CN108265108A - 一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法，其包括如下步骤：步骤一：以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR；步骤二：建立所述pmoA基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。本发明不需要对微生物进行培养，通过系统发育以及功能基因探针的方法来直接分析土壤样品中的油气微生物。

Description

一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法

技术领域

本发明涉及一种油气勘探领域的检测方法，尤其涉及一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法。

背景技术

油气微生物勘探法主要研究近地表土壤层中微生物异常与地下深部油气藏的相关关系。油气微生物勘探技术能为初期勘探提供廉价有效的方法和指示，能预测有利勘探区块以降低勘探风险。而在勘探成熟区,这项技术能将地震勘探查明的地质构造划分成各种含烃级别，并以指示油、气、水的分布位置来为油气藏开发中的油气藏表征服务。其核心在于检测和油气利用相关的微生物数量及其活性，从而判断地下油气藏的分布和有无。因此，油气指示微生物的检测技术成为整个微生物勘探法的最重要的内容之一。

传统的微生物勘探主要以培养法为主，前苏联Kartsev等(1959)采用了一种最简单的方法来测定土壤中的烃消耗细菌。把土壤放入培养反应器，随后注入一定量的无机盐培养溶液并在顶空加入一定比例的丙烷或丁烷气体。培养一段时间后，根据培养基表面的菌膜厚度来估算细菌的数量和活性。这种方法虽然在早期取得了一些效果，但由于其受主观判断的影响较大，培养时间较长，误探率也较高，逐渐被淘汰。

另一种是气体利用检测法，其原理是测定培养过程中被烃氧化细菌消耗烃的量。Taggart等(U.S.Patent NO.2349472)构建了一系列较复杂的气体分压测试装置，监测培养时间内挥发性烃分压的变化，间接表征了土壤中的烃氧化细菌数量。这种方法的缺点在于培养时间特别长，通常需要数周时间。另外环境中很多微生物具有烃降解能力，在长期的驯化后，或多或少会表现出一定的烃消耗活性。

为了克服以上缺点，Hitzman等(U.S.Patent NO.2880142)采用了平板计数法或滚管法来直接测定土壤中的烃氧化微生物。他在培养基中加入高浓度毒性物质为唯一碳源来培养烃氧化菌，而这些毒性物质(如醇，醛等)可以抑制其他土壤微生物的生长。但是这种方法的缺点也是周期长，而且一般都是通过计数平板上的菌落数。琼脂本身也是一种碳源，不可避免地会造成假阳性。

除此以外，中石化无锡石油地质研究团队以最大可能数法为基础建立了多种与油气相关微生物的检测方法，经过评估虽然该方法稳定，但检测通量低，所得数据介于半定量和定量之间。随后该项目组结合医学上的酶标检测仪建立了高通量检测方法，由于色度检测非常灵敏，易受到主观和客观因素的干扰，但在严格控制各个操作环节下，该方法稳定、准确，检测周期短。作为经典的培养检测方法，项目组建立了稀释平板法，该方法同时考虑微生物数量和活性，该方法的缺点在于对于操作人员和耗材的需求量较大。

由此可见，现有的传统的以培养为主的测试技术和测试手段存在干扰因素稍多、操作较复杂、样品保存难度高、耗时较长，不能检测不可培养的烃氧化菌，同时特异性较低，计数使用平板法、MPN法，定量不准确等缺陷，还不能满足实际生产的要求，鉴于此，很有必要开发一种高效免培养的定量检测烃氧化微生物方法，从而提高油气化探的准确性和可靠性。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法，其包括如下步骤：

步骤一：以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBR Green作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR；

步骤二：建立所述pmoA基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。

针对油气微生物的实时荧光基因定量检测方法，利用定量PCR技术扩增甲烷(烃)氧化菌的功能基因来检测其存在和数量，从而高效快速准确地检测样品中可编码甲烷氧化菌的功能基因(例如pmoA基因)的数量，从而更加精确的指导微生物勘探。

在使用实时荧光定量PCR方法中，如果检测靶标基因需要达到检测灵敏度更高、特异性更强、重复性更好以及定量更准确的特性，则需要选择合适的实时荧光定量PCR体系，否则也难以实现检测灵敏度更高、特异性更强、重复性更好以及定量更准确的特性。对实时荧光定量PCR体系影响最为关键的组分包括引物序列的选择。因为实时定量的引物设计要求比较高，设计时要注意扩增的片段不能太大，本发明的发明人通过实验证实，在本发明中，扩增的片段最好在250bp-100bp之间，并且扩增的片段要尽可能的保守，避免存在碱基突变；避免引物自身或与引物之间形成连续配对；避免引物自身形成环状的发卡结构；避免引物之间的TM值相差超过2℃；同时要保证这对引物有绝对的特异性，因为要是产生非特异性扩增的话，就不能准确的计量模板量了，这样就失去了实时定量的意义了。

在本发明的一个具体实施方式中，用于扩增所述pmoA基因的引物对包括如SEQ IDNo.1所示的上游引物序列，和如SEQ ID No.2所示的下游引物序列。

本发明所用的术语“油气微生物”是指近地表土壤层中与地下深部油气藏存在相互关系的微生物。在本发明的一个优选的实施方式中，所述油气微生物是指烃消耗微生物，尤其是烃消耗菌。在本发明的一个优选的实施方式中，所述油气微生物是指烃氧化微生物，尤其是烃氧化菌。

在本发明的一个具体实施方式中，使用含有所述SYBR Green的SYBR Premix ExTaq Perfect Real Time(染料法实时定量荧光)试剂盒来进行实时荧光定量PCR。

所述实时荧光定量PCR的配制的体系为：1倍体积的SYBR Premix Ex Taq PerfectReal Time，分别为15-25μmol·L^-1的上游引物和下游引物，1-10ng的DNA模板。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述实时荧光定量PCR的配制的总体系为20μl，各组分的加入量分别为：10μl SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，分别为16-20μmol·L-1的上游引物和下游引物，3-5ng的DNA模板。

在本发明的一个优选的实施方式中，荧光定量PCR的扩增条件为：

1)92-98℃25-35s；2)92-98℃7-13s，3)50-60℃25-35s，4)70-74℃25-35s，5)77-83℃3-7s，6)从步骤2)至步骤5)循环30-45次；7)62-68℃3-7s；

优选1)95℃30s；2)95℃10s，3)55℃30s，4)72℃30s，5)80℃5s，6)从步骤2)至步骤5)循环35-42次；7)65℃5s

发明人研究发现，进行所述实时荧光定量PCR时，采用冷启动的方式。也就是，在配制体系过程中在零度以下进行，否则，PCR扩增过程中容易产生引物二聚体以及非特异性条带的扩增，这样会严重的干扰结果的准确性，特别是在模板含量较低时，例如在模板含量为0.5-1.5ng时。

对本发明的实时荧光定量PCR准确性的另外一个比较关键的因素是需要有一定浓度的pmoA基因定量标准品。因此，在本发明中，针对甲烷氧化菌的功能基因pmoA基因第一次构建出标准品。因此，所述方法还包括在步骤一之前的步骤A：制备所述pmoA基因的实时荧光定量PCR的标准品。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述pmoA基因实时荧光定量PCR的标准品制备步骤如下：

I)将所述pmoA基因进行克隆，获得存在于宿主细胞中的含有所述pmoA基因的克隆载体；

II)从宿主细胞提取所述步骤I)中的所述克隆载体，并使所述克隆载体线性化；

III)采用光度适应计测定线性化的克隆载体的溶液的浓度，然后对所述性化的克隆载体的溶液进行稀释，获得至少三个不同浓度的线性化的克隆载体的溶液来构成所述pmoA基因的标准品。

在本发明的一个优选的实施方式中，荧光定量PCR的所述标准品通过包括如下步骤的方法获得：

(1)将回收的PCR产物克隆到质粒pGEM-T Easy载体上。酶连体系:pGEM-T Easyvector 1μL，2×Rapid Ligation Buffer 5μL,T4Ligase 1μL(3U)，回收PCR产物3μL，共10μL，4℃过夜。

(2)PCR产物的转化：将冻存的感受态细胞JM109从-70℃取出，置冰上融化，加入冰预冷的连接反应产物5μL，轻轻混匀；冰浴30min，转到42℃水浴中热激90s，随后快速冰浴2min；加入950mL SOC培养基，混匀，置于37℃，200rpm培养1.5h。

(3)同时在预先倒好的含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板上涂布20μL 40mg/mL的IPTG和40μL 20mg/mL的X-gal，37℃倒置平皿，使其被培养基充分吸收。

(4)将培养1.5h的菌液取出，涂布200μL于准备好的平板，37℃培养12-14h后。使用蓝白斑筛选，用无菌的牙签随机挑取白色的菌落，转移至5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜。

(5)所得菌液一部分送样测序。测序工作由上海生工完成，所用仪器为ABI PRISMA377型自动测序仪。剩余菌液用上海生工小量质粒提取试剂盒提取质粒。需要注意的是，为了保证后续定量PCR扩增效率，需要用限制性内切酶EcoR I使环状质粒线性化。

(6)总细菌定量标准品构建通过16S rRNA V3区引物519f和907r扩增Escherichiacoli JM109基因组，具体操作参见[Yan T,Ye Q,Zhou J,et al.Diversity of functionalgenes for methanotrophs in sediments associated with gas hydrates andhydrocarbon seeps in the Gulf of Mexico[J].FEMS Microbiology Ecology,2006,57:251-259]。

(7)基因拷贝数按下式计算，模板DNA用BioPhotometer核酸蛋白测定仪测定后，用TE缓冲液10倍梯度稀释即构成荧光定量PCR的标准品。

实时荧光定量PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在本发明的一个优选的实施方式中，pmoA重组质粒制备完成后，分别以10倍梯度稀释含有pmoA重组质粒获得标准曲线，采用SYBR PremixEx Taq Perfect Real Time试剂盒于CFX96Real-Time PCR System扩增仪上对标样和未知土壤样品进行pmoA基因定量分析分析。在本发明的一个优选的实施方式中，荧光实时定量PCR的反应体系为20μL，包括1μL稀释10倍的DNA模板(1～10ng)、10μL SYBR Premix Ex TaqPerfect Real Time，正、反引物各0.2μL(20μmol·L-1)和8.6μL的灭菌双蒸水。在本发明的一个优选的实施方式中，荧光定量实时PCR扩增的温度条件：95℃30s；95℃10s，55℃30s，72℃30s，80℃5s，40个循环；65℃5s；土壤样品中的pmoA基因数量采用换算为干土的比例(所有土壤在105℃下称量至恒重：基因拷贝数/g·干重土壤)。

本发明的有益效果在于：本发明不需要对微生物进行培养，通过系统发育以及功能基因探针的方法来直接分析土壤样品中的油气微生物。利用定量PCR技术扩增甲烷(烃)氧化菌的功能基因检测其存在和数量，具有快速、灵敏、高通量、特异性强、自动化程度高、重复性好、准确定量等特点。

附图说明

图1为甲烷氧化pmoA基因定量PCR的标准曲线。

图2为荧光扩增曲线。

图3为pmoA基因溶解度曲线。

图4为应用效果图。

具体实施方式

下面结合非限制性的具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不局限于下述实施例。

甲烷氧化pmoA基因定量PCR的标准曲线(图1)、荧光扩增曲线(图2)和pmoA基因溶解度曲线(图3)的构建具体过程为：pmoA基因重组标准品制备完成后，分别以10倍梯度稀释含有pmoA重组质粒获得标准曲线，采用SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time(染料法实时荧光定量)试剂盒于CFX96Real-Time PCR System(实时定量聚合酶链式反应)扩增仪上对标样和未知土壤样品进行pmoA基因定量分析分析。荧光实时定量PCR的反应体系为20μL，包括1μL稀释10倍的DNA模板(1～10ng)、10μL SYBR Premix Ex Taq Perfect RealTime，正、反引物各0.2μL(20μmol·L^-1)和8.6μL的灭菌双蒸水。荧光定量实时PCR扩增的温度条件：95℃30s；95℃10s，55℃30s，72℃30s，80℃5s，40个循环；65℃5s；土壤样品中的pmoA基因数量采用换算为干土的比例(所有土壤在105℃下称量至恒重：gene copynumber/g·dry weight soil，拷贝数/克·干燥土壤)。

实施例1

pmoA基因的检测

1.用于构建pmoA基因标准品的pmoA基因扩增

PCR反应引物对如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(1)PCR反应体系(50μL)：TaKaRa Taq HS(热启动)聚合酶缓冲液5μL，MgCl₂5.0mM，dNTPs 0.2mM，正、反向引物各0.5mM，模板10-20ng，Taq HS聚合酶(TaKaRa)2U,ddH2O31μL。

(2)反应程序为：预变性94℃5min；变性94℃1min，pmoA基因55℃退火1min，延伸72℃1min，30循环；最后一步延伸72℃5min。扩增产物用PCR纯化试剂盒(TaKaRa)纯化。

2.构建pmoA基因片段的标准品

(1)将步骤1中的步骤(2)回收的PCR产物克隆到质粒pGEM-T Easy载体(一种商品化T载体，Promega)上。酶连体系:pGEM-T Easy vector 1μL，2×Rapid Ligation Buffer(快速连接缓冲液)5μL,T4Ligase(T4连接酶)1μL(3U)，回收PCR产物3μL，共10μL，4℃过夜。

(2)PCR产物的转化：将冻存的感受态细胞JM109(大肠杆菌JM109号菌株，Promega)从-70℃取出，置冰上融化，加入冰预冷的连接反应产物5μL，轻轻混匀；冰浴30min，转到42℃水浴中热激90s，随后快速冰浴2min；加入950mL SOC(Super Optimal broth withCatabolite repression)培养基(2％(W/V)胰蛋白胨，5％(W/V)酵母粉，0.05％(W/V)氯化钠，2.5mM的氯化钾；10mM的MgCl₂,20mM的葡萄糖；121℃灭菌20min后可以使用)，加入葡萄糖抑制分解代谢)，混匀，置于37℃，200rpm在LB培养基(配方：氯化钠10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，水1L，然后调节pH至7.0；121℃灭菌20min后可以使用)培养1.5h。

(3)同时在预先倒好的含100μg/mL氨苄青霉素的LB(配方：氯化钠10g，酵母粉5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉13g，水1L，然后调节pH至7.0；121℃灭菌20min后可以使用)平板上涂布20μL 40mg/mL的IPTG和40μL 20mg/mL的X-gal，37℃倒置平皿，使其被培养基充分吸收。

(4)将培养1.5h的菌液取出，涂布200μL于准备好的平板，37℃培养12-14h后。使用蓝白斑筛选，用无菌的牙签随机挑取白色的菌落，转移至5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床过夜。然后鉴定出连接正确的阳性克隆，并从含有阳性克隆的宿主细胞中提取含有pmoA基因片段的重组质粒DNA。

(5)所得菌液一部分送样测序。测序工作由上海生工完成，所用仪器为ABI PRISMA377型自动测序仪。剩余菌液用上海生工小量质粒提取试剂盒提取质粒。需要注意的是，为了保证后续定量PCR扩增效率，需要用限制性内切酶EcoR I使环状质粒线性化。

(6)总细菌定量标准品构建通过16S rRNA V3区引物519f和907r扩增Escherichiacoli JM109基因组，具体操作参见文献[Yan T,Ye Q,Zhou J,et al.Diversity offunctional genes for methanotrophs in sediments associated with gas hydratesand hydrocarbon seeps in the Gulf of Mexico[J].FEMS Microbiology Ecology,2006,57:251-259]。

(7)基因拷贝数按下式计算，含有线性化的重组质粒DNA溶液用BioPhotometer(光度适应计)核酸蛋白测定仪测定后，用TE缓冲液10倍梯度稀释即构成定量PCR标准品。基因拷贝数的计算方法如下：

实施例2

通过荧光定量PCR进行基因定量

pmoA基因片段标准品制备完成后，以10倍梯度稀释后的稀释液作为实时荧光定量PCR的模板对pmoA基因片段进行实时荧光定量PCR，并根据该实时荧光定量PCR获得的数据制作标准曲线。

采用SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time试剂盒于CFX96Real-Time PCRSystem扩增仪上对标准品和未知土壤样品中的总DNA进行pmoA基因定量分析。

将采取的待检测的土壤样品在105℃烘干至恒重，称取一定量的该烘干后的土壤样品，利用MPBIO fastdna spin kit试剂盒提取土壤的总DNA。

(1)荧光实时定量PCR的反应体系为20μL：包括1μL稀释10倍的DNA模板(1-10ng)、10μL SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，正、反引物各0.2μL(20μmol·L^-1)和8.6μL的灭菌双蒸水。

(2)荧光定量实时PCR扩增的温度条件：95℃30s；95℃10s，55℃30s，72℃30s，80℃5s，40个循环；65℃5s。

(3)将获得的荧光定量数据参照基因拷贝数公式获得相应的样品基因拷贝数，然后将土壤样品中的pmoA基因数量采用换算为干土的比例(所有土壤在105℃下称量至恒重：基因拷贝数/g·干土)。

实施例3

以不同方法检测油藏剖面的微生物数量的比较研究

本发明的发明人采用现有技术中的几种方法和本发明的方法对江苏油田实验区同一剖面进行了测定，结果如图4所示。本发明的荧光定量PCR检测相比于传统的培养法检测通量更高，培养法检测的是细胞，免培养法检测的是DNA，它们之间的原理并不相同。但是从这条过油气藏剖面的油气微生物定量结果可以发现，几种方法所得的形态非常类似，且在油藏上方均有高值异常显示，表明这几种方法都可以用来进行微生物勘探。因此，在今后实际的工程应用中，可以综合经费、人员、施工周期、野外采样和检测条件等多方面因素，选择合适的方法。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

<110> 中国石油化工股份有限公司；中国石油化工股份有限公司石油勘探开发研究院

<120> 一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法

<130> YH1660140CN

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> SEQ ID No: 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pmoA上游引物

<400> 1

ggngactggg acttctgg

<210> SEQ ID No: 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> pmoA下游引物

<400> 2

ccggmgcaac gtcyttacc

Claims (10)

1.一种监测土壤中甲烷氧化菌的方法，其包括如下步骤：

步骤一：以pmoA基因的标准品和提取的待测土样中的总DNA分别作为DNA模板、以SYBRGreen作为染料以及以能够扩增包含在所述pmoA基因内的序列的引物进行实时荧光定量PCR；

步骤二：建立所述pmoA基因的标准曲线，并根据所述标准曲线确定所述待测土样中的所述pmoA基因的拷贝数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于扩增所述pmoA基因的引物对包括如SEQ ID No.1所示的上游引物序列，和如SEQ ID No.2所示的下游引物序列。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，使用含有所述SYBR Green的SYBRPremix Ex Taq Perfect Real Time试剂盒来进行实时荧光定量PCR。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的配制的体系为：1倍体积的SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，分别为15-25μmol·L^-1的上游引物和下游引物，1-10ng的DNA模板。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的配制的总体系为20μl，各组分的加入量分别为：10μl SYBR Premix Ex Taq Perfect Real Time，分别为16-20μmol·L^-1的上游引物和下游引物，3-5ng的DNA模板。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的扩增条件为：

1)92-98℃ 25-35s；

2)92-98℃ 7-13s，

3)50-60℃ 25-35s，

4)70-74℃ 25-35s，

5)77-83℃ 3-7s，

6)从步骤2)至步骤5)循环30-45、优选35-42次；

7)62-68℃ 3-7s。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，荧光定量PCR的扩增条件为：

1)95℃ 30s；2)95℃ 10s，3)55℃ 30s，4)72℃ 30s，5)80℃ 5s，6)从步骤2)至步骤5)循环35-42次；7)65℃ 5s。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在步骤一之前的步骤A：制备所述pmoA基因的实时荧光定量PCR的标准品。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述pmoA基因实时荧光定量PCR的标准品制备步骤如下：

I)将所述pmoA基因进行克隆，获得存在于宿主细胞中的含有所述pmoA基因的克隆载体；

II)从宿主细胞提取所述步骤I)中的所述克隆载体，并使所述克隆载体线性化；

III)采用光度适应计测定线性化的克隆载体的溶液的浓度，然后对所述性化的克隆载体的溶液进行稀释，获得至少三个不同浓度的线性化的克隆载体的溶液来构成所述pmoA基因的标准品。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，