CN105483155A - 一种检测3′非翻译区对mRNA翻译效率的作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在细胞中通过双荧光报告系统同时对转录本和蛋白产量进行定量，来检测3’非翻译区(3ˊUTR)对mRNA翻译效率的作用的方法，属于分子生物学领域。本发明构建了一种的双荧光报告基因载体，在荧光蛋白编码区后插入一种编码可发荧光的RNA分子的序列，然后将所研究的3ˊUTR序列插入二者中间，将重组载体瞬时转染细胞，在成像培养基中同时对转录本和蛋白质表达量进行荧光定量分析，通过对比荧光强度来判断3’UTR对翻译效率的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种在细胞中研究3’UTR对mRNA翻译效率的作用的方法。
背景技术
可选择性多聚腺苷酸化(alternativepolyadenylation,APA)在基因表达调控中起着重要的作用。位于终止密码子下游的APA可以产生具有不同长度3’UTR的mRNA异构体，而不同长度的3’UTR可以导致顺式调控元件的包含或缺失，这些顺式调控元件包括RNA结合蛋白(RNAbindingprotein,RBP)的结合位点和miRNA结合位点等，从而对mRNA的转运、稳定性、翻译效率等产生影响，进而对表型造成影响。近年来的研究发现，在不同的生理和细胞状态中存在全基因组3’UTR转换现象，包括肿瘤发生和转移、动物发育、免疫应答等。因此，研究APA对基因表达调控的影响，对于揭示与APA相关疾病的致病机理、信号调控网路等具有重要的意义。
目前研究3’UTR长度与翻译效率关系的方法主要有以下两种：(1)运用荧光素酶报告基因载体，将不同长度的3’UTR连接到荧光素酶报告基因载体上，通过检测荧光素酶与底物反应产生的荧光强度来间接反映基因的表达量，从而判断3’UTR长度对翻译效率的影响；(2)多聚核糖体密度梯度离心(polysomeprofiling)结合APA位点高通量测序的方法，通过polysomeprofiling分离翻译效率不同的mRNA转录本，逆转录构建测序文库进行APA位点高通量测序，分析测序数据来研究3’UTR长度与翻译效率的关系。上述的方法都有其局限，均不能同时对mRNA转录本和蛋白产量进行动态定量分析，而基因的表达调控是一个动态的过程，涉及DNA的转录和mRNA的翻译，仅通过最终蛋白的产量或者mRNA上核糖体结合数量不能很好的反映3’UTR长度改变对翻译效率影响的动态过程。近年来发展的RNA体内荧光标记技术，有望为动态研究3’UTR长度与翻译效率关系提供更为直观的新方法。
RNA体内荧光标记技术是对传统生物荧光标记技术的发展，传统的生物荧光标记，如绿色荧光蛋白(GFP)，可作为标准化的基因元件应用于对目标蛋白进行荧光标记，可检测基因的表达、目标蛋白的细胞定位等。2011年，来自美国康奈尔大学的研究人员在Science上报道了一种名为Spinach的RNA荧光标记基因，其可在细胞中模仿GFP，将目的基因与Spinach连接，转录出含有Spinach结构的融合RNA在荧光染料DFHBI下发出绿色荧光，从而实现在细胞中对目的基因mRNA转录本进行荧光标记。随着不断改进优化，目前已开发出稳定性更高的RNA荧光标记基因Spinach2和荧光染料DFHBI-1T。将荧光蛋白基因与RNA荧光标记基因联用构建双荧光报告基因载体，连接上不同长度的3’UTR基因片段，可通过荧光同时对mRNA转录本和蛋白产量进行动态测量，为研究3’UTR长度与翻译效率关系带来了新的思路和策略。
发明内容
本发明的目的在于克服现有研究3’UTR与翻译效率关系方法的局限，提供一种通过双荧光报告基因载体动态研究3’UTR对翻译效率的作用的方法，同时本发明还提供了采用所述方法研究3’UTR长度与翻译效率的实例。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案分为以下两个内容：
(1)根据需要选择合适的荧光蛋白载体，对载体进行适当的改造，如在荧光蛋白基因末端插入终止密码子；合成RNA荧光标记基因tRNA-Spinach2或其他编码可发荧光RNA分子的DNA，并将其插入到上述改造的载体中，获得双荧光报告基因载体；
(2)将不同长度的3’UTR插入到双荧光报告基因载体中，瞬时转染细胞，在成像培养基下进行荧光观测，其中绿色荧光的强度代表转录本的量，红色荧光强度代表荧光蛋白的产量，在转录本量相同的情况下，蛋白产量越多，则表明翻译效率越高，以此对荧光强度数据进行标准化处理来判断3’UTR长度与翻译效率的关系。
其中，所述步骤(1)的荧光蛋白载体可选用除绿色荧光蛋白以外的荧光蛋白载体，因为Spinach2/DFHBI-1T复合物激发的是绿色荧光。
本发明的有益效果为：本发明所述的双荧光报告基因研究3’UTR长度与翻译效率关系的方法可通过测定荧光强度动态地对mRNA转录本和蛋白产量进行定量分析，适用于基础生物学研究，尤其适用于对3'UTR表达调控元件的研究。采用所述方法可以更为直观地对APA的功能进行研究，由此方法得到的结果可用于验证polysomeprofiling结合APA位点高通量测序的数据分析结果。
附图说明
图1为本发明所述实例中双荧光报告基因载体pmCS2构建流程
图2为本发明所述实例中双荧光报告基因载体研究3’UTR与翻译效率关系的原理示意图
实施案例：
为了更好地说明本发明的目的、技术方案和有益效果，下面将以构建pmCS2双荧光报告载体的构建过程和具体的研究实例，结合附图对本发明作进一步说明。
一、双荧光报告基因载体pmCS2构建流程
构建过程中，所有合成引物均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；除了标明出处的试剂，其余均为国产分析纯试剂。
T4DNALigase，T4PNK，去磷酸化酶，限制性核酸内切酶BbsⅠ和BglⅡ是NEB公司的产品；LATaqpolymerase，限制性核酸内切酶EcoRⅠ和SalⅠ购自Takara公司；荧光染料DFHBI-1T购自Lucerna公司。
双荧光报告基因载体pmCS2的构建方法包括以下两个步骤：
步骤1.以载体pmCherry-C1为基础，截取BbsⅠ和BglⅡ两个酶切位点的282bp基因片段，设计PCR引物，在mCherry基因下游引物3’末端加入终止密码子TAG进行扩增，分别对pmChrry-C1和PCR产物用BbsⅠ和BglⅡ进行双酶切，将PCR产物连接到载体上，替换原来的282bp基因片段，获得改造的pmCherry-C1载体，具体分为以下4步：
(1)对载体pmCherry-C1BbsⅠ和BglⅡ酶切位点之间的282bp序列进行扩增，PCR引物如下所示：
mCherry-F1:5’-GAAGAAGACCATGGGCTGGGAG-3’
BbsⅠ
mCherry-R1:5’-GATAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’
BglⅡterminator
配制以下PCR反应体系：
PCR循环的反应条件如下：
反应结束后，对PCR产物进行胶回收纯化，回收295bp的片段。
(2)对载体pmCherry-C1和步骤(1)中的PCR胶回收产物进行双酶切，配制以下酶切反应体系：
pmCherry-C1双酶切体系：
混匀反应液，37℃水浴1h。反应结束后，胶回收纯化双酶切载体。
PCR产物双酶切体系：
混匀反应液，37℃水浴20min。反应结束后，用胶回收试剂盒纯化PCR双酶切产物，接着对纯化产物进行磷酸化处理，配制以下反应体系：
混匀反应液，反应条件为：37℃30min，65℃20min。
(3)对步骤(2)的双酶切产物进行连接，在连接反应体系中，载体与连接片段的个数比例为1:5至1:6之间，配制以下混合反应液：
混匀反应液，16℃反应1h。反应结束后，将连接产物转化至感受态DH5α中。
(4)挑取单菌落送至测序公司测序，测序引物用通用引物CMV-F，检验片段序列是否插入终止密码子TAG。检验无误后可将经改造的pmCherry-C1载体转染细胞观察是否正常表达红色荧光蛋白。
步骤2.向经改造的pmCherry-C1载体酶切位点EcoRⅠ和SalⅠ之间插入RNA荧光标记基因tRNA-Spinach2，获得双荧光报告基因载体pmCS2，具体分为以下4步：
(1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成tRNA-Spinach2基因片段，在5’端加入EcoRⅠ酶切位点，在3’端加入SalⅠ酶切位点，序列如下所示：5’-GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCGGTAGAGCAGCGGCCGGATGTAACTGAATGAAATGGTGAAGGACGGGTCCAGTAGGCTGCTTCGGCAGCCTACTTGTTGAGTAGAGTGTGAGCTCCGTAACTAGTTACATCCGGCCGCGGGTCCAGGGTTCAAGTCCCTGTTCGGGCGCCAGTCGAC-3’
最终获得含有tRNA-Spinach2的质粒载体。
(2)用EcoRⅠ和SalⅠ对合成的tRNA-Spinach2基因片段进行双酶切，配制以下反应体系：
并同时配制经改造的载体pmCherry-C1双酶切反应体系：
混匀反应液，37℃水浴过夜酶切。
(3)胶回收纯化步骤(2)中的双酶切产物，并进行连接反应，在连接反应体系中，载体与连接片段的个数比例为1:7，配制以下混合反应液：
混匀反应液，16℃反应2h。应结束后，将连接产物转化至感受态DH5α中。
(4)挑取单菌落送至测序公司测序，测序引物用引物mCherry-F1，检测tRNA-Spinach2的插入情况，检验无误后即构建得双荧光报告基因载体pmCS2。
二、双荧光报告基因系统使用范例
下面将以CTNNBIP1基因为例，介绍如何使用该双荧光报告基因系统。
该基因的两种转录本具有不同长度的3’UTR，首先将其长3’UTR与短3’UTR分别插入到双荧光报告载体中荧光蛋白之后，将重组载体瞬时转染细胞，在成像培养基中同时对转录本和蛋白质表达量进行荧光定量分析，通过对比荧光强度来判断3’UTR长度与翻译效率的关系。
双荧光报告载体pmCS2研究CTNNBIP1基因3’UTR长度与翻译效率的影响包括以下步骤：
步骤1.对CTNNBIP1基因的长3’UTR和短3’UTR进行PCR扩增，两端加上酶切位点，将不同长度的3’UTR片段分别插入pmCS2载体BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点之间，获得pmCS2-3’UTR_L和pmCS2-3’UTR_S载体，具体包括以下4步：
(1)对CTNNBIP1基因的长3’UTR(2393bp)和短3’UTR(581bp)进行扩增，PCR引物如下所示：
上游引物：CTNNBIP1_3’UTR-F:
5’-CATAGATCTCTGCAAAGCCCTTGGAACA-3’
BglⅡ
下游引物：
长3’UTR下游引物CTNNBIP1_3’UTR_L-R:
5’-GCCGAATTCTTTAGTTGAAATATGGAGCCACA-3’
EcoRⅠ
短3’UTR下游引物CTNNBIP1_3’UTR_S-R:
5’-GCCGAATTCTAAATATTGCAAAGCGCACT-3’
EcoRⅠ
配制以下PCR反应体系：
PCR循环的反应条件如下：
反应结束后，对PCR产物进行胶回收纯化。
(2)对载体pmCS2和步骤(1)中的PCR胶回收产物用BglⅡ和EcoRⅠ进行双酶切，配制以下酶切反应体系：
pmCS2双酶切反应体系：
PCR产物的双酶切反应体系：
混匀反应液，37℃水浴过夜酶切。
(3)胶回收纯化步骤(2)中的双酶切产物，并进行连接反应，在连接反应体系中，载体与连接片段的个数比例为1:7，配制以下混合反应液：
混匀反应液，16℃反应2h。应结束后，将连接产物转化至感受态DH5α中。
(4)挑取单菌落送至测序公司测序，检测3’UTR片段的插入情况，得到pmCS2-3’UTR_L和pmCS2-3’UTR_S载体。
步骤2.将pmCS2-3’UTR_L和pmCS2-3’UTR_S载体分别瞬时转染293T细胞，在荧光显微镜下进行荧光成像检测，具体包括以下4步：
(1)转染前一天进行293T细胞铺板，用24孔板。
(2)使用Lipofectamine3000TransfectionReagent(invitrogen)对质粒进行瞬时转染，操作按转染试剂盒说明书进行，设置空白对照(不转质粒)，阴性对照(转pmCS2)和实验组(分别转pmCS2-3’UTR_L和pmCS2-3’UTR_S)。
(3)转染24h后，将生长培养基(DMEMwith10％FBS)替换成成像培养基(DMEMnophenolredsupplementedwith10％FBS,20μMDFHBI-1T,25mMHEPESpH7.4,and5mMMgSO4)，37℃避光培养1h，使用荧光成像显微镜或流式细胞仪进行观测和荧光强度分析。其中，Spinach2/DFHBI-1T复合物的激发光波长为482nm，发射光为505nm的绿色荧光；红色荧光蛋白mCherry的激发光波长为560nm，发射光波长为630nm。
(4)绿色荧光的强度代表转录本的量，红色荧光强度代表荧光蛋白的产量，如果相同时间内，在转录本量相同的情况下，蛋白产量越多，则表明翻译效率越高，以此对荧光强度数据进行标准化处理来判断3’UTR长度与翻译效率的关系。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (4)
1.一种应用双荧光报告基因质粒载体研究3’UTR对mRNA翻译效率的作用方法，其特征在于：
(1)在真核表达质粒载体荧光蛋白编码区后插入一种编码可发荧光RNA分子的DNA片段，从而可以转录出一条具有编码荧光蛋白和可发荧光RNA分子的mRNA；
(2)在步骤(1)所得质粒载体的编码可发荧光RNA分子的DNA片段后，或荧光蛋白编码区和编码可发荧光RNA分子的DNA片段中间，插入所要研究的3'UTR片段，从而可以转录出一条具有编码荧光蛋白、可发荧光RNA分子及所研究的3'UTR的mRNA；
(3)将步骤(2)所得重组载体瞬时转染真核细胞后，在成像培养基中同时对转录本和蛋白质表达量进行荧光定量分析，通过对比荧光强度来判断3’UTR对翻译效率的作用。
2.如权利要求1所述的一种应用双荧光报告基因质粒载体研究3’UTR对mRNA翻译效率的作用方法，其特征在于：荧光蛋白和可发荧光RNA分子所激发的荧光具有不同的波长，从而可以同时检测这两种蛋白和mRNA的量。
3.如权利要求1所述的一种应用双荧光报告基因质粒载体研究3’UTR对mRNA翻译效率的作用方法，其特征在于：可以通过激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测两种荧光的量。
4.如权利要求1所述的一种应用双荧光报告基因质粒载体研究3’UTR对mRNA翻译效率的作用方法，其特征在于比较插入不同3'UTR后两种荧光的强弱：，其中Ra和Rb为插入两种不同3'UTR载体所产生的荧光蛋白的荧光值，Ga和Gb为插入两种不同3'UTR载体所产生的荧光RNA分子的荧光值。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106979938A (zh) * | 2017-03-09 | 2017-07-25 | 东华大学 | 一种利用流式细胞仪进行目的基因表达定量检测的方法 |
| CN114075570A (zh) * | 2020-08-17 | 2022-02-22 | 西安交通大学 | 一种miRNA结合区域可变的报告基因质粒及其制备方法和应用 |
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2015
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