CN112080509A - 草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用 - Google Patents

草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用，本发明的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH，所述FaGalLDH基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高维生素C含量中的应用。草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高植物耐盐性中的应用。将该基因在拟南芥中超量表达后，得到维生素C(AsA)含量显著提高的转基因植株，且提高了转基因植株的耐盐性。实验证明，将本发明的FaGalLDH基因可以在体外合成维生素C，并且优化发现了最佳诱导条件，超量表达可显著提高转基因拟南芥叶片的维生素C含量，且对植物的正常生长没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物维生素C合成机制的研究，以及提高植物的维生素C含量的改良和抗逆性具有重要的理论及实际意义，应用前景广阔。

Description

草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用
技术领域
本发明涉及一种植物分子遗传与基因工程技术领域，尤其涉及的是一种草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用。
背景技术
草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，果实色泽鲜艳，芳香浓郁，酸甜适口，具有较高的营养和保健价值，有“水果皇后”的美誉。草莓果实被证明具有强抗氧化活性，与果实中所含的维生素C和多酚化合物有关。维生素C(又称抗坏血酸)是一种水溶性维生素，不仅对人类的坏血病、动脉硬化和高血压等疾病有积极的预防作用，而且在植物的生长发育过程中也起着抗氧化、应激等至关重要的作用。另外维生素C也是衡量草莓果实内在品质的标准之一，其含量的高低直接影响草莓果实的营养价值，所以探明维生素C的合成关键基因，对改善草莓品质及其生产有重要意义。L-半乳糖-1,4-内酯脱氢酶(GalLDH)是维生素C合成中关键酶，但是在草莓果实中GalLDH基因的研究目前却少有报道，因此阐明GalLDH基因在维生素C积累中的机理，对草莓生产至关重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：如何利用基因工程提高草莓果实的维生素C的含量，提供了一种草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的，本发明的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH，所述FaGalLDH基因具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
克隆所述基因的FaGalLDH的引物名称与序列如下：
FaGalLDH-F，CGATGCAGAGAGCTCTCACTCT；
FaGalLDH-R，CGTCAAATGGTATCAGACGATG。
所述基因FaGalLDH的CDS区包含一个完整的开放阅读框ORF，含1743bp，编码580个氨基酸。
一种含有所述的基因FaGalLDH的表达载体。
所述表达载体为：pMAL-FaGalLDH。
所述的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高维生素C含量中的应用。
所述的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高植物耐盐性中的应用。
将基因FaGalLDH转入拟南芥中超量表达，使用50～200mM的NaCl处理转基因拟南芥。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了草莓维生素C合成相关基因FaGalLDH及其应用，构建了原核表达载体pMAL-FaGalLDH，纯化得到了草莓pMAL-FaGalLDH离体表达蛋白，优化了催化维生素C合成的条件，发现该蛋白在25℃和pH4.0条件下活性最高。将该基因在拟南芥中超量表达后，得到维生素C(AsA)含量显著提高的转基因植株，且提高了转基因植株的耐盐性。实验证明，将本发明的FaGalLDH基因可以在体外合成维生素C，并且优化发现了最佳诱导条件，超量表达可显著提高转基因拟南芥叶片的维生素C含量，且对植物的正常生长没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物维生素C合成机制的研究，以及提高植物的维生素C含量的改良和抗逆性具有重要的理论及实际意义，应用前景广阔。
附图说明
图1是FaGalLDH基因的PCR扩增结果电泳图；
图中M为DL2000 DNA Marker；1、2、3为FaGalLDH基因的PCR扩增结果；
图2是草莓发育时期与器官中维生素C含量示意图；
图中，A、不同组织部分中维生素C含量；B、5个发育时期果实中维生素C含量；
图3是草莓发育时期与器官中FaGalLDH的表达量示意图；
图中，A、草莓不同组织器官FaGalLDH基因表达量；B、5个发育时期草莓果实的FaGalLDH基因表达量；
图4是pMAL-c5X-FaGalLDH蛋白诱导图；
图5是pMAL-c5X-FaGalLDH蛋白诱导纯化图；
图中，1、蛋白包涵体2、破碎上清3、纯化蛋白；
图6是温度和pH对FaGalLDH酶活性的影响示意图；
图中，A、温度对FaGalLDH酶活性的影响；B、pH对FaGalLDH酶活性的影响.
图7是过表达转基因拟南芥中FaGalLDH基因的验证结果；
图中，A、半定量分析；B、FaGalLDH基因的表达量；C、FaGalLDH的酶活性；D、维生素C(AsA)含量；
图8是培养13d的拟南芥的根长的照片；
图9是NaCl浓度下野生和转基因拟南芥的根长。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
一、目的基因克隆如下：
设计特异引物
Figure BDA0002690140150000031
以“红颜”草莓果实的cDNA为模版，以FaGalLDH-F为上游引物，以FaGalLDH-R为下游引物，进行PCR反应，克隆得到FaGalLDH基因，FaGalLDH的CDS区包含一个完整的开放阅读框(ORF)，含1743bp，编码580个氨基酸。
二、比对未经FaGalLDH表达的“红颜”、“章姬”与经过FaGalLDH表达的“红颜”、“章姬”的维生素C含量。
利用2，6-二氯酚靛酚滴定法可以测定维生素C含量。称取待测样品适当约5g，加入少许2％草酸溶液冰浴研磨，研磨充分充后漏斗过滤至50mL容量中，用2％草酸溶液定容。然后吸取10mL待测溶液于锥形瓶中，用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至粉色且15s内不退色为止，记录滴定液用量V0；空白对照测定，吸取10mL2％草酸溶液于锥形瓶中，用标定过的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定，记录滴定液用量V1。
公式：
Figure BDA0002690140150000032
m：每100g样品中含VC的量，mg/100g。
V0：滴定样品所用的2，6-二氯酚靛酚溶液体积，mL。
V1：空白对照所用的2，6-二氯酚靛酚溶液体积，mL。
A：1mL2，6-二氯酚靛酚溶液所相当于VC的量，mg/mL。
B：滴定时待测样品用量，mL。
a：待测样品取样量，g。
b：待测样品定容量，mL。
检测了“红颜”和“章姬”两个品种的不同组织器官里的维生素C含量。结果显示，“红颜”草莓的5个果实发育时期及不同组织器官的维生素C含量都明显高于“章姬”品种(见图2)。另外图2中的B显示：“红颜”和“章姬”两个品种的维生素C含量在果实发育过程中总体呈显著上升趋势，即成熟果的维生素C水平最高，小绿果的含量最少；从图2中的A中不难看出在根、茎、叶和花四个器官中的维生素C含量最高为叶片，但均低于成熟果的含量，花的维生素C含量最少，分别为0.17mg/100g，1.15mg/100g。从图3的A和B中不难看出维生素C含量在这两个草莓品种的不同发育时期和不同器官组织中差异较大，有明显的组织特异性。
实时定量PCR检测了FaGalLDH基因在‘红颜’和‘章姬’草莓中的时空表达模式。由图3的A可以看出在“红颜”和“章姬”的根，茎，花和成熟果中，“红颜”的FaGalLDH表达量均高于“章姬”；在两个草莓品种中花的FaGalLDH表达量极低，与维生素C含量类似。且在根、茎、叶和花中的表达量都低于成熟果实；另外图3的B中，在草莓果实的5个发育过程中，FaGalLDH表达量都是随着生长发育呈上升趋势，在成熟期表达量最大，并且在各时期“章姬”的FaGalLDH表达量都低于“红颜”的表达量。这些表达模式与图2中草莓中维生素C的含量呈明显正相关性，说明FaGalLDH表达与维生素C含量的积累存在密切关系。
三、草莓FaGalLDH基因的蛋白功能验证
构建了pMAL-c5X-FaGalLDH蛋白表达载体，在温度为28℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下对pMAL-c5X-FaGalLDH进行诱导。依据DNAMAN8分析预测pMAL-c5X-FaGalLDH融合蛋白的理论大小为104kDa。由图4可以看出从0h是没有蛋白产物出现的，从诱导1h开始后诱导的蛋白产物开始增加，且在6h时表达条带增加明显。相反空载体pMAL-c5X和表达载体未经IPTG诱导的菌株没有蛋白产物表达；图中诱导的蛋白条带与预测蛋白的大小相近，可以确定为目的蛋白。综上所述，在28℃，IPTG终浓度为0.5mM的条件下诱导6h可以诱导出pMAL-c5X-FaGalLDH蛋白。
在28℃，IPTG终浓度为0.5mM条件下诱导蛋白表达，收集6h的菌体，将诱导后的菌液进行超声破碎，超声破碎条件为温度为4℃，超声3s，停止3s，重复90次；破碎后在4℃、10000rpm条件下离心20-30min，得到蛋白粗提物。用淀粉树脂纯化目的蛋白。并且图5中纯化的目的条带与图4一致，在100kD左右有一条蛋白质条带，说明纯化得到了FaGalLDH的原核表达蛋白。
测定了FaGalLDH蛋白催化合成维生素C的酶活性。结果如图6所示。测了FaGalLDH蛋白在不同的温度和pH下的酶活性。其中图6中A中可以得到：从5℃到25℃不同的温度条件下，FaGalLDH蛋白酶活性随着温度的增加而升高，而超过25℃时，酶活性随温度升高而下降，说明FaGalLDH的酶活性最适温度是25℃。另外图6中B显示在不同的pH环境中，FaGalLDH的酶活性随着pH值增加呈现出先升高后下降的趋势，并在pH为4.0左右活性最好，说明该酶活性的最适pH约为4.0。
四、在拟南芥中超表达功能验证
通过农杆菌介导法，用pCXSN-FLAG-FaGalLDH-GV3101菌液侵染拟南芥(Col-0)花序，筛选得到了转基因拟南芥，选取两个株系Line1和Line2进行后续实验。分别测定野生拟南芥(WT)和转基因拟南芥中维生素C含量、FaGalLDH基因的表达量和FaGalLDH酶活性，得到的结果如图7所示。图7中的B为实时定量PCR结果，显示FaGalLDH基因的表达量在过量表达拟南芥植株Line1和Line2的显著高于对照植株(WT)。不仅如此半定量分析结果(图7中的A)也表明在野生拟南芥植株中未检测到FaGalLDH的条带，而在转基因拟南芥植株中都检测到了FaGalLDH的条带，而且Line1植株的条带明显比Line2的亮，另外，过量表达拟南芥Line1和Line2植株的FaGalLDH酶活性较WT分别提高了约8倍和4倍(图7中的C)。转基因植株Line1和Line2的维生素C含量较WT提高了80％和20％(图7中的D)。这与FaGalLDH基因的表达结果和酶活性结果结果一致。综上所述，在拟南芥中过量表达草莓FaGalLDH基因，提高了转基因植株FaGalLDH酶活性，而且维生素C含量也升高了。
将野生拟南芥和过表达转基因拟南芥播种在含0mM、50mM、100mM、150mM、200mMNaCl的MS固体培养基上，先低温(4℃)春化3d，后光照培养13d后观察拟南芥的生长情况，并拍照记录，结果如图8所示，在0mM NaCl的MS固体培养基上，野生拟南芥与FaGalLDH基因过表达转基因拟南芥的生长状况相似，而从50mM NaCl处理下，稳定过表达转基因拟南芥的生长优于野生拟南芥，根长较野生拟南芥分别增加了约57.78％和33.32％，并且在100mM和150mM NaCl处理下稳定过表达转基因拟南芥的根长明显长于野生拟南芥。在200mM NaCl处理下所有拟南芥的生长都受到了抑制，但转基因拟南芥的生长状况比野生拟南芥略好。如图9所示，这些情况表明FaGalLDH基因过表达提高了拟南芥植株对氯化钠的耐受性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 安徽农业大学
<120> 草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH及应用
<130> 100
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1743
<212> DNA
<213> Fragaria × ananassa Duch
<400> 1
atgcagagag ctctcactct gaagcgcacg ctccaatccc tccccagaat cactaaaaac 60
ccattgatcc cagggcgtgc attctgcaat gcttcaacac cgtcgccggc atcagcatct 120
gagctgcgca agtacatggg gtacaccgcc ctcgtgttat tctgcggtgc cgccacctac 180
tactctttcc catttcccga ggacgccaag cacaagaagg cccaaatctt ccgctacgcc 240
cctctccctg aggagctcca caccgtctct aactggagcg ggacccacga ggttcagacc 300
cgggtcttcc accagcccga gacccttgag gagctcgaga aagtagtcaa ggaggccaat 360
gctaggaagt accggattcg ccccgtcggc tctgggttgt cccccaatgg gattggattg 420
tccagggctg ggatggtcaa tttggctctc atggatgagg tcttggaggt ggataaggag 480
aagaagcgag tgagagtgca agctgggatc agggtccagc aattggttga tgggattaaa 540
gatcagggcc ttactttgca gaactttgca tccattaggg agcagcagat tgggggaatt 600
ctgcaggttg gtgctcatgg tactggtgca aggttacctc ctattgatga gcaggtgatc 660
agcatgaaat tggtcactcc tgccaaggga acaatagaag tctccaaggt aaaagatccg 720
gaactgtttt atttagctcg ctgtggcctt ggcggtcttg gagttgttgc tgaagttacc 780
ctccagtgtg ttgagagaca ggagcttgta gagcacacta ctgtttcaaa catggaagaa 840
atcaagaaaa atcacaagaa gttgctctcc gagaacaaac atgtgaagta cctctatatt 900
ccatataccg acactgttgt gattgtgaca tgcaaccctg tctcaaaatg gaaaggtccc 960
ccaaagttca aacccaaatt tacaacggat gaagccattc agcacgttcg tgatctatac 1020
agggactgcc tcaggaagta cagagtagtt ccagacaaca gcgtagatat agacgaactc 1080
tcttttacag agttgcgtga taaactcatt gccctaaatc ctctcaacaa ggatcatatc 1140
gttaaagtga atcaagctga ggcagagttc tggaggaagt cagagggata cagagtagga 1200
tggagtgatg aaattttggg ttttgactgt ggtggccaac aatgggtttc ggagacttgt 1260
tttccagctg gaactattgc caaacccagc atgaaagacc ttgaatacat agaagatcta 1320
aaacagctaa tagagaagga agagattcct gcgcctgctc caatagagca gcgttggaca 1380
gccagcagta agagccccat gagtccagct tcaagcttaa aggaggatga tatattttca 1440
tgggttggca ttatcatgta ccttccaacg acagatgccc gccaaagaaa ggatattaca 1500
gaagagtttt tccactacag gcatctaact cagacacagt tgtgggatac atattcttct 1560
tatgaacact gggccaagat tgaggtccca aaggacaaag aacaacttac cgctctgcag 1620
gcaaggctca ggaagcgttt tccagttgat gcctacaaca aagcacgatc ggagttagac 1680
ccaaaccgga tcctttcaaa cgtcaagctg gaaaagcttt ttccatcgtc tgataccatt 1740
tga 1743

Claims (9)

1.草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH，其特征在于，所述FaGalLDH基因具有如SEQID NO：1所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的基因FaGalLDH，其特征在于，克隆所述基因的FaGalLDH的引物名称与序列如下：
FaGalLDH-F，CGATGCAGAGAGCTCTCACTCT；
FaGalLDH-R，CGTCAAATGGTATCAGACGATG。
3.根据权利要求1所述的基因FaGalLDH，其特征在于，所述基因FaGalLDH的CDS区包含一个完整的开放阅读框ORF，含1743bp，编码580个氨基酸。
4.一种含有如权利要求1所述的基因FaGalLDH的表达载体。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为：pMAL-FaGalLDH。
6.如权利要求1所述的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高植物维生素C含量中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述基因FaGalLDH的表达载体纯化后表达蛋白在25℃和pH4.0条件下使用。
8.如权利要求1所述的草莓维生素C的合成相关基因FaGalLDH在提高植物耐盐性中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，将基因FaGalLDH转入拟南芥中超量表达，使用50～200mM的NaCl处理转基因拟南芥。
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