CN102676678A

CN102676678A - 用于区分五种贝类饵料微藻的pcr引物组

Info

Publication number: CN102676678A
Application number: CN2012101541621A
Authority: CN
Inventors: 朱鹏; 周海波; 徐继林; 严小军
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2012-05-16
Filing date: 2012-05-16
Publication date: 2012-09-19
Anticipated expiration: 2032-05-16
Also published as: CN102676678B

Abstract

本发明涉及一种用于区分五种贝类饵料微藻的PCR引物组，用于鉴定硅藻门的角毛藻、金藻门的球等鞭金藻和绿色巴夫藻、绿藻门的青岛大扁藻和微绿球藻，引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:1-10。本发明设计了五种饵料微藻的特异性引物，结合PCR技术对微藻18S rDNA进行体外扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳技术便可对扩增结果加以分析。扩增结果表明引物与模板很好地结合并引发扩增反应，可用于快速灵敏地区分和检测和鉴定样品中的五种饵料微藻的存在与否。

Description

用于区分五种贝类饵料微藻的PCR引物组

技术领域

本发明属于微藻鉴定技术领域，具体涉及用于区分五种贝类饵料微藻的PCR引物组，即用于快速灵敏区分和检测硅藻门的角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、金藻门的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、绿色巴夫藻(Pavlova viridis)、绿藻门的青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的特异性PCR引物组。

背景技术

海洋微藻是最早在地球上出现的生物类群，它们个体微小、种类数量多、繁殖速度快，作为海洋生态系统中的主要初级生产者，在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其重要的作用。许多海洋微藻富含多种多不饱和脂肪酸（PUFA），对沿海滩涂贝类具有极高的营养价值，加之其具有生长繁殖迅速、对环境的适应能力强、容易培养等优势，目前已广泛用于沿海滩涂贝类人工育苗产业的人工饵料。目前，五种常见饵料微藻已经广泛用于贝类人工育苗的生产实践，它们分别是硅藻门的角毛藻(Chaetoceros calcitrans)、金藻门的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和绿色巴夫藻(Pavlova viridis)、绿藻门的青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata)。

在沿海滩涂贝类人工育苗生产与实践中，不同稚贝对不同的饵料微藻的摄食选择性现象显得尤为突出，不同饵料微藻对不同稚贝的生长发育也存在着很大的影响，并体现出截然不同饵料效果。但目前这种选择性分析基本上还停留在经验、显微观察或粒度计数的层面，对于被稚贝摄食至体内的饵料微藻而言，这些方法很难做到对不同微藻进行精确的定性定量分析。为了研究稚贝对不同饵料微藻的摄食差异，就必须对稚贝体内的饵料微藻进行区分和检测并进行更深入的定量分析。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，利用分子生物学方法来进行分类学鉴定已得到越来越广泛的应用。但是，由于五种饵料微藻的遗传相似性很高，设计的引物很容易发生交叉扩增，使检测的结果产生偏差，影响生产应用。

发明内容

本发明的目的是提供用于区分五种贝类饵料微藻PCR引物组，即根据五种常见饵料微藻18S rDNA序列的特定区域设计的5对引物，能够通过PCR扩增的手段对此五种饵料微藻加以区分和检测，从而弥补现有技术的不足。

本发明用于区分五种微藻的PCR引物组，其信息如下：

用于检测角毛藻(Chaetoceros calcitrans)的引物对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；

用于检测球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的引物对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:3、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:4；

用于检测绿色巴夫藻(Pavlova viridis)的引物对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:5、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:6；

用于检测青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)的引物对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:7、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:8；

用于检测微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的引物对，其正向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:9、反向引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:10。

上述检测角毛藻(Chaetoceros calcitrans)的引物对，其扩增退火温度为64℃。

上述检测等鞭金藻(Isochrysis galbana)的引物对，其扩增退火温度为63℃。

上述检测绿色巴夫藻(Pavlova viridis)的引物对，其扩增退火温度为64℃。

上检测青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)的引物对，其退火温度为64℃。

检测微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的引物对，其扩增退火温度为65℃。

本发明设计了五种饵料微藻的特异性引物，结合PCR技术对微藻18S rDNA进行体外扩增，再通过琼脂糖凝胶电泳技术便可对扩增结果加以分析。扩增结果表明引物与模板很好地结合并引发扩增反应，可用于快速灵敏地区分和检测和鉴定样品中的五种饵料微藻的存在与否。

附图说明

图1：用于特异性引物设计5种饵料微藻18S rDNA的特异性区域比对结果；

图2：引物的扩增结果检测电泳图，其中：

a.引物Cha.-F/R验证结果，其扩增产物大小为155bp；

b.引物Pla.-F/R验证结果，其扩增产物大小为162bp；

c.引物Pav.-F/R验证结果，其扩增产物大小为156bp；

d.引物Nan.-F/R验证结果，其扩增产物大小为130bp；

e.引物Iso.-F/R验证结果，其扩增产物大小为154bp。

具体实施方式

以下结合相关实验数据对本发明作进一步详细描述。

一、引物的设计：

本发明通过对不同属之间的五种常见饵料微藻18S rDNA基因全长（约1700bp）进行克隆与测序，利用DNA序列比对分析软件MEGA 5.0和DNAMAN 6.0加以分析比较，结果显示：五种微藻18S rDNA序列差异百分比为8.32%~20.42%，平均差异度为11.14%。

通过分析发现，五种微藻18S rDNA的两两差异性区域并非纯粹而绝对的差异，在差异性区域中往往存在着多个同源位点，这些同源位点对于长度在短短20bp左右引物的设计产生了极大的干扰左右，主要体现在引物在PCR扩增中存在一定的兼并作用，容易产生交叉扩增，最终将导致之后的区分鉴定失败。

因此，本发明分析了五种微藻18S rDNA的差异性区域，找出两段间隔长度在200bp以内的差异性序列，利用引物设计软件Primer Premier 5.0针对此两段差异性序列分别设计了合适的上下游引物。通过多次试验分析比较，本发明最终获得了在上述五种饵料微藻间具有强特性特异性的五对引物，并对基于角毛藻、球等鞭金藻、青岛大扁藻、绿色巴夫藻及微绿球藻18S rDNA设计出的5种引物加以命名，分别为Cha.-F/R、Iso.-F/R、Pla.-F/R、Pav.-F/R与Nan.-F/R。其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1-10。

二、引物的效果检测

1、饵料微藻的培养：本发明所研究的5种饵料微藻藻种由宁波大学应用海洋技术重点实验室藻种室提供，分别为：硅藻门的角毛藻(Chaetoceroscalcitrans)、金藻门的球等鞭金藻(Isochrysis galbana)和绿色巴夫藻(Pavlovaviridis)、绿藻门的青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和微绿球藻(Nannochloropsis oculata)）。将藻种至于500mL锥形瓶中，在（20±2）℃，光照强度为18~27μmol·m^-2·s^-1的条件下，采用“NML3号”配方（100mg·L^-1KNO₃，10mg·L^-1KH₂PO₄，20mg·L^-1Na₂SiO₃，0.25mg·L^-1MnSO₄·H₂O，2.50mg·L^-1FeSO₄·7H₂O，10mg·L^-1EDTA-Na₂，6μg·L^-1VB1，0.05μg·L^-1VB₁₂）的培养液对微藻进行人工培养，每天摇瓶1-2次，静置培养一周左右的时间。

2、微藻基因组DNA的提取：采用改良CTAB法对5种目标饵料微藻的基因组DNA进行提取，CTAB提取缓冲液内含2%CTAB（W/V）、100mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20mmol/L EDTA、1.4mol/LNaCl及1~2%（V/V）的β-巯基乙醇（灭菌后冷却加入）。取5ml藻液离心沉淀微藻细胞，弃上清后，加入600μL CTAB提取缓冲液，混匀并于65℃水浴保温1h。加入等体积PCI抽提液（苯酚:氯仿:异戊醇为25:24:1），混匀后于4℃，12000rpm下离心10min，重复此步骤一次。水相转至新的离心管中,加入0.8倍体积的异丙醇,-20℃静置1h后于4℃，12000rpm下离心20min。弃上清，沉淀用75%的乙醇清洗两次，再用无水乙醇清洗一次，尽量去除管内乙醇并在无菌操作台内晾干10min。将DNA沉淀溶于100μL的无菌水中，于-20℃保存。

3、饵料微藻18S rDNA的克隆与测序：，利用上海Invitrogen公司合成的真核生物18S rDNA通用引物：

（上游引物为5’-GCTCGNMWYWARGRTTAAGCCATGC-3’，下游引物为5’-ACCTTGTTASGWCTTCACCYTCCTC-3’）对所提取的五种饵料微藻所提取的基因组DNA进行PCR扩增。扩增程序为：95℃预变性4min 30s、94℃变性50s、48~50℃退火30s、72℃延伸1min 30s，循环30次，最后72℃延伸10min。

将扩增出的18S rDNA片段割胶回收，与T载体进行连接并完成TA克隆。次日将全量连接液加入到100μLDH5α感受态细胞中，转化完成后向管内加入895μL的LB液体培养基，37℃震荡培养1h后，取150~200μL的菌液在含Amp的LB固体培养基的平板上进行涂板，37℃倒置培养过夜。挑出单菌落，转至含5mL左右LB液体培养基（带Amp）的试管内进行扩大培养过夜（7h左右为宜），取1000μL菌液提交Invitrogen公司测序。

4、特异性引物的设计：利用软件MEGA 5.0对所测得的五种微藻18S rDNA的序列进行比对，找出其两两特异性区域（见附图1），针对这些特异性区域设计条件合适（包括合适的T_m值和GC含量等，并防止错配与二聚体等情况发生）的特异性引物（见表1），使得上下游引物扩增出的片段大小能保持在200bp以内，以备后期实时荧光定量PCR分析所用。

表1五对饵料微藻的特异性引物序列

5、引物特异性强度分析：特异性引物设计完成后，分别采用某一微藻的特异性引物与所有物种饵料微藻基因组DNA模板进行PCR扩增，检验其特异性强度是否符合实验要求。如果以两位数表示这种验证关系，十位上的数字表示引物代号，个位上的数字（“0”表示空白对照）表示模板基因代号，以“1”、“2”、“3”、“4”、“5”分别代指角、金、扁、巴、微。例如，“15”就代表角毛藻的引物与微绿球藻的基因组DNA进行PCR扩增。若引物特异性强，则只有该特异性引物与其对应的饵料微藻基因组将发生扩增，与其他四种无扩增现象；若引物特异性差，则将发生非特异性扩增现象，出现多条扩增片段。利用1%的琼脂糖凝胶电泳并结合凝胶成像系统进行检测，如果包括阴性对照组在内的6个泳道中只有引物与模板同源（引物的设计模板来自同一微藻基因组）组所对应的泳道出现条带，则说明引物特异性很强，符合区分和检测各微藻的检测要求。结果表明（见附图2），本发明的引物组可以特异性的区分对应的藻种，而不会在另外的四种藻中发生非特异性的扩增。

三、引物的应用

1、样品基因组DNA提取

为了验证上述五对特异性引物的实际应用价值和意义，本发明设计了五种人工试验样品，编号为“Ch^-”、“Is^-”、“Pl^—”、“Pa^—”及“Na^-”，其实质分别为缺失了角毛藻、球等鞭金藻、青岛大扁藻、绿色巴夫藻及微绿球藻的其他四种微藻等体积混合均匀的藻液。同样采用CTAB抽提的方法对上述五种样品的基因组DNA进行提取，获得的五组DNA样品溶液均混有了四种各不相同的微藻18S rDNA。

2、PCR扩增检测

构建25μL的PCR反应体系，分别以上述五种样品基因组DNA为模板，利用设计出的五对特异性引物依次进行扩增，扩增程序为：95℃预变性4min 30s、94℃变性50s、63~65℃退火13s、72℃延伸18s，循环30次。

扩增结束后，将扩增产物通过1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，比较不同样品间的扩增条带的差异。

3、结果分析

通过对琼脂糖凝胶电泳的结果进行分析，发现样品“Ch^—”、“Is^-”、“Pl^-”、“Pa^-”及“Na^-”与五对特异性引物扩增的结果均只有四条DNA条带出现，且在缺失了某种微藻基因组的样品中，其对应的特异性引物均无扩增条带。此样品验证分析试验再一次充分说明了五对特异性引物在上述五种饵料微藻之间具很有的强特异性，可以通过PCR扩增技术对上述五种饵料微藻加以灵敏快速的区分。

从以上实验数据可以看出，本发明的用于快速灵敏区分和检测五种常见滩涂贝类饵料微藻的5对引物，均具有很强的特异性，可用于快速区分和检测上述五种饵料微藻，在检测滩涂贝类稚贝对此五种饵料微藻的摄食选择性方面具有重要意义。

Claims

1.用于区分五种贝类饵料微藻的PCR引物组，其中：

2.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述的检测角毛藻(Chaetoceros calcitrans)的引物对，其扩增退火温度为64℃。

3.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述的检测等鞭金藻(Isochrysis galbana)的引物对，其扩增退火温度为63℃。

4.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述的检测绿色巴夫藻(Pavlova viridis)的引物对，其扩增退火温度为64℃。

5.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述的检测青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)的引物对，其退火温度为64℃。

6.如权利要求1所述的PCR引物组，其特征在于所述的检测微绿球藻(Nannochloropsis oculata)的引物对，其扩增退火温度为65℃。