CN102175747A

CN102175747A - 研究dna与蛋白质相互作用的方法

Info

Publication number: CN102175747A
Application number: CN2010106109349A
Authority: CN
Inventors: 王荣; 张爱梅; 谢华; 贾正平; 孙坤
Original assignee: 王荣
Priority date: 2010-12-29
Filing date: 2010-12-29
Publication date: 2011-09-07

Abstract

本发明公开了研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括毛细管柱的修饰、DNA和蛋白质的共同孵育及标记以及运用毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)检测，最终确定分离条件；本发明的优点在于：具有筛分介质浓度调节简便、荧光标记方法简单、分离效果好、电泳过程试剂消耗量小、电泳时间短，可在30min内完成、检测效率高、分离效果好等优点，具有一定的实际应用价值。

Description

研究DNA与蛋白质相互作用的方法

技术领域

本发明涉及DNA与蛋白质的相互作用，具体地说是一种研究DNA与蛋白质相互作用的方法，属于分子生物学方法学领域。

背景技术

在细胞的生命活动过程中，DNA的复制与重组、RNA的转录与修饰，以及病毒的感染与增殖等等，都是涉及到特定的DNA区段与特殊蛋白质结合因子之间的相互作用。因此，长期以来人们就一直关注DNA结合蛋白的研究。蛋白质与DNA的相互作用也是分子生物学研究的中心问题之一。核酸-蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用，二者的协作是各种生命现象的基础。将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来，是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容。

常规的研究DNA与蛋白质相互作用的方法主要包括凝胶阻滞试验(gelretardation assay)、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)、甲基化干扰试验、酵母单杂交技术和噬菌体展示技术等等。

凝胶阻滞试验(gel retardation assay)是用于研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的重要实验技术之一。在凝胶实验中，传统的方法是用放射性同位素或其他生物素标记待检测的DNA片段(又称探针DNA probe)然后与细胞蛋白质提取物一道温育，于是便形成了DNA蛋白质复合物。将其移入非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，控制蛋白质与探针保持结合状态，电泳分离，最后借助放射性自显影技术(或其它适当技术)显现DNA条带位置。然而，此方法制胶过程繁琐，电泳时间长。

DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay)是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。该方法需对DNA进行单链标记，操作复杂，需要专门的检测手段。

甲基化干扰试验根据DMS能使G残基甲基化，而六氢吡啶又能够特异切割甲基化的G残基这一原理而设计。其操作结束后也需要做凝胶阻滞试验，因而操作比较繁琐。

酵母单杂交技术广泛用于DNA与蛋白相互作用的研究，但其基本操作需要三个方面的过程，涉及分子生物学的大量方法，需要酵母菌作为载体。

噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲选择相结合的技术，核酸适体技术首先是利用现有的分子生物学技术人工合成一个含有10¹⁴～10¹⁵个单链寡核苷酸序列的随机文库，体内足迹试验原理与甲基化试验基本相同，其实质是体外甲基化试验的变种，免疫沉淀技术操作步骤更加繁琐，

因此，以上常用的研究DNA与蛋白质相互作用的方法都有一定的局限性，不能全面反映DNA与蛋白质相互作用的真实情况。

发明内容

为了解决上述问题，本发明设计了一种研究DNA与蛋白质相互作用的方法，该方法是基于毛细管电泳的原理来进行的，具有筛分介质浓度调节简便、荧光标记方法简单、分离效果好、电泳过程试剂消耗量小、电泳时间短(30min内完成)、检测效率高、分离效果好等优点，具有一定的实际应用价值。

本发明的技术方案为，研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括以下步骤：

(1)毛细管柱的修饰，

取适当长度的石英毛细管，用NaOH清洗，再分别用水、甲醇、空气冲洗；然后用MAPS-甲醇冲洗毛细管，20～28℃反应8～16h后，用甲醇、水、空气各冲洗毛细管，再用丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管，20～28℃反应3～5h后，用水冲洗，即可使用；以上反应均在20～28℃下进行；

(2)DNA和蛋白质的共同孵育及标记，

取DNA Marker(pUC19 DNA/Msp I DNA Marker)和宽分子量蛋白Marker(Protein Molecular Weight Marker D532S)，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育结束后加核酸染料SYBR Green I标记，取标记混合物进行CE-LIF检测；以上反应在25～35℃进行；

(3)毛细管电泳检测，

冲洗毛细管，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质溶液，进行毛细管电泳，CE-LIF检测，10s负极电动进样，数据处理软件采集数据；CE-LIF检测在15℃进行；

a)选择聚氧化乙烯浓度，重量体积比浓度w/v分别为：0.05％、0.1％、0.5％、1.5％、2.5％、3.0％六个浓度梯度；

b)选择温度，温度选择为15℃和20℃两个温度梯度；

c)选择电压，选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压梯度；

d)选择pH值，选择为6.0、7.0、7.5、8.3、9.0和10.0六个pH值梯度；

(4)确定分离条件通过优化得到CE用于DNA-蛋白Marker相互作用的研究时的分离条件：PEO的浓度为0.1％、电泳温度为15℃、分离电压为15kV和缓冲液pH值9.0。

本发明的研究研究DNA与蛋白质相互作用的方法是用无胶筛分毛细管电泳-激光诱导荧光检测(NGS-CE-LIF)DNA-蛋白质相互作用，以核酸染料SYBR GreenI为荧光标记物，氩离子激光器(λex＝488nm，λem＝520nm)检测，研究DNA-蛋白质的相互作用。运用CE-LIF分别检测DNA Marker、蛋白Marker和DNA-蛋白质共孵育后产物，毛细管电泳图分别见图1、图2和图3。

本发明的优点在于：

1、筛分介质浓度调节简便，可选择筛分介质聚环氧化乙烷(PEO)重量体积比浓度w/v为0.05％～3.0％六个浓度梯度；

2、荧光标记方法简单，直接将核酸染料与DNA共同孵育进行标记，孵育温度为25～35℃；

3、电泳过程试剂消耗量小，可nL级进样；

4、电泳时间短，可在30min内完成；

5、分离效果好，所有被分离物均可得到基线分离；

6、检测效率高，具有一定的实际应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例的CE-LIF检测DNA Marker电泳图。

图2为本发明实施例的CE-LIF检测蛋白Marker电泳图。

图3为本发明实施例的CE-LIF检测DNA和蛋白质共同作用的电泳图。

具体实施方式

以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

研究DNA与蛋白质相互作用的方法，包括以下步骤：

1.毛细管柱的修饰

为减小电泳过程中电渗流(EOF)对分离的影响，对毛细管内壁进行修饰，取适当长度的石英毛细管(约3～4次使用)，用0.2mol/L氢氧化钠(NaOH)清洗1h，再分别用水、甲醇、空气各冲洗15min；然后用MAPS-甲醇1∶1(v/v)冲洗毛细管1h，室温反应过夜；第二天先分别用甲醇、水、空气各冲洗毛细管15min，再用3.4％(w/v)丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管1h，室温反应4h后，用水冲洗20min，即可使用。

所用到的试剂及仪器主要有：NaOH，甲醇，γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)(A Johson Matthey公司)，丙烯酰胺，石英毛细管柱(河北永年光导纤维厂)。

以上反应均在室温下进行。

2.DNA和蛋白质的共同孵育及标记

取10μL pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)DNA Marker和1μL Protein MolecularWeight Marker(Broad)D532S，加入14μL 1×TBE 30℃共同孵育4h，孵育结束后加入5μL 10×SYBR Green I标记30min，取标记混合物进行CE检测。

所用到的试剂及仪器主要有：DNA Marker(pUC19 DNA/Msp I(Hpa II)DNAMarker(26bp；34bp；34bp；67bp；110，111bp；147bp；190bp；242bp；331bp；404bp；489bp；501bp))(上海生物工程技术有限公司)；宽分子量蛋白Marker(Protein Molecular Weight Marker D532S(6.5～200KDa，6.5、14.3、20.1、29、44.287、66.409、97.2、116、200KDa))(TaKaRa)；1×TBE(三羟甲基氨基甲烷(Tris，上海山浦化工有限公司)，硼酸(Boric acid)(北京鼎国生物技术有限责任公司)，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)(北京鼎国生物技术有限责任公司))；核酸染料SYBR Green I(厦门百维信公司)。PHS-3C型酸度计(上海雷磁仪器厂)；AE240型电子天平(Mettler，瑞士)；磁力搅拌器(深圳天南海北实业有限公司)。

反应在30℃进行。

3.毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)检测

涂层毛细管柱长37cm×75μm，有效长度27cm，使用前以水和1×TBE(pH9.0)分别冲洗5min，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质聚环氧乙烷(poly(ethylene oxide)，PEO)溶液，以1×TBE(pH9.0)做缓冲液进行毛细管电泳，CE-LIF检测(λex＝488nm，λem＝520nm)，10s负极电动进样，P/ACESystem station数据处理软件采集数据。

所用到的试剂及仪器主要有：P/ACE System 5000型毛细管电泳仪、P/ACESystem 5000 station数据处理软件、P/ACE Systemlaser module 488nm激光发射器(美国Beckman)；聚氧化乙烯(PEO，Mr＝300000)(A Johson Matthey公司)

CE-LIF检测在15℃进行。

3.1PEO浓度将PEO固体溶于TBE中，配制成浓度从0.05％～3.0％(w/v)的筛分介质，经0.22μm的水性滤膜过滤和超声脱气后备用。在分离电压15kV、温度15℃、pH值为9.0时，考察不同浓度PEO(0.05％、0.1％、0.5％、1.5％、2.5％、3.0％)对DNA-Protein Marker的分离效果。选择0.1％为PEO最佳分离浓度。

3.2温度实验中当温度选择为15℃和20℃，研究二者的相互作用本质，但温度继续升高时，电泳峰数目减少，分离时间缩短。且温度过高会导致较大电流波动，最终确定分离温度15℃(仪器控制最低值)为实验的适宜温度。选择15℃为最佳分离温度。

3.3电压电压主要影响分离的效率及效果，实验选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压进行。综合考虑迁移时间以及分离效果，选择15kV为最佳分离电压。

3.4pH值缓冲液的pH值是CE分离成败的主要因素，在研究DNA-蛋白质相互作用的实际应用过程中，对影响分离效果的pH值进行了优化选择。pH选择为6.0、7.0、7.5、8.3、9.0和10.0时，分别进行DNA-蛋白质相互作用混合物的分离，当pH选择为9.0时样品得到基线分离，故选择分离条件较好的缓冲液的pH值为9.0。

3.5最佳分离条件通过优化得到CE用于DNA-Protein Marker相互作用的研究时的最佳分离条件：PEO的浓度为0.1％、电泳温度为15℃、分离电压为15kV和缓冲液pH值9.0。运用CE-LIF分别检测DNA Marker、蛋白Marker和DNA-蛋白质共孵育后产物，毛细管电泳图分别见图1、图2和图3。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)毛细管柱的修饰

取适当长度的石英毛细管，用氢氧化钠(NaOH)清洗，再分别用水、甲醇、空气冲洗；然后用γ-甲基丙烯酰基-三(甲氧基)硅烷(MAPS)-甲醇冲洗毛细管，20～28℃反应8～16h后，用甲醇、水、空气各冲洗毛细管，再用丙烯酰胺单体溶液冲洗毛细管，20～28℃反应3～5h后，用水冲洗，即可使用；以上反应均在20～28℃下进行；

(2)DNA和蛋白质的共同孵育及标记

取DNA Marker和宽分子量蛋白Marker，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育结束后加核酸染料标记，然后取标记混合物进行CE-LIF检测；以上反应在25～35℃进行；

(3)毛细管电泳检测

冲洗毛细管，再用毛细管电泳仪压力系统自动填充筛分介质聚环氧化乙烷(PEO)溶液，进行毛细管电泳激光诱导荧光(CE-LIF)检测，10s负极电动进样，数据处理软件采集数据；

b)选择温度，温度选择为15℃和20℃两个温度梯度；

c)选择电压，选择10kV、15kV、20kV和25kV四个电压梯度；

d)选择pH值，选择为6.0、7.0、7.5、8.3、9.0和10.0六个pH值梯度；

(4)确定分离条件通过优化得到CE用于DNA-Protein Marker相互作用的研究时的分离条件：PEO的浓度为0.1％、电泳温度为15℃、分离电压为15kV和缓冲液pH值9.0。

2.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的DNA Marker为pUC19DNA/Msp I DNA Marker；所述的宽分子量蛋白Marker为Protein Molecular Weight Marker D532S。

3.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(2)中的核酸染料为SYBR Green I，且在加入三羟甲基氨基甲烷后共同孵育。

4.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(2)中取DNA Marker和宽分子量蛋白Marker，加入三羟甲基氨基甲烷共同孵育，孵育温度为25～35℃。

5.根据权利要求1所述的研究DNA与蛋白质相互作用的方法，其特征在于所述的步骤(3)中的采用毛细管电泳激光诱导荧光方法检测DNA与蛋白质共同孵育产物。