁敏感型小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄植株分别进行测定；B，对加铁条件下测定获得的野生型番茄和缺铁敏感型小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和缺铁敏感型小仙桃、中蔬四号和粉冠802番茄植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行显著性差异的计算，结果发现，当检测在加铁水培营养液上生长的中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的叶绿素含量时与野生型植株相比无明显差异；当检测在缺铁水培营养液上生长的中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的叶绿素含量时与野生型植株相比明显降低或无明显差异，且差异显著，P值< 0.05。其结果见图6 A。
其次结果发现，当检测在加铁水培营养液上生长的中蔬四号、小仙桃和粉冠802的铁还原酶活性时与野生型植株相比无明显差异；当检测在缺铁营养液上生长的中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的铁还原酶活性时与野生型植株相比明显降低，且差异显著，P值< 0.05，其结果见图6 B；最后结果发现，在加铁条件下，中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的茎部和根部中的铁含量显著低于野生型植株或无明显差异，且差异显著，P值<0.05；其结果见图6 C-D；在缺铁胁迫条件下，紫珍珠和串珠樱桃番茄植株的茎部和根部中的铁含量明显高于野生型，且差异显著，P值< 0.05。以上结果表明，在缺铁胁迫下，中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株的茎部和根部中的铁含量显著低于野生型或无明显差异，且差异显著，P值< 0.05。此结果证实，筛选获得的中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株为缺铁敏感型番茄品种，同时也进一步证明SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1和SlIRT1作为筛选缺铁耐受型番茄品种的候选基因是一个可靠指标，并且能够在筛选缺铁耐受型番茄品种上进行利用，结果见图6；
由图6的A可见，野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株在加铁和缺铁胁迫下叶绿素含量分析；
由图6的B可见，野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株在加铁和缺铁胁迫下氧化还原酶活性分析；
由图6的C见，野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株在加铁和缺铁胁迫下茎中铁含量；
由图6的D，野生型、中蔬四号、小仙桃和粉冠802番茄植株在加铁和缺铁胁迫下根中铁含量；
图6所示数据为三个独立重复实验的平均值和标准差，不同小写字母表示统计显著性差异（Tukey's test，P值< 0.05）。
以上实验结果表明，筛选获得的耐受型番茄品种，必须满足以下条件，首先SlFRO1和SlIRT1基因表达水平的显著上调且差异显著，P值<0.05；SlMYB4和SlMNB1基因表达水平显著抑制且差异显著，P值<0.05；时则初步为缺铁耐受型品种番茄；其次，将初步获得缺铁耐受型番茄品种的种子播种至土培盆中生长10天用去离子水清洗干净表面的泥土后分别移栽至加铁和缺铁水培营养液中培养12天观察番茄植株的生长情况进一步确定为缺铁耐受型番茄品种；最后，测定表型分析中番茄植株加铁和缺铁处理条件下新叶中的叶绿素含量、根和叶中的铁含量以及铁的还原酶活性，确定其结果与表型一致时即为缺铁耐受型番茄品种。而不满足以上耐受型番茄品种的筛选条件的番茄品种，则被视为缺铁敏感型番茄品种，可将其进行弃除。
序列表
<110> 合肥工业大学
<120> 一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法
<130> 1234
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 822
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
atgggaaggt caccttgttg tgagaaggca catacaaaca aaggagcatg gactaaagaa 60
gaagatgaaa gactaatttc ttacattaga gctcatggtg aaggttgttg gaggtctctt 120
cctaaagctg ctggacttct tcgatgcggt aaaagttgtc gtctccgatg gattaattac 180
ttaagacctg accttaaacg tggtaacttt actgaagaag aagatgaact cattatcaaa 240
ctccatagcc tccttggaaa caagtggtcg cttatagcag gaagattacc aggaagaaca 300
gataacgaga taaaaaacta ttggaacaca catataagac gaaagctctt gagtcgaggt 360
attgatccaa caacacatag atcaatcaat gatcctacta caataccaaa agttacaacg 420
attacttttg ctgctgctca tgaaaatatt aaagatattg atcaacaaga tgagatgata 480
aatatcaaag ctgaattcgt tgaaacaagc aaagaatcag ataataatga aataattcaa 540
gaaaagtcat catcatgtct tcctgactta aatcttgaac tcagaattag tcctccacat 600
catcaacaac tcgatcatca tcgtcatcat caacgatcaa gctctttatg ttttacatgt 660
agtttgggaa ttcaaaatag taaagattgc agttgtggaa gtgaaagtaa tggaaatgga 720
tggagtaata atatggtaag tatgaacatt atggctggtt atgacttttt gggcttgaag 780
actaatggtc ttttggacta tagaactttg gaaactaagt ga 822
<210> 1
<211> 894
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
atgtctcctt catggcctac tacacttctt gcctctctat ttctcttctc ccaaatattt 60
tcttgcattg cccaagttcc acttgaaaac acctttaaat tcgtcaacga aggcgaatta 120
ggaccttatg tcgtagaata tcaagcagat tatcgcgttc ttagtgtttt cagtaatcca 180
ttccagctct gtttctataa cacaactcct aacgcatgga cactagcgtt acgaatgggc 240
actgtccgtt ctgaatcact catgcgttgg gtgtgggaag caaatagagg aaaccccgtt 300
aaagaaaacg cgaccctcac atttggaact aacggaaatc ttgtattggc ggatgctgac 360
ggtcgaatcg cttggcagac caacacagcc aataaaggag tgacagggtt caagttgtta 420
cctaatggta acatggtgct acatgactct aaaggtaaat tcgtctggca gagtttcaac 480
tatcccactg atactttact agtgagccaa actctcagat tgtccggccc gaataagctt 540
gtgagtcggg cttcggtgaa aaaaaatgcg aacgggcctt atagcttggt ggtgcagcca 600
aaattgtttg ctatctacaa taggactaag ttaggcgtgg aattagcttg gttcgatttt 660
ggaaacagta tgttggaatc cgtgaaatta aataatggaa accaaagatt gaaattggat 720
tatagattgg caaaatcaac aaaaagaagt tcacatgtga tggcatttac taaatataac 780
acaacattaa catatcttag acttgaaatt gatggaaatt taaaggctta cacttttgtt 840
agagatgaag aggcagatga atttcgttgg aaggtaactt atcaaatgct ataa 894
<210> 1
<211> 1900
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
gttaccaatg atcttcaagc aactataatg gctctaatat taattgttac tattgggtat 60
tttctacttt tgatagtaac accaactaat atgtatagac aaatatggac acccaagatt 120
aaagctcaca ctaccaactc cacatacttt ggagctcaag gaaggacttt gttgatgaac 180
acatttcctc tcatatttat tgctgtcttg ggatgtgtat acctccattt atggaagaaa 240
tccaataata aaaacatcaa cagatttgag aagaaacaaa agttggctat atggaggagg 300
ccaataatca tgaaggggct gggaattgta tcaagaatag agcttggttt ttttgtgatg 360
tttattgcac tcttagtttg gacttttgct tcttacttgc acattatttt tcccactatt 420
acaccaaaat ccgtagcaaa cagtggagaa aaagtatggg aagccaagtt ggaagattca 480
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agaggctcat ctgtgttaca agtatttggt ttgacatcag aagctagtgt taaatatcat 600
atatggcttg gccatattgt aatgactctt ttttctgctc atggcatttg ttacattatc 660
tattgggctt ccactcatca attgtctgag atgctgaaat ggggaaaaac tgatatatca 720
aatttggctg gtgaattggc attgctttct ggattggtgt tgtggatagc aacatttcct 780
aaaattagga gaaagatgtt tgaactcttc ttctacactc atcatttcta cattctcttt 840
gtcgtcttct tcgtcttcca tgttggtgtt tcttacgctt gcatcatgct tcctggtttc 900
ttcctcttca tggttgatcg attcttgaga ttcttacagt cacgatcaaa tgttcgttta 960
gtctctgctc gtgttctgcc atgtgaaact cttgaactca atttctccaa gactaaaggt 1020
ttaagttaca caccaactag catcatgttt gtgaatgtac ctagcatttc aaaattgcaa 1080
tggcatcctt ttaccatcac ttcaagtagt aatttggagc cagagaaaat cagtgttgcc 1140
attaagggtg aaggaagttg gtccaaaaaa ctctaccaga tgatctcttc ccctaattct 1200
gtcgatcgtc ttaacgtctc tgttgaagga ccttatggac ctccttccac acattttcta 1260
aggcatgatt tattggttat gataagtgga ggaagtggaa ttactccttt catttccatc 1320
attagggagc taattcatac aagtgagtca caaaaatgca agacaccaga aatcctactt 1380
attagtgtgt tcaagaattc ggaagatctc accatgttgg accttctcct tcctatatct 1440
ggtgctccat cagaaacttg taaactgggg ctacaaatcg aggcttttgt aacgagagaa 1500
aagcaaccag tatcgacaga agacaagaag aatgtgagga ctatatggtt caagcccaac 1560
ccatctgata agcctatcac tccaattctt ggacaaaaca attggctctg gcttggtgct 1620
atcatatcat gttccttcct cattttcttg atttccttgg gggtcttgaa tagatattac 1680
atatatccaa tcgacaataa tactaatgac atattttcgt atccaataaa ggcggtgttg 1740
aatatgctaa tcatttgcat atctatagtc atcacaagta gtgctgcatt tgtttggaac 1800
aagagacaga gtgggactga tgcaaaacag attcagaaca tggaaggtgc aactcctatg 1860
gcttcgccta attcttggtt ctataatgcc gatagggaga 1900
<210> 1
<211> 1053
<212> DNA
<213> 番茄(Solanum lycopersicum)
<400> 1
atggcaaatt ataatttcaa gtacatcgcc attttcctcc ttctcatctc aattttggcc 60
cctcgagtac tatcagtagt agaagattgt ggagcagaag aagacaactc atgtgtcaat 120
aaatccaaag cgttaccctt aaaaatcata gccatagtct ccatccttat cactagtatg 180
atcggagtat gtcttccact agtcacacgt tctattccgg ccctaagccc ggaaagaaac 240
ctttttgtga tagttaaggc atttgctgct ggaattatcc tggctacggg gtttatgcac 300
gtgctaccgg actcgtttga catgttgtca tcgagttgcc ttaaggagca cccgtggcac 360
aaattcccct ttactggatt tgtggcaatg ttgtccgcta tagtaacgat ggctattgac 420
tctatagcta ctagtttata cagcaaaaag cataatggtg gtgtggttaa tccagaaggt 480
gatcaagaaa tggctgtggc tggaaatcat gttcattccc atcatcatca tggatccctt 540
tcgactaaag atggacttga tggcaaaaaa ttactaagat acagagtaat tgccatggtg 600
ttagagcttg gaattattgt tcactccata gtgattgggc tatcactagg tgcgtcaagc 660
aatacatgta cgattaaagg actcgtagct gcactttgct ttcatcaaat gtttgaagga 720
atgggccttg gtggttgcat cctacaggcg gagtataagt tcatgaagaa ggctataatg 780
gcgtttttct tcgcagtaac aacaccattt ggtatagcac ttgggatagc attgtcaact 840
acttatgagg aaaatagtcc acgggcgtta ataactgttg gattactgaa tgcatcatct 900
gctggacttt tgatatatat ggctttggtt gatcttcttg ctgctgattt tatgggtgac 960
aaattacaag gcagtgtcaa actacaaatt aagtcttaca tggctgttct tcttggtgct 1020
ggtggaatgt cagtcatggc catttgggct taa 1053
Claims (4)
1.一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法，其特征在于，操作步骤如下：
（1）番茄幼苗的培养和缺铁处理
将10种以上番茄品种的种子采用土壤培养10天，得到番茄幼苗；
用去离子水洗净番茄幼苗的根表泥土，分别移栽至加铁营养液的育苗盘中和缺铁营养液的育苗盘中，分别在人工气候培养室中培养6天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60%、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，分别得到10种以上加铁待测番茄幼苗和10种以上缺铁待测番茄幼苗；
所述加铁待测番茄幼苗为对照组番茄幼苗，所述缺铁待测番茄幼苗为处理组番茄幼苗；
SlMYB4、SlMNB1、SlFRO1、SlIRT1基因表达水平的测定
分别取10种以上加铁待测番茄幼苗的根部和10种以上缺铁待测番茄幼苗的根部，进行核糖核酸的提取和cDNA的反转录，通过定量即时聚合酶链锁反应实验，分别分析加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因和缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平；
所述SlMYB4基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：l所示；
所述SlMNB1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：2所示；
所述SlFRO1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：3所示；
所述SlIRT1基因的DNA序列如序列表SEQ ID No：4所示；
得到10种以上加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据和10种以上缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、 SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达数据；
（3）显著性差异的计算
对10种以上加铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平和10种以上缺铁待测番茄幼苗的根部中SlMYB4基因、SlMNB1基因、SlFRO1基因和SlIRT1基因的表达水平分别进行显著性差异的计算；缺铁胁迫下当SlFRO1基因和SlIRT1基因表达水平的显著上调，且P值< 0.05，差异显著；SlMYB4基因和SlMNB1基因表达水平显著抑制，且P值< 0.05差异显著时，则初步为缺铁耐受型品种番茄；其所述的缺铁胁迫下SlFRO1、SlIRT1、SlMYB4和SlMNB1基因表达水平的显著性差异P值的计算，是使用SPSS 22软件，并选择单因子ANOVA方差分析的方式求算P值，若P值< 0.05，则会被认为是具有显著性差异，所述的显著性差异则被认为是缺铁耐受；
通过显著性差异的计算分析从10种以上番茄品种中初步获得缺铁耐受型番茄品种；
（4）番茄幼苗遗传表型分析
将初步获得缺铁耐受型番茄品种的种子和野生型番茄品种的种子播种至土培盆中，生长10天，用去离子水清洗干净两种番茄幼苗根部表面的泥土，分别移栽至加铁水培营养液和缺铁水培营养液中，培养12天，培养条件：温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1，光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替，观察缺铁条件下两种番茄植株的生长情况，所述野生型番茄为对照番茄幼苗，与野生型番茄相比较进一步确定缺铁耐受型番茄为缺铁耐受型番茄品种；
（5）番茄幼苗生理指标的测定
分别测定缺铁耐受型番茄幼苗和野生型番茄幼苗的生理指标；
表型分析中的番茄植株生理指标根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性的测定：A，在加铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株根和叶中的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行测定；B，对缺铁条件下测定获得的野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性以及在缺铁条件下对野生型番茄和初步获得缺铁耐受型番茄品种植株中的根和叶铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性分别进行显著性差异的计算，缺铁胁迫下，当初步获得缺铁耐受型番茄植株中根和叶的铁含量、新叶中的叶绿素含量和铁的还原酶活性与野生型番茄相比显著上调，且P值< 0.05，差异显著，即为缺铁耐受型番茄品种；使用SPSS 22软件，并选择单因子ANOVA方差分析的方式求算P值，若P值< 0.05，则会被认为是具有显著性差异，所述的显著性差异则被认为是缺铁耐受型番茄品种。
2.根据权利要求1所述一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法，其特征在于：步骤（1）中，番茄土壤培养具体操作：取黑土，经过121℃高压高温灭菌处理20 min，将珍珠岩、蛭石和黑土按1:3:9的比例混合，搅拌均匀，装入土培盆中；再将预先置于42 ℃去离子水中浸泡1小时的番茄种子播种至土培盆的培养土中，将土培盆在人工气候培养室中培养10天，培养条件为温度22 ℃、相对湿度40-60 %、光照强度100 μmol·m-2·s-1、光照周期为日照16小时和夜晚8小时昼夜交替。
3.根据权利要求1所述一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法，其特征在于：步骤（1）中，1 L所述加铁营养液由5 mL A1、5 mL A2 、1 mL B、1 mL C、1 mL D和 987 mL水混合均匀制成；
所述A1由101.12g硝酸钾、283.44g四水硝酸钙和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A2由147.84g七水硫酸镁、磷酸二氢钾和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B由3.092g硼酸、2.028g一水硫酸锰、0.172g五水硫酸铜、0.286g七水硫酸锌、0.058g钼酸钠和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述C由18.36g乙二胺四乙酸铁钠和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D由21.12g五水偏硅酸钠和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
4.根据权利要求1所述一种番茄缺铁耐受型品种的快速筛选鉴定方法，其特征在于：步骤（1）中，1 L所述缺铁营养液由5 mLA3、5 mL A4 、1 mL B1、1 mL D1和 988 mL水混合均匀制成；
所述A3由101.12g硝酸钾、283.44g四水硝酸钙和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述A4由147.84g七水硫酸镁、磷酸二氢钾和3 L水混合均匀，再补水定容至4L而制成；
所述B1由3.092g硼酸、2.028g一水硫酸锰、0.172g五水硫酸铜、0.286g七水硫酸锌、0.058g钼酸钠和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成；
所述D1由21.12g五水偏硅酸钠和500 mL水混合均匀，再补水定容至1L而制成。
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| 用卫星DNA沉默载体研究植物矿质营养相关的基因:以沉默番茄的高铁还原酶基因FRO1为例;何秀霞;金崇伟;李桂新;尤广奕;周雪平;郑绍建;;中国科学(C辑:生命科学)(第04期);全文 * |
| 转FRO2基因番茄突变体的抗缺铁黄化特性;张伟玉;杨静慧;刘艳军;黄俊轩;梁国鲁;乔红娥;曲佳;;西南大学学报(自然科学版)(第03期);全文 * |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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