CN107328746A - 基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用 - Google Patents

基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用。具体步骤如下：(1)依次移取AgNO3的溶液，CoA溶液，磷酸缓冲溶液于PCR管中，在恒温磁力搅拌机上震荡反应。便得到CoA‑Ag(I)CP；(2)向(1)中加入SYBR Green II(1∶100)，室温下避光孵育。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度；(3)不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化；(4)不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化；(5)不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。

Description

基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及 应用
技术领域
本发明涉及荧光生物传感器，尤其是涉及基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用。
背景技术
抗坏血酸(Ascorbic acid，AA，又叫维生素C)，存在于水果和蔬菜，在人类和动物体中是一种重要的不可缺少的微量元素。抗坏血酸是一种氧化剂、自由基清除剂，是脑系统最重要的神经化学物质之一，也是药物治疗坏血病、药物中毒、肝脏疾病、过敏反应和动脉硬化的重要物质，它有助于促进细胞健康发展和组织正常生长。抗坏血酸的缺乏会导致坏血病，但是过多的抗坏血酸摄入可能会导致尿道结石、腹泻、胃痉挛等疾病。在临床上，抗坏血酸用于预防和治疗常见的感冒、精神疾病、不孕不育和冠心病，在淤血化验和诊断中快速、准确、选择性的检测抗坏血酸含量是非常重要的。
L-半胱氨酸(L-Cys)，一种生物体内常见的氨基酸。动物体内可经由蛋氨酸和丝氨酸合成。其结构中含有非常活泼的巯基(-SH)，半胱氨酸的巯基能与各种金属离子以R-S-M-S-R的方式形成稳定程度不同的配位聚合物。L-Cys是一种氨基酸类解毒药，它参与细胞的还原过程和肝脏内的磷脂代谢，有保护肝细胞不受损害，促进肝脏功能恢复和旺盛的药理效应。半胱氨酸也是一种还原剂，它可以减少混合所需的时间和所需药用的能量。
谷胱甘肽(GSH)是一种含γ-酰胺键和巯基的三肽，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成。存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用，半胱氨酸上的巯基为其活性基团，易与某些药物、毒素等结合，而具有整合解毒作用。能帮助保持正常的免疫系统。谷胱甘肽具有广谱解毒作用，不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。
一价币族巯基-金属配位聚合物是通过一价币族金属之间的金属-金属相互作用形成的一类纳米材料，早在60年前人们就已经将巯基-Ag(I)配位聚合物当成治疗类风湿关节炎的药物。因为巯基-Ag(I)配位聚合物这种二元系统具有独特的链状结构和特殊的性质，巯基-Ag(I)配位聚合物被广泛地研究，比如合成多用途的化合物、材料、功能化的薄片以及纳米结构粒子等。以往的报道中，含有巯基配体，如半胱氨酸、巯基丁氨酸、谷胱甘肽等可以作为合成类蛋白结构的巯基-Ag(I)配位聚合物。而且近年来研究者们对于巯基-Ag(I)配位聚合物的研究主要集中在巯基-Ag(I)配位聚合物结构特点的探究和影响因素上，而对巯基-Ag(I)配位聚合物作为荧光传感方面的性质研究十分有限。
辅酶A(CoA)作为一种含有巯基的生物小分子，在生物体的新陈代谢中起到重要的作用，它是生物体中一种重要的辅酶，同时也是一些生物酶如乙酰转移酶、柠檬酸合成酶的重要反应产物。我们发现CoA的结构中两端的重要功能基团：一个是腺嘌呤结构，另一个是巯基基团。如果能够同时利用CoA两端的两个功能基团进行生物化学检测，势必会增加其检测的特异性以及选择性，这种特殊的结构使得CoA有可能成为生物化学相关研究领域的重要物质，因此，可采用其作为配体，利用CoA相比于其它巯基小分子物质的独特的结构和优势，与币族金属离子形成类核酸配位聚合物，与核酸染料结合，进一步用于新型荧光生物传感器的开发。
本发明依据辅酶A与硝酸银形成类核酸配位聚合物(简写为CoA-Ag(I)CP)，嵌入核酸染料后有较的强荧光信号产生，抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽对嵌入核酸染料的聚合物荧光猝灭作用的原理，构建一种简单、高灵敏、快速的分析传感方法，用于分别检测抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光传感方法。该传感器特异性好、过程极其简单，为临床应用提供了一种很有前景的辨别手段。目前，基于CoA-Ag(I)CP与核酸染料SYBR Green II(SGII)结合的荧光生物传感器研究及利用嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭现象检测抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的相关报道也未见。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠的基于嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭现象分别检测抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的荧光生物传感方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用。
具体步骤如下：
(1)CoA-Ag(I)CP的制备
依次移取5.0～15.0μL浓度为50～100μM的AgNO3的溶液，5.0～15.0μL浓度为80～100μM的CoA溶液，70.0～90.0μL浓度为5～15mM pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在25～37℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约5～15min。便得到CoA-Ag(I)CP。
(2)荧光生物传感器的制备
向(1)中加入1～3μL SGII(1∶100)，室温下避光孵育10～30min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度。
(3)抗坏血酸的检测
不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(4)半胱氨酸的检测
不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(5)谷胱甘肽的检测
不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
利用上述基于嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭检测抗坏血酸、半胱氨酸及谷胱甘肽，利用荧光分析，荧光扫描在514-700nm范围内，激发波长是494nm，狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，扫描电压是700V，检测不同浓度的物质对嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭作用，获得一系列不同浓度目标物质对应的荧光强度大小，建立荧光强度大小F与目标物质浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中目标物质的浓度。
发明原理：本发明是一种荧光生物传感器，利用一种一端含有巯基，另一端有类腺嘌呤结构的化合物辅酶A作为合成巯基-Ag(I)配位聚合物的配体，辅酶A上的巯基与Ag(I)通过Ag-S键连接，被拉近的相邻两个Ag(I)之间发生金属间作用而形成CoA-Ag(I)CP。CoA-Ag(I)CP与核酸染料SGII结合发出较强的荧光，抗坏血酸、半胱氨酸及谷胱甘肽能够猝灭嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP所发出的荧光。不同浓度的这三种物质对嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP荧光的猝灭作用不同，在一定浓度范围内呈线性关系，可分别实现对这三种物质的检测。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了一种基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器检测抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽。首先，在室温下简单快速合成CoA-Ag(I)CP。其次，CoA-Ag(I)CP与核酸染料SGII结合，发出较强的荧光信号。随后，向该体系加入不同浓度的抗坏血酸或半胱氨酸或谷胱甘肽，记录不同浓度目标物质对应的荧光强度变化。其优点在于：
(1)高灵敏度。实验得出抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽在一定浓度范围内与嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP所发出荧光强度之间呈现良好的线性关系，分别为：
抗坏血酸：线性方程：F＝7469-6CAA，线性相关系数：R2＝0.9987；
半胱氨酸：线性方程：F＝7543-108CL-Cys，线性相关系数：R2＝0.9986；
谷胱甘肽：线性方程：F＝7458-60CGSH，线性相关系数：R2＝0.9938。
这些结果表明，曲线均具有很好的拟合度，我们组建的传感器对这三种物质的检测具有较高的灵敏度。
(2)结果准确。在体积比为10％的尿液和10％的血清环境中，回收率均在90％～105％之间。
(3)制备方法试剂用量少、反应速度快、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对三种物质的高灵敏检测。
综上所述，本发明是基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器，用于抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的检测，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现低浓度物质的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为本发明传感器的可行性实验图；
图2为本发明传感器对不同浓度抗坏血酸检测的荧光响应和校准曲线图；
图3为本发明传感器对不同浓度半胱氨酸检测的荧光响应和校准曲线图；
图4为本发明传感器对不同浓度谷胱甘肽检测的荧光响应和校准曲线图；
图5为本发明传感器对抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的选择性检测图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用，具体步骤如下：
(1)CoA-Ag(I)CP的制备
依次移取10.0μL浓度为100μM的AgNO3的溶液，10.0μL浓度为100μM的CoA溶液，80.0μL浓度为10mM pH为7.4的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在30℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约15min。便得到CoA-Ag(I)CP。
(2)荧光生物传感器的制备
向(1)中加入2μL SYBR Green II(1∶100)，室温下避光孵育10min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度。
(3)抗坏血酸的检测
不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育0min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(4)半胱氨酸的检测
不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育0min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(5)谷胱甘肽的检测
不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育0min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
实施例2
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用，具体步骤如下：
(1)CoA-Ag(I)CP的制备
依次移取5.0μL浓度为80μM的AgNO3的溶液，6.0μL浓度为80μM的CoA溶液，81.0μL浓度为8mM pH为7.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在37℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约10min。便得到CoA-Ag(I)CP。
(2)荧光生物传感器的制备
向(1)中加入1μL SYBR Green II(1∶100)，室温下避光孵育15min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度。
(3)抗坏血酸的检测
不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育4min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(4)半胱氨酸的检测
不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育2min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(5)谷胱甘肽的检测
不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育1min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
实施例3
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用，具体步骤如下：
(1)CoA-Ag(I)CP的制备
依次移取8.0μL浓度为90μM的AgNO3的溶液，12.0μL浓度为85μM的CoA溶液，80.0μL浓度为9mM pH为6.8的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在32℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约14min。便得到CoA-Ag(I)CP。
(2)荧光生物传感器的制备
向(1)中加入2.2μL SYBR Green II(1∶100)，室温下避光孵育18min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度。
(3)抗坏血酸的检测
不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育3min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(4)半胱氨酸的检测
不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育1min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(5)谷胱甘肽的检测
不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育4min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
二、可行性实验
具体实施示例1，将按上述步骤得到嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP在Hitachi F-4600荧光分光光度计上进行荧光光谱检测，同时进行空白实验：
100μL 10mM的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)+2μL SYBR Green II(1∶100)；
10μL 1mM的AgNO3溶液+90μL 10mM的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)+2μL SYBR Green II(1∶100)；
10μL 1mM的CoA溶液+90μL 10mM的磷酸缓冲溶液(pH 7.4)+2μL SYBR Green II(1∶100)。
对比空白实验与嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光光谱发现，嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP在波长530nm处有极高的荧光发射强度信号，这一点充分说明了聚合物的类核酸结构。证明我们提出的方案可行。
三、荧光传感器检测抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的应用
1、利用上述具体实施例1制备的荧光生物传感器检测抗坏血酸
利用荧光分析，设置狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测体系荧光强度对不同浓度抗坏血酸的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中抗坏血酸的浓度(具体实施示例1)。图2在530nm处CoA-Ag(I)CP与SGII构成的传感器的荧光强度随抗坏血酸浓度的增大而减弱。传感器荧光强度对抗坏血酸浓度的线性相关方程F＝7469-6CAA，R2＝0.9987。根据S/N＝3计算得知，检测限为3nM。说明传感器对抗坏血酸可实现高灵敏度检测。
2、利用上述具体实施例1制备的荧光生物传感器检测半胱氨酸
利用荧光分析，设置狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测体系荧光强度对不同浓度半胱氨酸的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中半胱氨酸的浓度(具体实施示例1)。图3在530nm处CoA-Ag(I)CP与SGII构成的传感器的荧光强度随半胱氨酸浓度的增大而减弱。传感器荧光强度对半胱氨酸浓度的线性相关方程F＝7543-108CL-Cys，R2＝0.9986。根据S/N＝3计算得知，检测限为0.1nM。说明传感器对半胱氨酸可实现高灵敏度检测。
3、利用上述具体实施例1制备的荧光生物传感器检测谷胱甘肽
利用荧光分析，设置狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测体系荧光强度对不同浓度谷胱甘肽的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中谷胱甘肽的浓度(具体实施示例1)。图4在530nm处CoA-Ag(I)CP与SGII构成的传感器的荧光强度随谷胱甘肽浓度的增大而减弱。传感器荧光强度对谷胱甘肽浓度的线性相关方程F＝7458-60CGSH，R2＝0.9938。根据S/N＝3计算得知，检测限为0.01nM。说明传感器对谷胱甘肽可实现高灵敏度检测。
4、选择性实验
选择性实验如图5所示，利用荧光分析，设置狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，上述具体实施例1制备的CoA-Ag(I)CP体系分别检测1200μM抗坏血酸(AA)、70μM半胱氨酸(L-Cys)、120μM谷胱甘肽(GSH)、100μM无机物质(如：NaCl、KCl)、100μM生物小分子(如：尿酸(UA)、三磷酸腺苷(ATP)、100μM氨基酸(如：甘氨酸(Gly)、赖氨酸(L-Lys))和β-环糊精(CD)。如图，与抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽对比，传感器对其他物质的响应非常小，基本接近空白信号，说明传感器对抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽的检测有很好的选择性。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用，其特征如下：
(1)CoA-Ag(I)CP的制备
依次移取5.0～15.0μL浓度为50～100μM的AgNO3的溶液，5.0～15.0μL浓度为80～100μM的CoA溶液，70.0～90.0μL浓度为5～15mM pH为5.0～8.0的磷酸缓冲溶液于PCR管中，在25～37℃恒温磁力搅拌机上震荡反应约5～15min。便得到CoA-Ag(I)CP。
(2)荧光生物传感器的制备
向(1)中加入1～3μL SGII(1∶100)，室温下避光孵育10～30min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度。
(3)抗坏血酸的检测
不同浓度的抗坏血酸加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(4)半胱氨酸的检测
不同浓度的半胱氨酸加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
(5)谷胱甘肽的检测
不同浓度的谷胱甘肽加入到(2)中，室温下避光孵育0～5min。在激发波长494nm处扫描，检测体系的荧光强度变化。
利用上述基于嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭检测抗坏血酸、半胱氨酸及谷胱甘肽，利用荧光分析，荧光扫描在514-700nm范围内，激发波长是494nm，狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，扫描电压是700V，检测不同浓度的物质对嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光猝灭作用，获得一系列不同浓度物质对应嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光强度大小，建立荧光强度大小F与物质浓度之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中物质的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于类核酸配位聚合物的多功能荧光生物传感器的制备及应用，其特征在于：可实现抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽三种物质的荧光分析传感检测。
3.一种利用权利要求1-(3)中所述的一种检测抗坏血酸的荧光传感方法，其特征在于：狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光强度对不同浓度抗坏血酸的定量关系，确定待测样品中抗坏血酸的含量。
4.一种利用权利要求1-(4)中所述的一种检测半胱氨酸的荧光传感方法，其特征在于：狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光强度对不同浓度半胱氨酸的定量关系，确定待测样品中半胱氨酸的含量。
5.一种利用权利要求1-(5)中所述的一种检测谷胱甘肽的荧光传感方法，其特征在于：狭缝宽度为：激发10nm和发射10nm，激发波长是494nm，扫描电压是700V，检测嵌入SGII的CoA-Ag(I)CP的荧光强度对不同浓度谷胱甘肽的定量关系，确定待测样品中谷胱甘肽的含量。
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