CN109182292A

CN109182292A - 一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用

Info

Publication number: CN109182292A
Application number: CN201811119748.8A
Authority: CN
Inventors: 谢兴斌; 薛婷婷; 方从兵; 赵静; 王申; 冯欢; 石梦云; 宋佳丽
Original assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Current assignee: Anhui Agricultural University AHAU
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2019-01-11
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109182292B

Abstract

本发明公开了一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用，该草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。本发明克隆出草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因，并通过侵染草莓果实试验发现，FaGST1与草莓果实花青苷积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，CHS1、F3H1、ANS1、UGT1等花青苷合成主要基因表达量受到抑制。可见，该FaGST基因在花青苷合成中将具有广泛的应用。

Description

一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用

技术领域

本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用。

技术背景

草莓(Fragaria×ananassa Duch.)是蔷薇科草莓属的多年生草本植物，果实色泽鲜艳，芳香浓郁，酸甜适口，具有较高的营养和保健价值，有“水果皇后”的美誉。草莓果实被证明具有强抗氧化活性，与果实中所含的多酚化合物尤其是花青苷有关；同时，花青苷是构成草莓果实颜色的主要色素，对于形成果实外观品质至关重要；此外，花青苷还具有重要的生物学功能，如能够保护植物本身抵抗紫外线、低温和病虫害等。因此，开展花青苷在草莓果实内的代谢和累积等相关研究，具有十分重要的意义。

花青苷在草莓果实内的代谢和累积情况取决于其在细胞质中的生物合成以及在液泡中的转运贮藏过程；其中，花青苷生物合成是由一系列结构基因的催化以及受MYB、bHLH和WD40等转录因子的协同调控。然而，花青苷从细胞质被转运至液泡的过程仍不清楚。

研究发现，花青苷转运过程与谷胱甘肽转移酶转运蛋白密切相关，花青苷转运机制是由位于细胞质的谷胱甘肽转移酶(Glutathione S-transferase,GST)和位于液泡膜上的多药耐药抗性相关蛋白(Multidrug resistanceass protein,MRP)共同调控。花青苷在细胞质合成后，GST催化谷胱甘肽(Glutathione,GSH)和花青苷共价结合，形成谷胱甘肽交联复合物(Glutathione S-conjugate)，并被位于液泡膜上的MRP识别，MRP通过疏水基间的交互作用结合花青苷，将其跨膜转运至液泡。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因，满足使用需求。本发明的另一目的是提供一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的表达蛋白。本发明还有一目的是提供一种上述草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为：

草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的表达载体。

含有所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的宿主菌。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因在草莓果实花青苷积累中的应用。

所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因在调控CHS1、F3H1、ANS1或UG T1基因表达中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明克隆出草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因，并通过侵染草莓果实试验发现，FaGST1与草莓果实花青苷积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，CHS1、F3H1、ANS1、UGT1等花青苷合成主要基因表达量受到抑制。可见，该FaGST基因在花青苷合成中将具有广泛的应用。

附图说明

图1是草莓果实注射侵染沉默表达FaGST1基因结果图；草莓果实注射侵染沉默表达FaGST1基因后，草莓果实着色被明显抑制，图中，A、为注射PHells gate-FaGST1农杆菌后的草莓果实，B、为侵染液注射后的草莓果实；

图2是注射PHellsgate-FaGST1农杆菌后FaGST1基因表达结果图：图中，c ol(Control)是对照(侵染液侵染后得到的空白对照)，anti1是PHellsgate-FaG ST1基因浸染果实1，anti2是PHellsgate-FaGST1基因浸染果实2；

图3是注射PHellsgate-FaGST1农杆菌后花青素合成基因的表达结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例中未详细述及的操作步骤或条件，均按照本领域常规技术、条件实现。

实施例1

以草莓基因组公布的草莓GST疑似基因序列(基因登陆名：XM_004294173.2)为模板，使用DNAMAN设计获得上游引物GST1-F和下游引物GST1-R，以“甜查理”草莓转色期果实的cDNA为模版，进行PCR反应，克隆得到“甜查理”草莓的FaGST1基因，基因序列全长657bp，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，表达蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。将“甜查理”草莓的Fa GST1基因转化pMD-18T载体，获得pMD-18T-FaGST1质粒，提取质粒备用。

其中，引物序列为：

GST1-F：5′-AATGGCGGATGAGGTTGTC-3′，

GST1-R：5′-CCACTTGGAATAAGAAACTG-3′。

主要转化过程如下：

(1)连接产物转化大肠杆菌感受态：重组DNA粘附在细菌细胞表面，经过42℃的热击处理90sec，促进吸收DNA，然后在37℃非选择LB液体(未添加抗生素)培养基中震荡培养1h，均匀地涂布在添加抗生素的固体培养基中37℃过夜培养。

(2)挑取单克隆，重新进行活化，即在新的含抗生素的固体培养基上重新划线，每个挑取12个单克隆进行重新划线活化，37℃过夜培养。

(3)挑取菌落，按照上述PCR反应体系进行菌落PCR反应检测。

(4)根据菌落PCR结果，挑取菌落，置于添加抗生素氨苄青霉素(Amp)的液体LB培养基中震荡培养10h，送去上海生工生物工程有限公司测序。

选取测序正确的单菌落，放入(20mL LB+20μL Amp)的LB液体培养基，37℃摇床摇12-16h，提质粒。

提质粒步骤为：取1-4mL在LB培养基中培养过夜的菌液，12000×g离心1min，弃尽上清。加250μL Buffer S1悬浮细胞沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。确认Buffer S1中已加入RNase A；加入250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4-6次混合均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。加入350μL Buffer S3，温和并充分地上下翻转4-6次，12000×g离心10min，吸取离心上清并转移到制备管(试剂盒内提供)，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加500μL Buffer W1，12000×g离心1min，弃滤液。将制备管置回离心管，加700μL Buffer W2，12000×g离心1min，弃滤液，重复一次。将制备管置回2mL离心管中，12000×g离心1min。将制备管移入新的1.5mL中，在制备管膜中央加60-80μL Eluent或去离子水，室温静置1min，12000×g离心1min。

20μL PCR体系为：DNA模板1μL，dNTP Mixture(10mM)2μL，G ST1-F(20μM)1μL，GST1-R(20μM)1μL，10×Buffer(Mg²⁺Plus)2μL，TaKaRa Taqase(5U/μL)1μL，ddH₂O 12μL。

PCR程序为：94℃，1min；94℃，30sec，55℃，30sec，72℃，45sec(35个循环)；72℃，10min。

实施例2

以GST1-PHF和GST1-PHR为扩增引物，以实施例1得到的pMD-18T-FaG ST1质粒为模板进行PCR反应，回收目的基因产物。将目的基因与PHellsgate载体进行连接。25℃连接12h后加入1μL反应终止酶。主要过程如下：

热击法转化DH5α大肠杆菌感受态。采用pHellsgate2干涉载体进行重组构建在FaGST1的5’端选取300-500bp左右的片段设计引物，并在特异引物前加入attB位点通用引物，作为目标片段扩增引物。以草莓cDNA为模板扩增得到目标片段，PCR产物经回收后，经BP反应重组连接至pHellsgate2载体，构建成目的载体。选取菌落PCR反应后正确的单克隆菌株，提取质粒并进行带有P Hellsgate-FaGST1基因的质粒进行双酶切验证。选取双酶切验证正确的带有PHe llsgate-FaGST1基因的质粒，冻融法转化农杆菌GV3101。菌落PCR鉴定。

引物如下：

GST1-PHF：5′-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTAATGGCGGATGAGGTTGTC-3′，

GST1-PHR：5′-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGGACAACGAAAGGAGATGAGC-3′。

双酶切体系：反应1：质粒10μL，10×M Buffer 2μL，0.1％BSA 2μL，Xbal 0.8μL，加ddH₂O至20μL。反应2：质粒2μL，10×H Buffer 2μL，Xhol 0.8μL，加ddH₂O至20μL。

农杆菌转化步骤如下：

(1)从-80℃取出保存的感受态农杆菌于冰上融化；

(2)每100μL感受态加1μg质粒DNA混匀，依次于冰上静置5min、液氮5min、37℃5min、冰浴5min；

(3)加入700μL无抗生素的LB液体培养基，于28℃振荡培养2～3h；

(4)5000rpm(转/分钟)离心3min收集菌，留取50μL左右的上清轻轻吸打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2～3天；

(5)挑单菌落培养并鉴定，鉴定正确的菌液每300μL加入50％甘油700μL置于-80℃保存。

实施例3

挑选实施例2鉴定正确的单菌落进行草莓果实侵染。选择大绿果时期的八倍体果实为试材，采用注射法进行果实侵染，具体方法如下：

1)挑去含PHellsgate-FaGST1质粒的阳性克隆，接种至15mL LB培养基中(含有50mg L^-1的卡那和50mg L^-1利福平)，28℃、200rpm摇菌至OD₆₀₀≈2.0。

2)取20mL新鲜的LB液体培养基(含有50mg L^-1的卡那和50mg L^-1利福平)，接入1mL步骤1)的农杆菌，28℃、200rpm摇至OD₆₀₀≈0.6。

3)收集菌液，室温、6000rpm离心3min。

4)用侵染液重新悬浮菌液，室温条件下，6000rpm离心3min。侵染液配置：分别配置浓度为1.0mol L^-1的MES、1.0mol L^-1的MgCl₂以及浓度为1.0mol L^-1的乙酰丁香酮，取200μL的MES、200μL MgCl₂、20μL乙酰丁香酮，灭菌水定容至20mL，即为侵染液，备用。

5)重复步骤4)一次。

6)最后用20mL侵染液重新悬浮菌株，室温静止2h，注射法侵染草莓果实。

数据测定：将PHellsgate-FaGST1基因做荧光定量PCR，分析该基因在草莓果实的表达模式

PCR体系为：Nuclease-Free Water 7μL，上游引物(5`-AGGTCTGGACTAACAAGCCAC-3`)1.0μL，下游引物(5`-CCTGCTCATCTCCTTTCGTTG-3`)1.0μL，qPCR Master Mix 10μL，模板cDNA 1μL。

PCR反应条件：95℃，2min；95℃，15sec，60℃，1min(50个循环)；溶解曲线。

图1是草莓果实注射侵染沉默表达FaGST1基因，图中，A、为注射侵染后的草莓果实，B、为侵染液注射后的草莓果实。FaGST1与草莓果实花青苷积累相关，将该基因沉默后，其表达量降低，但是注射PHellsgate空载体的果实花青苷的积累不受影响。

图2是PHellsgate-FaGST1基因表达，基因沉默后，FaGST1的表达量降低。

图3是花青素调控基因的表达，基因FaGST1沉默后，CHS1、F3H1、ANS1、UGT1等花青苷合成主要基因表达量受到抑制。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽农业大学

<120> 一种草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因及其表达蛋白和应用

<130> 100

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 657

<212> DNA

<213> Fragaria × ananassa Duch

<400> 1

atggcagatg aggttgtctt gttggacttc tggcctagcc catttgggat gaggctgagg 60

atcgctctgg ccgagaaagg cgtcaagtac gagtacaagg acgaggacct gaggaacaag 120

agcccgctgt tgcttcagtc gaacacggtt cacaagaaga tcccggttct cattcacaac 180

ggcaaacctg tctgcgagtc tgtcattgct cttcagtaca ttgatgaggt ctggactaac 240

aagccactat tgccctccga cccttacctc agatcccagg ccaggttctg ggccgacttt 300

gtggacaaga agatatatga tatcggtagg aagacatgga caacgaaagg agatgagcag 360

gaggcagcaa agaaggaatt catcgactgc attaagttgc tagaagtgga gcttggggac 420

aagcctttct ttggcggtga gaccctcgga tttgtggacg tgacgctcat tcctttctat 480

tcctggttct ctgtgtatga gaaatacggc aacttcagca ttgcgccaga gtgcccgaag 540

ttcatggctt gggttaagag gtgtatggag aaggagagtg tgtcaaagtc tcttcctgac 600

caggacaagg tctgtggctt tgttgccgag atgaggaaga agcttggagt tgagtag 657

<210> 2

<211> 218

<212> PRT

<213> Fragaria × ananassa Duch

<400> 2

Met Ala Asp Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Trp Pro Ser Pro Phe Gly

1 5 10 15

Met Arg Leu Arg Ile Ala Leu Ala Glu Lys Gly Val Lys Tyr Glu Tyr

20 25 30

Lys Asp Glu Asp Leu Arg Asn Lys Ser Pro Leu Leu Leu Gln Ser Asn

35 40 45

Thr Val His Lys Lys Ile Pro Val Leu Ile His Asn Gly Lys Pro Val

50 55 60

Cys Glu Ser Val Ile Ala Leu Gln Tyr Ile Asp Glu Val Trp Thr Asn

65 70 75 80

Lys Pro Leu Leu Pro Ser Asp Pro Tyr Leu Arg Ser Gln Ala Arg Phe

85 90 95

Trp Ala Asp Phe Val Asp Lys Lys Ile Tyr Asp Ile Gly Arg Lys Thr

100 105 110

Trp Thr Thr Lys Gly Asp Glu Gln Glu Ala Ala Lys Lys Glu Phe Ile

115 120 125

Asp Cys Ile Lys Leu Leu Glu Val Glu Leu Gly Asp Lys Pro Phe Phe

130 135 140

Gly Gly Glu Thr Leu Gly Phe Val Asp Val Thr Leu Ile Pro Phe Tyr

145 150 155 160

Ser Trp Phe Ser Val Tyr Glu Lys Tyr Gly Asn Phe Ser Ile Ala Pro

165 170 175

Glu Cys Pro Lys Phe Met Ala Trp Val Lys Arg Cys Met Glu Lys Glu

180 185 190

Ser Val Ser Lys Ser Leu Pro Asp Gln Asp Lys Val Cys Gly Phe Val

195 200 205

Ala Glu Met Arg Lys Lys Leu Gly Val Glu

210 215

Claims

1.草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的表达蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.含有权利要求1所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的表达载体。

4.含有权利要求1所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因的宿主菌。

5.权利要求1所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因在草莓果实花青苷积累中的应用。

6.权利要求1所述的草莓谷胱甘肽转移酶FaGST基因在调控CHS1、F3H1、ANS1或UGT1基因表达中的应用。