CN113005138B

CN113005138B - 拟南芥pho1；h10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用

Info

Publication number: CN113005138B
Application number: CN201911323001.9A
Authority: CN
Inventors: 苏震; 徐文英; 达玲玲; 宋倩; 刘凤霞; 张群连
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2019-12-20
Filing date: 2019-12-20
Publication date: 2022-04-26
Anticipated expiration: 2039-12-20
Also published as: CN113005138A

Abstract

本发明公开了一种拟南芥PHO1；H10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用。AtPHO1；H10基因突变体植株叶片中花青素合成、转运和相关调控基因的相对表达量低于野生型，花青素含量也明显低于野生型。ATPHO1；H10基因过表达植株中叶片中花青素合成、转运和相关调控基因相对表达量高于野生型，花青素含量也高于野生型。ATPHO1；H10基因补偿体植株中花青素合成、转运和相关调控基因的相对表达量高于突变体，花青素含量也高于突变体。可以通过调控植株中AtPHO1；H10基因的表达量，调控植株花青素含量，从而改善植株营养品质。本发明为提高植物花青素含量提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

Description

拟南芥PHO1；H10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用

技术领域

本发明涉及拟南芥PHO1；H10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用。

背景技术

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性黄酮类化合物，负责高等植物花、果实和叶子着色，使其呈现红色到紫色范围内的颜色。花青素在多种生理过程中发挥着重要的作用，例如作为视觉吸引剂诱导昆虫授粉，作为营养组织中的光保护屏，保护植株免受紫外辐射和压力损害，并且还起到抗昆虫攻击和病原体感染的抗微生物剂的作用。此外花青素具有潜在的抗氧化活性、保护心血管和增进视力等作用，有益于人类营养健康。在农业生产中，花青素是构成花瓣、果实和种子的主要色素之一，植物的营养和品质与花青素含量有着密切的关系，比如水果中花青素的存在主要决定果实的外部品质，这是消费者选择购买的重要考虑因素，研究花青素合成相关的功能基因对于提高植物营养品质,药用价值和基因工程改良花色有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供拟南芥PHO1；H10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用。

PHO1；H10蛋白为如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)序列表中序列1所示的蛋白质；

(a2)将序列表中序列1所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物花青素合成相关的由其衍生的蛋白质；

(a3)来源于拟南芥且与(a1)所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且与植物花青素合成相关的蛋白质。

PHO1；H10基因为编码PHO1；H10蛋白的基因。

PHO1；H10基因为如下(b1)或(b2)或(b3)：

(b1)编码区如序列表中序列2所示的DNA分子；

(b2)来源于拟南芥且与(b1)至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％以上同一性且编码所述蛋白质的DNA分子；

(b3)在严格条件下与(b1)限定的核苷酸序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。

本发明提供了一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在受体植物导入PHO1；H10基因，得到转基因植物；与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青素含量增高。在强光照射下，与所述受体植物相比，所述转基因植物的花青素含量增高。

PHO1；H10基因具体可通过重组表达载体导入受体植物。重组表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到受体植物中。

可用现有的植物表达载体构建含有PHO1；H10基因的重组表达载体。

构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。从转基因安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以表型筛选转化植物。

所述植物表达载体具体可为载体pCAMBIA1300。

本发明还保护PHO1；H10蛋白的应用，为如下(c1)或(c2)或(c3)：

(c1)调控植物花青素合成；

(c2)调控植物花青素含量；

(c3)促使植物的花青素含量增高。

促使植物的花青素含量增高具体可为促使强光照射下植物的花青素含量增高。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中PHO1；H10蛋白的含量和/或活性，从而使植物的花青素含量增高。植物的花青素含量增高具体可为强光照射下植物的花青素含量增高。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中PHO1；H10基因的表达，从而促使植物的花青素含量降低。植物的花青素含量降低具体可为强光照射下植物的花青素含量降低。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中PHO1；H10蛋白的含量和/或活性，从而促使植物的花青素含量降低。植物的花青素含量降低具体可为强光照射下植物的花青素含量降低。

本发明还保护抑制PHO1；H10基因表达的物质的应用，为促使植物的花青素含量降低。植物的花青素含量降低具体可为强光照射下植物的花青素含量降低。

以上任一所述受体植物为单子叶植物或双子叶植物。

以上任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

所述双子叶植物具体可为十字花科植物。

所述十字花科植物具体可为拟南芥属植物。

所述拟南芥属植物具体可为拟南芥，例如哥伦比亚生态型拟南芥。

所述强光的光照强度为500μmol·m-²·s-¹以上。

经强光照射之后，AtPHO1；H10基因突变体植株叶片中花青素合成、转运和相关调控基因的相对表达量低于野生型，花青素含量也明显低于野生型。经强光照射之后，ATPHO1；H10基因过表达植株中叶片中花青素合成、转运和相关调控基因相对表达量高于野生型，花青素含量也高于野生型。经强光照射之后，ATPHO1；H10基因补偿体植株中花青素合成、转运和相关调控基因的相对表达量高于突变体，花青素含量也高于突变体。结果表明，ATPHO1；H10基因是花青素合成途径的上游调控基因，可以调控花青素合成、转运和相关调控基因的表达水平，具有提高植株在强光照射下的叶片花青素含量的能力，因此可以通过调控植株中AtPHO1；H10基因的表达量，调控植株花青素含量，从而改善植株营养品质。

本发明为提高植物花青素含量提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。

附图说明

图1为重组质粒S1300-AtPHO1；H10的元件示意图。

图2为突变体WiscDsLox 7H11的T-DNA插入示意图。

图3为PHO1；H10基因相对表达量的结果。

图4为培养48小时和96小时后的照片。

图5为培养48小时和96小时的花青素含量。

图6为7个花青素合成途径中的基因的相对表达量。

图7为2个花青素转运相关的基因的相对表达量。

图8为5个调控花青素合成途径基因的转录因子基因的相对表达量。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。T0代种子长成的植株即为T0代植株。T1代种子长成的植株即为T1代植株。T2代种子长成的植株即为T2代植株。T3代种子长成的植株即为T3代植株。

拟南芥AtPHO1；H10蛋白如序列表的序列1所示。拟南芥cDNA中编码AtPHO1；H10蛋白的开放阅读框如序列表的序列2所示。

实施例1、转基因拟南芥的获得

一、重组质粒的构建

1、取哥伦比亚生态型拟南芥的叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用引物CDS-PF和引物CDS-PR组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物。

引物CDS-PF：5’-TGCTCTAGAATGAAGTTTGGGAAGATATTTAA-3’；

引物CDS-PR：5’-ATAGGATCCTCAGTCATCTTTGTCAACATC-3’。

3、取步骤2得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶XbaI和BamH I进行双酶切，回收酶切产物。

4、取载体pCAMBIA1300，用限制性内切酶XbaI和BamH I进行双酶切，回收载体骨架。

5、将步骤3得到的酶切产物和步骤4得到的载体骨架连接，得到重组质粒S1300-AtPHO1；H10。根据测序结果，对重组质粒S1300-AtPHO1；H10进行结构描述如下：在载体pCAMBIA1300的XbaI和BamH I酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA分子。重组质粒S1300-AtPHO1；H10的元件示意图见图1。

二、转基因植株的获得

1、将重组质粒S1300-AtPHO1；H10导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、将步骤1得到的重组农杆菌接种至含50mg/L利福平和100mg/L硫酸卡那霉素的液体YEP培养基，28℃振荡培养至OD_600nm值约为0.6；然后取1体积份菌液，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀，将菌体沉淀重悬于1体积份MS盐溶液(1/2MS溶液，5％蔗糖，200μL/LSilwet-77)，即为侵染液。

3、取开花的哥伦比亚生态型拟南芥植株，剪去已长出的果荚并浇水，然后倒置并将花序浸泡于步骤2得到的侵染液中1-2min，然后使用黑色塑料袋罩住避光保湿1天，然后去除塑料袋，正常培养1-2周，收获成熟的种子，即为T0代种子。

4、取步骤3得到的种子，干燥15天以上，然后筛选阳性单株。

筛选阳性单株的具体方法：①洗种(用6％次氯酸钠水溶液洗涤种子15min，然后用无菌水洗涤4-6遍)；②低温处理(将种子放置于4℃低温处理2-3天)；③将种子平铺于含30mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，正常培养10天，然后挑选深绿色、长出根且根较长的阳性小苗移栽至土中；④植株生长到4-6周时，剪取每个单株的叶片提取基因组DNA，进行PCR鉴定(PCR鉴定采用S1300F和S1300R组成的引物对，靶序列位于载体骨架)，如果得到扩增产物判断为阳性植株，即转基因植株。

S1300F:5'-GCTTTACAGCAAGAACGGA-3'；

S1300R:5'-GATAATCATCGCAAGACCG-3'。

5、步骤4筛选得到的阳性单株自交并收获种子，即为T1代种子。

6、取步骤5得到的种子，干燥15天以上，依次进行洗种(同步骤4的①)、低温处理(同步骤4的②)，然后置于含30mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，正常培养；如果某一T0代植株得到的T1代种子在培养基上均能生长，该T0代植株为纯合植株。

7、取T0代纯合植株自交得到的T1代植株，自交并收获种子，即为T2代种子。

8、取步骤7得到的种子，干燥15天以上，依次进行依次进行洗种(同步骤4的①)、低温处理(同步骤4的②)，然后置于含30mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，正常培养；如果某一T1代植株得到的T2代种子在培养基上均能生长，该T1代植株为纯合植株。

9、取T1代纯合植株自交得到的T2代植株，自交并收获种子，即为T3代种子。

10、抽样取步骤9得到的种子，干燥15天以上，依次进行依次进行洗种(同步骤4的①)、低温处理(同步骤4的②)，然后置于含30mg/L潮霉素的固体1/2MS培养基，正常培养；如果某一T2代植株得到的T3代种子在培养基上均能生长，该T2代植株为纯合植株。

由同一T2代纯合植株自交得到的后代，作为一个纯合过表达株系，简称过表达株系。

实施例2、突变体pho1；h10的获得

1、在TAIR网站(http://www.arabidopsis.org/)查找AT1G69480的突变体，选择T-DNA插入突变体WiscDsLox 7H11(T-DNA插入示意图见图2)，种子编号CS868702，从拟南芥资源库ABRC购买该突变体种子。

2、用6％次氯酸钠水溶液洗涤种子15min，然后用无菌水洗涤4-6遍；然后，将种子放置于4℃低温处理2-3天；然后，将种子置于固体1/2MS培养基上，正常培养7-10天；然后将植株移栽到培养基质(1体积份营养土与1体积份蛭石混匀)并覆膜保湿，约2-3天后揭膜。培养条件：50-70％相对湿度，16h/8h光照/黑暗，光照时的光照强度为100μmolm^-2s^-1。

3、步骤2中生长3周左右的单株，剪取叶片，提取基因组DNA。以基因组DNA为模板，分别采用引物LB和引物RP组成的引物对和引物LP和引物RP组成的引物对进行PCR鉴定。如果只有引物LB和引物RP组成的引物对能得到扩增产物(扩增产物大小为543-843bp)，说明该植株为T-DNA插入纯合型植株。如果只有引物LP和引物RP组成的引物对能得到扩增产物(扩增产物大小约1173bp)，说明该植株为野生纯合型植株；若两个引物对都能得到扩增产物，说明该一条染色体为T-DNA插入，一条染色体为野生型，该植株为杂合型植株。

引物RP：5’-TTTTTCGTGCCCTGTATGATC-3’；

引物LP：5’-AAGCCTCAACTGTTCCTCTCC-3’；

引物LB：5'-GCGTGGACCGCTTGCTGCAACT-3'。

将T-DNA插入纯合型植株继续培养并自交繁种，得到的后代植株为突变体pho1；h10。

实施例3、补偿性株系的获得

用突变体pho1；h10植株代替哥伦比亚生态型拟南芥植株，其他同实施例1的步骤二。

由同一T2代纯合植株自交得到的后代，作为一个纯合株系，简称补偿性株系。

实施例4、不同植株中PHO1；H10基因表达水平比较

供试植株：哥伦比亚生态型拟南芥植株(野生型)、实施例1制备的过表达株系1的T3代植株(过表达1)、实施例1制备的过表达株系2的T3代植株(过表达2)、实施例2制备的突变体pho1；h10植株(突变体)、实施例3制备的补偿性株系1的T3代植株(补偿体1)、实施例1制备的补偿性株系2的T3代植株(补偿体2)。

1、离体叶片的强光处理

在同一环境下生长3-4周的大小一致的供试植株,剪取叶片，置于培养皿中，加蒸馏水使叶片漂浮，保持叶片正面朝上，叶子与叶子之间不存在重叠，将培养皿盖子盖好，置于培养箱中培养48小时。培养箱条件：21℃，50-70％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗，光照时采用的光照强度为500μmol·m^-2·s^-1(该光照强度属于强光)。

2、实时荧光定量RT-PCR鉴定

(1)取完成步骤1的叶片，提取总RNA，以总RNA为模板进行反转录，得到cDNA。

(2)以步骤(1)得到的cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR。以18sRNA基因为内参基因。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。设置三个生物学重复，结果取平均值。

用于鉴定AtPH1；H10基因的引物如下：

SP5-F:5'-ACTCCTCCGTAAGCACTCCA-3'；

SP5-R:5'-TCATTACCATGGCTGCAAAA-3'。

用于鉴定18sRNA基因的特异引物序列如下：

18s-F:5'-GCTTTGGTGACTCTAGATAAC-3'；

18s-R:5'-GTCGGGAGTGGGTAATTTGC-3'。

PHO1；H10基因相对表达量的结果见图3。突变体pho1；h10中PHO1；H10基因相对表达量显著低于野生型，过表达株系中PHO1；H10基因相对表达量显著高于野生型，补偿性株系中PHO1；H10基因相对表达量显著高于突变体pho1；h10。

实施例5、同植株中花青素含量比较

花青素是自然界一类广泛存在于植物中的水溶性黄酮类化合物。在不同的pH条件下呈现出不同的颜色。花青素在酸性条件下呈红色，本实施例根据颜色的浓度与花青素的含量呈正比来进行检测花青素含量。

每个株系设置3个生物学重复。

1、离体叶片的强光处理

在同一环境下生长3-4周的大小一致的供试植株,剪取每片叶片，置于培养皿中，加蒸馏水使叶片漂浮，保持叶片正面朝上，叶子与叶子之间不存在重叠，将培养皿盖子盖好，置于培养箱中培养。培养箱条件：21℃，50-70％相对湿度，16小时光照/8小时黑暗，光照时采用的光照强度为500μmol·m^-2·s^-1(该光照强度属于强光)。

2、表型

分别于培养48小时和96小时后拍照，照片见图4。

3、检测花青素含量

分别于培养48小时和96小时后，取叶片，检测花青素含量。

检测花青素含量的方法：取约70mg叶片，称鲜重(FW)，然后加至1ml花青素花青素提取液中，沸水煮1.5min，然后12000rpm离心5min，取200μL上清至酶标板，测定A_535nm值和A_650nm值；花青素含量＝(A_535nm-2×A_650nm)；计算每克鲜重叶片的花青素含量。

花青素提取液的组成(100ml)：1ml 37％盐酸、18ml异丙醇和81ml水。

48小时的结果见表1和图5A。96小时的结果见表2和图5B。经过强光照射的离体叶片，强光照射时间越长花青素含量越高。野生型植株花青素含量高于突变体pho1；h10植株。野生型植株花青素含量低于过表达株系植株。补偿性株系植株花青素含量高于突变体pho1；h10植株。

表1

	野生型	突变体	过表达1	过表达2	补偿体1	补偿体2
							植株1	0.0123	0.0063	0.0228	0.0188	0.0296	0.0245
植株2	0.0123	0.0070	0.0243	0.0188	0.0296	0.0257
							植株3	0.0124	0.0069	0.0244	0.0186	0.0294	0.0254
平均值	0.0124	0.0067	0.0239	0.0187	0.0295	0.0252
							标准差	4.03E-05	0.0003	0.0009	0.0001	0.0002	0.0006

表2

	野生型	突变体	过表达1	过表达2	补偿体1	补偿体2
							植株1	0.0416	0.0274	0.0663	0.0425	0.0592	0.1072
植株2	0.0431	0.0273	0.0665	0.0434	0.0616	0.1079
							植株3	0.0433	0.0276	0.0684	0.0452	0.0618	0.1082
平均值	0.0427	0.0274	0.0670	0.0437	0.0608	0.1078
							标准差	0.0009	0.0001	0.0012	0.0014	0.0014	0.0005

实施例6、花青素合成相关基因实时荧光定量RT-PCR鉴定

花青素的合成起始于苯丙氨酸，在PAL(phenylalanine ammonia lyase)催化下生成肉桂酸，经过C4H(cinnamic acid 4-hydroxylase)和4CL(4coumarate CoA ligase)作用生成4-香豆酰辅酶A；然后在CHS(chalcone synthase)、CHI(chalcone isomerase)、F3H(flavanone 3-hydroxylase)F3′H(flavanone 3′-hydroxylase)和F3′5′H(flavanone 3′5′-hydroxylase)的作用下合成二酰黄酮醇；在DRF(dihydroflavonol reductase)作用下合生成各种无色花色素，再被ANS(anthocyanidin synthase)/LDOX(leucoanthocyanidindioxygenase)作用氧化脱水形成有色花青素，在UF3GT(UDP-flavonoid 3-O-glucosyltransferase)催化作用将不稳定的花青素转变成蓝紫色、砖红色或紫红色的稳定花色素苷,最后进入液泡中。其中GT决定糖基化的位置，除了3GT还有5GT(anthocyanin 5-O-glucosyl transferase)、7GT(flavonoid 7-O–glucosyl transferase)等，5MAT(anthocyanidin 5-O-glucoside-6'-O-malonyl transferase)与5GT协同表达，参与花青素的丙二酰化。

这些合成途径中的基因会受到一些重要的转录因子调控，例如bHLH转录因子(TT8(transparent testa 8)，GL3(glabra 3)和EGL3(enhancer of glabra 3))、MYB蛋白(MYB75(MYB domain protein 75)、PAP3(phytochrome-associated protein 3)和GL1(glabra 1))和WD40(TTG1((transparent testa 1))和COP1(coronatine insensitive1))组成的WD-repeat/bHLH/MYB复合物共同调控花青素合成过程中的多种基因表达。COP1是光形态建成的负调控因子，CIP7是COP1的下游作用因子，CIP7受光诱导表达后会促进CHS表达，有文献报道降低CIP7(COP1-interacting protein 7)表达水平会导致花青素积累缺陷。BBX22(B-BOX domain protein 22)受SRS5(shi-related sequence 5)正调控，是光形态建成的促进因子，促进CHS和CHI等基因表达，进而促进花青素合成。

GSTF12(glutathione S-transferase 12)参与多种植物中花青素的转运，负责将花青素从胞质转运到液泡。ER(erecta)基因是一个类受体激酶，是一类跨膜蛋白。

供试植株：哥伦比亚生态型拟南芥植株(野生型)、实施例1制备的过表达株系1的T3代植株(过表达1)、实施例2制备的突变体pho1；h10植株(突变体)、实施例3制备的补偿性株系1的T3代植株(补偿体1)。

1、离体叶片的强光处理

同实施例4的步骤1。

2、实时荧光定量RT-PCR鉴定

检测的各个目标基因以及所用引物见表3。

表3

	Forward(5'-3')	Reverse(5'-3')
			ATPAP3	ACCACAGTTCCAAGTCTCGG	ATTGCCAATCGTCGAAGAAC
AT5MAT	TTTACGGGTCTGATTTTGGG	ACAATGAAACCGAAGCATCC
			ATTT8	CTTGGAGACACCATTGCGTA	ACAAGTACGCGTCCGCTTAT
ATMYB75	CGACCTCGATCCTTCACAGT	GTCCAAGGCATGGAGGATTA
			ATBBX22	TCAAAAGATGGCCTTCGATC	ACGAGAGGAAGCTTTGTCGA
ATER	CCAAAAGACAGCCGAATGAT	GGTGGTTGTTCCGATAGCAT
			ATF3H	GGACTCAAGCGTCACACTGA	AGGCTGAACCGTAATCCATG
AT5GT	GTGCTGTGGGATGTTTTGTG	ACACTGATCAGCAAACTGCG
			ATANS	TCATCGTGGGTTGGTGAATA	AGGCAACGGCTTAAGAACAA
ATCIP7	GAACTTTCTCGTGACCCGAG	CAACAGAAGCAACAGCAGGA
			ATCHS	TGGTCTCACCTTCCATCTCC	ATCCCCAAAGGTTTAAACGC
ATGSTF12	GGCAAGTCTCTAGAGCACCG	GGGCCAGAACGTTGAAGTAA
			ATDFR	CGCTCTCTCCTATCACTCGG	TGAGCGTTGCATAAGTCGTC
ATUF3GT	GGTAGCCAACCCGTTGTAAA	GGCTTAATGGCAACCAGAAA
			18s	GCTTTGGTGACTCTAGATAAC	GTCGGGAGTGGGTAATTTGC

结果见图6、图7和图8。7个花青素合成途径中的基因(CHS,F3′H,DFR,ANS,UF3GT,5GT和5MAT)和2个花青素转运相关的基因(GSTF12和ER)的相对表达量变化与AtPHO1；H10类似，也是在突变体pho1；h10中的相对表达量低于野生型，在过表达中的相对表达量高于野生型，在补偿体中的相对表达量高于突变体。5个调控花青素合成途径基因的转录因子(TT8,PAP3,MYB75,CIP7和BBX22)的表达也与AtPHO1；H10类似，说明这些转录因子也受到AtPHO1；H10的调控。这些结果说明改变AtPHO1；H10基因的表达水平可以改变花青素合成途径基因、转运蛋白、以及调控合成途径基因的转录因子的表达水平，进而影响合成的花青素含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业大学

<120> 拟南芥PHO1;H10蛋白及其编码基因在调控植物叶片花青素合成中的应用

<130> GNCYX192697

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 777

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 1

Met Lys Phe Gly Lys Ile Phe Lys Lys Gln Met Val Pro Glu Trp Val

1 5 10 15

Glu Ala Tyr Val Asp Tyr Asn Gly Leu Lys Arg Val Leu Lys Glu Ile

20 25 30

Arg Ser Tyr Lys His Ser Lys Leu Thr Arg Ala Ala Ser Arg Val Ser

35 40 45

Gln Gln Ala Glu Ala Leu His Arg Ser Phe Ser Gly Leu Ser Phe His

50 55 60

Pro Arg His Ser Glu Arg Ala Gly Asp Ile Glu Asp Gln Val Ile Lys

65 70 75 80

Val Asp Thr Val Gln Glu Glu Gly Ser Arg Lys Leu Tyr Glu Thr Lys

85 90 95

Phe Leu Lys Lys Ser Glu Glu Gly Gly Glu Phe Glu Glu Ser Phe Phe

100 105 110

Lys Lys Leu Asp Glu Asn Leu Asn Lys Val Asn Lys Phe Tyr Arg Asp

115 120 125

Lys Val Lys Glu Val Ile Glu Glu Ala Ala Leu Leu Asp Lys Gln Met

130 135 140

Asp Ala Leu Ile Ala Leu Arg Val Lys Met Gln Lys Pro Asp Val Asp

145 150 155 160

Asn Leu Asn Leu Glu Lys His Pro Ser Asp Lys Val Val Val Asp Thr

165 170 175

Ser Asp Asn Thr Met Arg Thr Gln Gly Thr Ala Asn Thr Asp Met Val

180 185 190

His Gly Ile Glu Arg Thr Asn Ile Pro Glu Glu Glu Ala Ser His Ile

195 200 205

Met Ala Asp Ile Val Pro Val Ser His Thr Asn Gly Asp Glu Glu Glu

210 215 220

Ala Ser Ile Gly Asp Lys Gln Asp Leu Arg Glu Ile Leu Glu Arg Val

225 230 235 240

Lys Met Asn Asp Val Leu Glu Ser Pro Ile Thr Thr Leu Lys Gly Val

245 250 255

Phe Gly Asp Ser Asn Glu Pro Ile Ser Lys Lys Gly Leu Lys Lys Gly

260 265 270

Glu Glu Gln Leu Arg Leu Val Phe Ser Glu Phe Tyr Gln Lys Leu Arg

275 280 285

Arg Leu Lys Glu Tyr Ser Phe Met Asn Leu Leu Ala Phe Ser Lys Ile

290 295 300

Met Lys Lys Tyr Glu Lys Ile Ala Ser Arg Asn Ala Ser Arg Asn Tyr

305 310 315 320

Met Lys Ile Val Asp Asn Ser Leu Ile Gly Ser Ser Asp Glu Val Asn

325 330 335

Arg Leu Leu Glu Arg Val Glu Val Thr Phe Val Lys His Phe Ser Ser

340 345 350

Gly Asn Arg Arg Glu Gly Met Lys Cys Leu Arg Pro Lys Val Lys Arg

355 360 365

Glu Arg His Arg Val Thr Phe Phe Ser Gly Phe Phe Ser Gly Cys Ser

370 375 380

Ile Ala Leu Val Ile Ala Val Val Phe Lys Ile Glu Ser Arg Lys Ile

385 390 395 400

Met Glu Lys Asn Tyr Gly Thr Glu Tyr Met Ala Asn Ile Ile Pro Leu

405 410 415

Tyr Ser Leu Phe Gly Phe Ile Ile Leu His Met Leu Met Tyr Ser Ala

420 425 430

Asn Ile Tyr Phe Trp Lys Arg Tyr Arg Val Asn Tyr Thr Phe Ile Phe

435 440 445

Gly Phe Lys Gln Gly Thr Glu Leu Gly Asp Arg Glu Val Phe Leu Val

450 455 460

Ser Thr Gly Leu Ala Val Leu Ala Phe Val Cys Phe Leu Leu Asn Leu

465 470 475 480

Gln Leu Asp Met Asp Trp Arg Met Lys His His Lys Thr Leu Pro Glu

485 490 495

Val Ile Pro Leu Cys Leu Ala Thr Ile Val Leu Phe Ile Leu Phe Cys

500 505 510

Pro Phe Asn Ile Ile Tyr Arg Ser Ser Arg Phe Phe Phe Ile Arg Ser

515 520 525

Leu Phe His Cys Ile Cys Ala Pro Leu Tyr Glu Val Thr Leu Pro Asp

530 535 540

Phe Phe Leu Gly Asp His Leu Thr Ser Gln Ile Gln Ala Ile Arg Ser

545 550 555 560

Phe Glu Leu Phe Ile Cys Tyr Tyr Gly Leu Gly Glu Tyr Leu Gln Arg

565 570 575

Gln Asn Lys Cys His Ser His Gly Val Tyr Asn Ala Phe Tyr Phe Val

580 585 590

Val Ala Val Ile Pro Tyr Trp Leu Arg Phe Leu Gln Cys Ile Arg Arg

595 600 605

Leu Cys Glu Glu Lys Glu Ser Val His Gly Tyr Asn Ala Leu Lys Tyr

610 615 620

Met Leu Thr Ile Ile Ala Val Ile Val Arg Thr Ala Tyr Glu Leu Lys

625 630 635 640

Lys Gly Arg Thr Trp Met Ile Leu Ala Leu Val Ser Ser Gly Val Ala

645 650 655

Thr Gly Met Asn Thr Phe Trp Asp Ile Val Ile Asp Trp Gly Leu Leu

660 665 670

Arg Lys His Ser Lys Asn Pro Tyr Leu Arg Asp Lys Leu Leu Val Pro

675 680 685

His Lys Ser Val Tyr Phe Ala Ala Met Val Val Asn Val Ile Leu Arg

690 695 700

Val Ala Trp Met Gln Leu Val Leu Glu Phe Asn Leu Lys Ser Leu His

705 710 715 720

Lys Ile Ala Val Thr Ser Ile Ile Ser Cys Leu Glu Ile Ile Arg Arg

725 730 735

Gly Ile Trp Ser Phe Phe Arg Leu Glu Asn Glu His Leu Asn Asn Val

740 745 750

Gly Lys Tyr Arg Ala Phe Lys Ser Val Pro His Pro Phe His Tyr Tyr

755 760 765

Asp Asp Asp Asp Val Asp Lys Asp Asp

770 775

<210> 2

<211> 2334

<212> DNA

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2

atgaagtttg ggaagatatt taagaagcaa atggtgccag agtgggtaga agcttatgtg 60

gattacaatg gcttgaagag ggttttaaaa gaaatacgta gctacaagca cagtaagctg 120

actagagcag cgtcgagagt ttcacagcag gcagaggcgt tgcaccgttc atttagtggt 180

ctgtcttttc atcctaggca tagtgaacgt gcaggggata ttgaggacca agtcataaaa 240

gttgacacgg tgcaggaaga aggttctcgt aagttgtatg agacaaagtt tctcaaaaag 300

tctgaagaag gaggggaatt cgaagagtca ttctttaaga agcttgatga gaatctaaac 360

aaagttaaca agttttaccg ggataaagtt aaggaagtga ttgaggaagc ggctttgtta 420

gataaacaaa tggatgcact gattgcgttg agggttaaga tgcaaaaacc tgatgtagat 480

aacctgaatt tggagaagca tccatctgat aaggttgtag tagatacatc tgataacaca 540

atgagaacac agggtactgc aaacacagat atggtacatg gtattgaaag aactaacatt 600

ccagaagaag aggcctccca tatcatggct gacattgtcc cggtttctca taccaatgga 660

gatgaagagg aagccagtat tggtgataag caggatcttc gagaaatact tgagcgtgtg 720

aagatgaatg atgtgcttga atctcctatt actacattaa aaggagtttt tggggattct 780

aatgaaccaa tctccaagaa aggattgaaa aaaggagagg aacagttgag gcttgttttt 840

agtgagttct atcagaaact ccgccgtttg aaggaataca gtttcatgaa tcttctggca 900

ttttcaaaaa tcatgaagaa gtatgagaag attgcttcga ggaatgcatc taggaactac 960

atgaaaattg tggataattc attgattgga agttctgatg aggttaacag actcctggag 1020

agagtagagg taacttttgt taagcacttt tcaagtggta atcgaagaga aggcatgaag 1080

tgtctaaggc caaaagttaa aagagaaagg cacagggtta cattcttctc tggtttcttt 1140

tctggttgct ctattgcact agttattgct gttgttttca agatagaaag tagaaaaatc 1200

atggagaaga actacggtac tgaatacatg gcaaatatta tccctcttta cagcttattt 1260

ggattcatca ttcttcatat gctcatgtac tcagcgaata tatacttctg gaagcgttat 1320

agagtcaact ataccttcat ctttggtttc aagcagggaa cagagttggg tgaccgagaa 1380

gttttcctgg taagcaccgg tcttgcggtg cttgcttttg tctgtttcct gctaaatttg 1440

cagcttgata tggactggag gatgaaacat cataagacac tccctgaagt tattcctttg 1500

tgtttggcca ctattgttct tttcatactt ttttgtcctt tcaacatcat ataccgctca 1560

agtcggtttt tctttatacg atcactgttt cactgtatat gtgcccccct ctacgaggtc 1620

acacttccag attttttctt gggagaccac ctaaccagtc agatacaagc cataaggagc 1680

tttgagctat tcatttgcta ctatggctta ggagaatact tgcagaggca aaacaagtgt 1740

catagtcatg gtgtttacaa tgccttctac tttgtcgttg ctgttatacc ctactggctc 1800

cgcttcctcc agtgcatacg cagattatgc gaagaaaaag aatccgtaca cggatacaat 1860

gcgttgaaat atatgttgac aatcattgca gtcatcgtaa gaacagcgta tgaactgaaa 1920

aagggacgca cttggatgat tttggctctt gtaagctcag gtgtagcgac agggatgaac 1980

acattctggg acattgttat agactgggga ctcctccgta agcactccaa gaacccatac 2040

ttaagggaca aattactggt ccctcacaaa agcgtctatt ttgcagccat ggtagtgaat 2100

gtgattctaa gagtggcatg gatgcagcta gtgctagagt tcaacttgaa gtcgcttcac 2160

aaaatcgcag taacaagcat tatttcatgt ttagagatta ttcgtcgggg aatatggagc 2220

ttcttcaggt tggagaatga gcacttgaac aatgtaggca aatacagagc cttcaagtca 2280

gttccacatc ctttccatta ctacgatgac gacgatgttg acaaagatga ctga 2334

Claims

1.PHO1;H10蛋白在调控植物花青素合成中的应用；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

2.PHO1;H10蛋白在调控植物花青素含量中的应用；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

3.PHO1;H10蛋白在促使植物的花青素含量增高中的应用；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

4.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中PHO1;H10蛋白的含量和/或活性，从而使植物花青素含量增高；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

5.一种植物育种方法，包括如下步骤：抑制植物中PHO1;H10基因的表达，从而促使植物的花青素含量降低；PHO1;H10基因为编码PHO1;H10蛋白的基因；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：编码PHO1;H10蛋白的基因为编码区如序列表中序列2所示的DNA分子。

7.一种植物育种方法，包括如下步骤：降低植物中权利要求1中所述的PHO1;H10蛋白的含量和/或活性，从而促使植物的花青素含量降低；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

8.抑制PHO1;H10基因表达的物质的应用，为促使植物的花青素含量降低；PHO1;H10基因为编码PHO1;H10蛋白的基因；所述PHO1;H10蛋白为序列表中序列1所示的蛋白质；所述植物为拟南芥属植物。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：编码PHO1;H10蛋白的基因为编码区如序列表中序列2所示的DNA分子。