CN112779272A - 一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因与应用，属于生物工程技术领域。所述增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因序列如序列表SEQ ID No：l所示。本发明是将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物对缺铁胁迫耐受性的功能基因在植物中进行敲除，使其在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状。本发明植物增强缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因可为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗逆性和耐逆性增强的植物种子。

Description

一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因与 应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及利用该基因作为一种负调控因子增强植物对缺铁胁迫的耐受性及提高植物体内铁含量的方法。

背景技术

铁（Fe）是人、动物和植物所必需的重要营养元素之一，也是食品中重要矿质营养之一。铁作为许多功能蛋白的重要辅助因子，其对维护人、动物和植物机体正常生理功能具有重要作用，参与造血、维持生长发育和抵御感染性疾病等。同样，Fe对植物体有着重要作用，参与植物叶绿素的合成、光合作用、生物固氮和呼吸作用中的细胞色素和非血红素铁蛋白的组成，是植物能量代谢的重要物质。叶绿体的合成需要Fe的参与，所以缺Fe胁迫下植物会出现叶绿素的合成缓慢、叶片叶脉间失绿，从而影响光合作用。土壤中虽然富含大量的铁元素，但可利用率极低，高pH和高碳酸盐含量严重降低了土壤中Fe的有效性，导致植物难以从土壤中吸收足够Fe，造成缺Fe胁迫，严重影响植物的生长发育，减少农作物产量。所以提高作物对缺铁胁迫的耐受和提高作物对铁的吸收及积累已经成为关系民生的大事,也已成为农业生产和食品营养研究的重点，倍受世界各国政治界和学术界的关注，也是当前生命科学研究的热点。

利用模式植物拟南芥作为试验材料，模式植物拟南芥现被广泛应用于植物遗传学、作物生物学、发育生物学和分子生物学等研究领域。基于拟南芥具有结构简单、繁殖系数高、生长周期较短、生活力强、自花授粉和易于转化的特点，将拟南芥作为研究对象能够更快更好的达到实验预期目标，可以很大程度上缩短实验时间和简化实验条件，表现出其他生物无法比拟的优越性。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到, 有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研究，且拟南芥全基因组测序已完成，因此利用模式生物拟南芥研究植物响应缺铁胁迫的分子生物学机制将对对特定区域提高作物的产量和增加食品安全性具有重要的理论与经济意义。根据拟南芥测序数据库（www.arabidopsis.org）寻找和发现新的具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一,也是不同国家之间科技竞争的焦点。拟南芥共有约1.3亿个碱基对，2.9万个基因。目前大部分基因的功能研究还尚不清楚，用突变技术研究基因功能已经成为最有效的方法之一，目前可利用CRISPR/Case9介导的基因编辑技术方法，还可采用T-DNA插入、转座子插入、EMS诱变、RNAi干涉等方法，利用这些基因工程技术方法最终将研究功能基因进行敲除，并将转化的植物组织培育成突变体植株。通过对突变体基因功能的研究, 发现了一些与植物相关的缺铁胁迫响应的调控因子，如：FIT、bHLH38、FRO2、IRT1、MYB10、MYB72等。

面对日益严重的环境污染问题, 寻找调控植物铁稳态及增强铁积累的功能基因阐明其功能具有重要的理论及实践意义。根据拟南芥数据库公布的基因组序列,MYB4（AT4G38620）是拟南芥MYB转录因子家族中的成员,MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，其家族成员较多且功能多样。研究表明，在植物中大多数MYB蛋白主要是以R2R3型MYB结构域为特征的蛋白亚家族存在，在植物生长发育、激素响应、植物防御反应以及生物胁迫和非生物胁迫中起着重要的调控作用，如开花、叶片衰老、激素响应、病害、盐害、干旱、重金属镉等，特别是近年来发现MYB转录因子参与植物营养缺乏胁迫响应的调节，如MYB10和MYB72作为正调控因子参与植物对缺Fe胁迫响应的调节。然而，是否有其他MYB转录因子参与植物对缺Fe胁迫响应的调控仍有待于进一步发掘和研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因，本发明的第二个目的提供所述功能基因作为负调控因子在调控植物缺铁耐受及提高植物铁含量方面的应用。

一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因的DNA序列如SEQ IDNo.1所示。

将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受并提高植物铁含量的编码基因在植物中进行敲除，即在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状，所述植物为拟南芥。

将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受并提高植物铁含量的编码基因通过转座子插入的方法，实现将拟南芥中的负调控蛋白MYB4基因敲除。以提高拟南芥对Fe的吸收，导致拟南芥体内的Fe含量上升，进而表现为对缺铁胁迫耐受性状。

本发明的有益技术效果体现在以下方面：

1.根据拟南芥数据库公布的基因组序列，MYB4（AT4G38620）是拟南芥MYB转录因子家族中的成员，申请人发现MYB4基因突变后在缺铁胁迫处理下植株表现为对缺铁胁迫耐受，这表明该MYB4基因响应缺铁胁迫的调控。为此，我们研究了该基因功能，进一步研究结果表明，MYB4基因突变体植株体内Fe含量与野生型植株相比较高，这说明敲除基因MYB4可以提高拟南芥对Fe的吸收，导致拟南芥体内的Fe含量上升，进而表现为对缺铁胁迫耐受。

2.本发明所述的MYB4基因突变后可以增强植物缺铁耐受及铁积累，它为农作物抗逆遗传改良提供新的基因资源和技术保障，应用其可培育出抗逆性和耐逆性增强的植物种子。

附图说明

图1为myb4-1突变体植物中MYB4基因的表达水平检测图。

图2为MYB4基因在野生型拟南芥中被缺铁胁迫诱导表达图

图3为myb4-1突变体植株与野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于MS与-Fe的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中MS培养基为对照图。

图4为野生型与myb4-1突变体植株根、茎中的铁含量比较图。

图5为myb4-1突变体植株与野生型植株在MS培养基上正常生长2周，再移致-Fe培养基处理7天后检测缺铁相关基因的表达水平图。

图6为MYB4过表达植株中MYB4基因的表达水平检测图。

图7为MYB4过表达植株（OE1和OE2）与野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于MS、-Fe的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周的比较照片，其中MS培养基为对照图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地描述。

下述实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

实施例1 MYB4突变体的获得及培育缺铁表型耐受拟南芥

1、我们利用从美国拟南芥种质资源库获得的拟南芥突变体种子筛选响应植物缺铁胁迫的突变体。使用不含有铁的MS培养基对拟南芥种子突变体库进行筛选，获得了一株对缺铁耐受的突变体，筛选鉴定发现该突变体为转座子插入MYB4基因功能缺失突变体，命名为myb4-1，其种子编号为CS26404。该突变体属于兰兹贝格背景，故其生态型是兰兹贝格(Landsberg erecta, Ler)生态型。因为该种子为转座子插入突变，利用半定量PCR，对myb4-1突变体材料进行转录水平鉴定，发现这该突变体中MYB4基因的表达水平显著低于野生型（WT）参见图1。为了进一步确定MYB4基因是否参与植物缺铁胁迫响应，我们提取了7天缺铁胁迫处理的野生型（WT）拟南芥的RNA并反转录成为cDNA，利用实时定量PCR技术进行MYB4基因的转录水平的分析，发现MYB4基因表达水平相对于对照组被缺铁胁迫显著抑制，该结果进一步表明MYB4是作为负调控因子来响应缺铁胁迫,参见图2。

2、将野生型(WT)与myb4-1同时播种于直径为90 mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，通过对在MS培养基上生长的WT、myb4-1检测的叶绿素含量及氧化还原酶活性进行检测，发现其均无显著差异,见图3中B和图3中C。在植株直接点种在不含有铁的培养基上培养，myb4-1表现出明显的缺铁耐受的性状,见图3中A。在缺铁胁迫下，myb4-1的叶绿素含量及氧化还原酶活性明显比WT高, 见图3中B和图3中C。上述结果表明myb4-1较WT对缺铁胁迫表现出明显耐受。

3、野生型和myb4-1突变体植株根、茎中的铁含量分析

myb4-1突变体和野生型植株（WT）在培养皿上垂直培养，分别直接点种于加铁和缺铁的培养基上在正常光照条件下垂直培养2周。分别检测MS和-Fe处理条件下WT、myb4-1植物中根和茎中的铁含量。结果发现，在正常条件下，myb4-1茎和根中的铁含量较野生型WT无明显差异，见图4中A和图4中B；在缺铁条件下，myb4-1茎和根中的铁含量均高于野生型WT，见图4中A和图4中B，上述结果进一步表明了MYB4作为负调控因子从而增强植物缺铁耐受及积累的基因及其编码蛋白。

4、缺铁胁迫下myb4-1突变体与野生型WT植株中缺铁相关基因表达水平比较

取在缺铁胁迫处理7天条件下的myb4-1与野生型WT植株，提取RNA并反转录成cDNA后进行利用实时定量PCR技术，对相关基因（FIT、IRT1、FRO2、bHLH38）表达水平进行测定，发现myb4-1突变体植株体内FIT、IRT1、FRO2、bHLH38基因表达水平明显高于WT，见图5中A、图5中B、图5中C、图5中D，表明myb4-1植株对缺铁耐受可能与FIT、IRT1、FRO2、bHLH38基因表达显著诱导上调表达有关。

实施例2、培育缺铁表型敏感拟南芥

1、MYB4基因过量表达转基因株系MYB4-OE1、OE2的获得

为进一步验证该基因在植物缺铁胁迫调控中的功能，我们构建了MYB4基因过量表达载体（35S:MYB4）。首先进行目的片段扩增。将野生型拟南芥在MS培养基上正常培养两周，提取植株总RNA，反转录合成cDNA，以合成的cDNA为模板，进行PCR，扩增出足够量的目的产物,再以PCR产物为模板，进行第二次扩增，目的是引入酶切位点。将PCR产物与载体pCAMBIA1301进行酶切回收。再将回收纯化好的目的DNA片段和载体用T4 DNA连接酶连接过夜。将上述连接液转入DH5a中，检测筛选出阳性克隆进行测序。测序结果确定无误后，利用电击转化法转入农杆菌GV3101。电击转化后的农杆菌GV3101，经活化后涂布于含双抗（Kan，Gen）的LB培养基平板。随机挑取单菌落，在含双抗（kan，Gen）的LB培养液中扩培并使用载体引物进行PCR鉴定。PCR扩增片段大小与目的基因一致后，采用浸花法转化拟南芥野生型植株，从而获得MYB4基因过表达转基因株系。利用半定量PCR,我们对MYB4过表达转基因植株进行了转录水平的鉴定，最终选择OE1和OE2进行下一步实验,参见图6。其中,引物1：F 5'NNNGGTACCATGGGAAGGTCACCGTGCT 3'；

引物2：R 5' NNNCTCGAGTTATTTCATCTCCAAGCTTCGAAAG 3'。

2、MYB4-OE1和OE2过表达转基因植株与野生型植株的缺铁性比较

将野生型(WT)与MYB4-OE1和OE2同时播种于直径为90 mm的培养皿中，培养基为加铁和不加铁的固体培养基，置于22℃恒温光照培养箱中（光周期为16小时光照，8小时黑暗）垂直培养。两周后，在MS培养基上生长的MYB4-OE1和OE2检测的叶绿素含量及氧化还原酶活性均无显著差异,见图7中B和图7中C；将植株直接点种在不含有铁的培养基上培养MYB4-OE1和OE2都表现出明显的缺铁敏感的性状,见图7中A。在缺铁胁迫下，MYB4-OE1和OE2的叶绿素含量及氧化还原酶活性明显比WT低, 见图7中B和图7中C。上述结果表明，MYB4-OE1和OE2较WT对缺铁胁迫表现出更加明显的敏感性状，进一步证明了MYB4基因作为负调控因子从而响应缺铁胁迫的调控。

序列表

<110> 合肥工业大学

<120> 一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因与应用

<130> 2021

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 849

<212> DNA

<213> 拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgggaaggt caccgtgctg tgagaaagct cacacaaaca aaggagcatg gacgaaagaa 60

gaggacgaga ggctcgtcgc ctacattaaa gctcatggag aaggctgctg gagatctctc 120

cccaaagccg ccggacttct tcgctgtggc aagagctgcc gtctccggtg gatcaactat 180

ctccggcctg accttaagcg tggaaacttc accgaggaag aagacgaact catcatcaag 240

ctccatagcc ttcttggcaa caaatggtcg cttattgccg ggagattacc gggaagaaca 300

gataacgaga taaagaacta ttggaacacg catatacgaa gaaagcttat aaacagaggg 360

attgatccaa cgagtcatag accaatccaa gaatcatcag cttctcaaga ttctaaacct 420

acacaactag aaccagttac gagtaatacc attaatatct cattcacttc tgctccaaag 480

gtcgaaacgt tccatgaaag tataagcttt ccgggaaaat cagagaaaat ctcaatgctt 540

acgttcaaag aagaaaaaga tgagtgccca gttcaagaaa agttcccaga tttgaatctt 600

gagctcagaa tcagtcttcc tgatgatgtt gatcgtcttc aagggcatgg aaagtcaaca 660

acgccacgtt gtttcaagtg cagcttaggg atgataaacg gcatggagtg cagatgcgga 720

agaatgagat gcgatgtagt cggaggtagc agcaagggga gtgacatgag caatggattt 780

gattttttag ggttggcaaa gaaagagacc acttctcttt tgggctttcg aagcttggag 840

atgaaataa 849

Claims (3)

1.一种增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因，其特征在于：所述编码基因的DNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.根据权利要求1所述的增强植物缺铁耐受性并提高植物铁含量的编码基因的应用，其特征在于：将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受并提高植物铁含量的编码基因在植物中进行敲除，即在植物中不表达，植物表现为缺铁耐受性状，所述植物为拟南芥。

3.根据权利要求2所述的应用 ，其特征在于：将序列表SEQ ID No：l所示的增强植物缺铁耐受并提高植物铁含量的编码基因通过转座子插入的方法，实现将拟南芥中的负调控蛋白MYB4基因敲除。

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