CN105018609A - 一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法。包括构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站、样品处理、采用工作站自动液体处理装置完成移液、自动核酸提取设备提取与纯化DNA、琼脂糖电泳检测、甲烷氧化菌丰度的实时荧光定量PCR检测、获得其丰度结果等步骤。本发明基于自动分析方法，使甲烷氧化菌的核酸提取与纯化步骤实现自动化；使其特异基因PCR反应体系的配制实现自动化，减少手工操作引入的人为因素所造成的误差，操作步骤在洁净环境中运行，整个检测过程通过计算机软件控制，检测流程可以追溯，可实现系统误差的统一校正。

Description

一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法

技术领域

本发明涉及油气与天然气水合物勘探及油气与天然气水合物藏表征技术领域，更具体地，涉及一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法。

背景技术

中国是一个能源消耗大国。2013年我国石油的对外依存度接近60％。随着工业化和城镇化进程的加快，我国对油气与水合物能源的需求进入持续增长期。我国虽然正在实施节能减排和新能源发展战略，但是在相当长时期内我国仍然无法摆脱对油气资源的依赖，因此我国能源安全已被提上重要日程。为缓解我国能源紧张局面，加大力度勘探和更加高效地开发油气与水合物迫在眉睫，而高效的勘探方法及其配套装备的是解决能源需求的关键途径之一。

油气和水合物勘探领域包含地质勘探、地球物理勘探、地球化学勘探和微生物勘探四大核心技术。其中前三种勘探技术相对微生物油气与水合物勘探技术而言已趋于成熟。微生物勘探属油气和天然气水合物勘探领域四大核心技术之一，是依据地表土壤/沉积物/水中微生物异常进行能源潜力评价的重要方法。微生物勘探技术因其快速、经济、结果易解释等优势而倍受学界的关注。微生物勘探方法具有快速、经济和结果易解释等优势。然而，因土壤、沉积物和水体中99％以上微生物不可培养，故基于培养法而建立的传统微生物勘探方法在检测精度上很难满足勘探要求；因气态烃微渗漏是动态和不连续的，故传统微生物勘探方法无法在微裂隙处于挤压状态的区块发现气态烃微渗漏；采用单一的活菌异常指标难以在现今沙漠、戈壁和海洋深水等环境开展勘探；传统微生物勘探方法用于油气藏表征时需两次采样，这不仅显著增加成本，且在很多开采区无法实施，因我国多数油气藏未开展过微生物表征。

微生物油气与水合物勘探技术的不成熟性主要表现在：(1)面对丰度很低、对油气具有指示意义的、专性或兼性微生物的复杂样品，基于微生物培养法而建立的传统微生物油气勘探技术，不仅很难测准其微生物丰度(因为土壤和沉积物中99％以上的微生物不可培养)，数据可靠性差；(2)无法发现微裂隙处于挤压状态的勘探区油气与水合物藏；(3)面对复杂多样的油气与水合物勘探区，特别是沙漠、戈壁、盐碱地和海洋深水区，基于微生物培养法而建立的传统微生物油气与水合物勘探技术基本失效；究其原因，主要是传统微生物油气与水合物勘探技术仅依赖于单指标的活菌异常；(4)基于培养法的传统油气与水合物勘探技术对样品的处理效率非常低，通常一批样品至少需要14天才能获得结果，周期长，效率低，成本高；(5)数据影响因素多、波动大，在分析测定流程中会引入大量的人为误差；检测流程不可追溯，且无法进行系统误差的校正。

王江海等基于微生物单细胞和基因的原态检测技术，率先提出原态微生物油气与水合物勘探技术的概念、原理和技术方案，并在甲烷氧化菌活菌体外特异性荧光染色、甲烷-丁烷氧化菌死菌和活菌的快速定量检测、微生物油气勘探多重指标的设立和油气田区微生物群落变性梯度凝胶电泳分析的PCR策略等方面取得重要进展，形成以气态烃氧化菌及其关联菌类的活菌、死菌和总菌异常为多重勘探指标的微生物油气与水合物勘探技术，但目前仍然需要用手工方法检测微生物丰度，无法根本性解决微生物油气与水合物勘探技术的缺陷。

原态微生物油气与水合物勘探技术(IsMOST)是基于现代分子生物学技术的油气与水合物勘探技术，只有实现低丰度微生物样品的大批量快速处理，以及在配套装备技术领域取得根本性的突破的基础上，才有可能真正将原态微生物勘探技术运用于油气和水合物勘探方面。

发明内容

本发明要解决的一个技术问题是针对现有微生物油气与水合物勘探技术的不足，尤其是自动化样品处理技术不足，提供一种定量检测甲烷氧化菌丰度的自动化方法，基于所述方法可实现低丰度微生物样品的大批量快速处理和分析，并保证准确的分析检测结果，实现检测流程的可追溯性和系统误差的统一校正。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种检测甲烷氧化菌丰度的自动化样品处理方法，包括以下步骤：

S1.构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站(isMOST)；所述工作站包括自动液体处理装置、核酸提取设备、PCR反应体系配置系统；

S2.样品处理，从每个样品中得到大于1.5ml的上清液；

S3.采用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站的自动液体处理装置(isMOST Station 1)完成移液；具体是执行自动液体处理装置设定的程序，将不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和移液模块的操作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱板中；

S4.自动核酸提取装置提取与纯化DNA，将所有的样品板都准备好后，执行本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 2)设定的程序，即可得土壤和/或沉积物中的总基因组DNA。约1小时后，核酸提取与纯化流程结束，将样品的核酸提取液移转移至微量PCR管中，标记清楚后于-20℃冰箱中保存；

S5.琼脂糖电泳检测；

操作方法如下：

a.取5μl DNA提取液于1％琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000。

b.若有>2kbp条带，则取5μl DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并在4℃下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20℃。

S6.甲烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测

(1)甲烷氧化菌的培养

配制甲烷氧化菌的培养基；将1％甲烷氧化菌接种于培养瓶中；密封后注入甲烷；在适宜的温度下培养15天，尔后转接培养，至肉眼可见培养液浑浊；收集培养所得的甲烷氧化菌/丁烷氧化菌菌体，用于甲烷氧化菌的核酸提取及标准曲线的绘制。

(2)设计特异性引物

根据甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列，设计并合成可用于实时荧光定量PCR检测甲烷氧化菌的特异性引物，引物序列如下：

F:5’-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3’

R:5’-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3’

(3)制备标准品

以总基因组DNA为模板，采用特异性引物扩增甲烷氧化菌的目标片段，且将其与T载体连接；将连接产物加至感受态细胞悬液中，再提取质粒；经测序证实为甲烷氧化菌目标片段后，再测定质粒DNA的纯度并定量；最后用无菌双蒸水稀释至一定浓度，-20℃分装保存，作为荧光定量PCR的标准品。

(4)建立实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件

实时荧光定量PCR扩增在Roche Light Cycler 480(Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)中完成。反应体系是根据Premix Ex Taq^TM(TaKaRa)制造商说明书制备。用特异引物扩增甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列。沉积物中总基因DNA以1～10ng的水平作为模板加入每个反应混合物中。按照表2配制PCR反应体系。

表2 PCR反应体系配方

用无菌ddH₂O代替DNA作为阴性对照。操作过程均在冰浴中进行。采用LightCycler480 Software 1.5.0软件对实验数据进行分析。

RT-PCR反应条件：

其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)中完成。操作流程如下：

S11.按照表2配制好反应体系混合液(除了2μL DNA模板)，分装于2ml灭菌离心管中，每管大于0.5ml，置于制冷保存的载物架中。

S12.将原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 2)提取和纯化的带核酸样品的深孔板一起置于载物架中，作为DNA模板。

S13.执行原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)设定的程序，将建立PCR反应体系所需的混合试剂和2μL DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即完成PCR反应体系的配置。

后续步骤参照文献(邵明瑞等,2013,三种油气指示菌定量PCR方法的建立及其在油气田土壤中的初步应用，生物技术通报，第4期，172-178)进行操作；实验结束后，用LightCycler 480 Software 1.5.0软件对实验结果进行分析，即可获得样品中甲烷氧化菌的丰度。

本发明的有益效果：

基于本发明，可以获得以下有益效果：

(1)使气态烃氧化菌及其关联菌类的核酸提取与纯化步骤实现自动化；

基于科学分析结合大量优化实验研究结果，建立气态烃氧化菌及其关联菌类核酸的最佳提取和纯化流程，根据其最佳核酸提取和纯化流程，通过多通道准确移液、抗悬滴、机械臂和软件控制等技术，实现土壤和/或沉积物中核酸提取和纯化步骤的自动化。

(2)使气态烃氧化菌及其关联菌类特异基因PCR体系的配制实现自动化；

通过多通道准确移液、抗悬滴、机械臂和软件控制等技术，精确控制完成气态烃氧化菌及其关联菌类特异基因的荧光定量PCR体系所需的各试剂的准确用量，实现PCR体系配制的自动化，减少手工操作时的人为因素造成的误差。

(3)进一步地，层流罩的设计保证核酸提取等操作步骤在洁净环境中运行，一方面确保无外界污染的影响和检测结果的准确性，另一方面将可挥发的试剂进行回收，保证操作人员的安全和实验室环境的整洁。

总结来说，突出的有益效果在于：(1)解决了丰度很低、对油气与水合物具有指示意义的、专性或兼性微生物复杂样品的丰度检测，数据可靠性高；(2)本发明基于对油气与水合物具有指示意义的气态烃氧化菌的多种指标的检测，可很好地适用于在复杂多样的勘探区进行油气与水合物勘探；(3)样品的处理效率非常高，周期短，成本降；(4)自动化处理，消除了多种影响因素，减少数据波动，有效避免在分析测定流程中引入的人为误差；(5)整个检测流程通过计算机软件控制，检测流程可以追溯，可实现系统误差的统一校正。

附图说明

图1本发明机械臂的结构示意图。

图2本发明的移液原理图。

图3本发明所述移液通道上设置的移液模块实物图。

图4用本发明分析方法检测海洋沉积物平行样中细菌的PCR扩增电泳图。

图5手工处理陆地土壤样品中细菌的PCR扩增的电泳图，其中a:CTAB-酚氯仿法；b:试剂盒法。

1-机械臂，2-移液通道，3-移板机械手，4-纳升点样及96或384通道，5-活塞，6-套筒，7-压力传感器，8-空气柱，9-液体。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步说明本发明。本发明装置和系统中最大的发明点在于优化和整合了现有常规的其他领域的相关技术，解决了在进行微生物油气与水合物勘探的样品分析检测时手工操作所存在的弊端。一些部件以及部件之间的连接关系可以参照相关领域成熟的技术予以实现，因此并不在此一一赘述，或者因此限定本发明范围。

实施例1

本实施例提供一种原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化样品处理装置，包括自动液体处理装置和核酸纯化设备；

所述自动液体处理装置对样品、反应试剂的自动化加样、配制和处理，并通过整合各种终端分析检测设备将整个实验过程置于无人操作的环境下全自动运行并给出结果。优选地，所述自动液体处理装置由四个部分的结构组成：操作平台、机械臂、移液通道及实验用品的载架和辅助设备；所述操作平台上设置有若干定位轨道(T)，用于固定放置各种实验用品的载架。操作平台是整个工作站的框架，为半封闭式结构，平台正面有可手工开、关的气动控制门。平台上设计有很多定位轨道，不同的实验用品，不同的排放顺序，其所需要的载架大小也不同，会占据不同数量T的位置。按处理样品的能力大小可将操作平台分为多种类型。主要类型有三种：紧凑型操作平台：30个T，最多可放置25个SBS国际标准板(如96孔微孔板)；通用型操作平台：54个T，最多可放置45个SBS国际标准板(如96孔微孔板)；延展型操作平台：71个T，最多可放置55个SBS国际标准板(如96孔微孔板)。

所述机械臂的结构示意图见附图1所示，机械臂1上装载移液工具和移板机械手3，所述移液工具包括单个或多个独立控制的移液通道，所述机械臂1带动移液通道2在X轴方向精确移动；移液通道2上设置若干移液模块以及纳升级的微量点样模块4。附图3提供了一种移液模块的实物图。

优选地，所述机械臂1上的每个移液通道2都具有独立的动态定位系统，多通道同时操作时，每个通道可以同时在Y、Z轴进行非统一、非对称的移动和移液，通道间距离可以调整，满足各种规格的样品管或多孔板的多道同时操作。通道可直接自动装卸一次性吸头或可重复使用的针式吸头。

可选地，所述机械臂可以为2～6个，不同机械臂同时执行不同的移液任务。

进一步地，机械臂带动移液通道在X轴方向精确移动，将吸头精确定位。机械臂的位移精度为±0.1mm。机械臂上可装载各种移液工具，如单个或多个独立控制的移液通道，并可提供1、2、4、8、12或16个移液通道的不同配置；对于更高通量，还可设置96通道或384通道的移液模块，以及纳升级的微量点样模块。在装载有移液通道的机械臂上还可同时安装移板机械手，而不需要额外的机械臂来控制。

所述液体处理装置的移液技术是基于空气置换原理，类似于通常使用的手动移液器，通过通道内活塞5的移动来推动空气进行吸液和放液的。采用这种原理移液不需要步进电机控制的注射泵、各种导管和系统溶液，不易产生工作站内部的系统污染，避免了样品间由于系统污染而产生的交叉污染。见附图2所示，附图2中，5为活塞，6为套筒，7为压力传感器，8为空气柱，9为液体。

所述辅助设备包括样品振荡装置、孵育装置、样品装载装置、样品编号扫描和记录装置、实验耗材的转移装置、上下游设备的衔接装置。基于所述辅助设备的除了能够执行移液操作以外，还能够执行很多其他的实验任务，如样品的振荡、孵育、自动装载和记录带编号的样品、实验耗材的转移、与上下游实验设备的衔接等功能。

所述核酸提取与纯化设备为全自动核酸磁珠提取与纯化系统，工作原理是先通过震荡样品，使核酸游离出来，再用大体积提取磁头将样品中的核酸吸住，转移至新的离心管中；这样重复操作3次，就可获得很纯的核酸，为后续开展PCR反应体系的自动化配置和实时荧光定量PCR检测及其他分子生物学研究提供高纯度的核酸样品。在样品处理过程中，不仅获得的核酸纯度高，而且其提取效率也非常高(对于微生物丰度很低的海洋沉积物样品，仍然可以获得足量的核酸供后续工作之用)。采用现有常规计算机技术，在所述核酸提取设备中内置多个核酸纯化程序，通过电脑软件控制而实现自动化操作。

实施例2

基于本发明所述原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化样品处理装置，本实施例提供一种原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站，所述工作站包括原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化处理样品装置，还包括层流罩和PCR反应体系配置系统。

在所述自动液体处理装置和/或核酸提取设备的上方设置超净层流罩，保证无菌工作环境；也可连接通风管路，将实验中产生的有害物质排放或回收。这样的设置既能保护操作者的健康与安全，也能保证样本与实验流程的安全性。

基于本发明自动化装置和工作站，可以实现对气态烃氧化菌及其关联菌类丰度的自动化分析，包括以下步骤：

S1.搭建工作平台，工作平台上设置定位轨道，用于固定放置各种实验用品的载架；

S2.在自动液体处理与PCR反应体系配置系统(isMOST Station-1)及核酸提取设备(isMOST Station-2)中，将样品的上清从样品管经自动进样系统分装到样品深孔板并在样品深孔板中加入磁珠和缓冲液，同时将洗涤液和洗脱液分装于洗涤液深孔板；

S3.将装有上清的深孔板和装有洗涤液的深孔板分别安放于自动液体处理装置的载架盘上；

S4.在核酸提取设备中，完成核酸的提取与纯化；

具体是通过移液通道从试剂槽向样品深孔板和洗涤液深孔板中分别添加样品液或核酸提取与纯化所需试剂，通过移液装置将添加样品液或所述试剂的洗涤液深孔板移动至吸磁位置，经电磁头探入深孔板搅拌并吸住磁珠进行吸磁和抽吸废液，完成DNA洗脱；

S5.在PCR反应体系配置系统中进行PCR反应；

S6.获得PCR反应结果。

其中，S2步骤所述样品为多个，分装于多个样品管中，连续自动进样，对样品管或深孔板逐个扫描条形码，记录样品编号，实现样品跟踪，简化实验操作，并保证实验者的安全。

实施例3应用实验

用原态微生物油气与水合物勘探技术(isMOST)工作站自动化提取与纯化土壤和/或沉积物中核酸并结合实时荧光定量PCR仪开展甲烷氧化菌丰度测定。

土壤和/或沉积物样品中甲烷氧化菌的总基因组DNA提取和总菌数量的分析方法和具体实验步骤如下：

一、配制试剂

1、Buffer TE：10mM Tris-HCl，1mM的EDTA，调pH为8.0；

2、20mg/ml溶菌酶溶液配制：20mg溶菌酶溶解于1ml Buffer TE；

3、DNA抽提液：10mM Tris-Hcl,1M EDTA,0.5％SDS；

4、20mg/ml蛋白酶K；

5、Binding Buffer：从Omega公司购买；

6、Buffer PHB：从Omega公司购买；

7、SPM Wash Buffer：78％体积比的乙醇水溶液(现配现用)。

8、磁珠悬浮液(Magpure particles)：每毫升磁珠悬浮液中包含被薄层纳米硅包裹的磁性微球(直径是60nm)(奥润微纳新材料科技有限公司)50ng，其余为水。

二、样品处理

1、从干燥、碾细的土壤和/或沉积物样品中称取2.5g，将其置于10ml灭菌离心管中。

2、向离心管中加入1.5ml溶菌酶溶液(20mg/ml)，振荡悬浮，50℃水浴1小时；

3、依次加入400μl DNA抽提液，25μl蛋白酶K溶液(20mg/ml)，于55℃水浴中放置2h。

4、6000×g离心5min，得到上清液；将上清液装于新的10ml灭菌离心管中，再次6000×g离心5min，每个样品得到大于1.5ml的上清液。

三、用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)完成移液

1、将10ml离心管放置在载物架中。

2、按下表1将试剂准备好。

3、执行原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)设定的程序，将不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和移液模块的操作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱板中。

表1：试剂清单

四、自动核酸提取设备提取与纯化DNA

将所有的样品板都准备好后，执行本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 2)设定的程序，即可得土壤和/或沉积物中的总基因组DNA。约1小时后，核酸提取与纯化流程结束，将样品的核酸提取液移转移至微量PCR管中，标记清楚后于-20℃冰箱中保存。

五、琼脂糖电泳检测

1.取5μl DNA提取液于1％琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000。

2.若有>2kbp条带，则取5μl DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并在4℃下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20℃。

六、核酸浓度和纯度检测

对提取的样品基因组DNA使用微量核酸测定仪测定其浓度和纯度。当OD260＝1时，双链DNA(dsDNA)浓度约为50μg/ml

单链DNA(ssDNA)浓度约为37μg/ml

寡核苷酸浓度约为30μg/ml

纯DNA：OD260/OD280≈1.8(若大于1.9，表明有RNA污染；若小于1.6，表明有蛋白质和酚等污染)。

七、甲烷氧化菌数量的荧光定量PCR检测

(1)甲烷氧化菌的培养

配制甲烷氧化菌的培养基；将1％甲烷氧化菌接种于培养瓶中；密封后注入甲烷/丁烷；在适宜的温度下培养15天，尔后转接培养，至肉眼可见培养液浑浊；收集培养所得的甲烷氧化菌菌体，用于甲烷氧化菌的核酸提取及标准曲线的绘制。

(2)设计特异性引物

根据甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列，设计并合成可用于荧光定量PCR检测甲烷氧化菌的特异性引物。

以甲烷氧化菌的特异性引物为例，根据甲烷单加氧酶基因的CDS序列，设计如下可用于荧光定量PCR的引物，并由上海生工合成。引物序列如下：

F:5’-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3’

S:5’-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3’

(3)制备标准品

以总基因组DNA为模板，采用特异性引物扩增甲烷氧化菌的目标片段，且将其与T载体连接；将连接产物加至感受态细胞悬液中，再提取质粒；经测序证实为甲烷氧化菌目标片段后，再测定质粒DNA的纯度并定量；最后用无菌双蒸水稀释至一定浓度，-20℃分装保存，作为荧光定量PCR的标准品。

(4)建立荧光定量PCR的反应体系和反应条件

实时荧光定量PCR扩增在Roche Light Cycler 480(Roche Diagnostics,Penzberg,Germany)中完成。反应体系是根据Premix Ex Taq^TM(TaKaRa)制造商说明书制备。用特异引物扩增甲烷氧化菌pmoA基因的CDS序列。沉积物中总基因DNA以1～10ng的水平作为模板加入每个反应混合物中。按照表2配制PCR反应体系。

表2 PCR反应体系配方

用无菌ddH₂O代替DNA作为阴性对照。操作过程均在冰浴中进行。采用LightCycler480 Software 1.5.0软件对实验数据进行分析。

RT-PCR反应条件：

其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)中完成。操作流程如下：

S1.按照表2配制好的反应体系混合液(除了2μL DNA模板)，分装于2ml灭菌离心管中，每管大于0.5ml，置于制冷保存的载物架中。

S2.将原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 2)提取和纯化的带核酸样品的深孔板一起置于载物架中，作为DNA模板。

S3.执行原态微生物油气与水合物勘探工作站(isMOST Station 1)设定的程序，将建立PCR反应体系所需的混合试剂和2μL DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即完成PCR反应体系的配置。

后续步骤参照文献(邵明瑞等,2013,三种油气指示菌定量PCR方法的建立及其在油气田土壤中的初步应用,生物技术通报,第4期,172-178)进行操作，实验结束后，用LightCycler 480 Software 1.5.0软件对实验结果进行分析，即可获得样品中甲烷氧化菌的丰度。

实施例4本发明自动化工作站工作性能测试

1.样品处理能力

从本发明检测系统运行记录总结出，处理96个海洋沉积物平行样的起始时间是11点06分26秒，终止时间是12点46分03秒，约耗时1小时40分(即100分钟)；本发明检测系统按每天运行8小时，则每天可处理样品数＝(8小时×60分/小时)×96个/100分]＝461个；每年运行时间按300天计，则本发明检测系统每年可处理样品13.83万个。

2.提取核酸的效果

从上述获得的96个核酸样品中任意选取9个样品进行PCR扩增，其电泳图如图4所示。为了进行核酸提取效果的对比，将手工处理陆地土壤样品中细菌的电泳图展示于图5中。对比图4和图5可以明显看出：

(1)用本发明检测系统提取的核酸质量很高，且非常稳定及具有可重复性(见图4中的1至9灰白色条带)；

(2)本发明检测系统核酸纯化得非常好(图4中灰白色条带的亮度基本一致)，这与图5中明显不同(图5a：核酸没有提取出来；图5b：核酸虽然提取出来，但具有从很亮至逐渐变暗的带状变异趋势，反映出核酸纯化得不好)；

(3)从样品中扩增出的细菌条带与M条带(标志物Marker)之间的距离可以看出，用手工提取的细菌核酸，其分子量大致在2万左右(图5)；而用本发明检测系统提取的细菌核酸，其分子量大致在20万左右(图5)，反映出用本发明检测系统提取核酸不容易水解，这为后续对细菌的丰度进行荧光定量提供了更佳的样品，会使定量精度更高、更准确。

(4)本发明检测系统同时能提供试验过程的真实记录，使所获得的数据不仅具有可追溯性，且因其具有相同误差，故能对数据进行统一的误差校正。

3.同一样品的对比实验

按照本发明方法以及采用现有常规的手工提取的方法提取同一个海洋沉积物样品所得提取核酸效果的比较结果列于表3：

表3

*海水之下沉积物的深度。

从上表3看出：(1)用本发明方法提取核酸的效率明显比手工提取的效率高，平均高出约14％；(2)用本发明方法提取核酸的稳定性(误差约为0.3％)明显比手工提取核酸的稳定性(误差约为7.6％)好。

  SEQUENCE LISTING

 

<110>  广州安能特化学科技有限公司

 

<120>  一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法

 

<130> 

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列引物F

 

<400>  1

ctggcagggc attcaggatt                                                 20

 

 

<210>  2

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列引物S

 

<400>  2

gaagaagggc gtcagcgtgt                                                 20

Claims (4)

1.一种甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.构建原态微生物油气与水合物勘探技术的自动化工作站；所述工作站包括自动液体处理装置、核酸提取设备、PCR反应体系配置系统；

S2.样品处理，每个样品得到大于1.5 ml的上清液；

S3.采用本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站自动液体处理装置完成移液；具体是执行自动液体处理装置设定的程序，将不同的试剂通过自动控制机械臂上移液通道和移液模块的动作自动加入对应的样品板、结合板、洗涤板和洗脱板中；

S4.自动核酸提取设备提取与纯化DNA，将所有的样品板都准备好后，执行本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站设定程序，得到土壤和/或沉积物中的总基因组DNA；核酸提取与纯化流程结束后经自动液体处理装置将样品的核酸提取液移转移至微量PCR管中，标记清楚后于-20 ℃冰箱中保存；

S5.琼脂糖电泳检测；

S6.经实时荧光定量PCR检测，获得甲烷氧化菌丰度。

2.根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化处理方法，其特征在于，S5步骤所述琼脂糖电泳检测操作方法如下：

（1）取5 μl DNA提取液于1%琼脂糖上电泳鉴定，DNA Ladder为DL2000；

（2）若有> 2 kbp条带，则取5 μl DNA提取液加灭菌水稀释20倍后作为PCR模板并在4℃下保存，样品基因组DNA提取液保存于-20 ℃。

3.根据权利要求1所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，S6步骤所述甲烷氧化菌丰度的荧光定量PCR检测包括以下步骤：

（1）甲烷氧化菌的培养；

（2）设计特异性引物；

（3）制备标准品；

（4）建立实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件；

其中，PCR反应体系的配制在本发明原态微生物油气与水合物勘探工作站中完成；

操作流程如下：

S61.按照配制好反应体系混合液，经自动液体处理装置分装于灭菌离心管中，每管大于0.5 ml，置于制冷保存的载物架中；

S62.将原态微生物油气与水合物勘探工作站提取与纯化的带核酸样品的深孔板一起置于载物架中，作为DNA模板；

S63.执行原态微生物油气与水合物勘探工作站设定的程序，将建立PCR反应体系所需的混合试剂和DNA模板依次加入对应的、新的深孔板中，即完成PCR反应体系的配置；

（5）对样品进行实时荧光定量PCR检测，分析实验结果，即可获得样品中甲烷氧化菌的丰度。

4.根据权利要求3所述甲烷氧化菌丰度的自动化检测方法，其特征在于，步骤（2）所述引物序列为：

        F: 5’-CTGGCAGGGCATTCAGGATT-3’；

        S: 5’-GAAGAAGGGCGTCAGCGTGT-3’。