CN102187223A

CN102187223A - 检测膜蛋白内化的方法

Info

Publication number: CN102187223A
Application number: CN2009801385263A
Authority: CN
Inventors: 于里安·兹维尔; 罗伯特·波尔; 埃尔韦·安萨奈; 米歇尔·芬克; 埃里克·特兰凯特
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2011-09-14
Anticipated expiration: 2029-07-30
Also published as: US20120009599A1; US8999653B2; EP2329272A2; WO2010012962A3; EP2329272B1; JP2011529338A; WO2010012962A2; FR2934684A1; FR2934684B1; CN102187223B

Abstract

一种对目标跨膜蛋白的内化进行检测的方法，所述跨膜蛋白在细胞表面表达，所述方法包括以下步骤：a)用荧光金属复合物标记所述目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0.1ms；b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的组合物；c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自：a.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在反应介质中的终浓度大于10^-7M；b.还原剂，其氧化还原电位小于+0.1V，优选为0.25-0.75V；c.与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂；d.金属离子，所述金属离子与稀土金属竞争以形成非荧光金属复合物；d)当所述化合物是荧光受体化合物时，在所述荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节化合物的发射波长下，测定反应介质所发出的光；e)将步骤d)中测定的信号与仅经历步骤a)和c)的细胞上测定的参比信号进行比较。用途：对膜蛋白内化进行检测的方法。

Description

检测膜蛋白内化的方法

技术领域

本发明涉及检测膜蛋白被活细胞内化的方法，尤其可用于证明能够引发该内化作用的化合物。具体而言，本发明记载了以测定荧光金属复合物发生内化时的发光变化为基础，对与所述荧光金属复合物偶联的跨膜蛋白的内化进行检测的方法。

背景技术

内化：

在膜受体的配体将细胞活化期间，所述膜受体受到级联机制，该级联机制通常引起被细胞内化。首先，该过程可以抑制或减少由于摄取配体(通常是激动剂)而对细胞造成的刺激；其次，该过程引起受体的脱敏作用，因此引起常规的信号转导级联的中断。所述转导单元的脱敏作用是一个复杂的机制，该机制已有相对详尽的记载(参见例如Gainetdinov等，Annu Review Neurosci 2004 v27 p107-44)。

所述内化机制是调节G-蛋白偶联受体(GPCR)及受体酪氨酸激酶的主要过程之一。

粗略地讲，激动剂引起的GPCR活化造成该受体的胞内部分被磷酸化，从而诱导一定数量的胞内蛋白、特别是视紫红质抑制蛋白(arrestin)的募集(recruitment)，所述视紫红质抑制蛋白引起网格蛋白包被的胞吞囊泡的形成。随后，通过胞内运输机制处理这些囊泡，引起所述囊泡与溶酶体融合而发生降解，或引起所述囊泡与细胞质膜(plasma membrane)融合而恢复原状(reconversion)。

对开发具有治疗活性的新分子而言，GPCR是首选的靶分子，存在若干种技术用于测定GPCR被候选化合物(激动剂、拮抗剂或反向激动剂)活化的水平变化。事实上，其中一些技术的目的在于通过研究与GPCR内化相关的事件，来检测GPCR的活化。

视紫红质抑制蛋白是在GPCR内化过程中发挥主要作用的胞内蛋白，如下文所示，视紫红质抑制蛋白被用于若干种检测内化的方法中。

申请WO 01/67106记载了旨在通过对视紫红质抑制蛋白的组成性活性突变体与GPCR间的结合的调节作用进行测定，来鉴定GPCR配体的方法，所述组成性活性突变体的活性取决于GPCR的磷酸化水平，所述配体用放射性原子、酶、报告蛋白或荧光化合物进行标记。

申请WO 01/59451记载了采用“ICAST”技术(顺反子间互补分析筛选技术)检测GPCR活化的方法，所述“ICAST”技术基于突变酶两个亚基间的互补作用；例如，所述酶的各个片段一方面与GPCR以融合蛋白的形式表达，另一方面与视紫红质抑制蛋白以融合蛋白的形式表达。如果发生了GPCR-视紫红质抑制蛋白相互作用，所述酶会通过互补作用重建，并能产生可检测的信号。因此，这又成了通过检测GPCR与视紫红质抑制蛋白的结合来分析GPCR活化的问题。如申请WO 01/58923中所记载的，可通过采用GPCR突变体或视紫红质抑制蛋白突变体来改进该技术。

申请WO 2005/007822记载了确定化合物是否对两个目标蛋白间的相互作用进行调节的方法。所述方法同样基于对GPCR-视紫红质抑制蛋白结合的检测。该方法的基础是使用下述GPCR：通过对特定蛋白酶敏感的肽序列，与转录因子在GPCR的C端部分融合的GPCR。所述视紫红质抑制蛋白以其一部分与该蛋白酶融合。在GPCR被激动剂配体活化期间，视紫红质抑制蛋白会与GPCR相互作用，所述相互作用将会具有使所述蛋白酶靠近切割序列并引起转录因子释放的作用，而转录因子的释放随后将能够激活报告基因的转录，从而可检测到GPCR的活性。

对于采用视紫红质抑制蛋白-GPCR的结合作为GPCR活化的标记而言，其所关系到的问题之一在于该结合的性质不稳定，所述结合仅是引起胞吞囊泡形成的级联事件中的中间步骤。申请WO 04/065963通过采用视紫红质抑制蛋白突变体解决了这个问题，所述视紫红质抑制蛋白突变体与野生型视紫红质抑制蛋白不同，无法与该级联中的蛋白伴侣(protein partners)结合，因而可相对稳定地保持与受体结合。

Charest等(EMBO Rep.2005Apr；6(4)：334-40)开发了用于检测视紫红质抑制蛋白三维结构变化的技术，该三维结构变化发生在视紫红质抑制蛋白与活化的GPCR相互作用期间；作者构建了荧光素酶-视紫红质抑制蛋白-YFP(黄色荧光蛋白)的融合蛋白，并证明了在GPCR活化期间，分子内BRET(生物发光共振能量转移)信号的增大(被称为“双亮度视紫红质抑制蛋白”(double-brilliance arrestin)的技术)。

Molecular Devices公司出售“Transfluor

”技术，该技术具体记载于专利EP 1 015 608中，所述技术以使用视紫红质抑制蛋白-GFP融合蛋白为基础：利用适当的图像采集设备，使用表达该融合蛋白的细胞可以将视紫红质抑制蛋白-GFP的转位(translocation)及其在细胞内的重新分布(对目标GPCR活化的响应)可视化。

下文具体记载了证明膜受体内化的其它方法，这些方法并不基于对GPCR-视紫红质抑制蛋白的结合或视紫红质抑制蛋白的胞内转位进行的检测。

申请WO 00/03246记载了对能够诱导GPCR内化的化合物进行鉴定的方法，所述方法的基础在于：采用GPCR-发光蛋白融合蛋白或通过向介质中加入能与这些受体结合的已标记分子，将所述受体进行发光标记。所述方法包括对必须分析的细胞采集图像的步骤，以鉴定受体已发生内化的细胞。

Amersham Biosciences公司出售商品名为CypHer5

的花青苷(cyanin)衍生物；这些具体记载于申请WO 00/75237中的有机荧光团具有下述性质：中性pH下荧光极弱，而酸性pH下荧光极强。例如，这些花青苷衍生物可与能结合至GPCR的抗体缀合：在结合至GPCR的抗体-Cypher5发生内化期间，Cypher5会从中性pH的介质(胞外介质)进入酸性pH的介质(核内体)，其发光将会增强。

镧系元素复合物以及动态FRET引起的荧光猝灭

镧系元素复合物(下文中也称作“稀土金属复合物”)作为荧光化合物来研究生物学现象的用途开发于20世纪90年代(例如参见Mathis等的文章，Clin.Chem.1995Sep；41(9)：1391-7)。

FRET现象在生物学中已有广泛应用，特别是用于研究生物学相互作用。它的基础在于荧光供体化合物(例如镧系元素复合物)及任选的荧光受体化合物的使用，其中每个化合物都与生物分子偶联。当所研究的生物学相互作用引起所述生物分子彼此更为靠近，并且供体化合物被激发时，供体和受体间发生能量转移，导致反应介质发出的光发生变化。有若干个公司出售用于实施该方法以研究生物学过程的试剂；例如，本申请人提供用于研究特定生物学现象(检测酶活性、分析第二信使等)的供体化合物和受体化合物以及试剂盒。

对于在介质中自由扩散的处于溶液中的供体化合物及受体化合物，二者间动态能量转移的现象具体记载于D.Thomas等，(1978)，PNAS，75：12，5746-5750中。该现象通常表示为其首字母缩略词DEFET，意思为“扩散增强的荧光能量转移”。传统上用于研究生物学现象的能量转移以生物学相互作用(所述相互作用会使供体化合物及受体化合物彼此更为靠近)的发生为基础，与之不同的是，通过动态转移的FRET(或DEFET)基于一个或两个FRET伴侣在反应介质中的自由扩散。

D.Thomas等(1978)，PNAS，75：12，5746-5750记载了均处于溶液中的铽复合物(Tb(DPA)₃)及罗丹明之间的DEFET，并利用DEFET测定了存在于膜泡的水介质中的Tb(DPA)₃与膜内含有的曙红-磷脂酰胆碱的曙红生色团之间最近路径的距离。这些研究是在“快速扩散限制”的条件下，特别是使用具有长寿命(2.2毫秒)的供体荧光团进行的。在这些条件中，能量转移的效率本质上只取决于供体和受体之间最近路径的距离，这使得尤其可以在低的受体浓度下观察到信号。

专利申请GB 2 223 096记载了用于检测分子(例如抗体或抗原)的方法，所述方法正是基于动态FRET的概念，已知该动态FRET取决于FRET伴侣的扩散常数。事实上，所记载的方法在于测定供体化合物和受体化合物间动态FRET的变化，该变化是在供体或受体与待检测分子发生相互作用后，供体或受体在介质中的扩散作用改变而产生的。所述方法需要供体化合物或受体化合物之一同能够与待检测分子相互作用的实体发生缀合(例如，供体或受体同蛋白或抗体发生缀合)。

Zheng等(J.Am.Chem.Soc.2005，127，16178-16188)开发了一类能与镧系元素复合并能非特异性地插入脂质膜的亲脂性大环分子(DTPA-PDA-C_n，n＝10，12)，所述大环分子用于细胞标记的应用以及用于核磁共振(在钆复合物的情况下)的应用。该作者采用DEFET技术，通过测定由铽复合物及钙黄绿素之间的能量转移产生的信号，确定了这些复合物的细胞定位。当钙黄绿素被加入到胞外介质中时(钙黄绿素无法穿过细胞膜)，作者能够检测到他们所研究的复合物与钙黄绿素之间的DEFET，而无法检测到与胞内的钙黄绿素(以中性的钙黄绿素酯的形式引入细胞)之间的DEFET，由此可以推出，他们所研究的脂质的镧系元素复合物插入了细胞质膜的外表面上。该小组并未研究他们所研究的镧系元素复合物的内化事件中可能的信号变化。

一些小组还利用DEFET来研究与并入有能量-受体基序的蛋白结构及该蛋白结构与能量-供体化合物的相互作用，以确定蛋白表面的静电位。

镧系元素复合物以及氧化还原作用引起的荧光猝灭

文献中已经记载了某些还原剂对镧系元素复合物发光的影响：

例如，Kielar等人研究了由多种还原剂引起的、铕复合物及铽复合物的激发态的动态猝灭(Org.Biomol.Chem.，2007，5，2975-2982)，该研究表明，对于所研究的稀土金属复合物，氧化电位略低于1V的化合物可通过还原作用具有荧光猝灭作用；例如，碘离子(+0.54V)、尿酸根(+0.59V)、抗坏血酸根(+0.30V)及某些儿茶酚离子(pH 7时为+0.54V)就是这种情况。此外，这些作者还证明了这些化合物对铽复合物的荧光猝灭作用比对铕复合物(具有相同的螯合结构)所观察到的荧光猝灭作用要强。

申请WO 2008/007089涉及通过铽复合物或铕复合物，对具有还原能力的分析物进行分析的方法。

确实需要一种灵敏、易于实施并且适于高通量应用的方法，用于检测目标膜蛋白的内化。对于容易地证明能引发膜蛋白内化的化合物而言，特别是旨在检测新型药物的途径方面，上述方法尤其有利。此外，鉴于仅有10-40％可内化的受体事实上发生内化，因而所讨论的方法应当足够灵敏，以使得可以观察到内化发生时的信号变化。

定义

“与荧光金属复合物相配(compatible)的FRET受体化合物”：该表述表示与所述荧光金属复合物形成FRET伴侣对的FRET受体化合物。

“FRET伴侣对”：该表述表示由供体荧光化合物及受体化合物组成的对；当它们彼此接近并且在供体荧光化合物的激发波长下被激发时，这些化合物发出FRET信号。已知的是，为了让两个荧光化合物成为FRET伴侣，供体荧光化合物的发射光谱必须与受体化合物的激发光谱部分重叠。优选的FRET-伴侣对是R0值(

距离，即能量转移效率为50％时的距离)大于或等于

的伴侣对。

“FRET信号”：表示任何可测量的、代表供体荧光化合物及受体化合物之间FRET的信号。因此，FRET信号可以是供体荧光化合物或受体化合物(当受体化合物发荧光时)的发光强度或发光寿命的变化。

“反应介质”：表示活细胞可在其中与试剂接触的任何容器，例如培养板的孔、试管等。

“EDTA”：乙二胺四乙酸；

“DTPA”：二乙三胺五乙酸；

“TTHA”：三乙四胺-N，N，N′，N″，N″′，N″′-六乙酸；

“DOTA”：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N′，N″，N″′-四乙酸；

“NTA”：氮川三乙酸；

“HDTA”：六亚甲基二胺四乙酸；

“DTPP”：二乙三胺五膦酸；

“EDTP”：乙二氮川四(甲基膦酸)；

“NTP”：氮川三(亚甲基膦酸)；

“DOTP”：1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N′，N″，N″，N″′-四(亚甲基膦酸)；

“DO3A”：1，4，7，10-四氮杂环十二烷三乙酸；

“DOTAGA”：1-(1-羧基-3-羧基丙基)-4，7，10-(羧基甲基)-1，4，7，10-四氮杂环十二烷；

“DY647”：由Dyomics公司出售的具有五甲川结构的荧光团；

“D2”：Cisbio Bioassay公司出售的有机荧光受体化合物；

“PBS”：磷酸盐缓冲溶液；

“Lumi4-Tb”：Lumiphore公司及Cisbio Bioassay公司出售的铽复合物；

“DMEM”：″Dulbecco改良式Eagle培养基″，可商购并用于多种应用的细胞培养基；

“NHS”：N-羟基琥珀酰亚胺。

发明内容

本发明的主题是对蛋白内化进行检测的方法，所述方法包括以下步骤：

a)用含有镧系元素或钌的荧光金属复合物标记目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0.1ms，优选为0.5-6ms；

b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的化合物；

c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自：

1.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物；所述FRET受体化合物在反应介质中的终浓度大于10^-7M，优选为10^-6M至10^-3M；所述FRET受体化合物的分子量小于50kD，优选为0.1-10kD；

2.还原剂，其氧化还原电位小于+0.1V，优选为0.25-0.75V；

3.与荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂；

4.金属离子，所述金属离子与所述镧系元素或所述钌竞争以形成非荧光金属复合物；

d)在荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节剂的发射波长下，测定所述反应介质所发出的光；

e)将步骤d)中测定的信号与在仅经历步骤a)和c)的细胞上测定的参比信号进行比较，步骤d)中测定的信号与所述参比信号的差别表示所述目标蛋白的内化。

这些必要的步骤可按照(a、b、c、d、e)的顺序实施。在该情况下，所述调节化合物在目标蛋白内化期间并不存在于胞外介质中，所以优选采用该实施方式，从而降低所述调节化合物存在于核内体(endosomes)中的风险。

当所述调节剂是FRET受体化合物(即本发明的优选实施方式的情况)或还原剂时，也可以按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序完成这些步骤。

此外，可在步骤a)以及下一个步骤之间加入清洗步骤。术语“清洗步骤”意在表示更换一次或多次(优选为2次或3次)培养基的步骤。所述清洗步骤用于将未与目标蛋白偶联的荧光金属复合物从胞外介质中清除；然而，由于本发明的基础是观察由于内化作用引起的信号差别，该步骤是任选的。但是，为了改进本方法的灵敏度，优选进行该清洗步骤。

本发明所述方法的基础是检测含有活细胞和适当试剂的反应介质所发出的信号，信号强度由于目标膜蛋白被细胞内化而发生变化。

具体而言，在本发明所述的方法中，目标膜蛋白以暴露于胞外介质的域的水平，直接或间接地与能发出发光信号的荧光金属复合物结合。所述胞外介质所含有的化合物(称为“调节化合物”)在反应介质中的存在具有改变由荧光金属复合物所发出信号的作用。

目标膜蛋白的内化改变了所述荧光金属复合物对于调节化合物的可及性(accessibility)：经过一段时间后，所述荧光金属复合物不再暴露于胞外介质，而是暴露于胞吞囊泡内的介质，或是暴露于胞液。本发明人等已经发现，尽管仅有10-40％能够内化的跨膜受体事实上发生了内化，所述荧光金属复合物对于调节化合物的可及性变化造成反应介质所发出的发光信号的变化，这一变化可进行检测或甚至任选可进行定量。

反应介质发出的发光信号对应于荧光金属复合物发出的光；或者，当所述调节剂是FRET受体化合物时，反应介质发出的发光信号对应于该调节剂发出的光。

在这两种情况下，均为荧光金属复合物对于调节化合物的可及性的变化造成反应介质中测定的发光的差异。

现在，将会更详细地对本发明所述的方法及其实施变型中使用的试剂进行说明。

A.荧光金属复合物

一般而言，“荧光金属复合物”这一表述意在表示由镧系元素或钌以及多齿络合剂(polydentate complexing agent)组成的化合物，所述多齿络合剂即包含至少2个、优选2-9个电子供体杂原子(如N、O或S)的试剂，这些原子与所述镧系元素或钌形成配位键。优选地，所述荧光金属复合物包含一个或多个由芳香结构组成的生色团；优选地，这些芳香结构包含1、2或3个选自N和O的杂原子，所述杂原子起到镧系元素配位原子或钌配位原子的作用。

适于本发明目的的荧光金属复合物在络合剂与稀土金属缔合/解离的情况下应当保持稳定，其形成常数(K_f)应优选大于10¹⁰M^-1。

许多络合剂都已有记载且为本领域技术人员所知：对于络合剂的实例，可以提及以下化合物：EDTA、DTPA、TTHA、DOTA、NTA、HDTA、DTPP、EDTP、HDTP、NTP、DOTP、DO3A及DOTAGA。

适于本发明目的的荧光金属复合物的实例为：

●镧系元素穴状化合物，所述穴状化合物包含一个或多个吡啶单元。这类稀土金属穴状化合物记载于例如专利EP 0 180 492、EP 0 321 353和EP 0 601 113中以及国际申请WO 01/96877中。铽(Tb³⁺)及铕(Eu³⁺)的穴状化合物尤其适于本发明的目的。Cisbio Bioassay公司出售所述镧系元素穴状化合物。以非限制性实例的方式提及具有下式的铕穴状化合物，所述穴状化合物能够与标记有反应基团(如NHS基团或反应基团R)的化合物偶联。

●镧系元素螯合物，具体记载于专利US 4 761 481、US 5 032 677、US 5 055 578、US 5 106 957、US 5 116 989、US 4 761 481、US 4 801 722、US 4 794 191、US 4 637 988、US 4 670 572、US 4 837 169及US 4 859 777中。专利EP 0 403 593、US 5 324 825、US 5 202 423及US 5 316 909中记载了由九齿配体(如三联吡啶)组成的螯合物。PerkinElmer公司出售所述镧系元素螯合物。

●由螯合剂组成的镧系元素复合物，所述螯合剂例如四氮杂环十二烷。所述复合物被含有芳香环的生色团取代，也可使用如Poole R.等人在Biomol.Chem，2005，3，1013-1024“ Synthesis and characterisation of highly emissive and kinetically stable lanthanide complexes suitab

●也可使用专利EP 1 154 991及EP 1 154 990中记载的稀土金属穴状化合物。

●来自于Lumiphore公司的铽穴状化合物Lumi4-Tb，Cisbio bioassays出售。

●具有下式的铽穴状化合物Tb(KR)(所述穴状化合物能够与标记有反应基团(在该情况下，例如NHS基团)的化合物偶联)：

其合成记载于国际申请WO 2008/063721中。

●来自于Research Organics公司的量子染料，具有下式(所述量子染料能够与标记有反应基团(在该情况下，为NCS)的化合物偶联)：

●钌螯合物，特别是由钌离子及若干个联吡啶组成的复合物，如三(2，2′-联吡啶)钌(II)。

●具有下式的铽螯合物DTPA-cs124Tb，Invitrogen公司出售(所述螯合物能够与标记有反应基团R的化合物偶联)，其合成记载于美国专利US 5,622,821中。

镝(Dy³⁺)、钐(Sm³+)、钕(Nd³⁺)、镱(Yb³⁺)或铒(Er³⁺)的复合物同样是适于本发明目的的稀土金属复合物，尤其优选铕(Eu³⁺)和铽(Tb³⁺)的复合物。

已经记载了大量的镧系元素复合物，具体而言，其中一些复合物目前已被PerkinElmer、Invitrogen、Molecular Devices及Cisbio Bioassay公司进行了商业开发。图1显示了可用于本发明目的的铕复合物和铽复合物的其他实例。

尽管荧光金属复合物的使用是本发明的必要特征之一，但本发明并不局限于给定类型的荧光金属复合物，本领域技术人员能从荧光金属复合物中选择出最适合于其特定用途的荧光金属复合物，所选择的复合物寿命大于0.1ms，优选为0.5-6ms。

依照本发明，所述荧光金属复合物与偶联剂缀合(即共价键合)，从而使得用所述荧光金属复合物直接或间接地标记目标蛋白。这些偶联剂记载于“目标蛋白的标记”部分，优选为配体/受体对的一员，例如：标签抗体；生物素；或“自杀”酶的底物，如苄基鸟嘌呤衍生物、苄基胞嘧啶衍生物或氯烷烃衍生物。

荧光金属复合物与偶联剂的缀合是本领域技术人员常识的一部分，所述缀合作用的基础是反应基团的使用。可商购的稀土金属复合物含有可与偶联剂缀合的反应基团，或是已含有所述偶联剂，并且随时可用。

B.调节化合物

B1：调节化合物是能量受体

在本发明所述方法的一个实施方式中，所使用的调节化合物能够通过从所述荧光金属复合物(能量供体)向所述调节化合物(能量受体)发生

共振能量转移(FRET)的现象，改变由荧光金属复合物发出的信号。这一本领域技术人员所公知的现象基于两个FRET伴侣化合物之间彼此接近时的能量转移；在本实施方式的情况下，这一现象基于荧光金属复合物及在反应介质中自由扩散的调节化合物之间的能量转移。

通常，将FRET现象用于研究生物学过程意味着FRET伴侣对的成员各自与将会彼此发生相互作用的化合物缀合，由此使得FRET伴侣彼此靠近，从而产生FRET信号。在本发明所述的方法中，所述能量受体在反应介质中自由扩散，不与任何化合物缀合；而所述荧光金属复合物直接或间接地与目标膜蛋白偶联：根据DEFET现象，两个FRET伴侣之间的能量转移只取决于受体化合物在反应介质中的扩散。

本发明人等已经确定了在同膜蛋白偶联的荧光金属复合物与在胞外介质中扩散的受体之间建立DEFET所必需的条件，这些条件也使得在目标蛋白发生内化时观察到信号变化成为可能。

依照本实施方式，为了观察与目标蛋白内化和荧光金属复合物相关的DEFET，所采用的实验条件如下：

●所述荧光金属复合物及所述调节化合物是FRET伴侣；

●所述荧光金属复合物的寿命应当大于0.1ms，优选为0.5-6ms；

●胞外介质中所述调节化合物的浓度应当为0.1μM至1mM。优选所述化合物的浓度为1μM至100μM，使其可在快速扩散极限下发挥作用，并可测定与所述荧光金属复合物浓度无关的DEFET信号；

●优选所述调节化合物不应穿过细胞膜。此外，其扩散常数应当足够高。通常，分子量小于50kD、优选为0.1-10kD的调节化合物适于本发明的目的。

本发明所述方法的实施方式中，所述调节化合物可以是荧光或非荧光的化合物。

对于所述调节化合物是荧光的能量-受体化合物并且所述镧系元素是铽或铕的情况，该调节化合物可选自以下化合物或化合物家族：花青苷(cyanin)衍生物、DY647、D2、荧光素及其衍生物、香豆素、罗丹明、carbopyronine、噁嗪及其类似物、Alexa Fluors、结晶紫、苝酰亚胺(perylene bisimide)型荧光团、方酸菁(squaraines)、商品名为BODIPY

的硼-二吡咯甲烯基衍生物、NBD(硝基苯并噁二唑)及NBD衍生物、DABCYL(4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)。

Alexa Fluor化合物及硼-二吡咯甲烯基衍生物由Invitrogen公司出售；化合物Dy647是由Dyomics公司出售的花青苷衍生物；特别地，所述花青苷衍生物还由Amersham Biosciences公司出售；其它化合物由多个化学试剂供应商(如Sigma、Aldrich或Acros公司)出售。

当非荧光化合物的吸收光谱与荧光金属复合物的发射光谱相配时，也可使用非荧光化合物。以下非荧光受体可商购得到：来自于Anaspec公司的QXL产品，特别是QXL 570、QXL 610、QXL 670及QXL 680；来自于Dyomics公司的DYQ660和DYQ661产品；以及来自于Invitrogen公司的QSY7、QSY9及QSY21产品。

反应介质中检测到的信号可以是：荧光金属复合物发出的光；或者，在受体化合物也发荧光的情况下，所述受体化合物发出的光；以及上述二者发光的强度或寿命。无论如何，这些信号都取决于DEFET现象，并会在目标跨膜蛋白的内化过程中以如下方式发生变化：

●如果跨膜蛋白发生内化，在荧光金属复合物的发射波长下测定的该荧光金属复合物的发光强度或发光寿命会增加；

●如果调节剂是荧光受体化合物，蛋白发生内化时，在所述受体的发射波长下测定的信号强度或信号寿命会改变。应该注意到，来自于所述受体化合物的信号取决于与所述荧光金属复合物之间发生的DEFET；但当受体化合物的浓度高时，也取决于发生于胞外介质中可能的分子间发光-猝灭效应。有鉴于此，在受体调节化合物的发射波长下发出的信号在内化后可增强或减弱；

●如果调节剂是荧光受体化合物，其信号可通过计算受体信号/供体信号的比值进行校正。文献中广泛采用并记载了上述FRET信号的比值校正方法。

B2：调节化合物相对于荧光金属复合物是还原剂：

本发明人等发现，在本发明所述的方法中，可优选使用能够在荧光金属复合物和/或复合结构的水平上，通过氧化还原反应的方式使荧光金属复合物发光减弱的还原剂。

所述还原剂应当具有适合于还原所述荧光金属复合物的氧化还原电位。本领域技术人员根据所选择的荧光金属复合物，能够确定适合于实施本发明所述方法的还原剂，但是优选氧化还原电位为+0.1至+1.2V之间的还原剂。更优选氧化还原电位为+0.25至+0.75V的还原剂。

因此，当对荧光金属复合物发出的信号进行调节的化合物是还原剂时，该化合物可以选自例如以下还原剂：碘离子、抗坏血酸根、尿酸根、儿茶酚离子、无机化合物(如Fe(CN)₆ ²⁺)。将这些离子以与反离子成盐的形式加入到测定介质中，例如对于阴离子而言，以钠盐或钾盐的形式加入到测定介质中。

在本实施方式中，所测定的信号将会对应于荧光金属复合物发出的光，该发光作用由胞外介质中存在的还原剂调节：当与所述荧光金属复合物偶联的目标蛋白发生内化时，所述荧光金属复合物不再与调节剂接触或接近；相比于没有发生内化的情况，所述荧光金属复合物的发光作用将会更强，寿命也将更长。

在本实施方式中，为了能够测定发生内化及未发生内化两种情况之间的信号差异，本发明人等已经确定，所述还原剂应当以大于或等于荧光金属复合物/还原剂对的Stern-Volmer常数的浓度存在于反应介质中。该常数被定义为引起荧光金属复合物的发光强度降低50％所必需的还原剂浓度。Kielar等人的文章中具体给出了荧光金属复合物/还原剂对的Stern-Volmer常数的实例(Org.Biomol.Chem.，2007，5，2975-2982)。

因此，在本实施方式的第一方面，对荧光金属复合物的发光作用进行了测定。

在本实施方式的第二方面，本发明所述方法的第一个步骤包括：将第一荧光金属复合物及第二荧光金属复合物加入到测定介质中，所述第一荧光金属复合物及第二荧光金属复合物用于对目标蛋白进行标记。

除了金属有所不同，该第二荧光金属复合物与所述第一复合物相同。例如，所述第一荧光金属复合物是铕复合物，所述第二金属复合物是含有相同螯合结构的铽复合物。因此，在本实施方式中，给定的目标蛋白可能直接或间接地与第一荧光金属复合物结合，或直接或间接地与第二荧光金属复合物结合(或不被任何荧光金属复合物标记)。

在本实施方式中，例如通过算出镧系元素复合物之一所发出的光与所述第二荧光金属复合物的发光强度的比值，可以将所测定的信号标准化。这类测定结果可将由不同反应介质得到的信号进行比较，因此特别适于进行定量研究。

B3：调节化合物是与荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂：

所述调节化合物可以是具有可与荧光金属复合物特异性且非共价地结合的域的试剂：事实上，这些化合物可以引起荧光金属复合物的发光减弱。这些化合物可选自：抗体或抗体片段、肽或适体，上述每种化合物都具有与荧光金属复合物结合的域。

在这些试剂中，能够识别荧光金属复合物的抗体或抗体片段是优选的调节剂。申请WO2007/116069(A1)记载了针对稀土金属复合物的特异性抗体的制备，此外，本领域技术人员利用他们掌握的处理技术能够制备该类型的化合物。

为了用该类调节剂实施本发明所述的方法，在加入调节剂之前加入能够引起内化的化合物是可行的，否则，调节剂会与荧光金属复合物同时内化。换句话说，在本实施方式中，上述方法中的步骤应当按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序进行。

B4：调节化合物是与稀土金属竞争、从而形成非荧光金属复合物的金属离子：

另一类适于实施本发明所述方法的调节剂是金属离子，所述金属离子与稀土金属竞争、从而与络合剂形成非荧光复合物。因此，对于稀土金属螯合物的情况，所述调节剂可以是Mn²⁺离子。

在这种情况下，以与适当的反离子成盐的形式(例如以MnCl₂的形式)，将所述调节剂加入到胞外介质中。

为了用该类型的调节剂实施本发明所述的方法，在加入调节剂之前加入能够引起内化的化合物是可行的。换句话说，在本实施方式中，上述方法中的步骤应当按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序进行。

C.目标蛋白——用荧光金属复合物标记

C1.表达

当膜蛋白可以以其胞外部分直接或间接地与荧光金属复合物偶联时，可以采用任何能够发生内化的膜蛋白来实施本发明。

本发明对于研究G-蛋白偶联受体(以下称为“GPCR”)及受体酪氨酸激酶(以下称为“RTK”)的内化特别有用，如上所述，所述GPCR及RTK的调节机制之一就是内化。然而，也可以采用希望证实其是否发生内化的其它膜蛋白来实施本发明。

目标蛋白在细胞膜上天然表达，或采用常规的分子生物学技术使其表达，特别是采用稳定或瞬时导入细胞的表达载体使目标蛋白表达。用于将异源DNA稳定或瞬时导入细胞的试剂可商购得到，编码目标蛋白的DNA序列、特别是编码GPCR及RTK的DNA序列可在数据库(如Genbank)中得到。当细胞稳定表达目标蛋白时，由于存在过于大量的GPCR，可能会观察到细胞毒性现象；在该情况下，采用可诱导型表达系统来限制GPCR的表达是有利的。

因此，本发明所述的方法可以包括用编码目标蛋白的表达载体转染细胞的预备步骤。如下文所述，该载体也可包含编码自杀酶的序列，使得可以用荧光金属复合物对目标蛋白进行共价标记。

在一个具体的实施方式中，将第二表达载体与编码目标蛋白的载体进行共转染，该表达载体包含编码β-视紫红质抑制蛋白1的序列。尽管这一共表达作用对于实现本发明并非必要，但由于β-视紫红质抑制蛋白1能够非特异性地放大内化现象，所以这一共表达作用可以提高该方法的灵敏度。

C2.用荧光金属复合物标记

本发明一个特别简单的实施方式在于，将所述荧光金属复合物同已知能与目标蛋白结合的化合物(配体)缀合：通过与目标蛋白结合，经修饰的配体可以间接地标记该蛋白。

已经记载了许多用于修饰蛋白的技术，本领域技术人员能够利用现有的工具将蛋白偶联至荧光金属复合物。具体而言，传统的分子生物学技术可以对蛋白给定的域进行增加、删除或修饰。

实施本发明唯一的必要特征是所述荧光金属复合物以在胞外介质中的方式与所述蛋白偶联，由此，反应介质发出的发光信号事实上取决于调节化合物在胞外介质中的存在。

如果目标蛋白是GPCR或RTK，则所述荧光金属复合物会因此通过其N端(胞外)域的修饰与该蛋白缀合，从而根据下文中记载的技术之一，使该蛋白被荧光金属复合物直接或间接地标记。

以非限制性例证的方式，提到用于将跨膜蛋白与荧光金属复合物偶联的以下技术：

*将目标蛋白与荧光金属复合物间接(非共价)偶联

所述荧光金属复合物能够通过结合伴侣对的方式与目标蛋白偶联，所述伴侣对中的至少一种本质上为蛋白。在该方法中，通过常规的分子生物学技术手段(构建表达载体，所述表达载体包含编码目标蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列与编码蛋白结合伴侣的序列融合；以及将所述表达载体导入细胞)，将目标蛋白与本质上为蛋白的结合伴侣融合。所述荧光金属复合物与另一个的结合伴侣(此处是指偶联剂)共价缀合，随后被加入到胞外介质中。结合伴侣的识别作用使得可以用荧光金属复合物间接地标记目标蛋白。

对于特别适于实施本发明的结合伴侣，以非限制性实例的方式提到：

●由半胱氨酸-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸-半胱氨酸序列(SEQ ID No.1)及双砷化合物(biarsenic compound)组成的对，其中X为任意氨基酸。这些双砷化合物可以用荧光素型或罗丹明型的有机分子容易地标记(关于技术的细节，请参见B.A.Griffin等.(1998)Science.1998，281，269-271及S.A.Adams等.(2002)J.Am.Chem.Soc.2002，124，6063-6076)。

●BTX(环蛇毒素)肽，由13个氨基酸的肽组成，可被环蛇毒素(BTX)识别，能够与荧光分子偶联(参见C.M.McCann等.(2005)，Biotechnique(2005)，38，945-952)。

●链霉亲和素/生物素对：链霉亲和素结合序列(SBP-标签)是由38个氨基酸形成的序列，该序列对生物素有很高的亲和力，所述生物素可用荧光金属复合物进行预标记(参见C.M.McCann等.(2005)，Biotechnique(2005)，38，945-952)。

●大肠杆菌二氢叶酸还原酶(eDHFR)的序列，该序列能够以高的亲和力特异性地与配体(如三甲氧苄二氨嘧啶)结合，可以根据来自于Active Motif公司的被称为“配体接合通用标记技术”(Ligand link Universal labeling technology)的技术，将荧光金属复合物接枝(graft)到该配体上。

●标签/标签抗体对是经常用于标记蛋白的结合伴侣。术语“标签”表示一段由通常但不必须很短(少于15个氨基酸)的氨基酸序列组成的小的蛋白“标记”，该标签与目标蛋白融合或天然存在于该蛋白中。术语“标签抗体”表示与所述标签特异性结合的抗体。在本实施方式中，所述标签抗体与所述荧光金属复合物共价结合。当如此标记的抗体被加入到胞外介质中时，其结合至与目标蛋白缀合的标签，标签/标签抗体的相互作用使得可以用所述荧光金属复合物间接地标记该蛋白。

以标签/标签抗体对的非限制性实例的方式提到以下的对，其成员可商购得到：GST/抗-GST抗体，其中GST代表谷胱甘肽S-转移酶或其片段；6HIS/抗-6HIS抗体，其中6HIS是由6个组氨酸组成的肽；Myc/抗-Myc抗体，其中Myc是由人Myc蛋白的410-419位氨基酸组成的肽；FLAG/抗-FLAG抗体，其中FLAG是具有8个氨基酸DYKDDDDK(SEQ ID No.2)的肽；HA/抗-HA抗体，其中HA是由9个氨基酸YPYDVPFYA(SEQ ID No.3)组成的流感病毒血凝素表位。显然，所述标签的确切性质对于实施本发明并非必不可少。

*将目标蛋白与荧光金属复合物直接(共价)偶联

在该方法中，所述荧光金属复合物会通过共价键合与目标蛋白偶联；多种技术已有记载，并且实施所述技术所必需的试剂可商购得到。对于该偶联，可以采用下文中的任一种技术：

●以目标蛋白上存在的反应基团的水平形成共价键，尤其是以以下基团之一的水平形成共价键：末端氨基、末端羧基、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、赖氨酸的胺基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的巯基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。

存在于目标蛋白上的这些基团能够与所述荧光金属复合物上带有的反应基团形成共价键。

本领域技术人员已知适合的反应基团：例如，马来酰亚胺基官能化的荧光金属复合物能够与蛋白的半胱氨酸上带有的巯基共价键合。同样地，带有N-羟基琥珀酰亚胺酯的荧光金属复合物能够与目标蛋白的胺共价键合。

●自杀酶的使用：

术语“自杀酶”意在表示具有酶活性的蛋白，所述蛋白经过特异性突变的修饰，使得它们具有与底物快速地共价键合的能力。由于每一分子的酶都只能与一个荧光分子键合，底物的附着阻断了酶的活性，所以这些酶被称为“自杀者”。因此，这些酶构成了用于特异性标记目标蛋白的首选工具，所述标记以一个荧光分子对应一个蛋白的比值进行。在该方法中，通过常规的分子生物学技术，自杀酶优选在其N端部分与膜蛋白融合；并将酶的底物导入胞外介质中，所述底物与供体/受体共价键合。所述酶促反应实现了经标记的底物与酶的共价键合，并由此实现了用供体或受体对膜蛋白进行标记。

以非限制性实例的方式提到以下的酶：

-O⁶-烷基鸟嘌呤DNA烷基转移酶(AGT)的突变体。NEB公司出售的酶SNAP-标签(Juillerat等，Chemistry & Biology，Vol.10，313-317April 2003)及CLIP-标签(Gautier等，Chemistry及Biology，15，128-136，February 2008)是人AGT的突变体，其底物分别是O⁶-苄基鸟嘌呤(下文中简写为BG)及O²-苄基胞嘧啶(下文中简写为BC)。酶N-AGT(Gronemeyer等，Protein engineering，design & selection，vol.19，No.7，pp 309-3016，2006)是该酶的另一突变体，其与O⁶-苄基鸟嘌呤的反应性优于SNAP-标签酶的反应性；

-脱卤素酶的突变体(Promega出售的HaloTag)同样产生了自杀型的酶促反应(参见WO 04/072232 A2)，该突变体的部分底物由氯烷烃家族、尤其是含有-NH-CH₂CH₂-O-CH₂CH₂-O-(CH₂)₆-Cl单元的氯烷烃构成。在该情况下，所述荧光金属复合物与该类单元缀合；

-ACP蛋白(酰基载体蛋白)，在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的存在下，辅酶A的4′-磷酸泛酰巯基乙胺残基被转移到ACP的丝氨酸上(N.Georg等，Journal of the American Chemical Society，126，(2004)p8896-8897)。当采用该方法用所述荧光金属复合物标记目标蛋白时，有必要将磷酸泛酰巯基乙胺转移酶加入到反应介质中。NEB公司出售商品名为“ACP-Tag”的ACP片段用于蛋白标记。

当该方法被用于标记目标蛋白时，用包含DNA的表达质粒转染细胞，所述DNA对包含自杀酶及目标蛋白的融合蛋白进行编码。该质粒还可包含：编码这些蛋白的DNA的上游、编码标签的DNA(所述标签例如FLAG表位、myc表位或流感病毒血凝素(HA)表位)。

为了确保所述融合蛋白将会在细胞膜中表达，在表达质粒中包含下述序列是有用的：编码目标蛋白及自杀酶的序列的上游、编码膜靶向肽(如T8信号肽或mGluR5受体的信号肽)的序列；本领域技术人员已知将上述序列用于这一目的。最后，还希望确保编码目标蛋白的序列不包含任何天然的膜靶向序列，所述天然的膜靶向序列会成为目标蛋白及自杀酶之间的键翻译后切割的对象：如果是这种情况，优选不将该域导入表达质粒中。

为了与存在于胞外介质中的酶的底物(如BG-荧光金属复合物缀合物)发生酶促反应，自杀酶暴露于胞外介质是必要的：当天然的目标蛋白(此处为GPCR及RTK的情况)的N端部分暴露于胞外介质时，构建所述融合蛋白从而使得自杀酶在融合蛋白的N端部分表达，但如果存在膜靶向肽，则始终在膜靶向肽的下游表达。

最后，当将自杀酶用于将目标蛋白用所述荧光金属复合物进行标记，并且目标蛋白是GPCR或RTK时，本发明包括下述预备步骤：用包含编码融合蛋白的DNA序列的表达载体转染细胞，所述融合蛋白的N端部分包含自杀酶，所述融合蛋白的C端部分包含目标蛋白。

在胞外介质中引入酶的底物将会实现用该荧光金属复合物对目标蛋白进行标记，所述酶的底物与荧光金属复合物缀合。

在本实施方式中，可使用对选自以下融合蛋白的融合蛋白进行编码的表达载体：

自杀酶-目标蛋白，或

标签-自杀酶-目标蛋白，或

膜靶向肽-标签-自杀酶-目标蛋白。

实施例

以下实施例例证了本发明的优选实施方式，也就是说，在所述优选实施方式中：荧光金属复合物是与苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶共价键合的铕穴状化合物或铽穴状化合物；目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达；调节化合物是花青苷衍生物(尤其是Cy5或Cy5-COOH)，或是荧光素或其衍生物之一。当使用了铕穴状化合物时，优选采用花青苷衍生物而非荧光素。

实施例1：加压素受体V2-R内化的检测

在该实施例中，目的在于通过本发明所述的方法检测融合蛋白的内化，所述融合蛋白包含加压素V2受体、Snap-tag酶及HA标签。

具体而言，将铽穴状化合物(LUMI4-TB)-苄基鸟嘌呤(BG)缀合物在该情况下用作供体化合物，将花青苷Cy5-COOH在该情况下用作受体，观察随着受体内化后DEFET的变化引起的信号变化。

试剂及材料

OptiMEM培养基(Invitrogen(51985-026))

PBS磷酸盐缓冲液

DMEM woPR(无酚红的DMEM培养基，Invitrogen)

DMEM+：加入以下物质的DMEM：1mM L-丙氨酰/L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、10％胎牛血清(Invitrogen SKU#10091-148)、1％青霉素-链霉素(Invitrogen SKU#15070-063)、2mM HEPES、1％非必需氨基酸

DMEM woPR+(无酚红的DMEM+培养基)

Krebs-Tris+葡萄糖0.5g/l

BG-LUMI4-TB(苄基鸟嘌呤-铽穴状化合物的缀合物，Cisbio Bioassay出售)

BG：O⁶-苄基鸟嘌呤(Sigma B2292)

加压素(Bachem)

HA-ST-V2质粒：包含编码融合蛋白的序列的质粒，所述融合蛋白包含T8膜靶向信号肽、HA表位、SNAPTAG酶及V2受体。

花青苷Cy5-COOH：Eras实验室。

板的处理

将50μl聚-L-鸟氨酸溶液(0.01％的溶液，分子量30000-70000(SIGMA P4957))分置入96孔板(Cellstar，黑色，黑底)的每个孔中，以促进细胞贴附到孔的底部，然后在37℃下将板培养30分钟后，用100μlDMEM+漂洗一次。

转染

随后，将具有以下组成的下述转染混合物或阴性对照混合物分置入孔中：

转染混合物(每孔)：	阴性对照混合物(每孔)：
		0.32μg HA-ST-V2质粒(CIS BIO)	0.32μg PRK6质粒(CIS BIO)
0.8μl脂质体2000(lipofectamine 2000)	0.8μl脂质体2000(Invitrogen)
		50μl生物培养基(DMEM+)	50μl生物培养基(DMEM+)

培养30分钟后，向每个孔中加入100μl COS7细胞(CIS BIO)，即80000个细胞，随后在5％CO₂的存在下，在37℃培养24小时。

剂量响应曲线

在将孔用DMEM woPR+培养基漂洗一次后，加入在DMEM woPR+培养基(100μl)中形成的156nM BG-LUMI4-TB溶液或156nM BG(阴性对照)溶液，然后将板培养1小时30分钟。

随后，在将各孔用100μl Krebs-Tris缓冲液+葡萄糖(0.5g/l)漂洗三次后，加入Krebs-Tris缓冲液，接着加入用Krebs-Tris缓冲液稀释的加压素(V2受体激动剂)(4℃、10μl、不同的浓度，参见板的方案)。

培养30分钟后，向B、D、E-H行中，加入处于Krebs-Tris缓冲液(10μl)中的、264μM Cy5-COOH溶液(参见方案)，从而受体终浓度为24μM。

将板摇动15分钟后，在安装有337nm氮激光以及545nm和665nm发射滤光片的Envision酶标仪(PerkinElmer)上，对板进行读数。两个通道均以400μs的延迟和400-2900μs的读数窗口进行读数。

所述96孔板的方案以及每孔中所加入试剂的量如下所示：

A行：采用PRK6质粒的阴性对照，因此无Snaptag(ST)标记；在无Cy5受体的情况下观察下述信号：无LUMI4-TB供体(A1-A4)；有LUMI4-TB供体而无加压素(A5-A8)；或有LUMI4-TB供体且有加压素(A9-A12)。

B行：采用PRK6质粒的阴性对照，因此无Snaptag(ST)标记；在有Cy5受体的情况下观察下述信号：无LUMI4-TB供体(B1-B4)；有LUMI4-TB供体而无加压素(B5-B8)；或有LUMI4-TB供体且有加压素(B9-B12)。

该行可以在受体未标记的情况下评估背景噪音，并可以校正所测得的信号。

C行：采用HA-ST-V2质粒的阴性对照，因此存在Snaptag，但不存在加压素或Cy5受体；在存在BG的情况下观察下述信号：所述BG不发荧光(C1-C4)；或所述BG发荧光，其带有LUMI4-TB供体(C5-C12)。

D行：采用HA-ST-V2质粒的阴性对照，因此存在Snaptag但无加压素，且存在Cy5受体；在存在BG的情况下观察下述信号：所述BG不发荧光(D1-D4)；或所述BG发荧光，其带有LUMI4-TB供体(D5-D12)。

该行可以在用BG-LUMI4-TB标记的V2受体未发生内化的情况下获得参比信号。

E-H行：相当于在各种浓度的加压素的存在下观察到的信号。

结果及讨论

图2表示在545nm下测得的供体发光的变化，其随加压素浓度变化，因此也随受体的内化作用变化。

％ΔAS对应于相对未发生内化(无加压素)时所测得的参比信号，供体信号在内化过程中增加的百分比。

具体而言，对于给定的加压素浓度、例如10pM(孔E1-E6)，按照下面的方式计算％ΔAS：

% ΔAS = \frac{({[E 1 - E 6]}_{545} - {[D 5 - D 12]}_{545})}{({[D 5 - D 12]}_{545} - {[D 1 - D 4]}_{545}) - ({[B 5 - B 8]}_{545} - {[B 1 - B 4]}_{545})}

在上式中，“[E1-E6]₅₄₅”、“[D5-D12]₅₄₅”等对应于在BG-LUMI4-TB供体的波长(545nm)下，在孔E1-E6、D5-D12等中所测得的信号的平均值。

分子对应于存在及不存在加压素(即发生及未发生内化)的情况下所测得的信号间的差异；分母对应于未发生内化时的参比信号([D5-D12]₅₄₅)，并用背景噪音及非特异性信号进行校正，所述背景噪音[D1-D4]₅₄₅在没有BG-LUMI4-TB供体的情况下测得，所述非特异性信号[B5-B8]₅₄₅-[B1-B4]₅₄₅在没有Snaptag标记的情况下测得。

图2显示了在加压素浓度增加的情况下，BG-LUMI4-TB供体化合物在545nm下的发光变化(此处为增强)，从而验证了本发明所述的方法在证明膜受体发生内化方面的用途。

如果所关注的是受体在665nm(Cy5)下发出的信号，并用545nm下的供体信号进行校正(该比值校正可以消除孔之间的信号变动性)，得到了类似的结果。

图3表示％ΔASR的变化，其随加压素浓度及由此的V2受体内化作用而变化。％ΔASR对应于未发生内化时的参比信号(无加压素的情况下测定)的百分比。

对于给定的加压素的浓度、例如10pM(孔E1-E6)，按照下面的方式计算％ΔASR：

% ΔASR = 1 - \begin{matrix} \frac{{[E 1 - E 6]}_{665} - {[D 1 - D 4]}_{665} - ({[B 5 - B 8]}_{665} - {[B 1 - B 4]}_{665})}{{[E 1 - E 6]}_{545} - {[D 1 - D 4]}_{545} - ({[B 5 - B 8]}_{545} - {[B 1 - B 4]}_{545})} \\ \frac{{[D 5 - D 12]}_{665} - {[D 1 - D 4]}_{665} - ({[B 5 - B 8]}_{665} - {[B 1 - B 4]}_{665})}{{[D 5 - D 12]}_{545} - {[D 1 - D 4]}_{545} - ({[B 5 - B 8]}_{545} - {[B 1 - B 4]}_{545})} \end{matrix}

将在加压素存在的情况下所测得的信号([E1-E6]₆₆₅/[E1-E6]₅₄₅)及参比信号([D1-D12]₆₆₅/[D1-D12]₅₄₅)分别对于背景噪音及非特异性信号进行校正，所述背景噪音[D1-D4]在BG-LUMI4-TB供体不存在的情况下测得，所述非特异性信号[B5-B8]-[B1-B4]在Snaptag标记不存在的情况下测得。

图3显示了当介质中存在的加压素浓度增加时的变化(受体化合物发出的信号的减弱)，从而验证了本发明所述的方法在证明膜受体发生内化方面的用途。

实施例2：加压素受体V2-R内化的检测

该实施例例证了本发明所述方法的另一实施方式，该实施方式用于检测V2加压素受体的内化。具体而言，将荧光素作为受体进行研究，将编码V2受体的表达质粒与编码β-视紫红质抑制蛋白1的质粒进行共转染。该共转染可以促进受体内化，因而提高本方法的灵敏度。

试剂及材料

OptiMEM培养基(Invitrogen(51985-026))

Krebs-葡萄糖：Krebs缓冲液+0.5g/l葡萄糖

BG：O⁶-苄基鸟嘌呤(Sigma B2292)

加压素(Bachem)

FLAG-ST-V2质粒：包含编码融合蛋白的序列的质粒，所述融合蛋白包含T8膜靶向信号肽、FLAG表位、SNAPTAG酶及V2受体。该质粒的序列为SEQ ID No.4

Flag-视紫红质抑制蛋白β1质粒：包含编码融合蛋白的序列的质粒，所述融合蛋白包含FLAG表位及人β-视紫红质抑制蛋白1。该质粒的序列为SEQ ID No.5

荧光素(Sigma)。

板的处理

将50μl聚-L-鸟氨酸溶液(0.01％的溶液，分子量30000-70000(SIGMA P4957))分置入96孔板(Cellstar，黑色，黑底)的每个孔中，以促进细胞贴附到孔的底部，然后在37℃下将板培养30分钟。

转染

随后将以下转染混合物分置入每个孔：

-0.16μg FLAG-ST-V2质粒+0.16μg Flag-β1视紫红质抑制蛋白质粒

-0.8μl脂质体2000

-50μl OptiMEM培养基。

培养30分钟后，将100μl含有100000个COS7细胞的悬浮液加入每孔中，随后在5％CO₂存在的情况下，在37℃培养24小时。

剂量响应曲线

吸出转染培养基，向每个孔中加入在Krebs-葡萄糖培养基中形成的浓度为100nM的BG-LUMI4-TB溶液。随后在CO₂存在的情况下，在37℃将板培养1小时。

接下来，用100μl Krebs-葡萄糖将每个孔清洗4次后，加入90μl Krebs-葡萄糖缓冲液或加压素溶液。

在+37℃及5％CO₂的条件下培养30分钟后，向孔中加入处于Krebs-葡萄糖缓冲液中的、浓度为240μM的荧光素溶液10μl，从而受体终浓度为24μM。

轻微摇动所述板，随后在安装有337nm氮激光以及620nm和520nm发射滤光片的Rubystar酶标仪(BMG)上，对板进行读数。受体通道(520nm)以60μs的延迟时间、60-400μs的读数窗口进行读数，供体通道(620nm)以400μs的延迟时间、400-1500μs的读数窗口进行读数。

结果及讨论

图4表示供体信号(620nm处测得)与受体信号(520nm处测得)比值的变化，该比值随加压素(AVP)浓度变化。所述比值可以消除孔间变动(inter-well variation)。此外，为了使该图表现度更好，将该比值乘以10000。

图4清楚地显示了加压素浓度增加引起所述比值增加，对应于供体化合物的发光增强。

事实上，加压素的加入引起了V2受体的内化，BG-LUMI4-Tb供体缀合物与所述V2受体结合，并且由于它们不再参与同胞外介质中的荧光素溶液的DEFET现象，因而会引起其发光的增强。

因此，该实施例再次显示，供体化合物信号的增强(对应于DEFET的减弱)以及V2受体在其激动剂加压素存在的情况下发生内化之间具有极高的关联度。该实施例还显示了如何将本发明所述的方法用于证明化合物是目标受体的激动剂。

实施例3：V2受体拮抗剂EDA9对加压素诱导的V2受体内化作用的影响

该实施例例证了本发明所述的方法在证明加压素V2受体拮抗剂的化合物方面的用途。将作为该受体已知拮抗剂的化合物EDA9(PolyPeptide集团)用于这一实施例。

所用试剂及材料与实施例2中的试剂及材料相同。对板和试剂的处理以及转染方案也相同。

拮抗剂EDA9存在时的剂量响应曲线

接下来，用100μl Krebs-葡萄糖将每个孔清洗4次后，加入45μl Krebs-葡萄糖缓冲液或EDA9溶液。

在+37℃及5％CO₂的条件下培养30分钟后，向孔内加入160nM的加压素溶液45μl，从而每个孔的加压素终浓度为80nM。

轻微摇动所述板，随后在安装了337nm氮激光以及620nm和520nm发射滤光片的Envision酶标仪(Perkin Elmer)上，对板进行读数。受体通道(520nm)以60μs的延迟时间、60-400μs的读数窗口进行读数，供体通道(620nm)以400μs的延迟时间、400-1500μs的读数窗口进行读数。

结果及讨论

图5表示在恒定浓度的加压素(AVP)存在的情况下，供体信号(620nm处测得)与受体信号(520nm处测得)的比值随拮抗剂EDA9浓度的变化。为了使该图表现度更好，将计算得出的比值乘以10000。

图5显示了当拮抗剂EDA9浓度增加时，所述比值降低。所述降低可以解释为供体信号的降低：在EDA9不存在但加压素存在的情况下，V2受体发生内化，供体不再参与同胞外介质中存在的受体的DEFET。在存在拮抗剂EDA9、且所述EDA9与加压素竞争同受体结合的情况下，V2受体的活化较弱，因而内化作用较弱；因此，供体参与同溶液中的受体的DEFET，因而，与不存在EDA9的情况相比，其发光减弱。

因此，该实施例显示：本发明所述的方法使检测受体的内化作用成为可能，使得本方法不仅可以证明该受体的激动剂化合物，还可以证明其拮抗剂化合物。

实施例4：CXCR7趋化因子受体内化的检测

该实施例涉及CXCR7受体内化的检测，所述内化作用由该受体的激动剂之一SDF-1(“基质细胞衍生因子1”分子的首字母缩写)的作用引起。完成该实施例的方案与实施例2中的方案类似。

所用试剂及步骤与实施例2中的试剂和步骤相同，只是用FLAG-ST-CXCR7质粒(SEQ ID No.6)替代了FLAG-ST-V2质粒，并用SDF-1(Laboratoire Pasteur，巴黎)替代了加压素。

结果及讨论

图6表示供体信号(620nm下测得)与受体信号(520nm下测得)的比值随SDF-1浓度的变化。所述比值可以消除孔间变动。此外，为了使该图表现度更好，将该比值乘以10000。

图6清楚地显示了SDF-1浓度的增加引起所述比值增加，反映出供体化合物的发光增强。

因此，该实施例显示，供体化合物信号的增强(对应于DEFET的减弱)以及在激动剂SDF-1存在的情况下CXCR7受体发生内化之间具有极高的关联度。该实施例同样支持了下述事实：本发明所述的方法能够归纳到所有活化后引起内化的受体。

实施例5：β2-肾上腺素能受体内化的检测

该实施例与实施例2类似，但关注的是β2-肾上腺素能受体内化作用的检测，所述内化由该受体的激动剂之一异丙肾上腺素的作用引起。

所用试剂及过程与实施例2中的试剂及过程相同，只是用FLAG-ST-β2AR(SEQ ID No.7)替代了FLAG-ST-V2质粒，并用异丙肾上腺素(Tocris)替代了加压素。

结果及讨论

图7表示供体信号(620nm处测得)与受体信号(520nm处测得)的比值随异丙肾上腺素浓度的变化。所述比值使得可以消除孔间变动。此外，为了使该图表现度更好，将该比值乘以10000。

图7清楚地显示了异丙肾上腺素浓度的增加引起所述比值增加，反映出供体化合物的发光增强。

因此，该实施例显示，供体化合物信号的增强(对应于DEFET的减弱)以及在异丙肾上腺素存在的情况下β2-肾上腺素能受体发生内化之间具有极高的关联度。该实施例同样支持了下述事实：本发明所述的方法能够归纳到所有活化后引起内化的受体。

Claims

1.一种对目标跨膜蛋白的内化进行检测的方法，所述跨膜蛋白在细胞表面表达，所述方法包括以下步骤：

a)用含有镧系元素或钌的荧光金属复合物标记所述目标蛋白，所述荧光金属复合物的寿命大于0.1ms；

b)向反应介质中加入能够引起所述目标蛋白内化的化合物；

c)向反应介质中加入调节剂，所述调节剂选自：

1.与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度大于10^-7M，所述FRET受体化合物的分子量小于50kD；

2.还原剂，其氧化还原电位小于+0.1V；

3.与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂；

d)当所述化合物是荧光受体化合物时，在所述荧光金属复合物的发射波长和/或所述调节化合物的发射波长下，测定所述反应介质所发出的光；

e)将步骤d)中测定的信号与仅经历步骤a)和c)的细胞上测定的参比信号进行比较，步骤d)中测定的信号与所述参比信号的差别表示所述目标蛋白的内化。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤按照a)、b)、c)、d)、e)的顺序实施。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调节剂为FRET受体化合物或还原剂；其特征还在于，所述步骤按照a)、c)、b)、d)、e)的顺序实施。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在步骤a)及下一个步骤之间包括清洗步骤。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物的寿命为0.5-6ms。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是：

a)镧系元素复合物，其中，所述镧系元素选自铕、铽、钕、钐及镝；或

b)钌复合物。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是镧系元素螯合物或镧系元素穴状化合物。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含：(i)2-9个选自N、O及S的电子供体杂原子，这些原子与所述镧系元素或钌形成配位键；以及(ii)一个或多个含有芳香结构的生色团，所述芳香结构包含1、2或3个选自N和O的杂原子，所述杂原子起到镧系元素配位原子或钌配位原子的作用。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是与所述荧光金属复合物相配的荧光FRET受体化合物或非荧光FRET受体化合物，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度大于10^-7M，所述FRET受体化合物的分子量小于50kD。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述FRET受体化合物在所述反应介质中的终浓度为10^-6M至10^-3M，以及所述FRET受体化合物的分子量为0.1-10kD。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的荧光受体化合物：花青苷衍生物、DY647、D2、Cy5、Cy5-COOH、荧光素、香豆素、罗丹明、carbopyronine、噁嗪及噁嗪类似物、Alexa Fluor荧光团、结晶紫、苝酰亚胺荧光团、方酸菁荧光团、硼-二吡咯甲烯基衍生物、NBD(硝基苯并噁二唑)及NBD衍生物、DABCYL(4-((4-(二甲氨基)苯基)偶氮)苯甲酸)。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的荧光受体化合物：荧光素及其衍生物；以及花青苷衍生物。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节剂是选自以下化合物的非荧光受体化合物：QXL 570、QXL 610、QXL 670及QXL 680；DYQ660及DYQ661；QSY7、QSY9及QSY21。

14.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是选自以下化合物的还原剂：碘离子；抗坏血酸根；尿酸根；儿茶酚离子；无机化合物，如Fe(CN)₆ ²⁺。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述调节剂是还原剂；其特征还在于，步骤a)包括加入第一荧光金属复合物以及加入第二荧光金属复合物，所述荧光金属复合物具有相同的螯合结构，但与不同的金属进行络合。

16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一金属复合物是铕复合物，所述第二金属复合物是铽复合物，所述的铽复合物及铕复合物具有相同的螯合结构。

17.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是与所述荧光金属复合物通过非共价的键合作用特异性结合的试剂，所述调节化合物选自以下化合物：抗体、抗体片段、肽或适体；上述每种化合物都具有与荧光金属复合物结合的域。

18.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述调节化合物是金属离子，所述金属离子与镧系元素或钌竞争以形成非荧光金属复合物。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述离子是锰离子。

20.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，用所述荧光金属复合物对所述目标蛋白进行的标记是通过结合伴侣对进行的间接标记，所述结合伴侣对的成员之一与所述荧光金属复合物共价缀合，另一个成员与所述目标蛋白共价缀合或天然存在于所述目标蛋白之上。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述结合伴侣对选自以下的对：序列CCXXCC/双砷化合物，所述序列CCXXCC为SEQ ID No.1，其中C＝半胱氨酸，X＝任意氨基酸；BTX肽/环蛇毒素；链霉亲和素/生物素，或亲和素/生物素；eDHFR片段/三甲氧苄二氨嘧啶；标签/标签抗体；目标蛋白的已知配体/目标蛋白。

22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物与标签抗体共价键合，所述标签抗体选自：所述目标蛋白的特异性抗体；标签的特异性抗体，所述标签选自GST、6HIS、Myc、FLAG及HA；其特征还在于，所述目标蛋白含有相应的标签。

23.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，用所述荧光金属复合物对所述目标蛋白进行的标记是通过共价键进行的直接标记。

24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物与自杀酶的底物缀合；其特征还在于，所述目标蛋白以融合蛋白的形式表达，所述融合蛋白的胞外部分含有所述自杀酶。

25.如权利要求24所述的方法，其特征在于，所述自杀酶/自杀酶底物对选自以下的对：烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体/苄基鸟嘌呤；烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体/苄基胞嘧啶；脱卤素酶突变体/氯烷烃；在磷酸泛酰巯基乙胺转移酶存在的情况下，酰基载体蛋白/辅酶A。

26.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含第一反应基团，所述第一反应基团能够与所述目标蛋白上存在的第二反应基团形成共价键，尤其是与以下第二反应基团形成共价键：末端氨基、末端羧基、天冬氨酸的羧基及谷氨酸的羧基、赖氨酸的胺基、精氨酸的胍基、半胱氨酸的巯基、酪氨酸的酚基、色氨酸的吲哚环、蛋氨酸的硫醚基团、组氨酸的咪唑基团。

27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物包含马来酰亚胺基，所述马来酰亚胺基用于与所述目标蛋白的巯基进行反应。

28.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶或它们的衍生物之一；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达。

29.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达；其特征还在于，所述调节化合物是花青苷衍生物，尤其是Cy5或Cy5-COOH。

30.如权利要求1-19所述的方法，其特征在于，所述荧光金属复合物是铕穴状化合物或铽穴状化合物，所述铕穴状化合物或铽穴状化合物共价键合至苄基鸟嘌呤或苄基胞嘧啶；其特征还在于，所述目标蛋白以与烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶突变体形成融合蛋白的形式表达；其特征还在于，所述调节化合物是荧光素或荧光素衍生物之一。

31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白选自：G-蛋白偶联受体及受体酪氨酸激酶。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括下述预备步骤：用包含编码所述目标蛋白的DNA序列的表达载体转染细胞。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述表达载体包含编码融合蛋白的序列，所述融合蛋白的N端部分包含自杀酶，所述融合蛋白的C端部分包含所述目标蛋白；其特征还在于，所述目标蛋白是GPCR或RTK。

34.如权利要求32或33所述的方法，其特征在于，所述转染步骤还包括：将包含编码β-视紫红质抑制蛋白1的DNA序列的载体进行共转染。